长链非编码RNA lncRNA973参与棉花对盐胁迫的响应gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

长非编码RNA (Long non-coding, lnc)是一类长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子，lncRNAs在生物和非生物胁迫的各种生物调控过程和响应中发挥着重要作用。通过RNA测序已经发现了与棉花盐胁迫相关的lncrna，但其功能尚未见报道。我们之前在棉花(Gossypium spp.)中发现了盐胁迫相关的lncrna，并发现了盐胁迫相关的lncRNA-lncRNA973。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在本研究中，我们鉴定了lncRNA973的表达水平、定位、功能及初步作用机制。LncRNA973位于细胞核内，在非胁迫条件下表达水平较低，但盐处理可显著提高其表达水平。这里lncRNA973被转化为gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和过表达。随着盐胁迫条件下转基因植株较野生型表达量的增加，转基因植株的种子发芽率、鲜重和根长均增加。我们还利用病毒诱导基因沉默技术敲除了lncRNA973的表达。在盐胁迫条件下，lncRNA973敲除后植株枯萎，叶片发黄脱落，说明与野生型相比，其对盐胁迫的耐受性下降。LncRNA973可能参与调控棉花盐胁迫过程中活性氧清除基因、转录因子及盐胁迫相关过程相关基因的表达。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

LncRNA973定位于细胞核内，经盐处理后其表达增加。lncRNA973过表达株系的耐盐性较野生型提高，而lncRNA973敲除株系的耐盐性降低。LncRNA973通过调控一系列盐胁迫相关基因的表达调控棉花对盐胁迫的响应。这为进一步研究lncrna973对棉花盐胁迫的响应机制提供了基础。gydF4y2Ba

长非编码rna (Long non-coding, lnc)是一类转录本长度超过200个核苷酸，不具备编码蛋白质的能力的rna [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．根据蛋白质编码基因的基因组定位，lncrna可分为基因间长非编码rna (linc)、非编码自然反义长rna (lncNATs)、内含子长非编码rna和与蛋白质编码基因部分重叠的重叠lncrna [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．大多数lncrna是由RNA聚合酶(Pol) II转录的。此外，植物特异性RNA聚合酶Pol IV和Pol V也会产生lncRNAs [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．与mrna不同，lncRNA的表达水平非常低，一般来说，它们的保守性较差。RNA是染色质的重要组成部分，许多调控RNA通过与染色质修饰剂和重塑剂相互作用来改变靶基因的表观遗传状态。其他rna通过多种方式调控基因表达水平，如影响mRNA的剪接、编辑、稳定性和翻译[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．lncRNA的作用机制有gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba相关的功能。gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-acting lncrna可能作为染色质的信号、引导或支架，调控位于遥远的染色体结构域甚至不同染色体的目的基因的表达。gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-acting lncRNA位于被编码蛋白的上下行，并与之相互作用gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-启动子或共表达基因的作用元件，从而在转录或转录后水平调控基因表达。植物lncrna可能在开花时间、基因沉默、根系器官发生、幼苗光形态建成、再生以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥关键作用[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

许多植物物种中lncrna的作用机制尚不完全清楚，只有少数lncrna被完全鉴定。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， lncrna，如冷辅助内含子非编码RNA (gydF4y2BaCOLDAIRgydF4y2Ba)和冷诱导的长反义基因内RNA (gydF4y2BaCOOLAIRgydF4y2Ba)，已被证明介导染色质修饰活性在转录沉默gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba（gydF4y2Ba开花轨迹CgydF4y2Ba)在春化期间[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．一些lincrna的附加调控功能，例如gydF4y2BaAt4gydF4y2Ba，gydF4y2BaIPS1gydF4y2Ba(诱导磷酸盐饥饿1)和pi缺陷诱导的长非编码RNA1 (gydF4y2BaPILNCR1gydF4y2Ba)，通过靶拟态机制充当miRNA诱饵，从而将具有调控作用的miRNA从其预期靶基因中隔离开来[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．作为lincRNA转录调控的一个例子，HIDDEN TREASURE 1 (gydF4y2BaHID1gydF4y2Ba)负调控光敏铬相互作用因子3 (gydF4y2BaPIF3gydF4y2Ba)及调控幼苗光形态建成[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， lncRNA elf18诱导的长非编码RNA1 (ELENA1)增强抗gydF4y2Ba两gydF4y2Ba，可解离FIB2/MED19a复合物并释放gydF4y2BaFIB2gydF4y2Ba从gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba启动子来增强gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba表达式[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．此外，植物lncrna可能在响应非生物胁迫中具有重要的生物学作用。例如，核局部干旱诱导的lncRNA (gydF4y2BaDRIRgydF4y2Ba)增强抗旱和耐盐能力[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

棉花(Gossypium spp.)是一种重要的经济纤维作物，为纺织工业生产天然可再生纤维，为牲畜饲料提供可食用蛋白质，是石油和生物燃料的来源。陆地棉的gydF4y2BaGossypiumgydF4y2Ba（gydF4y2BaG。gydF4y2Ba）gydF4y2Ba分子gydF4y2Ba它占世界棉花年产量的90%。然而，水的限制和棉花种植区的盐碱化是对棉花生产的挑战。高盐度还通过抑制叶片扩张、降低叶绿素含量和增加低氧和高渗胁迫对棉花的生长和产量造成严重限制[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．许多与盐胁迫相关的蛋白质编码基因已被报道，如gydF4y2BaSOS1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，gydF4y2BaSARP1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba南汽gydF4y2Ba转录因子(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．目前棉花lncRNA研究采用RNA测序(RNA-seq)和基于生物信息学的鉴定方法。Zhang实验室在中发现了大量与纤维发育相关的lncRNAsgydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba而且gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba使用RNA-seq [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．Zou等人使用链特异性RNA-seq方法鉴定了来自的5996个lncrnagydF4y2Bag . arboreumgydF4y2Ba纤维和树叶[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．Lu等人利用RNA-seq对3种不同环境(对照、干旱胁迫和复水)下9个陆地棉样品中的lncrna进行分析，转录组数据分析表明，lncrna XLOC_063105和XLOC_115463可能分别调控相邻的编码基因CotAD_37096和CotAD_12502 [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．Zhang等人鉴定了lncrna，并进行了表达和功能对比分析gydF4y2Ba大丽轮枝菌属gydF4y2Ba抗静电岛棉(gydF4y2Bag .取得gydF4y2Ba简历。“7124”)和感病陆地棉(gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba简历。' YZ1 ')使用RNA-seq [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．Deng等人发现了与盐胁迫相关的lncrnagydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba， lncRNA883与其下游基因Gh_D03G0339共表达。另外lncRNA973可能是miRNA399的模拟靶点[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．然而，对于这些lncrna的作用机制的研究还比较有限，关于它们在盐胁迫棉花中的作用还没有报道。gydF4y2Ba

在本研究中，我们鉴定并鉴定了lncRNA lncRNA973的功能。盐处理后lncRNA973的表达增加。原位杂交分析显示lncRNA973主要定位于细胞核。lncRNA973的过表达增强了盐胁迫的耐受性，而降低其表达则适得其反。转录组数据和实时荧光定量PCR分析显示，lncRNA973调节应激反应相关基因的表达水平，包括活性氧(ROS)清除、NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转运和转录因子可能共同促进盐胁迫耐受性的增强。gydF4y2Ba

棉花中lncRNA973基因的鉴定gydF4y2Ba

我们之前的研究涉及到一个与盐相关的lncRNA, lncRNA973 [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，被选作进一步分析。在Gh_D04G0659和Gh_D04G0660基因之间，鉴定为一个有意义的基因间lncRNA。它似乎是从RNA Pol II转录而来，它包含一个多聚腺苷化的3 '端。我们分析了lncRNA973的结构，它有内含子和外显子(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，类似于mRNA。另外，lncRNA973位于D基因组第4号染色体的感觉链上，有2个转录本(lncRNA973gydF4y2BaX1gydF4y2Ba和lncRNA973gydF4y2BaX2gydF4y2Ba)．对应的基因组区域约3.2 Kb，为lncRNA973gydF4y2BaX1gydF4y2Ba和lncRNA973gydF4y2BaX2gydF4y2Ba长度分别为2134 bp和2888 bp。此外,lncRNA973gydF4y2BaX2gydF4y2Ba外显子比lncRNA973长gydF4y2BaX1gydF4y2Ba；因此，检测lncRNA973表达的引物gydF4y2BaX2gydF4y2Ba在这个外显子上设计引物，将其与lncRNA973gydF4y2BaX1gydF4y2Ba．lncRNA973的表达水平gydF4y2BaX1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaX2gydF4y2Ba采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术对茎、根和子叶中lncRNA973的表达量进行分析gydF4y2BaX1gydF4y2Ba在根和子叶中含量较高，而lncRNA973gydF4y2BaX2gydF4y2Ba在这些组织中相对较低。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).此外，我们还检测了NaCl (250 mmol/L)处理棉花真叶在不同时间点(0、1、3、6、12和24 h) lncRNA973两种转录本的表达水平。lncRNA 973的表达gydF4y2BaX1gydF4y2BalncRNA973的表达在6和24 h时达到峰值gydF4y2BaX2gydF4y2Ba在不同的时间点都是较低的。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).因此，我们选择lncRNA973gydF4y2BaX1gydF4y2Ba为进一步研究。此外，还进行了序列保守性分析。和许多其他的lncrna一样，lncRNA973在其他植物中没有同源基因。为了探究lncRNA973的起源，我们分析了它在其他物种中的进化和同源性，发现它是一个新的基因，主要起源于gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba．其序列对齐gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba发现A基因组4号染色体上没有同源区域，这与A基因组的进化起源是一致的。gydF4y2Ba

生物资讯分析(gydF4y2Bahttp://cpc.cbi.pku.edu.cn/gydF4y2Ba)显示lncRNA973没有编码容量(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).使用ORF Finder在线工具对lncRNA973上的5个ORF进行预测gydF4y2BaX1gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1a)，范围从29到107个氨基酸。此外，根据大蛋白家族和结构域数据库(分别为Pfam和SMART)的同源性搜索，未发现与任何肽相匹配的功能域。gydF4y2Ba

lncRNA973的亚细胞定位gydF4y2Ba

lncrna的功能与其亚细胞定位有关[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．为了研究lncRNA973的亚细胞定位，我们使用lncRNA973特异性的双端digs标记探针在根中进行了荧光原位杂交。为了确定lncRNA973的亚细胞定位，我们使用DAPI和一个mRNA (gydF4y2BaGhUBQ7gydF4y2Ba)作为阳性对照。对于lncRNA973和gydF4y2BaGhUBQ7gydF4y2Ba探针，对棉花基因组进行序列特异性分析，选择特异性探针进行杂交。lncRNA973的荧光信号主要出现在与dig标记探针杂交的根细胞的细胞核中，在细胞质中也是微弱信号(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．阳性对照的荧光信号gydF4y2BaGhUBQ7gydF4y2Ba可见于细胞核和细胞质中。此外，我们还分别从细胞质和细胞核中分离纯化了RNA，用于RT-PCR。gydF4y2BaU6gydF4y2Ba主要在细胞核中表达，而tRNA主要在细胞质中表达。因此，细胞核和细胞质的分离是明显的。RT-PCR结果显示lncRNA973在细胞核中高度富集(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图印地)。这些数据说明lncRNA973转录本主要定位在细胞核内，在细胞质中信号较少。gydF4y2Ba

lncRNA973过表达增加了盐胁迫的响应gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

为了确定lncRNA973在植物盐胁迫应答中的作用，我们克隆了全长的lncRNA973转录本(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba图S2a)，包含泛素蛋白启动子的过表达载体gydF4y2Ba无论在哪里gydF4y2Ba构造(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba图S2b)，然后gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba(GV3101)介导的野生型转化(WT)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(Col-0生态型)。获得5个独立的转基因株系，选择3个过表达(OX- lncrna973 - 2、OX- lncrna973 - 3和OX- lncrna973 - 5)进行进一步研究(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2c)。未处理的转基因株系与对照株系在表型上无显著差异。Real-time PCR检测转基因后lncRNA973的转录表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．lncRNA973在转基因植株中的表达量明显高于WT(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2d)。研究转基因植物对盐胁迫、野生型和转基因植物的调控能力gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba将OX-lncRNA973放置在添加0 mM、100 mM和150 mM NaCl的1/ 2ms固体培养基上。然后测定了不同盐浓度处理1 ~ 7 d的种子发芽率和种子萌发后的表型。OX-lncRNA973系在正常(0 mM)条件下无异常表型。与野生型相比，OX-lncRNA973在正常(0 mM)条件下的萌发率没有出现异常表型(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).在100 mM NaCl处理3 d时，OX-lncRNA973品系的种子发芽率为55% ~ 60%，高于WT。在盐处理7 d时，OX-lncRNA973品系的种子发芽率平均为~ 95%，高于WT的~ 80%(图8)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).此外，nacl处理条件下WT和OX-lncRNA973株系的鲜重、根长和子叶绿度发生变化。100-150 mM NaCl处理也抑制了OX-lncRNA973幼苗的子叶变绿，但影响不如WT严重(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac). OX-lncRNA973幼苗的鲜重大于对照(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac). 100-150 mM NaCl显著抑制了根系伸长，而OX-lncRNA973幼苗的根系生长情况表明其对盐胁迫的耐受性更强(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae-f)。此外，我们还研究了OX-lncRNA973植株的丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、叶绿素含量和过氧化氢酶(CAT)活性等生理指标，以探讨OX-lncRNA973植株对盐胁迫的耐受性。在正常生长条件下，WT系和OX-lncRNA973系的叶绿素、MDA和Pro含量及CAT活性相似。但在200 mM NaCl处理后，总叶绿素含量下降，WT植株的叶绿素含量下降幅度大于OX-lncRNA973植株(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag)。WT和OX-lncRNA973植株的MDA和脯氨酸含量均有升高，WT植株的升高幅度大于OX-lncRNA973植株(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba设定h)。WT植株经NaCl处理后CAT活性受到抑制，OX-lncRNA973植株CAT活性较高(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baj).因此，WT和OX-lncRNA973植株的表型分析和生理指标显示，OX-lncRNA973植株对盐胁迫的耐受性高于对照植株。gydF4y2Ba

沉默lncRNA973导致盐胁迫易感性gydF4y2Ba

为了进一步探索lncRNA973在棉花抗盐胁迫中的可能作用，我们在棉花中沉默了lncRNA973gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba“SN91-11”使用病毒诱导基因沉默(VIGS)，这是经常用于基因功能分析。lncRNA973和gydF4y2BaCLOROPLASTOS ALTERADOS 1gydF4y2Ba（gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba)基因被独立克隆到TRV2载体中(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)，产生TRV2:lncRNA973和TRV2:gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba,分别。TRV2:gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba分别以空TRV2载体(TRV2)为阳性对照和阴性对照。约490 bp的lncRNA973片段和465 bp的gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba在VIGS系统中使用。浸润后约2周，标记基因TRV2:gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba含有白化蛋白的植物开始在其真叶中显示白化表型(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).利用qRT-PCR检测TRV2中lncRNA973的表达水平:lncRNA973-(VIGS)和含TRV2(空载体)的棉花植株。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab，在VIGS植株中，lncRNA973的表达量大幅降低，表明其被成功敲除。基因组中lncrna973相邻基因Gh_D04G0660的表达未受显著影响(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3)。选择2株VIGS植株和1株TRV2(空对照)植株进行盐胁迫处理。用250 mM NaCl灌溉植株，在盐处理后3 d, VIGS植株比对照植株表现出更严重的萎蔫和落叶表型，VIGS植株脱水后茎秆严重褐变，而TRV2植株茎秆仍呈绿色(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).因此，VIGS系对盐胁迫条件高度敏感。gydF4y2Ba

此外，为了检测VIGS棉花对盐胁迫的耐受性，我们还测定了MDA、Pro含量、相对含水量、ros清除酶活性和Na含量等生理指标gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba内容。正常生长条件下，VIGS与TRV2植株的各项生理指标无显著差异。盐胁迫条件下，VIGS植株的氧化胁迫指标MDA含量显著高于TRV2植株(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad). Pro和相对含水量是两个重要的抗逆性指标。盐处理下TRV2和VIGS植株Pro积累量均增加，但在VIGS植株中积累量更显著(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae).盐胁迫条件下，VIGS植株的相对含水量显著低于TRV2植株，说明VIGS植株失水更大，这与表型相一致(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf)。gydF4y2Ba

活性氧清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性在逆境胁迫应答中起着重要作用。盐处理后TRV2和VIGS植株ros清除酶活性降低;与TRV2植株相比，VIGS棉花表现出更显著的下降(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag),多余的钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba对植物是有毒的，而KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与娜gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba盐胁迫条件下[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．Na没有差异gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2BaTRV2和VIGS植株在正常条件下的浓度。但在盐胁迫下，VIGS植株积累了较多的NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba；相反，Na的浓度gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTRV2植株比VIGS植株低(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah).低水平KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在VIGS植物中，TRV2植物中含量更高(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bai). Na之间的不平衡gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba水平导致KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在VIGS植株中的比例(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Baj).此外，我们还检测了未注入VIGS载体的同生长期WT棉花幼苗的叶绿素、MDA、脯氨酸含量和CAT活性(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)，发现WT棉花幼苗与TRV2植株的生理指标差异不显著，排除了病毒载体的影响。结果表明，沉默lncRNA973后，棉花中MDA和Pro含量增加，相对含水量降低，ros清除酶活性降低。此外，它促进了KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba出口和内部NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba流动，导致K的不平衡gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含量、耐盐性降低。由此可见，lncRNA973基因敲除的植物对盐胁迫较为敏感，揭示了lncRNA973可以通过调控一些相关生理指标的积累来响应盐胁迫。gydF4y2Ba

LncRNA973调控棉花盐胁迫应答相关基因的表达gydF4y2Ba

根据之前的转录组数据，通过RNAplex计算lncRNA973与编码基因的共表达关系和结合自由能来预测共表达基因，共表达基因包括转录因子和胁迫相关基因(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。为了分析lncRNA973的潜在功能，我们选择了与lncRNA973共表达系数在0.95以上的蛋白编码基因进行分析。为进一步验证与植物盐胁迫反应相关的已知关键基因的表达，本研究从TRV2和VIGS盐胁迫幼苗叶片和未处理幼苗叶片中提取总RNA，并采用实时荧光定量PCR (real-time PCR)进行分析。2个NADPH氧化酶基因呼吸爆发氧化酶B (ROBHB)和D (ROBHD)的表达量在盐渍处理后分别下降了30%和50%以上;然而，在未经处理的植物中，表达水平没有显著变化(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).诱导表达gydF4y2BaΔgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba-PYRROLINE-5-CARBOXYLATE合成酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaP5CSgydF4y2Ba)可以促进Pro的积累[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．的表达gydF4y2BaP5CSgydF4y2Ba与TRV2系相比，盐处理VIGS植株增加了两倍(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).这些结果与Pro生理指数结果一致。我们进一步评估了钠钾离子相关基因对盐胁迫的响应。氢钠交换器7 (gydF4y2BaNHX7gydF4y2Ba)编码液泡中的NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba参与耐盐性的反向转运体，在质子与阳离子的电中性交换中起作用，如NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，穿过质膜[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2BaNHX7gydF4y2Ba盐胁迫条件下，VIGS植株比TRV2植株表达更高(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba对脱水敏感22gydF4y2Ba（gydF4y2BaRD22gydF4y2Ba)被与盐胁迫反应相关的脱落酸(ABA)信号激活[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．盐处理的VIGS植株中，其表达量也降低(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae).此外，我们还分析了ros相关基因的表达水平，gydF4y2Ba草皮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba圆荚体gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba．它们的表达水平在盐胁迫条件下被显著抑制，而在对照植株中增加(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf-h)。同时，我们检测了这些基因的同源基因在WT和OX-lncRNA973-2/5中的表达水平gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物。在未处理条件下，OX-lncRNA973植株中这些盐胁迫相关基因的表达量与WT相似gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5)，除此之外gydF4y2BaAtPODgydF4y2Ba基因表达显著上调。但盐胁迫后，WT和OX-lncRNA973植株中这些基因的表达均有所增加。的gydF4y2BaAtRBOHBgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtRBOHD, AtPODgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtCATgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtRD22gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtRD29AgydF4y2Ba,gydF4y2BaAtRD29BgydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba图S5a, b, f-j)盐处理后OX-lncRNA973植株的表达量显著高于WT，尤其是gydF4y2BaAtPODgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtRD29AgydF4y2Ba,gydF4y2BaAtRD29BgydF4y2Ba．的表达gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtNHX7gydF4y2BaOX-lncRNA973的表达量低于WT(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5c-d)。这些数据表明，lncRNA973可以通过调控盐胁迫应答相关基因的表达来调控植物对盐胁迫的耐受性。gydF4y2Ba

另外，转录因子可能参与lncRNA973的调控。这些转录因子包括MYB5、WRKY46、NAC29和乙烯应答62 (ERF62)转录因子。转录因子与lncRNA973的共表达系数普遍大于0.99，提示二者可能存在调控关系。采用RT-qPCR检测盐处理和未处理植物中这些转录因子的表达情况。盐胁迫条件下，VIGS植株中MYB5和WRKY46的表达水平低于对照植株(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bai j)。与未处理植株相比，NAC29和ERF62在盐处理植株中表达量较高(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bak-l)。同样，我们也检测了OX-lncRNA973植物和WT中这些转录因子同源基因的表达水平，发现转录因子AtERF和AtMYB5在处理前后没有明显变化(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5k-l)。AtWRKY46在正常生长的OX-lncRNA973植株中表达增加，盐处理后在OX-lncRNA973植株中表达明显上调(补充文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5 m)。在正常生长的植株中，AtNAC3的表达没有变化。与WT相比，盐处理后OX-lncRNA973植株中NAC3的表达显著诱导，且表达量显著高于WT(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5n)。由此可见，lncRNA973对盐胁迫的响应可能是通过调控多基因和多种复杂机制实现的。gydF4y2Ba

LncRNA973影响miR399及其靶PHO2的表达gydF4y2Ba

之前我们预测lncRNA973可能对miR399有调控作用[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．lncRNA973与miR399的相互作用区域位于第2外显子(图3)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).为了进一步确定lncRNA973对miR399的调控作用，我们在OX-lncRNA973中检测miR399及其靶基因PHO2的表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和TRV2:lncRNA973棉株。我们检测了基因敲除lncRNA973后棉花幼苗根部ghr-miR399的表达。当lncRNA973敲除效率达到60%及以上时，ghr-miR399的表达水平显著升高，而其靶基因gydF4y2BaGhPHO2gydF4y2Ba表达明显受到抑制。当敲除效率低于60%时，ghr-miR399和gydF4y2BaGhPHO2gydF4y2Ba表达水平未受显著影响(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。然而lncRNA973过表达并没有显著抑制ath1 - mir399的表达，也没有显著抑制ath1 - mir399的表达gydF4y2BaAtPHO2gydF4y2BaOX-lncRNA973明显改变gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).由此可见，lncRNA973调控ghr-miR399及其靶基因的表达gydF4y2BaGhPHO2gydF4y2Ba在棉花中，两者之间没有关系gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

近年来，随着生物技术的快速发展，许多lncrna被发现。然而，目前对其调控机制的研究还很少，对这些调控机制在盐胁迫应答中的作用机制的了解就更少了。本研究中，我们鉴定了一个与棉花盐胁迫响应相关的新lncRNA lncRNA973，并对其功能和作用机制进行了初步研究。大多数基因间lncrna是多聚腺苷化的，主要由Pol II转录，但在植物中也有一些由Pol IV和/或Pol V转录[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．与蛋白编码基因一样，lncRNA973的3’端存在poly a尾，提示lncRNA973可能是由RNA Pol II转录而来。其结构也与蛋白质编码基因相似，有外显子和内含子。lncRNAs的一个特征是它们不能编码蛋白质;然而，近年来，lncRNAs可以编码多肽。lncrna是否具有编码功能可以通过几种不同的在线软件程序进行分析和预测[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．因此，我们确定lncRNA973不具有蛋白编码功能，严格意义上是一个lncRNA。和许多其他lncrna一样，lncRNA973的基础转录水平非常低[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，但盐处理后其表达增加。在动物和植物中，只有少数lncRNA具有部分的进化保守性，大多数lncRNA在物种间不具有同源性，说明lncRNA的保守性较差[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．通过守恒和进化分析，确定lncRNA973是一个新基因进化而来gydF4y2Bag . raimondii就gydF4y2Ba而且gydF4y2Bag . arboreumgydF4y2Ba这在其他物种中保守性极差，基本上没有同源序列。此外，lncrna特有的亚细胞定位可能与它们的功能有关[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．我们的实验表明lncRNA973主要定位在细胞核内，这为我们研究lncRNA973的功能和作用机制提供了基础。gydF4y2Ba

功能研究涉及lncRNA的敲除和过表达。Qin等人研究了gydF4y2BaDRIRgydF4y2Ba发现它是一个对盐、干旱和脱落酸有反应的功能性lncRNA。gydF4y2BaDRIRgydF4y2Ba的过表达可以提高盐和干旱胁迫的耐受性[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．构建含有lncRNA973的过表达载体，转化为WTgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．然后,T3转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用不同浓度的NaCl溶液处理。在盐胁迫条件下，lncrna973过表达系的种子发芽率、根长和鲜重均明显大于WT。因此，过表达lncRNA973的植物对盐胁迫的耐受性更强。此外，我们利用VIGS技术敲除陆地棉中lncRNA973的表达。VIGS已经被用来研究lncRNAs在gydF4y2Ba抗黄萎病gydF4y2Ba和纤维发育，lncrna GhlncNAT-ANX2和GhlncNAT-RLP7，以及XLOC_545639、XLOC_039050和XLOC_079089响应gydF4y2Ba抗黄萎病gydF4y2Ba和纤维发育[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．我们利用VIGS技术研究了lncRNA973的功能，并观察了盐处理后VIGS植株的表型。lncrna973沉默的幼苗对盐胁迫的耐受性较差。过表达和敲除实验表明，lncRNA973正向调控棉花盐胁迫。gydF4y2Ba

lncrna是基因表达的关键调控因子。在植物中，许多lncrna会对不同的胁迫做出反应。LncRNAs可以直接调控DNA、蛋白质和miRNA的表达，也可以间接调控其他基因的表达。ELENA1也被发现与MED19a结合进行调控gydF4y2Ba革命制度党gydF4y2Ba响应病原菌胁迫和增加植物免疫反应的表达[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在本研究中，我们证明了lncRNA973通过调控一系列基因的表达调控植物对盐胁迫的响应。利用RNA-seq技术研究了几个关键的盐相关基因，检测了它们在VIGS沉默lncRNA973幼苗中的表达。部分盐相关基因正调控显著抑制，而其他负调控基因显著诱导。ros清除基因的转录gydF4y2Ba草皮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圆荚体gydF4y2Balncrna973沉默植株中SOD、POD和CAT活性下调，盐渍处理植株中SOD、POD和CAT活性明显受到抑制。这种抑制与表达水平呈正相关。易卜拉欣等发现，与耐盐品种‘中棉’23相比，盐敏感品种‘中棉’41的SOD、POD和CAT活性在盐处理过程中受到抑制[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．这些结果与我们的研究结果一致，即盐敏感材料中三种酶的活性都降低了。植物ROBH是一种NADPH氧化酶的同源物，在植物的胁迫应答中起着重要作用。RBOH调节ros依赖的离子调节，在盐胁迫下发挥稳态作用[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在我们的实验中，我们发现gydF4y2BaRBOHBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaRBOHDgydF4y2Ba盐胁迫下VIGS植物中RBOH家族的两个成员数量减少，降低了植物的耐盐性。植物的离子稳态对耐盐性也至关重要。过度NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba积累会降低植物的耐受性，降低生长发育。在盐胁迫下的VIGS植物中，过量的NagydF4y2Ba^+gydF4y2BaKgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在对照植株中，KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba比例增加。的表达gydF4y2BaNHX7gydF4y2Ba在lncRNA973基因敲除棉花中受影响，并受lncRNA973调控。这些结果与Gao等人的研究结果一致[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．gydF4y2BaP5CSgydF4y2Ba可以被认为是对盐胁迫做出反应的标记基因[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．更高层次的gydF4y2BaP5CSgydF4y2Ba说明在棉花中沉默lncRNA973降低了盐胁迫程度，而在棉花中沉默lncRNA973降低了盐胁迫的表达gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba在OX-lncRNA973植株中被抑制。转录因子MYB、NAC、ERF和WRKY在盐胁迫应答中发挥重要作用。MYB和WRKY家族在盐胁迫下主要通过正向或负向调控基因表达，NAC和ERF家族参与衰老过程以应对干旱和盐胁迫。在我们的实验中，lncRNA973沉默后，MYB5和WRKY46的表达水平降低，而NAC29和ERF62的表达水平显著升高，提示它们可能也位于lncRNA973的下游gydF4y2Ba草皮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba，gydF4y2Ba圆荚体gydF4y2Ba而且gydF4y2BaP5CSgydF4y2Ba，由lncRNA973调控。gydF4y2Ba

MiRNA在lncRNA中有重要作用。植物研究表明，lncRNAs是miRNAs的内源性模拟靶点，通过与miRNAs结合，直接抑制miRNA对mRNA的调控。这会降低mirna的表达，导致mRNA含量的增加[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．Jalali等报道lncrna不仅具有潜在的miRNA调控元件，还参与miRNA调控网络[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．我们发现lncRNA973可能对miR399有调控作用。在TRV2:lncRNA973棉花中检测到ghr-miR399的表达，敲除lncRNA973及其靶基因后发现ghr-miR399的表达增加gydF4y2BaGhPHO2gydF4y2Ba表情相对抑制。然而，我们在OX-lncRNA973中没有发现这样的结果gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．因此，两者之间可能存在内源性竞争RNA的调控机制或剂量效应，但具体的调控关系尚不清楚。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，lncRNA973过表达可以增强植物的耐盐性，而lncRNA973敲除表达可以降低植物的耐盐性，影响一些参与响应盐胁迫的基因的表达。此外，lncRNA973也可能参与mirna的调控。这些结果使我们能够提出lncRNA973调控基因对盐胁迫响应的机制模型。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．转录因子MYB5、WRKY46、NAC29和ERF62可能受lncRNA973调控。此外，还有一些ros清除基因和Na调节基因gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba抑制积累，增加促合成基因的表达。这些基因可以通过lncRNA973间接调控。gydF4y2Ba草皮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba以及其他基因受这些转录因子调控。LncRNA973可能通过诱导ros清除基因和Na的表达来提高棉花的耐盐性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba积累相关基因。gydF4y2Ba

在本研究中，我们鉴定并鉴定了一个与盐胁迫相关的lncRNA lncRNA973的功能。lncRNA973与mRNA结构相似，保守性较差。原位杂交分析发现lncRNA973主要定位于细胞核，盐处理显著提高了其表达水平。这里lncRNA973被转化为gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba过表达后，转基因植株对盐胁迫的耐受性增强，表达量降低则降低耐盐性。lncRNA973基因的沉默使棉花MDA和Pro含量增加，相对含水量降低，活性氧清除酶活性降低，KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含量、耐盐性降低。LncRNA973可以通过调控一些相关生理指标的积累来响应盐胁迫。转录组数据分析显示，lncRNA973可能参与了主要富集于胁迫相关生物过程和途径的基因调控[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．这些基因包括活性氧清除基因、转录因子和参与盐胁迫相关过程的基因。Real-time quantitative PCR证实，敲低lncRNA973影响这些基因的表达。LncRNA973通过调控盐胁迫相关基因的表达来响应盐胁迫。这些结果加深了人们对棉花耐盐机理的认识，为耐盐鉴定和耐盐新品种的选育提供了新思路。gydF4y2Ba

植物材料、生长条件和胁迫处理gydF4y2Ba

在本研究中，栽培品种gydF4y2Bag .分子gydF4y2BaSN91-11是我们实验室选育的耐盐品种，目前在实验室保存。它的生理特性与之前的描述一致[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．陆地棉(gydF4y2Bag .分子gydF4y2Ba“SN91-11”)种子在泥炭和蛭石的混合物中发芽，温度为28℃。棉籽在28°C/22°C的光照/黑暗周期下生长，生长时间为16小时/8小时。转基因和WTgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用70%乙醇表面消毒5min, 2% NaClO表面消毒5min，然后用无菌ddH洗涤5次gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在1/2 Murashige-Skoog (MS)培养基上萌发。种子先在4°C暗处春化3d，然后在22°C、16 h /8 h光周期/暗周期的生长室中萌发。gydF4y2Ba

陆地棉' SN91-11 '植株在标准田间条件下生长。在组织/器官特异性表达谱分析中，取10 d龄幼苗的子叶、茎和根。棉花幼苗在第一片真叶展开后，进行了不同的非生物胁迫处理。棉花幼苗在添加250mm NaCl的霍格兰溶液中培养。在指定时间点(0、1、3、6、12、24 h)采集棉苗的根、茎、叶。将所有组织/器官置于液氮中冷冻，−80°C保存，直至提取总RNA。gydF4y2Ba

LncRNA973目标预测和注释gydF4y2Ba

根据lncrna的调控方式来预测其潜在的靶基因，其调控方式分为gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba代理。gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba调控不依赖于位置关系，而RNAplex [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]用于筛选gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba通过计算lncRNA973及其共同表达的蛋白编码基因的结合自由能，来确定目标基因(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。根据自由能和相关性筛选预测靶标，筛选标准Cor > 0.90。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR分析gydF4y2Ba

使用RNAprep Pure Plant Kit多糖&多酚富集(TIANGEN Biotech，北京，中国)从植物中提取总RNA进行qRT-PCR分析。使用NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)对RNA浓度进行定量。利用PrimeScript RT-qPCR试剂盒(TaKaRa，大连，中国)合成第一链cDNA，逆转录引物由随机引物和寡核苷酸dT混合而成，然后将该cDNA作为模板进行lncRNA和mrna qRT-PCR扩增。采用SYBR进行qRT-PCR反应gydF4y2Ba预混料Taq交货gydF4y2Ba(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)和Applied Biosystems™QuantStudio™6 Flex Real-Time PCR系统(ABI;Life Technologies Inc.， Burlington, ON, Canada)。反应采用两步法进行。第2步，95℃变性30 s, 95℃变性5 s, 60℃扩增30 s, 40个循环，终体积为20 μL，其中含2 μL的1/10稀释水和10 μL的2 × SYBRgydF4y2Ba预混料Taq交货gydF4y2Ba， 0.5 μM浓度的正向和反向引物gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.用于检测miRNA表达的试剂盒为Mir-X™miRNA First-Strand Synthesis和TB Green™gydF4y2Ba预混料的前女友gydF4y2BaTaq™II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)。根据成熟的miRNA序列设计miRNA特异性引物作为qRT-PCR的5’引物(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)， qRT-PCR的3 '引物为Mir-X™miRNA第一链合成试剂盒中提供的mRQ 3 '引物。实验步骤按照试剂盒说明书进行。所有反应在3个重复中进行，每个基因均纳入对照(无模板和无RT)。棉花gydF4y2BaUBQ7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba拟南芥Actin2gydF4y2Ba作为归一化器，基因的相对表达水平用2gydF4y2Ba^{——∆∆ctgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．用于qRT-PCR的引物对列在附加文件中gydF4y2Ba7gydF4y2BaS2:表。以上所有样本进行了3次重复，数据使用Student’s进行分析gydF4y2Bat -gydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

RNA原位杂交gydF4y2Ba

RNA原位杂交探针的设计如Duncan等人先前所述[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]，每个序列在棉花基因组中进行检测，以确定目标探针的特异性(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)。从10日龄的棉花幼苗中取根，放置于玻璃皿中，皿中含有用焦碳酸二乙酯(DEPC)(1:1:18福尔马林-冰醋酸-70%乙醇)制备的10 mL固定缓冲液，室温下固定2-12 h。gydF4y2Ba

固定后，用梯度酒精脱水组织，然后用蜡浸泡，包埋，切片。石蜡切片在62°C烘烤2小时，然后置于二甲苯和不同浓度的酒精中进行脱蜡。组织样品在37℃下用蛋白酶K (Servicebio, WuHan, China)消化，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) (Servicebio)洗涤3次，每次5分钟。加入杂交前溶液，37℃孵育1 h，然后在每个载玻片的杂交前溶液中加入终浓度为250 nM的杂交溶液100 μL, 37℃黑暗杂交过夜。早上用移液管取出含有未杂交探针的杂交溶液。杂交后，载玻片先用2 × SSC 37℃洗涤10 min，再用1 × SSC 37℃洗涤2次，每次洗涤5 min，最后用0.5 × SSC室温洗涤10 min。然后加入牛血清白蛋白(BSA)，室温孵育30分钟。最后，去除杂交溶液后，加入anti-DIG-488于载玻片中，37℃孵育50 min, PBS洗涤4次，每次5 min。将4 '，6-二氨基苯基吲哚(DAPI)染料溶液加入载玻片中，然后在黑暗中孵育8分钟。加入抗荧光猝灭封口片，洗净封口。gydF4y2Ba

采用自动切片扫描系统3D HISTECH进行成像。使用以下波长进行荧光检测:DAPI的激发为330-380 nm，信号检测为420 nm;对于DIG标记的探针，激发465-495 nm，检测信号为515-555 nm。使用CaseViewer (3DHISTECH的实现，一个公共领域程序，可在gydF4y2Bahttps://www.3dhistech.com/caseviewergydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

核质RNA的分离和提取gydF4y2Ba

从10日龄的棉花根尖上分离出细胞核和细胞质样品。首先制备根尖原生质体，然后用原生质体分离细胞核和细胞质。原生质体的制备和核质分离主要依据核质分离试剂盒说明书(Bestbio Biotech Inc.， Shanghai, China)。使用RNAprep Pure Plant Kit多糖&多酚-rich (TIANGEN)试剂盒分别从细胞核和细胞质中提取各自的RNA。参照上述qRT-PCR过程进行逆转录和RT-PCR。gydF4y2BaU6gydF4y2Ba和tRNA分别作为核和细胞质提取物的内对照。gydF4y2Ba

lncRNA973克隆，载体构建，遗传转化gydF4y2Ba

利用之前获得的转录序列，两个特定的引物(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)根据棉花叶片一致序列设计lncRNA973进行克隆扩增。cDNA文库采用PrimeScript™II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)，逆转录引物为dT寡核苷酸。利用这对引物，利用PrimeSTAR®HS DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR，获得全长lncRNA973。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，然后用溴化乙锭染色，使用TIANgel Midi纯化试剂盒(TIANGEN Biotech, Beijing, China)纯化，连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，并进行DNA测序确认。lncRNA973转录本序列插入到基因的下游gydF4y2Ba无论在哪里gydF4y2Ba启动子在重组二元载体pCAMBIA1300-GFP中使用gydF4y2BaKpngydF4y2Ba我和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba我限制位点。构造被转移到gydF4y2Ba农gydF4y2Ba菌株GV3101转化为WTgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba使用花浸法。在添加50 mg/L潮霉素的1/ 2ms培养基上选择转基因株系。获得独立的转基因株系，提取植物DNA，进行PCR扩增和鉴定转入这些转基因的lncRNA973序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物。选取3个T3纯合株系进行后续盐胁迫耐受试验。gydF4y2Ba

Stress-treated转基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

在NaCl处理中，种子在4°C黑暗条件下分层2d，然后镀在含有基础1/ 2ms培养基的培养皿上，分为对照和盐处理。盐处理浓度分别为100和150 mmol/L。将灭菌后的种子置于1/ 2ms培养皿中，在22°C、光/暗周期为16小时/8小时的培养箱中培养7天。每个重复约30-40株幼苗，每个处理3个重复。每天测定种子发芽率，连续7天。生长7天后，将幼苗转移到相应的对照和盐处理介质中，然后对每个样本进行图像采集。对初生根长、植株鲜重和子叶绿化进行评分。主根长度的测量采用Image J软件。用精密天平测量新鲜重量。gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默(VIGS)构建和盐处理gydF4y2Ba

质粒TRV2 (pYL156)和TRV1 (pYL192)购自长沙盈润生物科技有限公司。VIGS序列设计使用SGN VIGS工具(gydF4y2Bahttp://vigs.solgenomics.net/gydF4y2Ba)，采用T4 DNA连接克隆法克隆至TRV2载体。lncRNA973和的沉默片段长度gydF4y2BaGhCLA1gydF4y2Ba分别为490和465 bp。TRV-VIGS结构也被转化为gydF4y2Ba农gydF4y2Ba应变GV3101。然后，按照Gao等人的方法，将含有不同构建体的菌株GV3101渗透到10日龄棉花幼苗的子叶中。[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．TRV2:gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba（gydF4y2BaCLOROPLASTOS ALTERADOS 1gydF4y2Ba)为阳性对照，空载体TRV2:00为阴性对照。采用RT-PCR检测内源性基因表达的沉默。在VIGS实验中使用的所有引物列在附加文件中gydF4y2Ba7gydF4y2BaS2:表。gydF4y2Ba

感染后2周，转入阳性对照基因的植株出现白化叶片表型gydF4y2BaCLA1gydF4y2Ba．然后对携带TRV2:lncRNA973的棉花植株和阴性对照TRV2进行盐处理。当对照TRV2和转基因TRV2:lncRNA973植株长出6-7片叶片时，选择大小相近的植株，用相同体积的水或盐溶液(250 mM/L NaCl)连续灌溉。在处理过程中对植物进行观察和拍照。gydF4y2Ba

叶绿素、相对水分、Pro和MDA含量分析gydF4y2Ba

选取发育阶段相近的胁迫处理和正常对照植株叶片，测定叶绿素、相对水分、Pro和MDA含量。棉花的叶绿素含量gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba采用乙醇和丙酮提取法对田间叶片进行检测。将大约0.1 g的叶子(去掉主茎)放入玻璃试管中，加入10-20毫升乙醇和丙酮的混合物，在室温下在摇床中摇16小时。在分光光度计中测量叶绿素在645和663nm处的吸光度。叶绿素含量的计算公式为((8.05*A663 + 20.29*A645)) *V(提取体积)/(样品重量)*1000。gydF4y2Ba

相对含水量的测定方法如Wang等人所述[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．利用盐处理和对照植株相近发育阶段的叶片进行Pro含量测定。如前所述检测到Pro [gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．使用0-12 μg Pro标准溶液，在100℃下加热30 min，制备Pro标准曲线。冷却后加入4 mL甲苯，用紫外分光光度计测定有机相在520 nm处的吸光度。通过与标准曲线比较，确定各样品的Pro含量。gydF4y2Ba

MDA水平的测定采用先前描述的硫巴比妥酸法[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．以上所有样本进行了3次重复，数据使用Student’s进行分析gydF4y2Bat -gydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

POD、CAT、SOD活性测定gydF4y2Ba

选取相近发育阶段的盐处理和未处理的棉叶(~ 0.1 g)，检测ros相关酶活性。根据试剂盒说明书(苏州科敏生物技术有限公司，江苏，中国)测定POD、CAT和SOD活性水平。gydF4y2Ba

本文描述的RNA-seq序列数据已在NCBI发布，PRJNA416197。支持本文结论的基因组数据来自CottonFGD (gydF4y2Bahttps://cottonfgd.org/gydF4y2Ba)．本研究中产生的结果数据包括在本文及其附加文件中。gydF4y2Ba

BSA:gydF4y2Ba

牛血清白蛋白gydF4y2Ba

CLA1gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

CLOROPLASTOS ALTERADOS 1gydF4y2Ba

DAPI:gydF4y2Ba

4, 6-diamino-phenylindolegydF4y2Ba

DEPC:gydF4y2Ba

diethylpyrocarbonategydF4y2Ba

ELENA1:gydF4y2Ba

ELF18-INDUCED LONG-NONCODING RNA1)gydF4y2Ba

lncRNA:gydF4y2Ba

长非编码RNAgydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige-SkooggydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸缓冲盐gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SSC:gydF4y2Ba

盐水柠檬酸钠缓冲液gydF4y2Ba

中收取:gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

感谢作物生物学国家重点实验室的研究人员为我们的研究做出的贡献。我们亦感谢国际科学编辑(gydF4y2Bahttp://www.internationalscienceediting.comgydF4y2Ba)编辑这份手稿。gydF4y2Ba

本研究主要受到中国转基因育种重大专项(批准号:2016ZX08005-004)和国家重点研发计划(批准号:2018YFD0100303)的资助，为我们的研究提供了资金和平台，但资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、数据的分析和论文的撰写。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 山东农业大学农学院，作物生物学国家重点实验室;中华人民共和国山东省泰安市岱宗街61号邮编271018gydF4y2Ba

   张晓培，董杰，邓芬妮，王伟，程莹莹，宋丽蓉，胡梦姣，沈坚，徐清江，沈发福gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XZ、FD、FS构思设计了本研究;XZ、JD、YC、MH、JS、QX进行数据采集并进行功能分析;WW、FD、LS贡献分析工具;XZ和JD分析数据，准备数据，撰写稿件;XZ和FD负责稿件的修改;XZ和FS进行英文编辑。所有作者已阅读并批准稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaFafu沈gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理认可和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》对出版的地图和机构附属关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许不受限制地在任何媒体上使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域转让豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba