WheatCRISPR:基于网络的指导RNA设计工具，用于CRISPR/ cas9介导的小麦基因组编辑

背景

CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在不保留转基因成分的情况下实现快速有效的基因改变，已成为一项革命性的作物改良技术。目前，缺乏强大的生物信息学工具来促进高特异性功能引导rna (gRNAs)的设计和小麦脱靶位点的预测是阻碍CRISPR技术在小麦改良中的有效应用的一个障碍。

描述

我们开发了一个基于网络的生物信息学工具，用于设计小麦基因组编辑和基因表达转录调控的特异性grna。Broad研究所和微软研究院之间的一项合作研究使用大规模的经验证据来设计算法(Doech等人，2016,Nature Biotechnology 34,184 - 191)，用于预测CRISPR/的靶活性和脱靶潜力SpCas9 (酿脓链球菌Cas9)。我们应用这些预测模型来确定针对小麦基因组中特定位点的单个grna的靶特异性和潜在的脱靶活性。使用全基因组gRNA映射和相应的预测靶标和脱靶活动的Doench分数来创建gRNA数据库，该数据库用作web应用程序WheatCRISPR的数据源。

结论

WheatCRISPR工具允许研究人员浏览所有可能针对感兴趣的基因或序列的grna，并根据其预测的高靶标和低脱靶活性评分以及其他特征(如在靶基因中的位置)选择有效的grna。公众可在https://crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/．

基于细菌适应性免疫系统的基因组编辑技术，称为CRISPR (Clustered, Regularly Interspersed, Palindromic Repeats) / Cas9 (CRISPR相关内切酶9)[1，2，3.，4];)在生物和农业研究方面引发了一场新的革命[5，6]。CRISPR/Cas9技术起源于酿脓链球菌依赖于两个重要的组成部分，Cas9内切酶和由两个小RNA分子融合形成的单向导RNA (sgRNA)，即CRISPR RNA (crRNA)和辅助反式激活crRNA (tracrRNA)，它们共同引导Cas9核酸酶到达特定的DNA位点[7，8]。每个crRNA单元包含一个与靶位点互补的20 nt的引导序列，称为引导RNA (gRNA)。Cas9系统的另一个关键特征是位于DNA靶点3 '端的原间隔邻近基序(protospacer -邻序，PAM)，它决定了Cas9的靶标搜索机制[9]。PAM由三组碱基对组成，其标准序列为5 ' -NGG-3 '，其中“N”为任意核苷酸[9]。其他非规范的PAM三元组也被描述过，包括支持效率较低的CRISPR/Cas9功能的NAG、NCG和NGA [10，11]，因此可能导致偏离目标的活动。

尽管CRISPR/Cas9的应用有望加快作物改良的步伐和进程[5，6但是，目前存在许多障碍，限制了这项创新技术的充分利用，特别是在具有大多倍体基因组的作物上。小麦是一种经济上重要的谷类作物，为全球人口提供20%的卡路里和蛋白质摄入量。它拥有一个16 Gb的复杂的同种异体六倍体基因组，其中约有85%的重复元素，估计有107,921个高置信度和另外161,537个低置信度的注释基因[12]。由于每个基因存在多达6个同等位基因，且基因家族较大，因此脱靶gRNA的结合和裂解是影响CRISPR/Cas9技术在小麦中实施的最关键问题之一。gRNA是CRISPR/Cas9系统的重要组成部分，它决定了Cas9核酸酶的有效性和特异性。一个有效的gRNA应该具有高的靶活性和低的脱靶潜力。因此，合理设计和优化功能性gRNA序列对于实现预期基因组位置的最大有效性和最高靶向特异性至关重要。

已经开发了多种生物信息学工具来促进grna的设计和脱靶位点的预测[13，14，15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24];然而，其中只有两个项目，包括E-CRISP [17]和CRISPRdirect [19小麦grna的支持设计。CRISPRdirect基于特异性的计算机预测来预测特异性grna，但缺乏基于证据的指标来预测脱靶位点是一个值得注意的警告。E-CRISP通过将grna与Bowtie2对准基因组来识别脱靶位点。然而，Bowtie2并不能保证找到所有可能的匹配，特别是当不匹配的数量很高的时候[11]。这导致了对潜在脱靶部位的低估。博德研究所的科学家和微软研究院的机器学习专家之间的合作努力使用了大规模的经验证据，这些证据基于成千上万的gRNA针对15个基因的切割潜力，以揭示预测gRNA功效和特异性的位置特异性序列特征，包括单核苷酸和双核苷酸的位置和频率，gRNA的GC含量，gRNA在蛋白质编码区的位置以及gRNA的前5、中8和后5个碱基对的熔化温度[11，25]。这些大规模经验数据的发现被用于设计gRNA脱靶活性的新规则[规则集(rs) 2]和切割频率确定(CFD)评分来预测gRNA脱靶效应[11]，这可以广泛应用。在这项研究中，我们应用这些预测模型来确定针对小麦基因组中任何位点的单个gRNAs的靶特异性和潜在的脱靶活性，并设计了一个基于网络的生物信息学门户网站(WheatCRISPR)，用于设计高特异性gRNAs，用于CRISPR/ cas9介导的基因组编辑和基于CRISPR的中国春小麦基因表达转录调控。

gRNA数据库建设及内容

基于当前标注[12]，面包小麦基因组在编码区大约有3500万个规范的PAM位点，在整个基因组中有超过60亿个潜在的脱靶位点，包括基因间区和非规范的PAM位点(表1)1）.虽然应用Doench算法在概念上很简单，但在大型小麦基因组中大量的PAM位点使得预测脱靶活性的任务在计算上具有挑战性。在所有可能的靶上(规范编码和启动子)和靶外(所有)位点对上运行预测模型是一项艰巨的计算工作。

为了减少应用Doench CFD算法必须考虑的潜在脱靶点的数量，我们将搜索限制在最多脱靶点的位置k与目标站点不匹配。在搜索带有k错配比将Doench算法应用于每个可能的站点要快得多，但它仍然是计算密集型的。为了使该解决方案更易于处理，我们改变了的最大值k在基因组的不同区域，使有害的脱靶效应的可能性最小化。对于外显子和启动子区域(起始密码子上游2kb)的典型NGG PAM位点，我们搜索了多达k= 6。对于其他基因区域[即内含子和非翻译区(UTR)]，我们搜索到k= 4，对于基因间区域，我们搜索到k= 3（表格2）．对于非规范的PAM位点(NAG, NCG, NGA)，我们在k= 4,k= 3，且k= 2（表格2）．除了这些绝对的k每个区域的限制，如果发现至少20个脱靶匹配到给定的k不匹配的，我们没有继续搜索k+ 1不匹配。对1 M对on-target::off-target gRNA配对的测试表明，小麦基因组中具有活性的off-target位点很少k≥3（无花果。1），使分层k接近一个更有效的搜索机制为大的小麦基因组。

为了实现这一策略，我们从IWGSC v1.0小麦(中国春)基因组中所有可能的PAM位点提取了PAM和gRNA序列[12]，将输出分为规范和非规范站点。这些位点根据其基因组位置进一步分类:编码、启动子、其他基因(内含子和UTR)和基因间。将规范编码集和启动子集指定为靶上数据集，并对每个靶上gRNA序列应用rs2算法。然后针对所有8个数据集搜索每个靶上gRNA序列的off-byk不匹配，设置最大值k如表所示2．将Doench CFD算法应用于结果集的on-target::off-target映射。创建gRNA数据库所涉及的步骤如图所示。2．gRNA映射、Doench分数和序列在基因组中的位置被用作WheatCRISPR web应用程序的数据源。

效用与讨论

WheatCRISPR (https://crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/)提供了一个方便的界面来浏览gRNA数据库，并允许研究人员查看一组预测的gRNA靶向某个感兴趣的基因或序列，并根据其预测的靶上和脱靶活性以及gRNA在靶基因中的位置来选择它们。该应用程序以图形和表格的形式呈现汇总统计数据，从而加快了对感兴趣基因的最有效候选grna的快速发现(图2)。3.和附加文件1:表1)。默认情况下，显示得分最高的10个gRNA的详细信息，以便快速识别最有可能有效的候选gRNA序列。如果需要，一个交互界面允许用户浏览所有其他grna。

评估gRNA脱靶活动的关键汇总统计数据是gRNA的最大CFD评分，即单个最严重的脱靶命中。gRNA图(如图2所示)。3.a)和表(附加文件1表S1)给出了编码区、启动子区、其他基因区和基因间区四个基因组区域的rs2评分和最大CFD评分。这有助于通过基于导致编码区功能改变的意外活动的可能性来表征脱靶效应的潜在严重性，从而促进特定grna的选择。

WheatCRISPR通过计算每个gRNA的总体得分(奖励高rs2分数和惩罚高CFD分数)，帮助用户在高靶标活性和低脱靶活性之间找到权衡1:表1)。总分是rs2和最大CFD分数的加权平均值。如果用户希望针对该基因的所有同源拷贝，则可以打开或关闭该分数的可选变体。在这种变化中，同源物中较高的CFD分数会得到奖励，而非同源物中最大的CFD分数仍然会受到惩罚(图2)。3.b).同源物通过可在ensemblgenomes.org．总分用于对一个基因的所有grna进行排序，以便用户可以快速识别最可能的候选grna。总体评分函数不基于任何经验证据，因此它只是一个直观的估计，旨在帮助加速寻找有效grna的过程。在选择gRNA之前，强烈建议用户考虑个体rs2和CFD评分，以及其他因素，如gRNA在基因蛋白质编码区的位置。针对特定基因(默认模式)时使用的确切功能是:

0.5(平日)+ 1−(0.5 (0.7 (max (cfd_coding cfd_promoter)) + 0.2 (max (cfd_other_genic)) + 0.1 (max (cfd_intergenic))) 0.5(平日)+ 1 (0.5 (0.7 (max (cfd_coding cfd_promoter)) + 0.2 (max (cfd_other_genic)) + 0.1 (max (cfd_intergenic)))

当靶向同源物被启用时:

0.33(平日)+(1−(0.33 (0.7 (max (cfd_coding cfd_promoter)) + 0.2 (max (cfd_other_genic)) + 0.1 (max (cfd_intergenic))))) + 0.34(平均(cfd_hmlgs))

除了预测的靶标和脱靶活性指标外，grna在基因中的位置也很重要。通常需要从出现在一个基因的所有剪接异构体中的外显子中选择grna，以确保所有替代转录本都是靶向的。为了确定gRNA在基因中的位置，WheatCRISPR提供了一个基因组浏览器式的基因图，其中包含基因模型和所选gRNA的轨迹（无花果。3.）．

预先计算的目标到非目标映射提高了性能，但限制了目标位点的注释基因。为了搜索标注基因外的目标，WheatCRISPR还允许用户粘贴任意感兴趣的序列。在这种情况下，提取grna，并动态计算脱靶序列和分数。在这种模式下，由于性能原因，功能受到限制。最大不匹配数限制如表所示2，而瞄准一组同源物是不可能的。

为了验证WheatCRISPR预测gRNA功效的准确性，我们比较了文献中报道的gRNA子集的总体排名及其靶向效率(附加文件)2:表S2) [26，27，28，29]。据报道，成功靶向Q (spelled因子基因)、TaGW2(小麦籽粒宽度和重量2)、TaLpx1(小麦脂氧合酶1)、TaPDS1(小麦植物烯去饱和酶1)和INOX(肌醇加氧酶)的小麦gRNAs预计具有高的靶特异性和低的靶外活性(即。根据WheatCRISPR的总分，美国排名更高)。相反，编辑TaGW2、TaDEP1(小麦致密直立穗1)和TaPIN1(小麦穗形1)失败或不成功的grna排名较低(附加文件)2表2)。我们还证实了一些靶向小麦基因的grna的功能，如TaPDS（无花果。4）及puroindoline A [30.]，使用体外核酸酶测定法。这些实例验证了WheatCRISPR预测的准确性，并展示了其在小麦基因组编辑应用中的实用性。

作为依赖自然或诱导诱变的一种优雅的替代方案，基于CRISPR/ cas9的基因编辑技术有可能改变作物育种的速度和进程。为了促进这项创新技术在小麦中的应用，我们开发了一个强大的基于网络的生物信息学工具(WheatCRISPR)，可以为用户指定的靶基因或序列选择特定的grna，并预测潜在的脱靶位点。目前WheatCRISPR的实施支持grna的选择来指导链球菌Cas9在小麦基因组中的位置。已报道的Cas9变异，如StCas9 (乳酸链球菌Cas9)、NmCas9 (奈瑟氏菌属meningitidesCas9)、SaCas9 (金黄色葡萄球菌Cas9)和FnCpf1 (弗朗西斯氏菌属novicidarna引导的内切酶是非常可取的。然而，Doench算法对SpCas9 PAM位点特异性的经验数据(gRNA有效性和特异性)的依赖限制了WheatCRISPR对其他Cas9变体PAM位点的扩展。此外，在小麦中，由于多倍体、重复DNA含量高以及通常作为多基因家族成员存在的基因具有高水平的序列同一性，将有一些基因很难找到独特的grna。在这种情况下，用户可能不得不考虑其他策略(例如，双grna)来提高靶向特异性。

WheatCRISPR web应用程序可在https://crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/．

研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章[及其补充信息文件]中。

Cas9:

CRISPR-associated核酸内切酶

CFD:

切割频率测定

CRISPR:

群集的，有规则地穿插的，回文重复的

crRNA:

CRISPR RNA

gRNA:

指导RNA

帕姆:

Protospacer-Adjacent主题

平日:

规则集2

tracrRNA:

trans-activating crRNA

UTR:

翻译区

我们要感谢丹·图尔潘博士对手稿的批判性阅读。

这项研究得到了加拿大小麦改良旗舰项目——加拿大国家研究委员会的支持。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 加拿大国家研究委员会，110体育馆广场，萨斯卡通，SK, s7n0w9，加拿大

   Dustin Cram, Manoj Kulkarni, Nandhakishore Rajagopalan, Pankaj Bhowmik, Andrew G. Sharpe和Sateesh Kagale

2. 加拿大农业和农业食品，107科学广场，萨斯卡通，SK, S7N 0X2，加拿大

   Miles Buchwaldt, Kevin Rozwadowski和Isobel A. P. Parkin

3. 萨斯喀彻温大学全球粮食安全研究所，加拿大萨斯卡通体育馆广场110号，SK, s7n4j8

   安德鲁·g·夏普

贡献

SK公司构思了这项研究。SK和AGS协调研究。DC设计并实现了WheatCRISPR应用程序。MK和PB提供了技术和数据分析支持。KR提供了载体和报告结构。MB和IAPP为基于blast的gRNA设计工具的开发做出了贡献。NR进行体外核酸酶测定以验证gRNA。SK, MK和DC撰写了手稿。所有作者都编辑了手稿并批准了最终版本。

相应的作者

对应到Sateesh Kagale．

伦理批准并同意参与

这项研究不需要伦理批准和同意，因为它不涉及人类受试者、材料或数据。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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