木薯对粉虱抗性自然变异的代谢组学特征

背景

木薯粉虱疫情最初报告发生在东非和中非的木薯(木薯耐目前已扩散到其他地理位置，成为一种严重影响农民和小农收入的全球性害虫。白蝇通过喂养和传播木薯花叶病毒和褐条病毒影响植物产量，使木薯根不适合食用或交易。抗病毒品种的部署对白蝇种群影响不大，因此开发抗白蝇品种也是害虫综合管理战略的必要组成部分。白粉虱抗性的合适来源存在于种质收集中，需要进一步鉴定以促进和协助育种计划。

结果

在目前的工作中，通过比较两种自然发生的木薯，一种对粉虱敏感，一种对粉虱抗性，采用分层代谢组学方法来研究与粉虱抗性相关的潜在生化机制。在侵染前阶段检测到的基因型之间的数量差异在整个白蝇侵染过程中的每个时间点都一致地观察到。这种普遍的差异特征表明，固有的基因型差异覆盖了白蝇存在引起的反应，它们与观察到的表型直接相关。与粉虱敏感性相关的最显著的定量变化与苯丙素超途径及其相关的亚途径有关:单脂醇、类黄酮和木脂素生物合成。这些发现表明，在易感品种中，木质素化过程不太活跃，因为易感植株沉积的木质素较少，并积累了单素中间体及其衍生物，这种差异在侵染的时间过程中保持不变。

结论

与木薯白蝇抗性相关的抗性机制是一种基于细胞壁增强的抗白蝇策略。抗性和易感材料在生化水平上对粉虱的反应不同，但内在的代谢差异与抗性表型直接相关，而不是植物的诱导反应。

木薯(木薯耐是一种原产于南美洲的木本灌木，最初在亚马逊盆地被驯化。木薯在16世纪首次被引入非洲，在那里它演变成一种主食来源，并在18世纪和19世纪在热带地区广泛分布。1]。几个关键特性促使木薯成为这些地区的食物来源;它们包括它能在土壤参数差的边缘土地上生长，其淀粉含量高，提供膳食热值。然而，根制品中的微量营养素含量很低[2]，这导致了生物强化计划的发展，以减轻发展中国家的微量营养素缺乏[3.]。

全世界有8亿多人以木薯根为主食[4]。2017年世界产量估计超过2.9亿吨(FAOSTAT，http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC/visualize)．非洲和中南美洲的生产主要面向人类消费食品，而不断增长的亚洲市场主导了木薯的出口，用于淀粉和生物燃料等工业用途。

最近，很明显，驯化的种质资源不足以应对新出现的非生物和生物压力，这些压力已被证明是小农木薯生产的主要威胁。例如，非洲木薯花叶病毒(ACMV)和木薯褐条病毒(CBSV)家族是所描述的最主要的破坏性病原体[5]。ACMV要么通过受感染的插枝传播，要么通过其载体白蝇传播烟．像20世纪90年代中期那样，严重的ACMV爆发导致肯尼亚和乌干达部分地区的作物全部损失，印度和斯里兰卡的损失高达90% [4]。最近，在柬埔寨考姆首次报道了斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)的存在[6]。今天，柬埔寨和越南的大部分木薯产区显示出这种疾病的高发，可能是由白蝇传播的;可能使其生产在该地区不可持续。

尽管有几项作物管理建议，但在这些敏感地区，白粉虱和相关病毒的大量暴发仍经常发生。解决粉虱侵染作为作物浪费原因的一种方法是通过开发对粉虱具有抗性或耐受性的木薯品种。社会对转基因技术的关注意味着利用自然变异对作物的投入和产出性状的改良计划至关重要。在国际热带农业中心(CIAT)和国际热带农业研究所(IITA)保存的种质资料中已经确定了白粉虱抗性的天然来源，包括野生近缘种和地方品种[7，8，9，10]。CIAT的加入表明，ECU72对南美白蝇具有一贯的抵抗力Aleurotrachelus socialis最近还发现了非洲粉虱烟粉虱因为它显示产卵率和成虫偏好降低，若虫死亡率更高。在白蝇感染时，ECU72也表现出较低的损害分数，这表明它对生物应激具有耐受性[11]。据报道，CIAT基因库中的其他地方品种也显示出对白蝇的耐受性和/或抗性[8，10]。

迄今为止，这些基因如何在分子和生化水平上赋予对粉虱侵害的耐受性和/或抗性有待阐明。这些知识的进步对于增加现有和未来的木薯育种计划至关重要，这些计划旨在开发生物抗性品种。目前可用于木薯的遗传资源极大地推动了对ACMV和CBSV或两者都具有抗性的品种的开发研究，例如基因组选择和标记辅助选择[12]。与此同时，转基因方法也产生了抗病毒的植物，但在田间的部署还有待监管部门的批准。然而，粉虱的媒介作用很少受到重视，对昆虫生物学的了解以及抗性品系的鉴定和发展的研究直到最近才开始(www.cassavawhitefly.org)．与西方社会消费的经济作物相比，遗传资源和工具是木薯育种的限制因素。尽管木薯基因组学取得了显著进展[13，14]，互补性的“基因组学”技术在协助木薯作物改良项目中仍然没有得到很好的利用。在本研究中，通过比较抗性品种(ECU72)和敏感品种(COL2246)，利用代谢组学方法研究了木薯对粉虱的抗性/耐受性机制。研究结果对在撒哈拉以南非洲实施抗粉虱木薯品种的育种前材料的合理开发进行了讨论。

抗性和易感木薯叶物质的产生Aleurotrachelus socialis

为了应用我们的调查比较代谢组学方法，生成了未侵染和侵染的木薯叶片材料。木薯植株生长到发育阶段，其中前五个小叶展开。采集5个生物重复的前2个展开叶片，分别代表时间点0 (T0)，并在侵染后12 h、24 h、7 d、14 d和22 d采集COL2246和ECU72独立暴露的叶片答:socialis殖民地。两个品种暴露于相同种群大小的成年粉虱。在本工作中进行的侵染试验致力于评估两种基因型的易感性或抗性，作为减少感染能力的手段。将耐受性评价为产量损失或植物适合度不在本研究范围内。与COL2246相比，ECU72在叶片上沉积的卵数量显著减少(附加文件)1:图S1)验证其抗性表型。在没有粉虱的情况下，平行进行补充实验。为了排除粉虱代谢物污染和对叶片发育的影响，收集了未被粉虱侵染的叶片作为模拟虫害防治。然后使用LC-MS和GC-MS代谢物分析方法制备该材料进行比较代谢组学。抽样方法的说明性表示在图中提供。1．

木薯叶的代谢组

根据代谢组学标准倡议，使用基于非靶向方法的互补LC-MS和GC-MS代谢物分析，能够对184种成分和28种4级未知成分进行明确的结构表征[15[附加文件2:表1)。包含注释和表征代谢物的数据矩阵被用作目标数据集。COL2246和ECU72中以T0(侵染前)为特征的化合物也存在于多个侵染时间点，并且没有在侵染叶片中检测到额外的代谢物被包括在目标数据集中，以防止对数据的模糊解释，因为它们可能来自粉虱代谢组。LC-MS表征的化合物包括一系列次级代谢产物，主要是苯丙素和类黄酮，以及某些与初级代谢相关的化合物，如氨基酸、单糖和双糖。苯丙素，包括羟基肉桂酸的酯衍生物，以及相关的单脂醇和低聚脂醇[16，17很明显。化学变化也扩展到其他类别的化合物，包括氰苷、羟基苯甲酸酯和糖基化类伪胡萝卜素(附加文件)2:表1)。极性提取物的GC-MS分析有助于对中间/初级代谢成分的注释。例如，TCA循环和糖酵解的组分、单糖和双糖、醇和酸糖、氨基酸和多胺。通过气相色谱法分析非极性提取物，可以检测到游离或糖基化形式的三萜、生育酚、脂肪酸或烷烃。

暴露于木薯代谢组变化的鉴定答:socialis

LC-MS非靶向分析揭示了9287种化学特征(附加文件)3.:表S2)，主成分分析(PCA)显示了基因型的分离，无论侵染与否或侵染持续时间如何。在本例中，分量1和分量2的得分图(图2)。2a)解释了18.88%的变异性，其中基因型沿PC1轴(18.8%变异性)和PC2轴(0.098%变异性)分离。基于212个特征的靶向分析方法能够对代谢重要部门的关键代谢物进行更稳健的量化和表征。当纳入PCA时，揭示了类似的基因型聚类模式(图2)。2b) PC1和PC2分别解释了变异的32.5%和13.9%。对GC-MS数据执行PCA也得到了类似的结果(附加文件)4:图S2及5:图S3)。总的来说，非靶向分析结合靶向代谢物谱揭示了COL2246和ECU72代谢组的明显化学差异，无论侵染处理及其进展如何。高置信度的代谢物特征也有助于数据挖掘两种基因型之间的关键生化分化因子，叶片发育和对叶绿素的响应答:socialis侵扰。

区分易感和抗性基因型之间的化学特征

苯丙素的变化

在侵染周期的每个时间点对两种基因型进行两两比较，发现代谢物组成的数量差异如下:p莽草酸、奎宁酸和苹果酸的香豆酰酯显著积累(p< 0.05)，以及咖啡酸和阿魏酸的苹果酸酯(图2)。3.;额外的文件2:表1)。黄酮醇的糖基化形式山奈酚和槲皮素发生在两个基因型。而戊糖衍生物在COL2246中优先积累，己糖衍生物在ECU72中优先积累。黄烷-3-醇表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其相应的二聚体EGC-EGCG在易感基因型COL2246中的丰度显著高于抗性基因型ECU72。此外，合并到这些分子中的三羟基苯甲酸没食子酸在COL2246中也具有更高的丰度。另一个在敏感品种中表现出较高水平的化合物家族被确定为氰苷prunasin和lotoaustralin的戊苷衍生物，其腈(非活性)形式。低聚寡脂G(t8 - 0 - 4) s (8-5) g [18木脂素、松木醇脱氧己糖苷和两种未鉴定成分在COL2246中也始终较高。从质谱上可以推断出这两个未知化合物与木脂素有关。例如，保留时间为13.9 min, m/z值为533.2062的未知特征生成化学式C27H34O11(附加文件)6(表S3)，分别在化学数据库Chemspider和ChEBI上检索到75次和3次命中。从Chemspider检索到的75个条目中有20个与木脂素arctiin相匹配，75个条目中有17个与木脂素phyllirin(或连素)相匹配，这是一种8,8 '偶联的木脂素，类似于lariciresinol，也以糖基化形式积累在COL2246中。同样，一种未知化合物在10.5 min时的准确m/z值为889.2034 (UNK-889.2034-10.5 min)，在COL2246的感染叶片中显示出与本研究中检测到的低聚脂醇和推测的木脂素相似的积累曲线，表明它可能是一种结构相关的分子(图2)。3.;额外的文件6表S3)。

相比之下，抗性品种ECU72在咖啡酸、阿魏酸、新木质素脱氢二花叶醇(DDC)和异脱氢二花叶醇(IDDC)以及黄酮类化合物tricin和山奈酚等一系列化合物中显示出明显更高的己糖苷衍生物水平。此外，在ECU72中还观察到一些未知的代谢物，根据它们的精确质量，这些代谢物可能代表(新)木脂素/低聚木质素(图2)。3.;额外的文件6表S3)。

某些化合物在COL2246中的差异积累在整个白蝇侵染周期中是明显的，并且在侵染前阶段(0 dpi)就已经存在。例如，香马甲酰奎酸酯和苹果酸酯、低聚油醇G(t8-O-4) S(8-5)G、木脂素松木醇脱氧己糖苷、推测值UNK-533.2062-13.9 min和UNK-889.2034-10.5 min在COL2246侵染前和侵染期间COL2246敏感叶片中黄酮类槲皮素戊苷和异鼠李素-3- o -芦丁苷含量均高于4倍(另附文件)2:表1)。山奈酚的戊糖衍生物在侵染0.5 dpi以后的时间过程中也始终较高(附加文件)2COL2246在侵染后期(≥7 dpi)，表没食子儿茶素和没食子酸的积累也显著增加。在抗性基因型ECU72中，与敏感的COL2246相比，黄酮类和木脂素的己糖衍生物在时间过程实验的早期阶段(即< 7 dpi)显着增加，而苯丙素类咖啡因和阿铁酰己糖在22 dpi时也显着增加(图2)。3.;额外的文件2:表1)。

白蝇感染后不同基因型甾醇组成和含量的差异

尽管苯丙素含量基因型之间的差异是代谢组最重要的比较特征(图2)。3.)，固醇、三萜和蜡质成分(长链烷烃)水平的变化也很明显，正如它们各自的生物合成途径所显示的那样(图2)。4)．这些基因型之间的显著差异发生在侵染的早期阶段(< 7 dpi)或在接触白蝇(0 dpi)之前就已经存在。两种未鉴定的化合物_np-st_Ketosterol_39.736 min and UNK_np-st_32.516 min是例外，在侵染后22 d，它们在COL2246中的丰度分别显著升高。

长链醇六醇和三康醇以及甾醇环蒿烯醇、阿芬那甾醇和豆甾醇在抗性品种ECU72早期优先积累。在敏感品种COL2246中，一组未鉴定的甾体苷具有相似的积累模式，而三萜类α-amyrin和luppeol以及未知的甾醇和萜类代谢产物的丰度显著较高。

在本工作中进行的实验中，有很大一部分甾醇分子不能被分解。从它们的EI (GC-MS)光谱可以清楚地看出它们以糖基化形式存在，但关于木薯中这类化合物鉴定的文献很少[19，20.]。因此，需要对这类特殊化合物进行详细的表征，以进一步阐明它们的结构，但这不是本研究的范围。

中间代谢的差异

主要与碳水化合物代谢有关的初级代谢成分发生了细微的变化。敏感品种COL2246的单糖葡萄糖、果糖和葡萄糖醛酸、正戊糖葡糖糖和双糖纤维素糖含量较高。COL2246中三羧酸循环(TCA循环)组分的丰度也较高(附加文件)2:表S1，图4)，而抗病品种ECU72则显示出较高的苏氨酸、半乳糖醇、柠檬酸和氨基酸苏氨酸含量(图2)。4)．

木薯代谢组的时间变异答:socialis侵扰

对COL2246和ECU72的时程实验分别进行方差分析(附加文件)7，8表4、表5)。那些代谢产物显示出显著(p< 0.05)的变化在多个统计事后检验中选择进一步讨论。

方差分析结果总结在图中。5a揭示了56种代谢物随时间在ECU72中发生显著变化。同样，COL2246中22种代谢物随侵染进展而变化，其中16种与ECU72相同。

这16种代谢物的核心组随时间的变化以热图的形式显示(图2)。5b)当比较COL2246和ECU72基因型时，至少可以观察到五种不同的模式。紫丁香素及其异构体定义的第一个聚类表明，侵染期间两种基因型的水平和时间变化相似。聚类2和聚类3被定义为在两个品种中相互积累的代谢物，即分别优先在COL2246或ECU72中积累。这两组代谢物通常随时间呈现相似的变化，有细微的例外(附加文件9:图S4)。例如，在集群2中，在1和7 dpi时，COL2246中黄酮醇异鼠李苷-3- o -芦丁苷含量增加，而在ECU72中含量减少;第3簇的UNK-7.1 min-471.111在敏感品种COL2246中呈下降趋势，从0.5 ~ 14 dpi下降，而在抗性品种ECU72中随时间增加。二、三羟基苯甲酸原儿茶酰己糖和没食子酰己糖以及黄酮醇甲基山酚己糖构成了代谢产物簇4，在两种基因型中具有相似的水平，但在14 dpi时积累量不同。同样，最后一个聚类代表代谢物在敏感品种COL2246中持续积累，并随着侵染的进展逐渐增加，除了在7 dpi时，敏感品种的代谢物急剧增加，然后在下一个时间点下降。这个亚群的代谢物包括类伪胡萝卜素、苹果酸阿魏酰和黄酮醇三糖(8.9 min-755.2034)。其中一些代谢物的时间变化与没有粉虱侵染的叶片发育过程中观察到的变化相匹配，这表明它们可能与叶片发育的进展有关，而不是对侵染的反应9:图S4)。例如紫丁香苷，黄酮醇异鼠李素-3- o -芦丁苷和槲皮素戊苷，以及簇3中的未知化合物，即UNK-7.1 min-471.111和UNK-17.4 min-664.262。

基于LC-MS靶向矩阵的侵染时间点树形图分类在COL2246和COL2246中区分出三个聚类(图2)。6a)和ECU72(图2)。7A)但集群内时间点分布不同。易感品种COL2246侵染早期(0 ~ 24 hpi)和后期(14 ~ 22 dpi)分别分为聚类1和聚类3,7 dpi时间点位于聚类2。然而，在抗性品种ECU72中，侵染前时间点0 dpi本身构成一个集群，侵染后早期(12-24 hpi)和后期(7-22 dpi)形成两个不同的群体(图2)。7a)。易感品种COL2246的早期和晚期侵染事件的区别也明显体现在该基因型特有的代谢变化中(图2)。6b).只在COL2246中发生变化的6种代谢物被排列在两个簇中，显示出时间的相互变化。丙烯腈非活性形式的氰苷、紫草苷和UNK-1.3 min-488.163随着侵染的进展呈增加趋势，这些化合物在侵染后期达到最高浓度。第2类代谢物则相反。其中，活性形态的枇杷苷、化合物泛酸和推测的木脂素-13.9-533.2062在侵染前丰度很高，随着时间的推移丰度迅速下降。

图中显示了40种代谢物在ECU72中独特变化的聚类和不同水平。7b.至少有5个集群表现出不同的时间变化模式。第一簇是唯一呈阳性趋势的，即代谢物水平随时间的增加而增加，而其余4簇在侵染期间呈下降趋势。聚类2和聚类4在时间过程中呈现出不同的波动模式。聚类2的浓度在侵染前最高，随着侵染的进展迅速下降，但在侵染后1和14 d达到峰值。聚类3的特征是，从侵染前到1 dpi浓度增加，然后在随后的时间点迅速下降。除聚类5的代谢物在14 dpi时急剧增加外，聚类4和聚类5的代谢物在早期侵染时间点保持较高水平，直至1 dpi，然后随着时间的推移逐渐减少。

层次代谢组学作为评估复杂自然变异的手段

使用的非靶向代谢组学方法创建了两种基因型木薯代谢组的强大化学指纹图谱。总体方差有利于基因型的分离，从而确定化学分化因子。更有针对性的代谢物分析使我们能够在我们的成分中纳入更强的稳健性，并为感兴趣的关键代谢物分配化学鉴定。这些方法也可以提供信息，以评估遗传阻力引起的未来渗入供体种质时，金字塔性状。

总的来说，这些数据代表了迄今为止对木薯最全面的研究之一。通过使用分层代谢组学方法，该研究在广泛的动态范围内以高置信度表征了木薯中200多种代谢物，并代表了代谢的关键部门。已经创建了一个初始的生化网络，可以与未来的互补组学数据集集成，例如转录组学，以创建潜在的相关网络。这种方法将使抗病和易感品种之间的系统水平比较成为可能;潜在地揭示健壮的代谢物和分子标记感兴趣的性状。

赋予粉虱抗性的潜在生化机制

存在许多突变体/转基因植物的例子，它们在单脂素生物合成途径中间体的丰度上发生了改变[21，22，23，24，25]，在某种程度上让人联想到在COL2246和ECU72之间观察到的代谢差异。羟基肉桂酸的苹果酸酯、喹酸酯和shikimate酯水平升高意味着什么p-香豆酸，咖啡酸和阿魏酸的易感品种?主要的假设是基于木质化的改变，基于在易受影响的木薯中单酚生物合成途径的最后步骤中较低的活性。这可能导致单素前体转化为辅酶a -硫酯形式，并通过羟基肉桂酰转移酶(HCT)迅速转化为各自的苹果酸酯、quinate或shikimate酯，羟基肉桂酰转移酶能够将shikimate、quinate和苹果酸酯转化为羟基肉桂酰辅酶a酯，反之亦然[26，27，28]。例如，阿魏酰苹果酸在ccr的1-敲除突变体拟南芥［22]以牺牲苹果酸新萘酰基为代价，阿魏酰和苹果酸新萘酰基酯及其糖苷前体的过度积累发生在答:芥木质素调节复合物的突变体[j]29]。尽管如此，阿魏酰苹果酸很可能也可以通过阿魏酰葡萄糖苷的酯交换反应合成，而不涉及辅酶a酯中间体，就像苹果酸辛纳福酰生物合成一样[22，30.]。这也可以解释这些阿魏酸衍生物在ECU72和COL2246中的不同积累。木质素分析的补充实验加强了目前的假设，因为抗性品种ECU72的叶片中木质素含量较高(附加文件)10表6)。此外，阿魏酸和p-香豆酸在细胞壁提取物(附加文件10:表S6)对细胞壁特性的影响[31]可能与生物力学防御直接相关，正如在其他物种中观察到的那样[32]。

酶产物对其各自的生物合成酶的抑制/激活是众所周知的酶活性调节机制。例如，苯丙氨酸解铵酶(PAL)是苯丙类生物合成的第一个承诺酶，它的产物肉桂酸会抑制它[33]。以类似的方式，木质素的缺乏可能会重新激活苯丙素途径的初始步骤，以产生更多的单脂醇。这一假设也被其他研究杨树和杨树的作者提出拟南芥CCR-下调的植物朋友转录水平升高[23，25]。在我们的案例中，这种反馈很明显，在敏感品种COL2246中，苯丙氨酸衍生的化合物总量明显更高(高达1.8倍)(附加文件)11:表S7和附加文件12:图5)。与抗性品种ECU72相比，该基因型的羟基肉桂酸、类黄酮和氰苷含量增加，其中一些含量在整个侵染过程中一直很高。各基因型中各化学类化合物的相对比例保持不变。

令人惊讶的是，羟基肉桂酸的己糖衍生物(可能是葡萄糖)和某些类黄酮在抗性品种ECU72中含量更高。传统上，糖苷被认为是代谢物的储存和运输形式，尽管不同的糖基转移酶和膜转运蛋白的作用仍然存在争议，但很明显，这些化合物参与了单脂醇代谢和定位的稳态[34]。

虽然尚未对碳水化合物进行详细深入的分析，但GC-MS谱显示，敏感品种COL2246中纤维素二糖含量较高。纤维素二糖是葡萄糖的二聚体，是纤维素的一个组成部分。突变体的CCR拟南芥中木质素含量下降，但碳水化合物含量无显著变化[35]。

考虑到所有这些结果，再加上PCA分析显示了基因型之间的主要差异，而不是在给定基因型内的侵染时间点之间的差异，我们提出ECU72的抗性策略是基于一种与维管组织木质素化细胞壁增强相关的抗虫机制，该机制可以防止白蝇取食ECU72的叶子。前人对温室粉虱取食行为的研究(Trialeurodes vaporariorum)对寄主的识别表明，这种以韧皮部为食的昆虫通过反复注入其柱头来探索叶片的机械抗性。这种进食前的行为使苍蝇能够评估树叶的硬度/韧性，并评估获取营养的可能性[36]。易感品种产卵率与取食行为呈正相关。其他作物抗虫机理的文章也强调了抗虫强化细胞壁作为预防粉虱或蚜虫侵害的策略。

基因型对粉虱侵扰的反应不同

木薯品种COL2246和ECU72在代谢水平上对粉虱侵染有不同的反应。时间点的树形图分类证明了这些差异，这些差异在PCA评分图上也很明显。在侵染前的ECU72总是聚集在远离侵染后时间点的地方，而在易感品种COL2246中，侵染前和0.5和1 dpi的早期阶段往往聚集在一起(图2)。2，6一个和7a). ECU72的这种反应模式可能与一种启动机制有关，该机制可迅速触发对粉虱的反应[37，38，39]。

对时间序列的分析确定了那些随时间变化的代谢物，这些代谢物可能与生物应激反应有关。尽管52种代谢物随时间发生显著变化，但只有16种基因型与两种基因型共享，6种在COL2246中完全改变，而在ECU72中有40种代谢物的变化与侵染时间有关。易感品种代谢物的时间变化呈典型的正负线性趋势，即随着侵染的进展代谢物逐渐增加和减少。例如，随着时间的推移，原氰苷lotaustralin随着其腈副产物的增加而减少，这与木薯中众所周知的毒性机制相对应[40，41]。然而，在抗性品种ECU72中，代谢物随着时间的显著变化似乎遵循更复杂的模式，化合物亚群在感染的某些时间点呈现丰度突然上升或下降，这可能与与不同白蝇发育阶段存在相关的生化事件有关。例如，黄酮类化合物苹果酸酯和醌酸酯p-香豆酸在图2和5簇。7B在14 dpi时表现出快速增长，可能是由新兴若虫的摄食活动引发的。

对木薯抗粉虱育种的启示

有许多策略来培育精英种质，以解决新兴的社会和环境问题。然而，标记辅助选择(MAS)仍然是目前私人植物育种行业使用的最合理或最主要的方法。

虽然在更精细的性状育种中，可以使用更密切相关的材料作为供体，以最大限度地发挥加性效应或杂种优势，但自然变异的必要性是至关重要的。在本研究中，我们利用拉丁美洲种质资源中存在的自然多样性来研究木薯的白蝇抗性/耐受性[8，10，42]。同时，还发现了一种易感和抗性菌株。现在，这些可能代表了具有良好特征的亲本材料，可以从这些亲本材料中制备分离种群，最终形成固定的标记，确定可用于培育抗白蝇性状的区域。在本例中，已鉴定出若干不同的代谢物以提供特定的化学特征。这些特征有可能作为数量性状标记。这些特征的稳健性现在可以在不同的环境条件下或在不同的背景下进行测试，这些背景可以赋予上位效应。此外，与抗性相关的代谢物可以作为预育种群体构建过程中的预测标记，在预育种群体中，由于基因剂量不足，表型参数可能不明显。

本研究利用代谢组学对一种南美衍生的木薯品种进行了表征，该品种与地理上相关的易感品种相比，对粉虱侵扰具有抗性。我们的代谢组学分级方法在存在和不存在侵染的情况下有效地快速捕获区分抗性化学型的分子特征。然后使用代谢物谱分析来确认表征抗性品种的代谢物池的变化。在整个白蝇侵染过程中以及侵染前，均检测到抗性和易感种质ECU72和COL2246的代谢物谱差异。因此，我们得出结论，在木薯品种ECU72中观察到的抗白蝇表型与基于细胞壁强化的抗白蝇策略有关。这一假设是基于区分这两个品种的最重要的化学特征，即单脂醇生物合成中间体的衍生物，在易感品种中优先积累，而在抗性品种中木质素的沉积较高。此外，还确定了在粉虱侵染期间，敏感和抗性植株的代谢组反应存在差异;不同物种对虫害的反应是不同的。

这些发现为与抗性表型相关的潜在生化机制提供了有价值的见解;同时为未来的育种计划提供有特色的亲本材料，旨在使发展中国家的主要作物具有抗粉虱的能力。

植物材料

在CIAT木薯遗传项目的组织培养实验室里，每一种木薯的幼苗木薯耐将CIAT基因库收集的(Crantz)基因型COL2246(白蛉敏感检测)和ECU72(白蛉抗性检测)进行体外扩增。离体培养植株8-10周龄，用砂与黑土比例为3:1的无菌土壤(无粘土表土)盆栽，在30℃、50-60%相对湿度的温室中保存[8]。CIAT的基因库在《粮食和农业植物遗传资源国际条约》(ITPGRFA)框架内运作(http://www.fao.org/plant-treaty/overview/en/)．与基因型、特征和鉴定的原始来源相关的信息存储在CIAT的基因库中，并在本手稿中作为附加文件15:表S10提供。

使用虫害生物测定法Aleurotrachelus socialis(Bondar)

的答:socialis用木薯基因型培养菌落木薯耐var. COL1468作为主机[8]。

采用完全随机设计的非选择试验对木薯基因型ECU72(抗白蝇)和COL2246(易受白蝇感染)[8，10]。将每株植物放入单独的圆柱形(1 m高× 30 cm直径)网箱中，分别放入雄性和雌性成虫各100只答:socialis被放进每个笼子里。成虫产卵72小时后，将植株移到没有粉虱的温室中，以使粉虱的生命周期继续进行。每个基因型和时间点使用5株植物，进行3次独立侵染试验，即3次生物重复。在侵染后0小时(T0)、12 hpi (T1)、24 hpi (T2)、7 d (T3)、14 dpi (T4)和22 dpi (T5)各时间点采集所有植物携带卵或若虫的侵染整叶。在显微镜下对采集到的叶子中的白蝇进行计数，然后立即将叶子快速冷冻在液氮中，并在- 80°C保存至冻干。

代谢物提取

冻干后的物料用组织破坏剂TissueRuptor (Qiagen)磨成细粉，提取代谢物用10毫克的分液。在50%甲醇中提取(室温，摇晃1小时)，然后加入1体积氯仿。离心后分别从甲醇期和有机期收集极性代谢物和非极性代谢物。极性和非极性提取物在分析前分别用0.45 μm尼龙膜和0.2 μm PTFE膜过滤。每个样品共取10 mg制备质控样品，每个样品在不同的分析平台上进行3个技术重复。每25个分析运行包括一个质量控制样品和一个萃取空白(空管)。

LC-MS代谢物分析

极性提取物的LC-MS分析采用MAXIS UHR-Q-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)和电喷雾离子源(ESI)在负模式下进行。离子源条件为:干气8l /min，毛细管3500 V，端板- 500 V，汽化温度195℃，雾化器1.3 Bar。质谱记录在全扫描模式下，从100到1200 m/z范围。在MS/MS模式下进行了单独的一批分析，以方便化学特征碎片化和结构表征。因此，在每个循环中，超过1000个计数强度阈值的最多4个离子被选择以数据依赖的方式通过碰撞诱导解离(CID)进行碎片化。在质谱检测前，使用配备PDA检测器(Dionex Softron)的UHPLC UltiMate 3000对代谢物进行分离。色谱柱为YMC-UltraHTPro C18 2 μm (100 × 2mm，流速)，流动相为10%乙腈水溶液(A)和乙腈溶液(B)，均含0.1%甲酸，梯度分离。这些溶剂以梯度模式使用，从100% (a)开始，保持1分钟，然后在17分钟内升至65% (a)，然后在12分钟内线性梯度至0% (a)。梯度程序包括5分钟的洗涤和再平衡时间。流速0.2 ml/min，进样量5 μl。样品加入染料木黄酮作为内标(瓶中0.01 mg/ml)。

为了进行结构表征，部分提取物还采用反相lc - esi -傅里叶变换-离子回旋共振(FT- icr)-质谱法在负电离模式下进行分析，使用连接LTQ FT Ultra的Accela UHPLC (Thermo Electron Corporation, Bremen, Germany)。情况如[43]。

GC-MS代谢物分析

中间/初级代谢组分主要由气相色谱耦合电子冲击-单四极杆质谱仪覆盖。取10 μl极性提取物，加入10 μl内标溶液(甲醇中氘化琥珀酸1mg /ml)，真空干燥(Genevac EZ.27)。干燥提取物衍生成甲氧基化和硅基化形式，并根据先前的出版物用气相色谱-质谱分析[44]。同样，400 μl氯仿提取液(非极性相)加入5 μl内标(氯仿中5-α-胆甾醇1 mg/ml)，真空干燥(Genevac ez27)。非极性代谢物的衍生化过程如上所述，并调整了GC-MS上的温度梯度以优化萜类化合物的检测[45]。非极性和极性萃取物的GC-MS分析生成的原始数据文件作为附加文件包含13和14,分别。

全球分析

使用R包metaMS对LC-MS netCDF原始数据文件进行峰对准、峰拾取和加合物分组[46]。输出是一个矩阵，其中包含每个样本中每个识别特征的强度，并将其分组为峰簇(PC)组，即可能来自同一化合物(同位素，加合物，源内碎片等)的特征共洗脱组。GC-MS原始文件的处理方法如下[44使用AMDIS 2.71版本。同时对LC-MS和GC-MS数据进行空白减法和质量控制(QC)样品的批量校正，并相对于相应的内标定量代谢物水平。

有针对性的分析

对LC-MS和/或GC-MS平台检测到的特征进行注释和识别，可以根据准确质量生成的MS碎片模式和化学式分析创建木薯特异性代谢物文库。在NIST 17文库和Golm代谢组数据库(GMD)中查询来自GC-MS的电子冲击(EI) MS谱，如[44]。在Chemspider和ChEBI数据库中检索由UHR-Q-TOF (LC-MS)获得的亲本离子、碎片和中性损失的精确质量生成的化学式，从而实现化合物的手动表征。此外，还使用内部基于ft - icr - ms的光谱数据库进行了结构验证[43]。使用Bruker Compass DataAnalysis软件v4.1根据测量的m/z值和母离子与碎片之间的中性损失计算化学式。色谱性质、分析平台和附加的紫外/可见光谱信息也被纳入鉴定工作流程。

数据分析策略与统计分析

使用主成分分析(SIMCA v15, Umetrics)对数据的质量和总体概况进行了修订。数据矩阵分析采用两种策略:(i)对每个时间点的基因型进行两两比较，采用多重t检验比较，经Holm-Sidak事后检验校正(α = 0.05);(ii)采用方差分析(ANOVA)和多重均值比较，以侵害前时间点(T0)为对照，采用Tukey HSD、Bonferroni或Dunnett事后检验，调查每个品种对白蝇侵害的反应。使用XLSTAT、GraphPad Prism 7和MetaboAnalyst在线平台进行统计分析和图表绘制。

结果绘制在由KEGG和木薯耐-PlantCyc专用数据库和文献参考。

木质素分析

无蛋白细胞壁提取物按照[47用该提取物20 mg进行木质素分析。木质素定量使用优化的乙酰溴测定法进行。47]和木质素单体组成及交联组分的分析采用标准硫代酸解法和温和碱法[48，49]。

本研究中使用的材料可向通讯作者索取p.fraser@rhul.ac.uk．

本研究中使用的植物材料的LC-MS和GC-MS分析产生的原始数据集可作为附加信息文件3,13和14 (.xlsx)在这篇发表的文章中获得。

本研究中分析的所有数据都作为附加信息文件包含在这篇发表的文章中。

ACMV:

非洲木薯花叶病毒

CBSV:

木薯褐条病毒

CID:

碰撞诱发离解

Dpi:

天post-infestation

DW:

干重

EI:

电子的影响

气相:

气相色谱-质谱法

现病史:

小时post-infestation

质:

液相色谱-质谱法

主成分分析:

主成分分析

UHPLC:

超高高效液相色谱法

WF:

粉虱

作者要感谢Chris Gerrish的技术支持，Margit Drapal博士和Elliott Price博士对数据的有益讨论，以及Hugh Shanahan博士对统计结果的解释。

本研究由格林威治大学自然资源研究所资助，由比尔和梅林达·盖茨基金会(grant OPP1058938)提供。后者没有参与具体的实验研究。

从属关系

1. 伦敦皇家霍洛威大学生物科学学院，英国埃格姆

   劳拉·佩雷斯·方斯和保罗·d·弗雷泽

2. 国际热带农业中心，哥伦比亚卡利

   Adriana Bohorquez-Chaux和Luis Augusto Becerra Lopez-Lavalle

3. 美国加州大学河滨分校植物与植物科学系

   Maria L. Irigoyen, Danielle C. Garceau和Linda L. Walling

4. 根特大学植物生物技术与生物信息系，比利时根特市科技园71,9052

   Kris Morreel & Wout Boerjan

5. 比利时根特大学植物系统生物学中心，技术园区71,9052

   Kris Morreel & Wout Boerjan

贡献

LABL-L、PDF和LLW构思了最初的研究计划;ABC和LABL-L提供样品，设计并进行侵染实验，编写相应的方法小节，生成附加文件1;LPF进行代谢物分析、数据分析和统计;KM和WB验证代谢物鉴定;PDF和LPF参与撰写所有作者贡献的手稿。MLL、DGC、LLW、ABC、LABL-L、KM和WB参与了数据讨论和结论。所有作者监督和审查写作和PDF接受作为联系和确保沟通的通讯作者。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到保罗·d·弗雷泽．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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