双苄基和黄酮类生物合成调节涉及肝脏BHLH转录因子的功能性表征GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

基本的螺旋环 - 螺旋（BHLH）转录因子（TFS）是TFS最大的家族之一，在许多次生代谢物的调节中起重要作用，包括类黄酮类化合物。它们在黄酮植物中的参与在血管植物中是很好的，但在血疱疮中没有。在肝脏中，均比苄基和黄酮类化合物均通过苯丙醇丙烷途径来衍生，并占据几种上游酶。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在本研究中，我们克隆了由苔类植物编码的bHLH家族蛋白PabHLH1，并对其功能进行了表征GydF4y2BaPlagiochasma appendiculatumGydF4y2Ba．PabHLH1与参与类黄酮生物合成的IIIf亚家族bHLHs具有亲缘关系。瞬时表达实验表明，PabHLH1沉积在细胞核和细胞质中，而酵母杂交实验表明它具有反转录活性。当PabHLH1在GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba在苄苄基和黄酮类化合物的含量和这些化合物的生物合成途径中的相应基因的转录丰度之间建立了阳性相关性。pabhlh1的异源表达GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba导致激活黄酮类化合物和花青素合成，涉及在黄酮类化合物合成途径早期和晚期作用的结构基因的上调。pabhlh1的转录水平GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba菌体对紫外线照射或水杨酸处理诱导的应激反应呈阳性。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

PabhlH1参与了肝曲线中黄酮类化合物的生物合成的调节，并刺激了黄酮和花青素在拟南芥中的积累。GydF4y2Ba

属于非血管苔藓植物的亚组的Liverworts产生各种次生代谢物，包括双苄基[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba),类黄酮(GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]和萜类化合物[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．许多简单的黄酮类，​​如黄酮GydF4y2BaCGydF4y2Ba——或者GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 葡萄原体，黄酮，三羟基苯吡喃酮和异黄酮（例如，5,3'，4'-Trihydroxyisoflavone-7-GydF4y2BaO.GydF4y2Ba葡萄糖苷）在Liverworts中发现[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．苄苄基和环状双（苯苄基）是通过肝曲线产生的主要酚类化合物[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．突出的实例是苄苄血管酸，其脱羧产品呼吸素和各种偶联环状双（苯苄基）化合物[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．这些物质含有两种偏苄基部分，其由乙醚桥和/或C-C键合浓缩[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]表现出明显的抗真菌和抗肿瘤活动[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．如在多种更高的植物物种中重复显示的，通过苯丙烷丙烷和聚酮途径合成黄酮类化合物。双苄基也通过苯基丙醇和聚酮化合物途径衍生，从L-苯丙氨酸和通过肉桂酸开始，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumaric acid，二氢 -GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumaric酸形成二氢 -GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumaryl coa [GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．二氢的缩合GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-Coumaryl CoA与三种丙酰基 - COA形成气血酸;当通过细胞色素P450单氧基酶催化时，两个肺酸分子浓缩，得到BIB苄基[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．双苄苄基的生物合成和黄酮类化合物在Liverworts中分享了几个上游步骤[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

在植物中，类黄酮生物合成的结构基因主要受转录水平的调控，受两类转录因子(MYB和bHLH)以及WD40蛋白的控制。bHLH转录因子对R2R3 MYB伴侣的活性至关重要，同时也增强了启动子的活性，该启动子包含一个顺式调节元件，该元件保存在几种类黄酮和花青素生物合成基因中[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．BHLH系列已分为26个子组[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba，调控广泛的细胞过程，包括表皮细胞的命运、激素反应、金属内环境平衡、光形态发生和花器官的发育[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]．与黄酮类生物合成相关的bHLHs被归为一个亚群，编号为IIIf。第一批被发现的成员之一是玉米GydF4y2BaR.GydF4y2Ba基因，其编码的调控花青素在谷物中的积累[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．编码BHLH因子的Delila（Del）基因调节红色花青素色素沉着的模式GydF4y2Ba金鱼草majusGydF4y2Ba植物(GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]．这GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2BabHLH蛋白AtTT8、AtGL3和AtEGL3均参与各种类黄酮的合成[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．喇叭花的花青素1（AN1）是合成花青素颜料所需的BHLH转录因子[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．在米饭中，产品GydF4y2Barc.GydF4y2Ba和GydF4y2Bard.GydF4y2BabHLH是控制籽粒果皮原花青素合成的转录因子，而烟草是基因吗GydF4y2Bantan1a.GydF4y2Ba和GydF4y2BaNTAN1B.GydF4y2Ba编码花青素在花中积累的增强子[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba大丽花瓦里亚尔，GydF4y2Badvvs (bHLH转录因子An1亚群成员)参与调控射线小花花青素合成[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]．在辉煌的辉煌中，IPIVS调节种子和花青素中的花青蛋白积累在花中的生物合成[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．两种葡萄化葡萄酒BHLH蛋白VVMYC1和VVMYCA1分别生产，分别是花青素和原霉素的生产[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在血管植物中广泛研究了BHLH TFS的黄酮类化合物的调节，但尚是众所周知的关于它们参与肝曲线中的双苄基和黄酮类化合物合成。Liverworts代表了苔藓植物种类的分裂，是最早的土地植物的分歧谱系，所述土地植物的日益早期的祖国师GydF4y2Ba期GydF4y2Ba（约488万到444万年）。涉及来自Liverworts的黄酮类生物合成调节的BHLH基因的表征将阐明BHLH转录因子的起源和演化的阐明。在我们之前的研究中，Pabhlh已被隔离和功能，其特征是来自Liverworts的二拜苄基生物合成的阳性调节剂GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．在这里，我们表征了另一种BHLH（PabhlH1）基因GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba通过过度表达GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba异源表达GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba．PabhlH1积极地调节双苄基和黄酮类化合物生物合成GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba并刺激黄酮酚和花青素在拟南芥中的积累。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

p . appendiculatumGydF4y2BaThallus（一点点样本最初是从四川省，然后在我们的绿色房子中培养和繁殖，并由Xueen Wen教授进行身份验证。凭借No.20091010-01的凭证已被存入制药科学学校，山东大学。收集该样本的研究目的无需具体许可。）在绿色房屋中升高，占山东大学的恒定温度和12小时光周期。收获了两月的杀伤，并在液氮中冷冻冷冻并储存在-80℃。Axenic Thallus和愈伤组织分别在半力量Murashige和Skoog（1962）（MS）中[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]添加0.5 mg LGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}6-benzyladenine。培养物暴露于12 h的光周期和22°C/20°C的昼夜温度条件下。GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba在恒定温度为22℃的恒定温度下，在16小时光周期下在生长室中升高在生长室中的生态型COL-0（从拟南芥生物资源资源中心）。这GydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州GydF4y2Ba（从生命科学教授捐赠了山东大学）施工大学所需的植物在12h光周期和24°C / 22°C的一天/夜温度制度下瞬态表达实验所需的植物5-6周．GydF4y2Ba

核酸提取及基因分离GydF4y2Ba

提取总RNAGydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba笨拙或GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba分别使用基于ctab的方法[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]和Rnaiso加试剂（Takara，Kusatsu，Shiga，日本）。根据制造商的协议，使用Primescript™RT主混合物（Takara，Otsu，Japan）的总RNA的制备合成cDNA。一种GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba缺失完整编码区域的片段从GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba转录组测序数据库(SRP073827)。然后应用3 ' -RACE方法恢复缺失的3 '序列:该反应的模板为3 ' -Ready cDNA，引物对为PabHLH1-NGP(序列见附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba表S1)，以及SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech, USA)提供的UPM引物。一旦完成开放阅读框(ORF)的序列GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba是后天获得的，是后天放大的GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba胎儿cDNA使用引物对PabhlH1-F / R（在附加文件中给出的序列GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1）;然后将扩增子插入PMD19-T中并进行测序以用于验证目的。GydF4y2Ba

序列分析GydF4y2Ba

预测的pabhlH1多肽序列与其植物同源物的那些对准GydF4y2Ba答:芥GydF4y2BaTT8 (CAC14865),GydF4y2BaIpomoea purpureaGydF4y2Baipiv (BAD18982)和GydF4y2Ba葡萄GydF4y2BaMYC1（EU447172）使用DNAMAN V5.2.2软件（Lynnon Biosoft，Canada）。基于Mega V4.0软件中实现的最大似然方法进行系统发育分析[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba，基于1000个引导复制。GydF4y2Ba

压力治疗GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba菌体GydF4y2Ba

一百个月大GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba用UV-B 311 NM窄带灯（Philips，PL-S 9 W / 01 / 2P，波兰）照射Thallus（60 mJ / cmGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba）或1mM水杨酸（Sa）10分钟，然后在0,6,12,24,36,48和60h后收获。将该材料在液氮中冷冻冷冻并在-80℃下储存直至如上所述的QRT-PCR测定处理。GydF4y2Ba

定量实时PCR（QRT-PCR）分析GydF4y2Ba

QRT-PCR方法用于表征转录行为GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba在三种不同的组织中。表达GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba随着许多苯基丙醇途径基因，使用QRT-PCR在野生型和转基因中分析了类黄酮结构基因和苄苄基合成基因GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba和GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba．所需的cDNA模板从上述RNA提取物中提取，使用Eppendorf Mastercycler ep realplex RealTime PCR System (Eppendorf, Germany)进行qrt -PCR。相关的引物在附加文件中列出GydF4y2Ba2GydF4y2BaS2:表。每个10 μL反应由2 μL SYBR、1 μL模板cDNA、0.5 μL引物对(10 μM)和6.5 μL RNase-free dH组成GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba参考基因GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba样品编码伸长系数，其由引物对放大GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba伸长率f / r [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．在三个独立实验中评估所有样品。GydF4y2Ba

亚细胞定位和转录活性测定GydF4y2Ba

使用包括attb重组位点的引物（额外文件中给出的序列提供的引物（在附加档案中给出的序列）的全长ORF（缺少止轭密码子）进行PCR扩增。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1），并进行扩增子进行BP克隆酶反应，以将其插入载体PDONR207（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中。重组质粒在网关LR克隆酶反应（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）中加工，用PGWB5载体，以通过CAMV 35S启动子驱动的PabhlH1-GFP融合[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]．这个结构被转移到GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2Ba用冻融法将EHA105菌株分离，并将其转化为GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba表皮叶细胞或洋葱表皮细胞[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba为它短暂的表情。洋葱表皮细胞用0.1 mg ml培养GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}DAPI 10分钟，细胞核染色。GFP和DAPI荧光通过共聚焦激光扫描显微镜(LSM 700, Carl Zeiss, Inc, New York, USA)或荧光显微镜(Olympus IX71;奥林巴斯公司，东京，日本)。四个不同的部分GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba是由的GydF4y2BaNDE.GydF4y2Ba我- - - - - -GydF4y2BaBamGydF4y2BaH我或GydF4y2BaNCOGydF4y2Ba我- - - - - -GydF4y2BaBamGydF4y2BaH I酶切得到与残基1-261、262-460、461-702和1-460序列对应的基因片段;这些分别连接到pGBKT7质粒(Clontech，美国)。由于PabHLH1的全长序列缺乏可用的限制性内切酶位点，因此使用Stratagene QuickChange位点定向诱变方法创建了一个单核苷酸替换(a957c)。引物X软件设计的必要突变引物(GydF4y2Bawww.bioinformatics.org/primerxGydF4y2Ba)(表S1)。PCR产物经凝胶纯化，用Dpn I (Thermo Scientific, USA)在37°C下酶切4 h，并转化成GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH5α。测序后，突变基因(PabHLH1-a957c)经Nde I和Nco I酶切后插入pGBKT7 (Clontech, USA)载体(本研究使用的引物如表S1所示)。然后用PEG/LiAC法将每个构建物转化为酵母株AH109 [GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．在缺乏色氨酸（SD-TRP）的合成液体中培养酵母转化体。在其基于PCR的验证之后，测试转化的菌落，用于对缺乏色氨酸，组氨酸和腺嘌呤（SD-TRP-HIS-ADE）的三重选择SD培养基生长的能力。GydF4y2Ba

植物转型GydF4y2Ba

这GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba通过Gateway克隆技术将pDONR207内的编码序列置于CaMV 35S启动子控制下的pGWB5载体中[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba然后被引入到GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2BaEHA105。1毫升一晚上的量GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2Ba将培养菌接种到含有50 mg/L卡那霉素的100 mL酵母膏蛋白胨培养基中，30℃摇瓶至ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba已达到1.5 - -2.0。采用离心(4000GydF4y2BaGGydF4y2Ba然后再悬浮在含有100 μM乙酰丁香酮(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的50 mL液体半强度MS培养基(pH 5.2)中。大约50GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba叶状体被切成小块并并入GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2Ba暂停。将混合物用摇动保持1小时，然后在22℃下在含有100μM乙酰苯乙烯酮的固体半强度MS培养基（pH 5.6-5.8）上培养72小时。将晶片在无菌去离子水中漂洗三次，然后转移到含有25mg / L潮霉素和200mg / L头孢噻肟的半强度MS培养基。2-3周后，存活的晶粒在含有50mg / L潮霉素和50mg / L头孢噻肟的半强度MS培养基上培养，培养基以两周间隔刷新。GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba生态型col0转化为GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2Ba使用花浸法携带转基因的GV3101 [GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．在22℃下在16小时的光周期下升高再生植物，并推定GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba利用引物对PabHLH1-vector-F/−R(序列见附加文件)对转化子进行pcr验证GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1）。GydF4y2Ba

组成分析GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba菌体GydF4y2Ba

转基因和非转基因GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba在半强度MS培养基上培养约20 d后，进行冻干处理。取25 mg溶液悬浮于500 μL甲醇中，超声1 h提取联苯甲醇(以黄芩苷为内标)。离心后，上清液用反相Luna 5u C18(2) 100A色谱柱(4.6 × 250 mm, Phenomenex, CA, USA)分离，采用Agilent 1260系列系统(Agilent, CA, USA)。HPLC参数为:溶剂A: 0.1% (v/v)甲酸水溶液，溶剂B:乙腈;流速为0.8 mL/min。初始溶剂为60% A/40% B, 33% A/67% B为45 min, 10% A/90% B为5 min, 100% B为5 min，检测波长为280 nm。通过相应的标准样品鉴定出主要的联苯类化合物月骨酸、利卡丁C和利卡丁D，并根据相应化合物的标准曲线进行定量。将冻干后的菌体10 mg悬浮于800 μl 80%甲醇中，超声处理1 h(内标加入杨梅素)。通过制备酸水解提取物，测定黄酮作为苷元的含量。取400 μL上清加入120 μL 3NHCl酸水解，90℃孵育1 h，再与200 μL甲醇混合。 An Agilent 1260 series HPLC system equipped with a Luna 5u C18(2) 100A column (4.6 × 250 mm, Phenomenex, CA, USA) was used for chromatographic analysis. The HPLC conditions were as follows: the mobile phase consisted of solvent A (acetonitrile) and solvent B (1% acetic acid in water, v/v). The gradient elution program was: 0–10 min, 30% solvent A; 10–30 min, 30–45% solvent A; 30–35 min, 45–100% solvent A; 35–45 min, 100–30% solvent A. The detection wavelength was set at 330 nm. The flavonoid was quantified as the relative content in wild type and transgenicp . appendiculatumGydF4y2Ba根据峰面积扭伤。在三个独立实验中评估所有样品。GydF4y2Ba

转基因植物中黄酮类和木质素的测定GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba

十天旧的转基因和野生型（wt）GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba幼苗被冻干并磨成细粉。以800 μL甲醇:水(80:20,v/v)为溶剂，超声(1 h)提取15 mg，测定黄酮类化合物的含量[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．离心后(16000GydF4y2BaGGydF4y2Ba采用Luna 5u C18(2) 100A色谱柱(4.6 × 250 mm, Phenomenex, CA, USA)进行反相高效液相色谱。流动相为5-85%乙腈和95-15%水(0.1% v/v甲酸)，流速为0.8 mL/min，流速超过40 min。检测波长为364 nm。经质谱和紫外光谱分析鉴定为特定山奈酚衍生物[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．蛹被用作峰值的内标，并计算各种黄酮的相对贡献。在培养5天培养后，在培养的半强度MS（pH 5.8）组成的蔗糖（3％，w / v）和琼脂（0.8％，w / v）组成后，在培养5天培养后，在视觉上筛选幼苗。对于转基因和野生型线的总花青素分析，将100mg的新鲜植物材料悬浮在400μl甲醇中，其中1％HCl（v / v）并超声处理1小时。离心（15,000g，10分钟）后，将上清液转移到新鲜管中，通过使用分光光度计（Shimadzu，Kyoto，Japan）测量A530和A657的OD来测定总花青素。通过计算吸光度a =（a530-0.25×a657）测定花青素的量。使用下式计算原始样品中的花青素颜料的浓度：花青素颜料（Mg / L）=（mw×df×1000）/（ε×1），其中Mw是Cyandindin-3的分子量-Glucoside（449.2），DF是稀释因子，ε是青霉素-3-葡糖苷（26,900）的摩尔吸收率[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．木质素在5 - 7叶期植物中的分布模式是通过按照上述步骤对茎段进行染色获得的[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．通过分光光度法（280nm）分析乙酰溴提取物的分光光度法（280nm）分析量化茎组织的木质素含量。将样品研磨成液氮中的粉末，然后依次萃取，用70％乙醇，氯仿/甲醇（1：1 V / V）和用于细胞壁制备的丙酮。根据乙酰溴方法[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba[70℃，将6mg干燥样品在70℃下用1ml 25％乙酰溴消化30分钟，并在冰浴中冷却10分钟后顺序加入5ml乙酸。然后将300μl上清液通过400μL1.5M NaOH和300μl0.5μl羟胺盐酸盐混合，然后将1.5ml乙酸稀释。灭绝系数GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba木质素为23.35 gGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba} L cm^{- 1GydF4y2Ba}在280 nm。在三个独立实验中评估所有样品。GydF4y2Ba

这GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba顺序GydF4y2Ba

全长orfGydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba通过3'-rame从部分转录物中回收。其长度为2109 BP，其预测产物是分子量76.86kDa和Pi 6.03的702残基蛋白。预测的多肽的序列分别与其最近同源物ATTT8，IPIVs和VVMYC1共享27.9,28.7和30.9％的序列（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）;已知后三种蛋白质调节花青素合成。尽管序列同一性的总体水平相对较低，但pabhlH1序列保留了BHLH结构域DNA结合她的基序（包括他/ Lys9，Glu13和Arg17）[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．在N末端区域中，在MYB相互作用区域（MIR）内注意到高水平的同源性。此外，蛋白质保留了K165，A167残基显示为转录激活至关重要[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．一项涉及植物bHLHs IIIf亚群的系统发育分析将蛋白质分为两个分支(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba):分支I包括AtTT8、玉米IN1、葡萄MYC1和水稻Rc，均参与调控黄酮类化合物的生物合成;分支II包括矮牵花JAF13、拟南芥GL3、金鱼草Delila (Del)和玉米Lc等转录因子。PabHLH1序列与之前报道的PabHLH序列一样，聚集在分支I内，位于分支的外围位置，这表明在陆基植物苔类中，PabHLH和PabHLH1转录因子可能代表了维管植物同源物的一个祖先外群。GydF4y2Ba

pabhlh1在不同组织中的表达及其对应力的反应GydF4y2Ba

探讨PabHLH1表达谱与靶代谢物积累、双联苯含量及表达模式的关系GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba在温室中的三种不同的组织，腋k，炎症和野生菌株生长（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa），量化。温室生长的妊娠的双苄基含量最高，轴静脉的含量高于愈伤组织（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。同时，表达模式GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba证明在三种不同的Liverwort组织中显示出与双苄基含量一致表达趋势（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

暴露的效果GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba紫外光照射或水杨酸处理均可上调其表达GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba．在前48小时内，SA处理增加了转录物丰度到背景水平的大约八个倍数，但是转录物的丰度在随后的12小时方面急剧下降（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。对紫外线照射的反应较少，在前24小时内增加，然后逐渐下降（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

PabHLH1的亚细胞定位和反式激活能力GydF4y2Ba

为了分析PabHLH1蛋白的亚细胞定位，将全长编码序列与GFP基因融合并在细胞内瞬时表达GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶或洋葱表皮细胞。结果表明，PabhlH1蛋白沉积在细胞核和细胞质中（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa，b）。使用酵母一种杂合测定来验证pabhlH1的转移活性。通过将序列分成五个区段（残基1-261和1-460形成的N个末端区段，以及C末端段262-460,461-702和1-702来研究各种区域的作用见图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac).当PabHLH1片段的存在允许酵母细胞生长时，可以推断反式激活活性。在SD-Trp培养基上，4个片段和空载体存在时细胞都可以生长，但在SD-Trp- his - ade培养基上，携带1-460片段和全长蛋白1-702的细胞存活。结论是，PabHLH1的反式活性依赖于位于片段1-460的序列。GydF4y2Ba

过表达PabHLH1后，黄酮类化合物含量增加GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba菌体GydF4y2Ba

为了解剖PabHLH1在体内的功能，我们将PabHLH1基因编码区亚克隆到二元载体pGWB5中并转化GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba叶状体通过GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba介导的方法[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．qRT-PCR分析证实了较高的丰度GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba转基因中的转录物比在WT骨盆中（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一种）。通过制备酸水解提取物，测定黄酮作为苷元的含量。HPLC分析中的主要峰显示与斜纹素素相同的保留时间和典型的UV光谱（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:图S1)。因此，黄酮类化合物的含量可分为野生型和转基因型的相对含量GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba晶粒和结果表明，转基因累积比野生型胎粪更多的黄酮（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab).菌体提取物的高效液相色谱分离结果显示，菌体中含有联苯月桂酸、利卡丁C和利卡丁D(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac，d），基于相应的标准样本识别（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S2)，在转基因菌体中比在WT中积累更强。Real-time PCR结果显示，PAL、C4H和4CL编码基因在转基因菌体中均显著上调(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bae），与编码黄酮类化合物合成酶的那些，Chalcone异构酶（Chi）和Chalcone合酶（CHS）。编码斯蒂芬羧酸合酶（STCS1）的基因和参与宾苄基合成的细胞色素P450，略微上调。GydF4y2Ba

黄酮和木质素在转基因植物中的积累GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba

为探明PabHLH1对拟南芥类黄酮生物合成的调控作用，将pGWB5质粒中含有总PabHLH1 ORF的构建物转化为拟南芥GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba．GydF4y2Bapabhlh1.GydF4y2Ba在TGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baa).对3个转基因纯合植株在半强度MS培养基上生长约10天的分析表明，转基因植株中黄酮醇衍生物的总体积累量高于野生型植株(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bab, c)。在花青素诱导培养基上，转基因拟南芥比野生型积累了更多的花青素(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bad）。在野生型幼苗的子叶和野生植物的结垢中积聚的花青素颜料小于转基因系中的野生型幼苗（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba这与这些植物幼苗中总花青素含量的定量结果一致(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bad）。然而，Lignin含量的Wiesner的染色和乙酰溴分析显示PabhlH1-OE和WT线之间没有显着差异（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:图S3)。通过qRT-PCR对编码类黄酮合成结构酶的基因的转录反应进行表征，发现PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、FLS等编码基因的表达均上调(尤其明显)GydF4y2BaDFR.GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baf).编码肉桂酰辅酶a还原酶(CCR)和肉桂酰醇脱氢酶(CAD)的基因转录丰度(这两种酶都参与木质素合成)不受转基因的影响(图)。GydF4y2Ba8.GydF4y2BaF）。GydF4y2Ba

bhlh是最大的植物转录因子家族之一，调控广泛的植物发育和生理过程[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]，包括黄酮类化合物的生物合成。目前，只有一种BHLH序列，丙比苄基生物合成的阳性调节剂，已从Liverworts中分离出[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．在本研究中，通过搜索bHLH转录因子，获得了新的bHLH转录因子PabHLH1GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba转录组数据库。它与已知调节类黄酮合成的bHLH的系统发育关系表明该基因属于bHLH IIIf亚群[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]．其序列的分析显示它已保留了BHLH区域（参与同质和异二聚体）和基本DNA结合区域[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]．此外，它保留了他/ Lys9，Glu13和Arg17（她的主题）残留物，其赋予G-Box的结合[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．除了BHLH域外，PabhlH1还具有表示与MYB型TFS交互的终端域的HARBORS N和C终端域[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]．PabHLH1在细胞核和细胞质中均有反转录活性。碱性螺旋-环-螺旋转录因子有望定位于细胞核。然而，一些参与类黄酮生物合成调控的bHLH蛋白也与细胞质相关[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

联苯类化合物是由苔类植物产生的一类独特的化合物，具有广泛的生物和药理活性。像黄酮类化合物和木质素一样，它们是苯丙素途径的产物，放射性标记前体的命运表明了这一点[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．Liverworts中苄基和黄酮类化合物的合成可涉及常见的结构基因和转录调节剂。这里，Pabhlh1的过表达GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2BaThallus具有促进培苄基的积累和编码PAL，C4H，4CL和STCS1的上调节基因的积累（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.苄苄基的含量和PAL的丰度，C4h和4CR转录物与PabhlH1的转录物丰度相关。这些结果表明在GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba，PabhlH1通过其上调苯丙烷途径早期作用的结构基因的上调来影响苄苄基合成。PabhlH1过表达诱导的类黄酮含量的增加伴随着编码类黄酮合成酶Chi和Chs的基因的显着上调。GydF4y2Ba

PabHLH1的结构性表达GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba提高了黄酮和花青素的积累，但对木质素含量没有影响。在基因水平上，转基因植株PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR和FLS基因表达上调，未影响木质素合成相关基因CCR和CAD的转录。DFR是花青素合成的第一个关键酶，其上调幅度为> 2倍。两者的乘积GydF4y2Ba矮牵牛织布达GydF4y2BaAN1和AtTT8控制类黄酮合成途径结构基因CHS、CHI、F3H、FLS1和DFR的表达[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，虽然早晨的辉煌TF IPIVs除外GydF4y2BaF3h.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．DVIVS是激活花青素生物合成基因，包括DVCHS1，DVF3H，DVDFR和DVANS的转录因子GydF4y2Ba大丽花摘要GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]GydF4y2Ba．GydF4y2BaPabhlH1似乎能够影响PAL，4CL，CHS，CHI，F3H，DFR和FLS的表达。这些结果表明，IIIF亚组中的BHLHS转录因子通过同时控制几种结构基因的表达来调节黄酮类化合物和花青素生物合成。GydF4y2Ba

许多次生代谢物，包括苄苄基和黄酮类化合物，用作非生物应激保护剂，其合成通常由环境应力引发。在某些情况下，应力信号通过植物激素进行转导，使得与SA的外源性处理可以模拟应力响应。作为次生新陈代谢合成的调节剂，BHLH TFS诱导盐度和极端温度，以及用植物激素治疗[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．在这里，Pabhlh1的转录GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba菌体对SA处理和紫外线照射都有积极反应，许多编码苯丙素合成关键酶的基因也是如此[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]．C4H和4CL1的转录，其编码的酶作用于苯丙素合成的前两个步骤，已知对外源性SA处理有积极响应[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．同时，通过这种治疗显着诱导了对类黄酮合成的“守门员”进行了CHS [GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]．该指示是pabhlh1起动调节一系列基因，这有助于防御非生物胁迫。GydF4y2Ba

从苔类植物中分离到bHLH TF，并对其进行了表征GydF4y2Bap . appendiculatumGydF4y2Ba．过表达时，PabHLH1能够调控双联苯的生物合成GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba，调控类黄酮和花青素的生物合成;在这两种情况下，基因的作用都是通过影响相关结构基因的转录。苔草转录因子的功能鉴定对追踪次生代谢产物合成的进化具有重要意义，同时也可能为提高植物中有价值分子的生产提供策略。GydF4y2Ba

支持本文中给出的结果的数据作为附加文件包含。如欲索取资料，请联络a.x.c (GydF4y2Baaxiacheng@sdu.edu.cn.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

4CL：GydF4y2Ba

4coumarate：辅酶是一个连接酶GydF4y2Ba

答:GydF4y2Ba

花青素合成酶GydF4y2Ba

C4H:GydF4y2Ba

肉桂酸4-羟基化GydF4y2Ba

Chi：GydF4y2Ba

查耳酮异构酶GydF4y2Ba

CHS：GydF4y2Ba

Chalcone合成酶GydF4y2Ba

DBR:GydF4y2Ba

双键还原酶GydF4y2Ba

DFR：GydF4y2Ba

二氢酚酰酚醇还原酶GydF4y2Ba

F3H:GydF4y2Ba

黄烷酮3β羟化酶GydF4y2Ba

弗尔斯：GydF4y2Ba

黄酮醇合成酶GydF4y2Ba

朋友:GydF4y2Ba

苯丙氨酸氨裂解酶GydF4y2Ba

stc):GydF4y2Ba

Stilbenecarboxylate合酶GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

本研究由国家自然科学基金项目(No. 31370330, No. 31770330)和山东省科技发展计划项目(No. 2016GSF121032)资助。资助方没有参与实验设计、数据收集和分析或手稿的撰写。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 赵宇、张玉英对这项工作的贡献是相同的。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 山东大学制药学院，山东大学制药部化学生物学重点实验室，济南，250012GydF4y2Ba

   俞兆，玉英张，慧柳，萧爽张，荣妮，桥毅王，帅高，洪翔娄＆艾夏成GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

AXC和HXL构思了研究计划并设计了实验;YZ，YYZ，HL，XSZ，RN，PYW和SG进行了实验;AXC和HXL监督实验并分析数据;YYZ和AXC写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaHong-Xiang卢GydF4y2Ba要么GydF4y2BaAi-Xia程GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

Plagiochasma appendiculatumGydF4y2Ba样本收集符合所有相关机构、国家和国际准则。在中国,GydF4y2BaPlagiochasma appendiculatumGydF4y2Ba不是一种脆弱的物种，因此没有具体许可需要收集这种植物进行研究目的。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人没有对本调查的利益冲突。GydF4y2Ba

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