全转录组RNA测序揭示紫阳湘城铜毒性反应中mrna、lncRNAs、miRNAs和circRNAs的整体分子反应和ceRNA调控网络(gydF4y2Ba香橙gydF4y2Ba摘要。田中交货)gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

铜毒性已成为柑橘生产的潜在威胁，但其机制尚不清楚。本研究旨在揭示mRNAs、长链非编码rna (lncRNAs)、环状rna (circRNAs)和microRNAs (miRNAs)在铜毒性反应中的全球格局，以构建竞争性内源性rna (ceRNAs)的调控网络，为柑橘铜反应提供有价值的知识。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

以“紫阳香城”为研究对象，对4种常用砧木对铜毒性的耐受性进行了评价。gydF4y2Ba(香橙gydF4y2Ba)被发现是最耐受的基因型。然后对“紫阳香城”的根和叶进行全转录组测序。与对照组相比，cu处理的根和叶中分别有5734和222个mrna, 164和5个lncrna, 45和17个circrna, 147和130个mirna被鉴定为差异表达(DE)。基因本体富集分析显示，DElncRNAs和DEmiRNAs的大部分demrna及靶点被标注为“氧化还原”、“磷酸化”、“膜”、“离子结合”等类别。利用预测的DEmRNAs-DEmiRNAs和DElncRNAs-DEmiRNAs对构建了ceRNA网络，进一步揭示了这些DERNAs在铜毒性中的调控作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

“紫阳香城”中大量的mrna、lncRNAs、circRNAs和miRNAs在铜毒性反应中发生了改变，这可能是通过ceRNA调控网络在铜毒性缓解中发挥重要作用。gydF4y2Ba

铜(Cu)是植物生长发育所必需的微量元素。Cu作为一种氧化还原活性过渡元素，在光合作用、呼吸、C和N代谢、氧化应激保护、木质化、花粉育性和乙烯感知等方面发挥重要作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．铜的大部分功能都是酶结合的铜，它催化氧化还原反应[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在植物中，有超过100种含cu的蛋白质，如质体青苷(PC)、铜/锌超氧化物歧化酶(CSD)、细胞色素c氧化酶(COX)、漆酶(LAC)、二胺氧化酶(DAO)和多酚氧化酶[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．尽管铜是必需元素，但它很容易对植物产生毒性，即使是在超最佳水平[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．过量的铜会抑制植物生长和其他矿质营养物质的吸收，并改变酶系统、膜完整性和许多其他生化和生理过程[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．不幸的是，在过去的几十年里，由于长期使用含铜杀菌剂和杀菌剂，废水灌溉，以及不合理的铜矿开采，铜污染已成为一个全球性问题[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在中国，铜是耕地污染第四大重金属[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．因此，更好地理解铜过量的生理和分子反应是非常重要和迫切的。gydF4y2Ba

值得一提的是，植物在进化过程中已经形成了一个严格调控的系统，以平衡铜的吸收、流出、螯合、分布和利用。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在该系统中，许多功能蛋白(如Cu转运蛋白和伴侣蛋白)、转录因子(tf)以及非编码rna (ncRNAs)可能参与了Cu稳态的调节。例如，Cu转运蛋白，包括ctrlike Cu transporters (COPTs)、P-type heavy metal ATPases (HMAs)、黄色条纹样(YSL)蛋白、锌/铁调节转运蛋白(ZRT/IRT)相关蛋白(ZIPs)和阳离子扩散促进因子(CDFs)被证明直接参与Cu的摄取、运输和分配[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．其中COPTs(如COPT1、COPT2、COPT6)主要负责从土壤中摄取铜并重新分配到生殖器官[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．的AtHMA5、AtHMA7/RAN1、AtHMA6/PAA1、AtHMA8/PAA2等hmagydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba参与铜向木质部、叶绿体或类囊体的转运[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．YSL16蛋白在铜从衰老组织向年轻组织和颗粒循环中的作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．除了这些功能蛋白外，一种被称为SPL7 (Squamosa Promoter binding-Like 7)的保守转录因子已被证明是铜稳态的中心调节因子[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．SPL7调控多个靶标的表达，如COPT1、COPT2、COPT6、铜还原酶FRO4和FRO5，以及铜调控的microRNAs (miR397、miR398、miR408和miR857)，这些靶标在铜缺乏或铜过剩时启动子中含有重复的铜响应元件()，启动子中含有GTAC基序[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除了蛋白质编码rna外，新出现的证据表明，ncrna在植物对非生物胁迫的反应中也起着重要的调节作用[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．MicroRNAs (miRNAs)是一种主要的ncRNA，长度为19 - 24个核苷酸，通过抑制翻译或直接降解植物中Cu相关蛋白来参与Cu稳态[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．前人研究表明，铜缺乏诱导miR397、miR408和miR857的表达，这些表达抑制了CSD1、CSD2、LAC、COX亚基5b (COX5b-1)和Cu伴侣的SOD (CCS1) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]，而Cu过量下调miR398，诱导CSD1和CSD2的表达[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．最近，在植物中发现了两种类型的ncRNA，长链非编码rna (lncRNAs)和环状rna (circRNAs)。lncrna属于长度超过200个核苷酸的一组ncRNA，可以通过调控基因的表达gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba−/gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-作用或miRNA海绵[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．环状rna是内源性共价闭合环状rna，通过选择性环状化产生[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．有人提出了一种竞争内源性RNA (ceRNA)假说，即lncrna、环状RNA、mrna和假基因可以作为ceRNAs竞争性结合常见miRNA反应元件(MREs)，从而调节广泛的生物学和发育过程[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．这些cerna也被称为miRNA海绵，用于隔离特定的miRNA并抑制其功能[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．在一些研究中，ceRNA调控理论已被用于揭示植物生物学的分子机制。例如，构建了一个ceRNA网络来解析lncrna在水稻磷酸盐饥饿中的功能[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在玉米种子发育过程中，建立了一个由lncrna、mrna和mirna组成的复杂ceRNA网络[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．在番茄乙烯途径中发现了大量环状rna，这些环状rna可能起着ceRNAs的作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．最近，ceRNA网络也被报道与gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba叶片发育、番茄开花与黄瓜热胁迫响应[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．然而，lncRNAs和circRNAs在植物中是否通过作为ceRNAs参与Cu稳态还有待进一步研究。gydF4y2Ba

柑橘在世界各地广泛种植。随着含铜杀菌剂在柑桔溃疡病防治中的广泛应用，铜中毒已成为柑桔的潜在威胁。然而，了解铜毒性反应的相关研究非常有限。本研究采用全转录组RNA测序(RNAseq)对紫阳香城(gydF4y2Ba香橙gydF4y2Ba摘要。ex Tanaka)是中国广泛使用的柑橘砧木，目的是在蛋白质编码rna (mRNAs)和ncRNAs (lncRNAs、miRNAs和circRNAs)水平上揭示铜毒性的全球分子响应。此外，构建的ceRNA网络进一步揭示了铜毒性反应的潜在调控机制。gydF4y2Ba

柑桔砧木对铜毒性的耐受性评价gydF4y2Ba

为了比较铜毒性的耐受性，对四种常用柑桔砧木——三叶橙(To)、紫阳香城(XC)、红柑橘(RT)和沙田柚(ST)进行了过量铜处理，并对植株表型和生理参数进行了评价。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba处理25 d后，TO和ST的顶叶呈黄色，XC和RT的顶叶基本正常(与CK的表型相似)。虽然铜中毒显著抑制了株高的相对增长速度，但XC对四种砧木的影响最小。Cu处理也显著降低了叶绿素含量，但XC处理25 d和40 d的叶绿素含量高于其他3种砧木。此外，过量Cu处理导致TO、RT和ST中MDA含量明显高于CK，而XC中MDA含量增加不明显。这些结果表明，XC是供试砧木中对铜毒性最耐受的基因型。因此，选择XC进行高通量RNAseq，以揭示mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA在铜毒性反应中的整体转录组。gydF4y2Ba

mRNA对铜毒性的整体反应gydF4y2Ba

从RNAseq数据中，我们以柚子为参考基因组，在XC叶片和根中鉴定出30123个蛋白质编码基因及其日志gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC值以图中火山图的图片表示。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA和b，在根中为- 8.2至7.9，在叶中为- 5.3至4.8。在所有这些基因中，分别在cu处理的根组(CuR/CKR)和叶组(CuL/CKL)中鉴定出5734个(2162个上调，3572个下调)和222个(132个上调，90个下调)DEmRNAs(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。根中的DEmRNAs数量显著高于叶片，表明根对铜毒性的反应更为明显。此外，在CuR/CKR和CuL/CKL之间共有137个demrna，这意味着它们可能参与了Cu毒性下的基本反应过程。DEmRNAs的热图显示了各处理中DEmRNAs的总体表达谱，并显示每个处理的3个重复总是聚在一起，而cu处理组和CK组分别聚在一起(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

为了探究demrna的功能，我们进行了GO注释和GO富集分析。基于GO注释，我们发现在叶片和根中的大部分demrna在生物过程(BP)下被注释为代谢过程、单生物过程、定位过程和对刺激的响应，在细胞成分(CC)下被注释为膜、细胞、细胞器和细胞外区域，在分子功能(MF)下被注释为结合、催化活性、转运蛋白活性、抗氧化活性、转录因子活性和营养库活性(附加文件)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S1a和b)。其中，有317个DEmRNAs对刺激有反应，膜中有596个，45个涉及抗氧化活性，1个涉及金属伙伴活性，32个涉及分子换能器活性，126个核酸结合转录因子，18个具有营养库活性，19个具有受体活性，188个具有根中转运蛋白活性(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S8)。氧化石墨烯富集分析表明，氧化还原过程、磷酸化过程、光合作用过程、木质素分解代谢过程、苯丙类分解代谢过程、膜、脱氢酶活性、过氧化物酶活性、蛋白激酶活性、铁离子结合、血红素结合在叶片和根中显著富集(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae和附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:图S1c)，这些DEmRNAs的GO项可能主要参与了Cu毒性的缓解。gydF4y2Ba

lncRNA对Cu毒性的整体反应gydF4y2Ba

除了mrna，我们还从RNAseq数据中鉴定出XC中243个已知lncRNAs和1033个新lncRNAs，方法是对GREENC数据库中柑橘的已知lncRNAs进行CNCI、CPC、CPAT和PfamScan分析(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa). lncRNA与mRNA的基因组特征比较显示，两者转录本长度分布相似，只是lncRNA的长转录本数量相对高于mRNA (> 4500 bp);对于外显子数量，2 ~ 4个外显子的lncrna比例较高;此外，lncRNAs具有较短的ORF长度和较低的FPKM值(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba抵扣)。在一个绝对值为log的截止点gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在CuR/CKR组和CuL/CKL组分别鉴定出FC > 1和FDR < 0.05, 164个(上调103个，下调61个)和5个(上调1个，下调4个)delncrna(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2)。日志gydF4y2Ba_2gydF4y2BaDElncRNAs的FC值在根中为−10.0 ~ 13.2，在叶中为−11.1 ~ 8.8。delncrna的一般表达谱如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag.与demrna类似，cu处理组和CK组的DElncRNAs分别成簇，而其3个重复序列成簇在一起。gydF4y2Ba

为了探索这些DElncRNAs的潜在功能，他们gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba用生物信息学方法预测靶向mrna(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:表S3)。DElncRNAs在根中的靶标GO注释显示，BP下有16条(主要涉及代谢过程、细胞过程、单生物过程、定位和刺激响应)，CC下有13条(主要涉及膜、细胞、细胞器和大分子复合物)，MF下有10条(主要涉及结合、催化活性、转运蛋白活性、电子载体活性、转录因子活性、和抗氧化活性)(附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba:图S2)。对这些靶标的GO富集分析表明，显著富集的GO项为光合作用过程、磷酸化过程、氧化还原过程、木质素分解代谢过程、苯丙类分解代谢过程、MCM复合物、光系统I反应中心、细胞外区、膜、脱氢酶活性、过氧化物酶活性、蛋白激酶活性、铁离子结合、血红素结合(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bah)。gydF4y2Ba

circRNA对铜毒性的整体反应gydF4y2Ba

在XC的叶和根中共鉴定出2404个circrna，其中基因间区型、外显子型和内含子型分别占60.48、28.62和10.90%(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).环状rna的序列长度分布如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA，大部分为10000 ~ 50000 bp，或小于1200bp。2号染色体(chr2)含有最多的环状rna，其次是chr3、chr5和chr8(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba环状rna的FC值如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad和e，在CuR/CKR组和CuL/CKL组中分别鉴定出45个(上调28个，下调17个)和17个(上调11个，下调6个)decircrna(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf和附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S4)，其中CuR/CKR与CuL/CKL共有1个DEcircRNAs。热图显示了每个处理中DEcircRNAs的一般表达谱，大多数DEcircRNAs在CuR组中高表达(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag).这些结果表明环状rna也参与了对铜毒性的反应。gydF4y2Ba

miRNA对铜毒性的整体反应gydF4y2Ba

在本研究中，CKL、CKR、CuL和CuR小RNA文库分别生成了23,333,512、24,526,156、21,822,295和25,871,923个原始reads。在这些原始读取中，去除适配器序列、低质量序列和短于18 nt、长于32 nt的读取后，我们获得了15,050,388、15,173,260、13,474,928和13,748,074个干净读取。大多数清洁读取的长度为20-24 nt(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).小RNA分类显示81%的clean reads为rRNA(42%)和unmatched(39%)，还有14%的miRNA, 5%的tRNA和1%的其他类型(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).从14%的干净reads中，我们最终鉴定出149个已知mirna和336个新mirna。每个样本中表达量最高的10个miRNAs如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac和d, miR166a-3p和11 -m0105-3p表达量最高。从已知miRNAs中，分别在CuR/CKR组和CuL/CKL组中鉴定出12个(10个上调，2个下调)和3个(全部上调)demirna，从新miRNAs中鉴定出135个(26个上调，109个下调)和127个(42个上调，85个下调)demirna。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae和f和附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S5)。这些demirna的一般表达谱如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Bag和h。在CK和cu处理的样品中以及根和叶样品中，它们的表达量存在显著差异。gydF4y2Ba

这些DEmiRNAs的靶向mrna在附加文件中列出gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S6。我们发现叶片中84.7%的DEmiRNAs(188/222)和根中81.0%的DEmiRNAs(4642/5734)被一个或多个DEmiRNAs靶向。DEmiRNAs在根中的靶点GO注释显示，BP下它们大多注释了代谢过程、细胞过程、单生物过程、定位过程和对刺激的响应，CC下注释了膜、细胞、细胞器和大分子复合物，MF下注释了结合、催化活性和转运蛋白活性(附加文件)gydF4y2Ba12gydF4y2Ba:图S3a和b). GO富集分析显示，已知DEmiRNAs在根中显著富集的目标GO项为光合作用、微管运动、碳水化合物代谢过程、DNA聚合酶复合物、微管、膜、纤维素合成酶活性、微管结合、催化活性，而新型DEmiRNAs富集的GO项为微管运动过程、磷酸化过程、蛋白质修饰过程、氧化还原过程、DNA聚合酶复合体、运动蛋白复合体、细胞外区、膜、蛋白激酶活性、转移酶活性、阴离子结合、催化活性(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA和b)。gydF4y2Ba

CeRNA调控网络对铜毒性的响应gydF4y2Ba

为了揭示铜毒性下蛋白质编码rna和ncrna的全局调控网络，基于ceRNA理论，使用demirna、DEmRNAs、DElncRNAs和decircrna构建了一个ceRNA网络。总共有5739个demnas, 64个DElncRNAs和5个DEcircRNAs被预测为根和叶中251个miRNAs的目标。当SCC <−0.5进一步过滤它们的相关性时，我们在根中得到3819个DEmiRNA-DEmRNA和10个DEmiRNA-DElncRNA相互作用，在叶片中得到12个DEmiRNA-DEmRNA相互作用(图5)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在该ceRNA网络中，11 -m0238-3p、11 -m0074-5p、11 -m0183-3p、miR166c-5p、11 -m0128-3p、11 -m0328-5p、miR165a-5p和miR535c参与了100多个节点，提示它们可能是核心调控因子。此外，tcon_00012501、tcon_00012960、tcon_00025983、tcon_00027274、tcon_00034874、tcon_00036810、tcon_00042747、tcon_00051884、tcon_00062474等lncrna参与网络。gydF4y2Ba

考虑到网络中包含了大量的信息，无法在图中一一显示，我们通过减少mRNA的数量构建了一个mini-ceRNA网络。我们从根的所有demmrna中鉴定出284个已知的cu相关mrna，这些mrna在以前的文献中直接或间接报道过;根据功能描述，包括铜相关调控因子(SPL、YSL、CDPK、MAPK、SUMO E3 Ligase等)、转运体(COPT、HMA、PPA、CDF、ZIP、OPT、ABC转运体等)和酶(LAC、CSD、CCS、PC、COX等)(补充文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S7和附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S8)。mini-ceRNA网络由这284个demirna和所有demirna、delncrna和decircrna组成。最后，只有261个DEmiRNA-DEmRNA和10个DEmiRNA-DElncRNA相互作用(SCC <−0.5)，包含18个demirna, 129个demrna和9个delncrna，如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．包括miR166a-5p、miR395c、miR535c、miR395k、miR166c-5p、miR165a-5p、miR399a在内的demirna共涉及20多个节点，均在CuR中表达上调。在网络中发现了一个已知的与铜相关的关键miRNA miR398b，其与5个demrna和2个delncrna表达下调并相互作用。此外，许多已知的与铜相关的关键mrna如SPL (Cg5g011720、Cg6g012520、Cg7g016770)、YSL (Cg7g013630)、HMA (Cg5g002920、Cg5g002930、Cg4g021370)、ABC transporter (Cg5g018290、Cg5g027620、Cg3g011050、Cg3g009290、Cg5g021160等)、LAC (Cg6g004840、Cg7g002640、Cg6g004880)、ZIP (Cg8g019240、Cg9g029160、Cg2g037280)在网络中表达下调。gydF4y2Ba

qRT-PCR验证了铜毒性下miRNAs和ceRNAs的表达相关性gydF4y2Ba

为确认RNAseq结果，验证miRNA与其靶标的表达相关性，从ceRNA网络中选取6个miRNA (miR398b、miR8175、miR157c-3p、miR166a-5p、miR165a-5p、11 -m0284-5p)及其靶标mrna和lncrna进行qRT-PCR。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba， qRT-PCR结果与RNAseq数据吻合较好，但部分低丰度mrna未检测到。此外，miRNA与其靶标表现出相当正确的上调或下调关系。例如，miR398下调，其所有预测靶点上调;miR8175表达上调，其所有靶蛋白表达下调。这一结果不仅表明了本研究RNAseq数据的可靠性，也验证了miRNAs与ceRNAs之间的负相关表达。gydF4y2Ba

XC和TO之间候选rna的表达模式gydF4y2Ba

为了进一步了解XC的铜耐受机制，我们将已知的铜相关miRNAs和ceRNAs在耐铜XC和铜敏感To中的表达进行了对比分析。如图所示。gydF4y2Ba9gydF4y2BamiR398b及其靶基因(Cg1g001620、Cg1g015400、Cg5g003300和tcon_0012960)在铜中毒第1天、第3天和第5天在XC和TO的根中均下调或上调。但是，log的绝对值gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba多数时间点，XC组FC明显高于TO组。在miR157c-3P和miR535c及其靶向mrna和lncrna中也发现了类似的变化。这些结果表明，在铜毒性作用下，耐铜的XC的铜相关miRNAs、mrna和lncRNAs的表达更为剧烈，这可能是导致XC耐铜能力增强的重要原因。gydF4y2Ba

ceRNA假说自几年前被报道以来，现在已被广泛接受[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．尽管利用ceRNA理论在了解人类疾病方面取得了巨大进展[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，在植物上进行的研究相对较少。在ceRNA网络中，mirna在不同的ceRNA(如mrna、lncrna和circrna)之间的连接和调控中起着关键作用。mrna可转录成具有直接功能的蛋白质，而未转录的lncRNAs和circRNAs可通过竞争性结合常见miRNAs间接影响mrna的表达[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．基于这一理论，我们试图构建一个ceRNA调控网络，以阐明耐铜基因型耐铜的机制。gydF4y2Ba

在本研究中，96.3%的demirna被预测为251个demirna的靶点，在根中构成3819个DEmiRNA-DEmRNA相互作用，在叶片中构成12个DEmiRNA-DEmRNA相互作用。这一结果表明，在铜毒性作用下，大多数demnas可能受到miRNAs的调控。从构建的ceRNA网络中，我们发现了几种miRNAs，包括大幅下调的miR398b和上调的miR165a-5p、miR166a-5p、miR166c-5p、miR395c、miR395k、miR399a和miR535c，这些miRNAs此前已被报道在金属应力响应中发挥作用。其中，miR398在Cu过量时表达显著下调，而在Cu缺乏时表达上调[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．的MiR395b和miR395cgydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba发现在Cu和镉(Cd)毒性作用下，其表达水平上调[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．此外，miR166和miR399在锰(Mn)、Cd、砷(As)或铝(Al)毒性中发挥重要作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．虽然没有直接证据支持miR535在金属胁迫中的功能，但miR156在Cd、Al、Mn和As毒性中的靶向作用已被充分证明gydF4y2BaSPLgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．有趣的是，这些与金属胁迫相关的mirna被预测靶向并调节ceRNA网络中大量已知的金属胁迫相关基因(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S7和附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S8)。例如，miR398b被预测靶向5种被过量Cu水平显著上调的DEmRNAs，包括推定的atp结合箱(ABC)转运体(Cg5g003300, Cg6g016060)，寡肽转运体(OPT, Cg1g001620)，多铜氧化酶(MCO, Cg1g015400)和丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK, Cg8g024350)。众所周知，ABC转运蛋白是植物蛋白中最大的家族之一，被认为与金属离子的摄取、转运和重金属解毒有关[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．由YSL和PT支组成的OPT蛋白已被证明通过金属螯合物的易位参与金属稳态[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．MCOs属于每个分子含有1到6个Cu原子的蓝色Cu蛋白，被认为在氧化还原反应中起作用[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．MAPK信号级联作为一种重要的信号转导途径，在响应不同的细胞外刺激中起着关键作用，之前已经发现它在过量的Cu和Cd [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．值得一提的是，除了mir398靶向基因外，其他demnas，包括假定的SPLs、YSLs、HMAs、ABC转运体、LACs和zip，都被上调的miRNAs靶向。这些目标mrna也被证明在铜或其他金属的稳态中发挥重要作用。因此，我们推测XC具有较强的铜毒性耐受性，至少部分归因于mirna介导的铜相关基因的调控，通过改变信号转导、铜的摄取、运输和解毒以及抗氧化能力来维持铜的稳态。这一推测被两种基因型的miRNAs和靶向mrna的差异表达水平所证实，这两种基因型对铜毒性的耐受性不同(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

越来越多的证据表明，两类新型ncRNAs——lncRNAs和circRNAs，作为ceRNAs(或称为“miRNA海绵”，“靶mimics”)在各种生物过程中发挥作用。在结直肠癌中，lncRNA H19被报道可以抑制内源性基因，gydF4y2Ba波形蛋白gydF4y2Ba，gydF4y2BaZEB1gydF4y2Ba,gydF4y2BaZEB2gydF4y2Ba，通过靶向miR138和miR200a [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．自噬促进因子(APF) lncRNA被证明与miR188-3p相互作用，从而受到影响gydF4y2BaATG7gydF4y2Ba心脏自噬细胞的表达与死亡[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．在植物中，lncRNA IPS1的过表达gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba导致积累的增加gydF4y2BaPHO2gydF4y2Ba，被miR399靶向并在磷酸盐摄取中发挥作用[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．此外，环状rna已被发现具有miRNA海绵的功能。例如，circHIPK3可以吸附9个具有18个潜在结合位点的mirna，并显著影响人类细胞生长[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．在本研究中，我们在ceRNA网络中鉴定了9个delncrna，这表明这些柑橘lncrna也可能作为miRNA海绵参与铜毒性的耐受。然而，需要指出的是，大多数delncrna没有被包含在ceRNA网络中。因此，我们认为这些lncrna通过其他机制参与铜毒性，如转录为miRNA前体、诱导DNA甲基化、调节染色质修饰或作为转录增强子[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．令人惊讶和意外的是，所有的decircrna都没有包含在ceRNA网络中。其中一个可能的原因是用于预测ceRNA对和derna之间相互作用的标准过于严格。gydF4y2Ba

基于ceRNA理论和本研究构建的ceRNA网络，我们提出了差异表达mrna、mirna、lncrna和circrna在铜毒性反应中的作用模式(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．在铜毒性作用下，miRNAs是调控重要铜转运蛋白、铜蛋白和铜调控因子(tf和激酶)上调或下调的关键调控因子。从而激活或抑制铜的摄取、流出和分布，保护细胞完整性，增强对铜毒性的耐受性。在这个过程中，一些lncrna可以作为ceRNA竞争性地结合mirna的MRE，这可能间接影响mRNA的表达。此外，circrna可能作为另一种类型的ceRNA隔离Cu-responsive mirna并抑制其功能。gydF4y2Ba

耐受性评价表明，XC对铜毒性的耐受性最强。全转录组RNAseq帮助我们在Cu处理的根和叶中分别鉴定出5734个(2162个上调，3572个下调)和222个(132个上调，90个下调)demrna，其中1243个被认为是响应过量Cu的关键候选基因。我们还鉴定出243个已知lncrna和1033个新lncrna，其中164个(103个上调，61个下调)和5个(1个上调，4个下调)分别在cu处理的根和叶中显著差异表达。从2404个鉴定出来的circrna中，在过量Cu暴露的根和叶中分别鉴定出45个(28个上调，17个下调)和17个(11个上调，6个下调)decircrna。此外，预测了149个已知mirna和336个新mirna，其中147个和130个分别在根和叶中对铜毒性反应。氧化石墨烯富集分析表明，大多数DEmRNAs以及DElncRNAs和DEmiRNAs的靶点都与氧化还原、磷酸化、膜化和离子结合有关。构建了一个由差异表达mrna、miRNAs和lncRNAs组成的ceRNA网络，进一步揭示了这些derna在铜毒性耐受中的关键作用。gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

四种常用柑橘砧木的种子，三叶橙(gydF4y2Ba枳壳trifoliatagydF4y2BaL. Raf.)、《紫阳向城》gydF4y2Ba(香橙gydF4y2Ba摘要。田中前)、红橘(gydF4y2Bac .试gydF4y2Ba布兰科(Blanco)和“沙田”柚子(gydF4y2Bac .茅gydF4y2Ba)采自西南大学柑橘研究所(重庆)。在温度为28℃、相对湿度为80%的石英砂塑料容器中，对砧木种子进行了萌发试验，以评价砧木对铜毒性的耐受性。均匀苗移栽于25℃蒸馏水洗净的新鲜石英砂中，光周期为16 h (50 μmol·m)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}·年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})进行沙土培养。在砂培过程中，由4 mM Ca (NO)组成的½强度Hoagland溶液gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1.5毫米知gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 0.5 mM NHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 1 mM MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 50 μM Fe-EDTA, 15 μM HgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 10 μM MnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 5 μM ZnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 1.5 μM CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba、1 μM HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaMoOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba生长30 d后，一半幼苗用上述溶液(对照，CK)灌溉，另一半幼苗用含187.5 μM CuSO的半倍Hoagland 's溶液灌溉gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(125×)处理40 d，认为是铜处理。每个处理进行3个生物重复。gydF4y2Ba

为了进行RNAseq和定量实时PCR (qRT-PCR)验证，首先用2%次氯酸钠对‘紫阳香城’和三叶橙种子杀菌15 min。剥去种皮后，在温度28℃、相对湿度80%的条件下发芽1周。将均匀苗转移到上述1 / 2倍浓度的Hoagland 's溶液中，25℃，光周期为16 h (50 μmol·m)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}·年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，每10 d更新一次。生长30 d后，一半幼苗用含75 μM CuSO的半倍Hoagland 's溶液更新gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(50×)为过量铜处理，其余以正常溶液更新(CK)。处理1 d、3 d和5 d后，将幼苗的根和叶取样，在液氮中冷冻，并分别保存在−80°C。每个处理进行3个生物重复。gydF4y2Ba

株高、叶绿素、丙二醛含量测定gydF4y2Ba

在Cu处理0 (PH1)和40 d (PH2)时，用直尺测量地上部的株高(PH)。株高相对增长率计算为(PH2-PH1)/PH1 × 100%。叶绿素和丙二醛(MDA)含量测定如Fu等所示。gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RNA提取，文库制备，RNA测序gydF4y2Ba

根据制造商的协议，使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从CK(缩写为CKR和CKL)和cu处理过的样品(缩写为CuR和CuL)的根和叶中提取总RNA。RNA质量和完整性用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)和NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)进行评估。仅选用高质量的RNA样本(1.8 < OD260/280 < 2.2, OD260/230≥2.0,RIN≥7.0,28S/18S≥1.0)构建测序文库。gydF4y2Ba

对于mRNA、LncRNA和circRNA测序，使用5 μg总RNA，根据制造商说明，使用TruSeq搁浅总RNA文库Prep和ripo - zero Plant Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)制备核糖体RNA (rRNA)去除链特异性文库。每个处理设3个生物重复，共制备12个文库。对于小RNA测序，使用来自CKL、CKR、CuL和CuR样品的3 μg总RNA和Truseq小RNA样品准备试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)构建了4个小RNA文库。文库用TBS-380荧光仪(Turner Biosystem, Sunnyvale, CA, USA)定量后，在上海迈迈生物制药生物技术有限公司(上海，中国)使用Illumina HiSeq X Ten平台进行深度RNA测序。gydF4y2Ba

读取映射和转录组组装gydF4y2Ba

通过SeqPrep(1.1版本)对成对的原始读取进行修剪和质量控制。gydF4y2Bahttps://github.com/jstjohn/SeqPrepgydF4y2Ba)和镰刀(版本1.33，gydF4y2Bahttps://github.com/najoshi/sicklegydF4y2Ba)，使用默认参数。然后，干净的读取分别对齐到Pummelo (gydF4y2Ba植物gydF4y2Ba)基因组[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]使用Tophat2软件进行定向模式[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba](版本2.0.13，gydF4y2Bahttp://tophat.cbcb.umd.edu/gydF4y2Ba)．每个样本的映射reads由Cufflink (version 2.2.1，gydF4y2Bahttp://cufflinks.cbcb.umd.edu/gydF4y2Ba)，以参考为基础。gydF4y2Ba

差异表达mRNA和基因本体(GO)富集分析gydF4y2Ba

为了识别CK和cu处理样品之间的差异表达mrna (demrna)，根据FRKM法计算每个转录本的表达水平。RSEM(版本1.2.31，gydF4y2Bahttp://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/gydF4y2Ba)用于量化基因丰度[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．R统计包软件EdgeR(3.14.0版本)[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]进行微分表达式分析，其绝对值为loggydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC > 1和FDR < 0.05。利用Omicshare在线平台(gydF4y2Bahttp://www.omicshare.com/tools/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

lncrna鉴定及其靶基因预测gydF4y2Ba

为了鉴定新的lncrna，首先丢弃与已知蛋白编码基因在同一链上重叠的转录本、片段数< 3的转录本、短于200 nt的转录本和长于300 nt的开放阅读框[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．然后，我们使用编码潜力计算器(CPC，版本0.9)、编码-非编码索引(CNCI，版本2.0)、编码潜力访问工具(CPAT，版本1.2.4)和Pfam扫描(版本1.6)筛选具有编码潜力的转录本。CPC、CNCI、CPAT和Pfam扫描的重叠输出被认为是可靠表达的新型lncrna。这些转录本也被用于blast在GREENC数据库中收集的柑橘lncRNA序列(gydF4y2Bahttp://greenc.sciencedesigners.com/wiki/Main_PagegydF4y2Ba)， e_value <1E-5，匹配碱基比> 90%的被鉴定为已知lncRNAs。使用Cufflinks套件中的cuffcompare程序将所有鉴定的lncrna分为基因间型、内含子型和反义型lncrna。采用FRKM法计算各lncRNA的表达量。以log为绝对值提取差异表达lncRNAs (DELncRNAs)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过EdgeR分析，FC > 1和FDR < 0.05。潜在的gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba根据DELncRNAs在染色体上的位置预测其-target mrna。在lncRNA上游或下游的10 kb窗口内搜索顺式目标[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．的gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-如Ou等人所描述的那样预测目标。[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

环状rna的鉴定和分析gydF4y2Ba

本研究使用CircRNA Identifier (CIRI, version 1.2)和CIRCexplorer (version 1.1.7)工具来识别CircRNA。CIRI扫描序列比对/映射(SAM)文件，并检测配对交叉剪切(PCC)信号和配对端映射(PEM)和GT-AG拼接信号的连接读取，如Gao等人所述。gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．CIRCexplorer通过两步TopHat和TopHat- fusion映射策略获得结点读取，如Zhang等人所述。[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．CIRI和CIRCexplorer的重叠输出被用于进一步分析。采用SRPBM (Spliced Reads per Billion Mapping)方法计算每个circRNA的表达量。以log为绝对值提取差异表达环状rna (differential expression circRNAs, DEcircRNAs)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过DEGseq (version 1.30.0)检测FC > 1和FDR < 0.05。gydF4y2Ba

miRNAs的鉴定与分析gydF4y2Ba

原始数据首先用Fastx-toolkit软件(版本)进行质量控制。0.0.13,gydF4y2Bahttp://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/gydF4y2Ba)通过过滤低质量碱基(sanger碱基质量< 20)、测序适配器、reads短于18 nt、reads长于32 nt获得干净的小RNA reads。然后在Rfam数据库(12.1版，gydF4y2Bahttp://rfam.sanger.ac.uk/gydF4y2Ba)去除非mirna序列(rRNA、tRNA、snoRNA等)。剩余的读值用于通过miRbase的BLAST搜索(版本21.0)来预测已知的mirna (gydF4y2Bahttp://www.mirbase.org/gydF4y2Ba)和新的miRNA，通过miRNA前体的发夹结构分析与Mireap(版本0.2，gydF4y2Bahttp://sourceforge.net/projects/mireapgydF4y2Ba)软件。按照TPM (The transcripts per million reads)方法计算各miRNA的表达水平。以log为绝对值提取差异表达miRNAs (DEmiRNAs)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过DEGseq测定FC > 1和FDR < 0.005。demirna的靶点预测使用psRobot本地版本1.01 [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ceRNAs调控网络的构建与分析gydF4y2Ba

为了揭示lncrna、circrna、mirna和mrna的作用和相互作用，我们基于ceRNA假说构建了lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA调控网络。psRobot [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]用于预测miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA和miRNA-circRNA对。如He等人所述，使用Spearman相关系数(SCC)和配对的表达谱数据评估miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA和miRNA-circRNA的两两相关性。[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．相互作用网络由<−0.5的SCC RNA对构建，并使用Cytoscape软件(2.8版)可视化显示[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

demrna、DElncRNAs和DEmiRNAs的qRT-PCR验证gydF4y2Ba

qRT-PCR检测demrna、DElncRNAs和DEmiRNAs的表达水平。分别使用RNAprep纯植物试剂盒(TIANGEN, Cat#DP432，中国)和miRcute miRNA分离试剂盒(TIANGEN, Cat#DP501，中国)从CuR和CKR样品中提取总RNA和小RNA。用HiScript®II Q RT SuperMix (Vazyme, Cat#R223，中国)从1 μg总RNA中合成第一链cDNA，用于mRNA的qPCR，用lnRcute lncRNA第一链cDNA合成试剂盒(TIANGEN, Cat#KR202，中国)进行lncRNA的qPCR。此外，除内参U6外，1 μg小RNA使用miRNA 1st Strand cDNA synthesis Kit (Vazyme, Cat#MR101, China)与茎环序列设计的茎环引物(GTCGTATCCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC)进行cDNA合成。qPCR在Bio-Rad CFX Connect RealTime系统上进行，使用ChamQ™Universal SYBR®qPCR Master Mix (Vazyme, Cat#Q711)、lnRcute lncRNA qPCR检测试剂盒(TIANGEN, Cat#FP402)和miRNA Universal SYBR®qPCR Master Mix (Vazyme, Cat#MQ101)，按照制造商的说明进行。2gydF4y2Ba^{——ΔΔCTgydF4y2Ba}方法用于归一化并确定相对于内参基因actin (Cs1g05000.1)或U6的RNA水平。所有引物都包含在附加文件中gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S9。gydF4y2Ba

所有支持性数据都可以在手稿及其附加支持性文件中找到。gydF4y2Ba

ABC转运蛋白:gydF4y2Ba

atp结合盒式转运器gydF4y2Ba

英国石油公司:gydF4y2Ba

生物过程gydF4y2Ba

答:gydF4y2Ba

蜂窝组件gydF4y2Ba

龙头:gydF4y2Ba

竞争性内源性rnagydF4y2Ba

circRNAs:gydF4y2Ba

圆形rnagydF4y2Ba

CIRI:gydF4y2Ba

circRNA标识符gydF4y2Ba

CKL:gydF4y2Ba

Cu-untreated叶gydF4y2Ba

CKR:gydF4y2Ba

Cu-untreated根gydF4y2Ba

CNCI:gydF4y2Ba

Coding-non-coding指数gydF4y2Ba

科普特人:gydF4y2Ba

类ctrl Cu转运体gydF4y2Ba

考克斯:gydF4y2Ba

细胞色素c氧化酶gydF4y2Ba

CPAT:gydF4y2Ba

编码潜在访问工具gydF4y2Ba

中国共产党:gydF4y2Ba

编码势计算器gydF4y2Ba

CSD:gydF4y2Ba

铜/锌超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

铜:gydF4y2Ba

铜gydF4y2Ba

CuL:gydF4y2Ba

Cu-treated叶gydF4y2Ba

坏蛋:gydF4y2Ba

Cu-treated根gydF4y2Ba

刀:gydF4y2Ba

二胺氧化酶类gydF4y2Ba

德:gydF4y2Ba

差异表达gydF4y2Ba

舰队指挥官:gydF4y2Ba

褶皱变化gydF4y2Ba

FRKM:gydF4y2Ba

每百万外显子中每千碱基的片段数gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

HMAs:gydF4y2Ba

p型重金属atp酶gydF4y2Ba

LAC:gydF4y2Ba

漆酶gydF4y2Ba

lncRNAs:gydF4y2Ba

长非编码rnagydF4y2Ba

MAPKKK:gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶gydF4y2Ba

穆迪:gydF4y2Ba

Multicopper氧化酶gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

MalonaldehydegydF4y2Ba

MF:gydF4y2Ba

分子功能gydF4y2Ba

microrna:gydF4y2Ba

小分子核糖核酸gydF4y2Ba

研究硕士:gydF4y2Ba

miRNA反应元件gydF4y2Ba

选择:gydF4y2Ba

寡肽转运体gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开式阅读架gydF4y2Ba

PC:gydF4y2Ba

质体蓝素gydF4y2Ba

PCC:gydF4y2Ba

成对交错剪gydF4y2Ba

PEM:gydF4y2Ba

Paired-end映射gydF4y2Ba

PH值:gydF4y2Ba

株高gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

RNAseq:gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

山姆:gydF4y2Ba

序列比对/地图gydF4y2Ba

鳞状细胞癌:gydF4y2Ba

斯皮尔曼相关系数gydF4y2Ba

SPL7:gydF4y2Ba

Squamosa启动子结合样7gydF4y2Ba

SRPBM:gydF4y2Ba

每十亿映射的拼接读取数gydF4y2Ba

TFs:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

:gydF4y2Ba

三叶的橙色gydF4y2Ba

TPM:gydF4y2Ba

每百万次阅读抄本数gydF4y2Ba

我:gydF4y2Ba

“紫阳相”gydF4y2Ba

伊夫圣罗兰:gydF4y2Ba

黄色条纹状蛋白质gydF4y2Ba

感谢华中农业大学刘继宏教授对稿件的修改。gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(2018YFD1000300, 2017YFD0202000)、国家自然科学基金项目(31772280)、国家柑橘工程研究中心项目(NCERC2019001)资助。资助者为RNAseq提供了资金支持，但在研究设计、数据收集、分析、解释和撰写手稿方面没有发挥作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 西南大学柑橘研究所，重庆400712gydF4y2Ba

   傅兴政，张晓勇，邱杰亚，周雪，袁孟，何义忠，春长品，曹莉，凌丽丽，彭良智gydF4y2Ba

2. 中国农业科学院柑橘研究所，重庆400712gydF4y2Ba

   傅兴政，张晓勇，邱杰亚，周雪，袁孟，何义忠，春长品，曹莉，凌丽丽，彭良智gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XZF和LZP构思并设计了该研究。XZF、XYZ和YZH分析了数据。JYQ和XZ进行qRT-PCR。MY和LC制备了实验材料。CPC和LLL测量生理数据。XZF撰写了这篇论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaXing-Zheng傅gydF4y2Ba或gydF4y2BaLiang-Zhi彭gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba