亚洲柑橘木虱长期、持续的摄食破坏了甜橙中水杨酸的稳态

背景

在不同的植物-昆虫相互作用模型中，韧皮部取食昆虫调节水杨酸(SA)信号通路。柑橘木虱是致命植物病原体的韧皮部摄食载体，Candidatus.Libibacter Americanus和.Candidatus.单独的Asiaticus和相互作用亚洲柑橘木虱凭借其可能调节植物防御的主持人并不充分了解。本研究的目的是探讨SA改性和甜橙色防御相关反应的转录调节的分子机制（柑橘sinensis.）暴露于连续进料的各种持续时间（7-，14-和150-天）通过亚洲柑橘木虱．

结果

我们量化了所涉及SA途径活化和随后改性的基因的表达，以及相关的SA代谢物（SA甲酯，2,3-DHBA和SA 2-O-β-D-葡糖苷）。NPR1和PR-1表达在通过暴露于连续进料的植物中上调亚洲柑橘木虱为14天。的表达BSMT样那MES1样和DMR6样氧，以及在其各自的代谢物的SA（SA甲酯，2,3- DHBA）的累积是在由暴露于连续进料的植物显著更高亚洲柑橘木虱超过150天的时间亚洲柑橘木虱侵扰。与此同时,的表达UGT74F2样物显著下调和它的代谢产物，SA 2-β-d葡糖苷，是高度暴露于150 d的树木积累喂养对照相比无树木亚洲柑橘木虱．

结论

亚洲柑橘木虱柑橘叶片取食差异调节转录和SA-代谢产物积聚，这取决于昆虫喂养的持续时间。我们的研究结果表明柑橘的时间较长，且不间断的曝光（150 d）至亚洲柑橘木虱喂养植物免疫和抑制生长，这可能突出了卷曲（HLB）管理中染色抑制作用的重要性。

Hemipteran，饲料昆虫被分为三个主要副机：Sternorrhyncha（粉虱，蚜虫，肉粥样蛋白和洋谷），Auchenorrhyncha（Planthoppers，叶蝉，Treehoppers，Spittlebugs和Cicadas），和杂种虫（种子虫，臭虫，刺客虫子叶脚虫和臭虫）[1]．许多血管人与主要农作物的害虫在经济上很重要[2那3.那4.];和人，动物和植物致病微生物的载体[5.那6.]．在Phloem喂养的血管上，蚜虫和粉虱是植物 - 昆虫相互作用中最受研究的模型。然而，很少有关于囊脂蛋白及其主体之间的相互作用，并且特别是关于植物防御。柑橘木虱Kuwayama（Heviptera：Lividae），通常被称为亚洲柑橘类氏植物（ACP），是一种植物植物的植物植物，植物植物植物植物的植物肽植物植物植物Candidatus.Liberibacter属，引起黄龙病（HLB），也被称为柑橘青果。这种植物疾病可以摧毁柑橘产量在受影响地区的全球。Since HLB was detected in Florida in 2005, citrus production has progressively declined resulting in $4.55 billion in lost revenue and > 8000 job losses since 2011 [7.]．因此，更深入地了解昆虫（载体）和植物（主持人）之间的相互作用对开发新颖的管理策略至关重要。

韧皮部取食者依靠它们高度改良的口器(茎管)通过不同的植物细胞层到达特定的取食点[8.]．特别是，亚洲柑橘木虱大多来自韧皮筛子元素的成年人，并在较小程度上似乎摄取与木质血管相关的SAP [9.那10那11]．在Phloem Engestion期间，已经在蚜虫，Plathoppers和蜘蛛螨中鉴定了许多唾液效应蛋白。这些效应器调制诸如植物防御信号途径的若干方法，如植物防御信令途径，如喀拉什艇和围墙中的回顾[12]和徐，钱[13]．迄今为止，尚未确定同源唾液效应器亚洲柑橘木虱基因组。但是，众所周知亚洲柑橘木虱柑橘馈送触发水杨酸甲酯的释放（MESA），[14]，暗示SA途径柑橘sinensis - D. Citri交互。

水杨酸（SA）在植物先天免疫中起着至关重要的作用，其合成通过植物中的植物中的等抚养物和苯丙氨酸氨 - 裂解酶途径发生，这两者都被陈某详细讨论和审查了[15[D'Maris Amick Dempsey，Vlot [16]．最近，描述了一种新的SA累积机制拟南芥蒂利亚纳，其中avrPphB易感3（的pBS3）在细胞溶胶中催化异分支酸-9-谷氨酸的形成（ISC-9-GLU），其自发地衰变成SA无酶催化的要求[17]．一旦SA生物合成，在细胞内发生了几种化学修饰，包括甲基化，糖基化，水解和氨基酸缀合。由MESA表示的甲基化方法由苯甲酸/水杨酸羧基甲基转移酶（BSMT）酶合成[18]．MESA的酯化由SA结合蛋白2（SABP2）和甲基酯酶介导，将MESA转化为SA [19那20.那21]．SA，SA 2-β-D-葡糖苷的糖基化分子由UDP-葡糖糖苷（UGT74F1和UGT74F2）催化[22那23那24]．此外，SA可以随后羟基化以产生分子2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）和2,5-二羟基苯甲酸（2,5-DHBA）[25那26]．SA代谢物是SA的非活动形式;但是，它们可能有一些生物学功能。有人建议，MESA与拟南芥，烟草和马铃薯触发系统所获得的抗性（SAR）有关，响应于微生物病原体[19那20.那21那27，并通过自然敌人的吸引引起间接防御[28那29那30.]．SA 2-β-D-葡萄糖苷在烟草中的应用诱导SA标记基因的表达，发病机理related-1 (PR-1)[31]．羟基化SA分子诱导不同的植物反应;例如应用2,3- dhba诱导的弱PR-1表达与SA的应用相比[32]．然而，2,5- dhba诱导合成了一套不同的PR蛋白[33]．

在下游SA信号传导期间，已经描述了各种蛋白质。例如，发生致病性相关基因1（NPR1）的转录辅因子非表达剂。NPR1含有两个保守的蛋白质 - 蛋白质相互作用结构域：BTB（Bric-A-BRAC，Tramtrack，宽复合物）结构域和Ankyrin重复域。NPR1与TGA转录因子相互作用[34]已经提出用作系统获得性抗性（SAR）基因表达的转录共激活剂[35那36]．NPR1通过诱导致病性相关（PR）基因的表达，但还在例如降低植物生长的基本细胞过程中参与的基因的表达[35那37] （无花果。1）。

SA依赖性免疫应答的部署与SA积累有关在足底．了解免疫反应的机制C. Sinensis.通过未感染后长时间喂养后通过累积SA及其代谢物亚洲柑橘木虱可能有助于解决与HLB疾病管理相关的基本问题。例如，尚不清楚在HLB流行地区抑制病媒的重要性。考虑到农用化学品的成本及其潜在的环境影响，在几乎100%树木被感染的地区进行病媒管理的必要性一直是一个有争议的话题[38]．

在这项研究中，我们假设SA依赖性途径和SA代谢差异诱导柑橘sinensis.经过不同程度的伤害造成亚洲柑橘木虱喂养（短期与长期）。我们描述了所涉及SA途径激活和随后改性的基因的转录调节，以及它们相关的代谢物C. Sinensis.挑战亚洲柑橘木虱对于各种喂养持续时间。总体目标是发现与SA修饰相关的潜在目标，可以操纵柑橘中的植物防御，以减轻HLB引起的下降。

鉴定柑橘sinensis.同源基因

通过分析核苷酸同源性百分率和qPCR引物特异性来选择基因。特别是,对BSMT样3个同源物(登录号:XM_006466773、XM_006471131和XM_006470290)。3套qPCR引物在cDNA样本中进行了检测，但只有1套BSMT样成绩单（登录号XM_006466773）显示了独特的扩增子;因此，我们丢弃了另外两个BSMT样来自进一步分析的同源物（XM_006471131和XM_006470290）。如果是DMR6-like加氧酶,测定了三种同源物C. Sinensis.(登录号:KK784903, XM_015533952和XM_006465249)。在这三个dmr6样homologs, the percentage of nucleotide identity (~ 92%) did not allow us to find a set of qPCR primers that could differentiate each homolog. For the transcripts,UGT74F2样（登录号码XM_006478492）和MES1样（访问号码XM_015532488），为每个（分别登录号：XM_006478493和XM_006485562）识别了一个额外的同性恋。山茶。然而，核苷酸同一性的百分比不允许我们设计一组QPCR引物以区分这两个同源物中的每一个。

进行贝叶斯分析以评估推导的蛋白质序列之间的关联C. Sinensis.来自选定的同源蛋白质答:芥（附加文件1：图S1，附加文件2：图S2，附加文件3.：图S3和附加文件4.：图S4）。BSMT的推导氨基酸序列（登录数XM_00646773）聚集在由S-腺苷-1-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶形成和水杨酸盐/苯甲酸甲酯甲基转移酶同源物质（附加档案5.：图S5）。DMR6样氧（登录号KK784903）集群与DMR6般从氧合C. Sinensis.和答:芥（附加文件6.:图S6)。MES1(登录号XM_015532488)聚集在由水杨酸结合蛋白2和来自的甲基酯酶1形成的分支内C. Sinensis.（附加文件7.:图S7)。udp -糖基转移酶74 F2 (Accession number XM_006478492)与其亚型2 (Accession number XM_006478493)形成一个分支，并与描述的udp -糖基转移酶74 F1/F2聚集在一起答:芥（附加文件8.:图S8)。总的来说，每一个选择的蛋白质序列都来自C. Sinensis.在其预期的蛋白质家庭内粘连。

与SA修饰相关的四个转录本在C. Sinensis.基因组（BioProject：PRJNA225998）。每个开放阅读框（ORF）为在硅片里用选定的同源蛋白翻译并对齐答:芥那普通烟草，和玉蜀黍。在深灰色盒子中突出显示相同的氨基酸残基。共享其侧链类似特性的氨基酸以浅灰色显示，而预测的保守域使用圆点线加下划线（附加文件5.:图S5，附加文件6.：图S6，附加文件7.：图S7和附加文件8.:图S8)。

采用两两比对C. Sinensis.和答:芥in-silico氨基酸(aa)序列翻译结果如下:i) dmr6样加氧酶1 (346 aa)C. Sinensis.与文献中所述的水杨酸3水解酶(348 aa)的同源性为65%，相似性为80%答:芥（DMR6样氧酶1，加入号码NM_117118）通过[25];Ii)一个水杨酸羧甲基转移酶(368 aa)C. Sinensis.使用S-腺苷-1-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶超细蛋白（378AA）具有46％的同一性和65％的相似性。答:芥（BSMT1，登录号NM_111981）;ⅲ）methylesterase1样（271个氨基酸）由C. Sinensis.具有54％的同一性和68％的相似性来自甲酯酶蛋白答:芥（MES1，登录号NM_127923）;和iv）UDP-糖基转移酶74F2样（454AA）来自C. Sinensis.拥有56％的身份，其同源蛋白质（445 AA）的相似性为73％答:芥（UGT74F2，登录号NM_129944）。

叶片中SA代谢中涉及的基因的表达模式柑橘sinensis.

定量RT-PCR（QRT-PCR）分析表明相对表达BSMT样显着（P. < 0.05) upregulated in plants exposed to continuous feeding by亚洲柑橘木虱14和150 d与树木没有亚洲柑橘木虱喂食（图。2a).的相对表达MES1样显示显著(P. < 0.05) downregulation in plants exposed to continuous feeding by亚洲柑橘木虱(无花果。2b)的分析DMR6样氧相对表达显示该转录性显着（P. < 0.05) upregulated in plants exposed to continuous feeding by亚洲柑橘木虱为150 d（图2c).的相对表达UGT74F2样显着（P. < 0.05) downregulated in trees exposed to亚洲柑橘木虱为7或150 d与对照相比，没有树木亚洲柑橘木虱(无花果。2d）。

基因的表达模式参与SA依赖性途径在叶柑橘sinensis.

定量RT-PCR（QRT-PCR）分析表明，两者的相对表达NPR1和PR-1只是显着（P. < 0.05) upregulated in plants exposed to continuous feeding by亚洲柑橘木虱14 d与树木没有亚洲柑橘木虱喂食（图。3.）。在150 d之后，类似的模式NPR1和PR-1控制树木之间观察到的表达不经亚洲柑橘木虱和树木暴露于连续进料。

紫穗槐成熟叶片中SA分析物的时间分布柑橘sinensis.

选择反应监测（SRM）和色谱图的标准和样品提取物光谱示于图4.和附加文件9.:分别为图S9。采用LC-MS对SA及其代谢物进行定量分析，结果表明，成熟叶片中SA总量在7 d和14 d的积累无统计学差异(P. > 0.05) between treatments. However, SA accumulation increased significantly (P. < 0.05) in plants exposed to continuous亚洲柑橘木虱与树木相比喂养150天亚洲柑橘木虱喂食（图。5.一种）。

代谢产物MeSA仅在植株成熟叶片中检测到亚洲柑橘木虱喂养;没有在树中没有检测到它没有亚洲柑橘木虱(无花果。5.b）。在暴露于150 d的连续喂养的植物的成熟叶中，2,3-dhba的积累显着增加亚洲柑橘木虱与其他持续的暴露或植物相比未暴露在一起亚洲柑橘木虱(无花果。5.C）。在所有时间点观察到SA，水杨酸2-β-D-葡糖苷（SAG）的糖基化形式，其积累显着增加（P. < 0.05) in mature leaves of plants exposed for 150 d of continuous亚洲柑橘木虱喂养与对照植物相比（图。4.d）。总的来说，在暴露于150 d的植物中，SA的积累和代谢物在连续喂养的150 d植物中显着增加亚洲柑橘木虱(无花果。5.）。

在暴露于连续喂养的植物中，在茉莉酸（JA）的积累中没有观察到统计学差异亚洲柑橘木虱与没有昆虫的植物相比(图。6.一种）。在比一个众所周知的增加SA / JA等于3.50是在暴露于150 d植物的叶子确定亚洲柑橘木虱喂食（图。6.b）。

已知参与SA生物合成和与SA积累相关的基因表达在混合年龄(幼、中、成熟)增加。C. Sinensis.在1个月后离开亚洲柑橘木虱感染(39]．尽管上游调控，活性SA水平也受到下游代谢修饰的调控，包括糖基化、甲基化、氨基酸偶联和羟基化[16那40]．这些后续的修改被认为是服务于植物防御不同的生物学功能[41]．有人建议，植物韧皮部识别送昆虫，如蚜虫，粉虱和木虱病原体，激活SA依赖性途径应答[8.那42]．因此，了解在SA新陈代谢期间发生的特定类型的调制，并确定其在依赖于SA依赖途径相关的情况亚洲柑橘木虱喂养（侵染率）可以揭示破坏的重要目标C. Sinensis - D. Citri疾病管理的互动。

D 'Maris Amick Dempsey, Vlot详细描述了能够催化SA修饰的蛋白质[16]和Maruri-lópez，瓦尔斯 - 巴罗扎尔[40]．在目前的调查中，鉴定了参与SA代谢的四种基因（转录物）和涉及SA依赖性途径的两种基因（转录物）C. Sinensis.在植物叶片的连续腹股沟饲料开始后，在几个时间点分析基因组及其表达模式。参与SA代谢的候选蛋白质显示出在其他植物物种中的同源物的高度相似之处（附加档案5.:图S5，附加文件6.：图S6，附加文件7.：图S7和附加文件8.：图S8），暗示在这里测得的各种代谢物的SA（MESA，2,3- DHBA，和SAG）的形成和水解这些推定的酶C. Sinensis.(无花果。5.）。

SA的甲基化由BA/SA羧甲基转移酶1 (BSMT1)控制，催化SA甲基酯MeSA的形成[18]．我们观察到显著的上调BSMT样(无花果。2a）和同时下调甲基酯酶，MES1样(无花果。2答案:B亚洲柑橘木虱喂养150天。在拟南芥中，一个ATBSMT1突变体无法诱导MESA合成假单胞菌含油感染，而过度表达ATBSMT1导致MESA在感染区积累，这些植物无法激活全身获得的阻力（SAR）[43]．该结果表明，在植物组织中存在过多的ATBSMT1脱颖而出的甲基酯酶（SABP2和MES）的活性或丰度。类似地，MESA生产的增加（图。5.b）用上调相关联BSMT样以及同期下调MES1样这里的记录表明，长时间的进食亚洲柑橘木虱在C. Sinensis.可以抑制SAR。

在拟南芥中，SA的羟基化由水杨酸3水解酶（S3H）控制，最近在柑橘中注释为2-氧代氟酯（2G）/ Fe（II） - 依赖性氧合酶（DMR6样氧酶）。该蛋白质的特征在于张，Halitschke [25[已知已知合成羟基化的SA代谢物：2,3-DHBA和2,5-DHBA。柑橘植物感染了亚洲柑橘木虱150 D表现出上调dmr6样(无花果。2C）;该上调符合成熟叶中的2,3-dhba浓度增加（图。5.C）。在拟南芥中，过度表达DMR6样氧植物易感性升高的真菌，Hyaloperonospora arabidopsidis，并诱发与疾病相关的褪绿病[44]．另一个调查表明表达DMR6样氧在参培叶子答:芥通过叶子中的SA升高的内源性水平上调[25]．同样，我们的分析确定了矛盾的调节（高水平的SA与增加的表达相关DMR6样氧）在叶子里C. Sinensis.暴露于长期亚洲柑橘木虱喂食（图。2C）。

SA向SAG的转化发生在大豆和烟草的细胞质中[45那46]．在拟南芥中，已经描述了两种UDP依赖性糖基转移酶（UGT74F1和UGT74F2），其具有形成凹凸或SA葡萄糖酯的活性差异[22那24]．歌曲，koo [47]确定UGT74F2的过度表达（也称为ATSGT1）导致较低水平的SA导致植物易感性增加P. inringae.．我们调查的目的是确定是否亚洲柑橘木虱可以调节表达UGT74F2和SAG水平。我们的研究结果表明在减少UGT74F2表达（图2d）增加水平的凹凸（图。5.A, d)在柑橘植株完整的叶片中长期暴露亚洲柑橘木虱喂养，这在没有昆虫的同类植物中没有发生。因此，基因表达和SAG水平之间的类似调节C. Sinensis.未观察到，表明柑橘中的凹陷累积水平可能由以下方式进行调节：i）另一种具有较高特异性的凹陷形成或II的酶UGT74F2转录本表达在本研究选择的时间进程之前达到了最高水平。

在长时间暴露之后，在柑橘植物的叶片中观察到SA的过分累积亚洲柑橘木虱馈送可以与植物生长和SA-依赖性途径有关。尽管SA作为一种植物激素调节几种植物生物学过程的重要性，其在植物生长的作用已经没有详细调查，并大多局限于拟南芥作为植物模型。创建以组成型拟南芥突变体表达高水平的SA的显示“矮化表型”与在两地上和地下的组织，其在某些情况下可导致植物死亡[减小的生长速率48那49]．在我们的调查中，植物生长（地上）C. Sinensis.跟随延长亚洲柑橘木虱侵扰被干扰或具有较少的树冠（附加档案10:图S10)，表明在叶片中定量高水平的SA与生长/冠层尺寸的减少有关亚洲柑橘木虱- 蚕树。此外，高SA浓度与拟南芥中的NPR1降解相关[50]．这可能是缺乏PR-1上调亚洲柑橘木虱- 漂白的树木（图。3.b）是由NPR1稳态的不平衡引起的，并且需要进一步研究与调节NPR1稳定性和活性相关的蛋白质，例如NPR1寄生碱基NPR3和NPR4，以完全理解这种依赖性途径。

我们描述了其分子机制:i) SA修饰的转录调控，ii)防御相关反应的激活C. Sinensis.各种持续时间挑战亚洲柑橘木虱喂养伤害。我们提出了两种情况，描述了通过NPR1描述SA改性和防御相关响应的转录调节C. Sinensis.这取决于植物受昆虫伤害的时间长短(图。6.a，b）。继短期暴露亚洲柑橘木虱喂养，柑橘的免疫应答随着NPR1的表达增加而上调PR-1并且没有相关的累积。但是，长时间喂养亚洲柑橘木虱改变了几种基因的转录（图。7.b），导致SA和代谢物过量积累（图。5.)。我们假设柑橘中sa相关基因的转录调控随时间的延长而延长亚洲柑橘木虱喂养破坏了危及局部和全身性获得的抵抗的SA路径的稳态。因此，由载体引起的喂养损伤可能促进与之无关的疾病进展Candidatus.Liberibacter胭脂（CLAS）的发病机制。

在HLB管理的背景下，我们的结果表明，损伤与长期亚洲柑橘木虱除了与病原体相关的下降之外，喂养可能会显着损害植物生长，例如Phloem堵塞CLas感染的柑橘树[51]．这些结果领域提供进一步支持向量的抑制，其中HLB疾病流行作为一个短期的管理策略。然而，长期的解决方案，如昆虫和/或耐病品种和/或治疗靶向生理表达虫伤或基于短期基因发病相关的症状是少不了必要的。

柑橘饲养

2017年8月，从商业南部柑橘苗圃，丹麦德·杜鹃生产和购买所有植物材料。实验中使用的植物是2岁的未感染[Candidatus.Libibacter Asiaticus（Clas） - 免费]柑橘sinensis.L. Osbeck cv Valencia嫁接到US-812砧木上[522个月后，将柑橘植株移植到新的塑料盆(19.69 × 45.7 cm)，并填充Fafard柑橘RSI土壤混合物，其中含有加拿大泥炭藓、珍珠岩、蠕石、白云石灰岩、RSI和Pluronic (Sungro, Horticulture Distribution, Inc.， WA, USA)。在23±3°C, 60RH, 16:8 h(光:暗)光周期，最大光合辐射215 μmol s的条件下，将植株置于生长室中⁻¹ m⁻²．植物每周浇水两次，每月两次施肥，交替时间为4升4升24-8-16个NPK溶液⁻¹（奇迹 - GRO所有植物食品;斯科特奇迹-Gro产品，Marysville，OH）和6-4-6（N-P-K）粒状肥料，每锅1克（专家园丁Gro Tec。Inc. Madison，GA）。

昆虫饲养

可克拉斯无克拉斯亚洲柑橘木虱在本研究中使用的用于3-4岁。老的柑橘sinensis.CV瓦伦西亚树木在温室间在26±2°C，60-65％RH和16：8小时（光：暗）光周期。在启动实验之前，在至少40中检查CLA的存在/不存在亚洲柑橘木虱个人使用Taqman QPCR确认缺乏感染。

Taqman QPCR测定的DNA提取和CLA检测

使用DNeasy血液和组织套件（Qiagen Inc.，Valencia，CA）分离来自单昆虫的基因组DNA，如制造商的协议。在Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）上测量DNA样品的数量和纯度。使用先前描述的CLAS特异性16S RDNA和内部对照序列（基因区域）的靶探针检测CLA的基因组DNA亚洲柑橘木虱（无翼） [53]．使用96孔微釜反应板（Applied Biosystems）在ABI 7500 QPCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA）中进行DNA扩增。使用100ng基因组DNA，每种双特异性标记探针 - 底簇100nm，Taqman®通用PCR主混合物（应用生物系统）进行100nm，并用分子级纯水调节到20μl的最终体积的氧化物QPCR反应。．用于Taqman测定的条件包括：在50℃下孵育2分钟，在95℃下在95℃下进行10分钟，然后在95℃下循环为15 s和60℃。每种96孔板含有样品，包括“无模板”控制，阳性对照（CLAS感染样品），阴性对照（CLAS-Uninfected样品）。如果由ABI 7500实时软件（版本1.4，应用生物系统）确定的循环量化（CQ）值（第1.4版，应用生物系统），则以重复算法进行反应，并考虑靶序列阳性，以≤36个循环。

生物信息分析

基因的选择

SA修饰和SA依赖防御信号通路相关基因的表达模式C. Sinensis.L. Osbeck CV瓦伦西亚被调查，并寻找同源物拟南芥。使用BLAST算法用于根据身份的百分比选择基因答:芥同源。我们选择Methylesterase 1（MES1，登录号NM_127926)，2-氧代摩托酸盐（2g）/ Fe（II） - 依赖性氧合酶（登录号NM_117118）[以前由张，Halitschke进行注释和描述[25]水杨酸3-hydroxylase（S3H或DMR6.）, S-adenosyl-L-methionine-dependent甲基转移酶（BSMT1，加入号码NM_111981），74年UDP-glucosyltransferase f2（UGT74F2，登录号NM_129944）致病性相关基因的非富态1（NPR1，登录号NM_105102)病因相关蛋白1（PR-1，登录号NM_127025）。在基因选择后，设计了每个候选转录物的RT-QPCR引物在引物3网[54为每个蛋白质家族进行系统发育分析。

SA修饰相关的基因的系统发育分析

每个开放阅读框C. Sinensis.基因选择了与从获得的同源核苷酸序列被对齐答:芥那rabidopsis lyrata.和柑橘肠道。使用Clustalw在用于系统发育研究（CIPRES）门户中的Cyber​​iN亚规中进行多种核苷酸序列比对[55]．在CIPRES门户中使用MrBayes 3.2.6进行系统发育的估计，设置如下:四链，两次运行，核苷酸模型=广义时间可逆(GTR)，速率变异=“invgamma”(GTR + I + Gamma模型)。对大都会耦合马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)的分析运行了1500万代，每5000步采样一次，前25%的采样树被丢弃为老化树。分支支持度采用后验概率法(≥0.70)计算。每个系统发育树都植根于中点，并在Figtree程序v.1.4.0中编辑[56]．

比对

创建氨基酸比对之前，被选择用于氨基酸比对仅显示出独特的扩增子的基因。对于具有SA的修改和信令相关联的每个转录物，使用的开放阅读框搜索工具（获得的开放阅读框（ORF）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）．用于DMR6样氧酶的序列比对结果为:中华绒螯蟹（加入号码KK784903），答:芥（加入号码NM_117118），烟草（登录号NM_001325946），和Zea Mays.（加入号码NCVQ01000003）。用于S-腺苷-1-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶超细蛋白的序列（BSMT.）对齐是：C. Sinensis.（登录号XM_006466773），答:芥（加入号码NM_111981），N. Tabacum.（登录号NM_001324786），和玉蜀黍（加入号码CM000785）。用于甲基酯酶对准的序列是：C. Sinensis.（登录号XM_015532488），答:芥(加入NM_127926数量),N. Tabacum.（登录号NM_001325513），和玉蜀黍（登录号XM_008676727）。最后，用于UDP-糖基转移酶74F2对准的序列是：C. Sinensis.(加入XM_006478492数量),答:芥（登录号NM_129944），N. Tabacum.(登录号:XM_016625845)玉蜀黍（加入号码NCVQ01000003）。使用Clustalw在Bioedit V7.2.5中进行所有比对进行57]．分析氨基酸序列之间的身份和相似性百分比C. Sinensis.和答:芥，使用BLAST2序列算法进行成对对齐[58]．在每个氨基酸序列预测的保守结构域使用NCBI保守结构域数据库搜索[确定59]．

饲养昆虫和采集植物组织

本实验的目的是比较暴露于一个不断繁殖的未感染群体的树木之间SA转化过程中的基因表达和SA代谢产物亚洲柑橘木虱(喂养处理)与没有昆虫的树木(控制处理)。在整个实验过程中，无论是载体还是宿主均未发现CLas感染。喂养治疗包括最初释放20例未感染的小鼠亚洲柑橘木虱（~ 50:50 male: female ratio) per plant that were then constantly exposed to a reproducing population of亚洲柑橘木虱成人和若虫喂养植物。对照植物相同地处理，但保持未曝光对脑脂莲。该实验开始于春季冲洗期间（2018年4月）当每次治疗时，六种类似尺寸和候选的植物单独容纳在（58.4×58.4×88.9厘米）的防虫笼内。从每株植物，19.63毫米²采集9个成熟叶片中肋不同时间的叶盘，观察短时间(7、14 d)和长时间(150 d)虫食后植物的反应亚洲柑橘木虱．选择“150 d”时间点是因为与没有昆虫的植物相比，植物的生长速度开始下降(附加文件)10：图S10）附近此时间点。植物组织立即使用液氮闪蒸，用液体氮气进行冷冻，在组织溶剂筛中研磨，然后储存在-80℃直至进一步分析。

RNA提取和cDNA合成

在制造商的指示之后，使用型型植物迷你套件（QIAGEN）将总RNA从20mg预先研磨的植物组织中提取。为了除去基因组DNA，使用涡轮DNase试剂盒（AMBION）在制造商的方案之后用DNase处理每个样品。在NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）中测定总RNA的量和纯度。去除DNA后，进行互补DNA（cDNA）的合成。每个cDNA合成反应由500ng的总RNA，5倍cDNA合成缓冲液，锚固 - 寡核苷酸（DT）引物，RT增强剂和雌核苷酸混合物组成，与vero cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，CA）进行，如下the manufacturer’s protocol. Thereafter, cDNA samples were stored at − 20 °C until further analyses.

RT-QPCR的基因表达分析

使用PowerUp™SYBR®Green Master Mix (ThermoFisher scientific)进行RT-qPCR反应。每个qPCR反应包含10 ng cDNA(模板)，每个基因特异性引物300 nM(见表)1），并在加电™SYBR®的1X绿色预混;the final volume was adjusted with nuclease-free water to 20 μL. The real-time PCR program consisted of a UDG activation step at 50 °C for 2 min, a denaturation step at 95 °C for 2 min, followed by 40 cycles at 95 °C for 5 s and 60 °C for 60 s. Real-time PCRs were performed using an Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Each RT-qPCR reaction was performed in duplicate with a negative control in each run. Primer specificity was monitored with melting curve analysis using QuantStudio™ software V1.3 (Thermo Fisher Scientific) and 2% agarose gel electrophoresis. The relative gene expression for each target gene was determined with the delta delta CT (ΔΔCT)方法(60.]分别使用β-肌动蛋白和伸长因子-1α的平均CT（分别登录号XM_026823249.1和XM_006488084）作为参考基因[61.]，后面的等式：ΔΔct=（CT_{， 目标}- CT._{，actin / ef1a}）_时间x——(CT_{， 目标}- CT._{，actin / ef1a}）_时间0.那where ‘time x’ corresponded to the ΔCT values observed between the target gene and the mean CT of β-actin and Elongation factor-1α following specified durations (7, 14 and 150 days) of plant exposure to treatments, while ‘time 0’ corresponded to the ΔCT values of genes analyzed in plants without insects, 1 day before beginning the assays.

代谢产物液相色谱-质谱分析(LC-MS)

使用20mg接地叶片提取Sa代谢物。简而言之，将每个样品与0.25ml冰冷甲醇/水溶液（20/80，v / v）混合，包括三种内标（0.01μg/ ml水杨酸-D_6.，用于水杨酸和茉莉酸;0.4 μg/mL 2,5-二羟基苯甲酸_3.，为水杨酸2- o -β- d -葡萄糖苷和2,3- dhba;0.8 μg/mL水杨酸甲酯d_4.对于mesa）。通过超声辅助萃取萃取30分钟在填充冰块玻璃玻璃中提取样品。温育后，在10分钟内以30,000g离心样品，回收上清液并用0.22μm膜过滤器过滤，将10μl注入LC-MS / MS系统中。

LC-MS / MS分析用耦合到TSQ Quantiva三重四极质谱仪（赛默飞世尔科技，圣何塞，CA，USA）的终极3000 LC系统中进行。The analytes (salicylic acid 2-O-β-D-glucoside, 2,3-DHBA, salicylic acid, jasmonic acid, and methyl salicylate) were chromatographed on a Thermo Fisher scientific Acclaim C30 column (150 mm × 2.1 mm, 3.0 μm particle size) at a column temperature of 30 °C using a gradient elution with 0.1% formic acid in water (eluent A) and 0.1% formic acid in acetonitrile (eluent B). The gradient was as follows: 0–10 min 20–95% B and 10–15 min 95% B. The column was re-equilibrated using the initial mobile phase before next run. The flow rate was set at 0.2 mL/min. The mass spectrometer was operated in both positive and negative electrospray ionization (ESI+ and ESI–) with selected reaction monitoring (SRM) mode. The ESI parameters were as follows: spray voltage, 3500 V for ESI+ and 2500 V for ESI–; sheath gas, 35 Arb; aux gas, 10 Arb; ion transfer tube temperature, 325 °C; and vaporizer temperature, 275 °C. Dwell time was 100 msec, and collision-induced dissociation (CID) gas was 2 mTorr. The parameters of MS/MS (retention time, SRM transition, collision energy and RF lens) are presented in Table2．通过将SRM过渡和保留时间与真实标准进行比较来分配分析物。使用通过通过绘制分析物的峰面积比相对于抗分析物浓度的内部标准构成的校准曲线来进行绝对量化（表3.）。汇集质量控制（QC）样品在每六个实验样品后运行，以检查批量可靠性。使用Xcalibur软件（3.0）用于数据处理和仪器控制。

统计分析

使用具有Tukey测试后Hoc分析的差异分析（ANOVA）分析SA代谢物的相对基因表达和量。使用Rstudio环境进行所有统计分析[62.]．

数据和材料可根据相应作者提供。因此，本研究不使用大型数据集未在公共存储库中存放任何补充数据。

2, 3-DHBA:

2,3-二羟基苯甲酸

ACP：

亚洲柑橘类洋谷

底层:

苯甲酸/水杨酸羧基甲基转移酶

C拉斯维加斯:

Candidatus.Liberibacter asiaticus

HLB：

黄龙冰

市场经济地位:

甲

台面:

SA甲酯（水杨酸甲酯）

NPR1：

致病性相关基因的非表达者1

PR-1：

发病相关基因1

SA：

水杨酸

SAG：

2 o -β-D-glucoside

SAR：

系统获得的阻力

UGT：

UDP-glucosyltransferases

我们感谢Kirsten Pelz-Stelinski博士为设备进行分析分析。我们感谢Kristin Racine在实验室的帮助和帮助。我们感谢Kara Clark和Angelique Hoyte为他们的增长室植物护理提供帮助。

这项工作得到了美国农业部HLB多机构协调（MAC）系统（AP17PPQS＆T00C163）的支持。这些资金的身体并没有参与这项研究，收集，分析和解释数据的设计，也没有在手稿，这是由作者完全写的文字。

隶属关系

1. 佛罗里达大学柑橘研究与教育中心昆虫与线虫系，佛罗里达阿尔弗雷德湖，佛罗里达33850，美国

   Freddy Ibanez＆Lukasz L. Stelinski

2. 佛罗里达大学柑橘研究中心，佛罗里达大学，阿尔弗雷德，弗雷德，33850

   Joon Hyuk Suh＆Yu Wang

贡献

FI和ls设计并构思了这个项目。JHS和YW进行了水杨酸代谢物分析。FI进行统计分析，FI和LLS撰写手稿。所有作者阅读，编辑，并批准手稿。

相应的作者

对应于弗雷迪Ibanez.或Lukasz L. Stelinski.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

开放获取本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。

再版和权限