昆虫食草动物的叶片诱导米防御反应

背景

对食草动物的植物防御始于感知。早期的植物检测到伤害，较大的植物将在其手臂与食草动物中受益。在喂食之前，稻瘟病的幼虫Cnaphalocrocis medinalis.，最初旋转丝并折叠叶子。米饭可以探测和保护自己C. medinalis.喂养。但是，米饭是否可以感知C. medinalis.叶子的滚动行为目前还不清楚。在这里，我们评估了叶片滚动的作用C. medinalis.水稻植物防御中的人造叶滚动及其间接效应两个重要C. medinalis.寄生虫（Itoplectis naranyae和ApantelesSP.．）通过挥发性分析，基因转录和植物激素分析的组合。

结果

天然叶子滚动C. medinalis.导致吸引力增加I. Naranyae.与12小时后的未损坏的植物相比。挥发性分析表明，总共22种成分中的六个顶部空间显着增加C. medinalis.与未损坏的植物相比，轧制厂。这些组分的主要成分分析显示了未损坏的植物顶部空间中的相似性，而领空挥发物C. medinalis.轧件明显延期。叶子滚动和喂养C. medinalis.上调植物转录组和一系列茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）相关基因。在12至36小时后喂养显着增加JA水平，在2至12小时后滚动显着增加。与人工轧制相比，36小时后，天然滚动显着增加了JA水平，在2和12小时后SA水平。

结论

我们的研究结果表明天然叶滚动C. medinalis.可以通过水稻植物感染。这种行为的检测可以作为最有利于水稻植物防御的预警信号C. medinalis.．

在整个生命周期中，植物体验生物和非生物应激，这可能会严重影响其生长和产量[1，2，3.］．在全球范围内，食草昆虫是最严重的生物问题之一，它们与植物有着密切的关系[4］．虽然昆虫已经进化了寻找宿主的方法，但植物正在选择压力下逃避攻击或在攻击时辩护4，5，6］．

为了抵御昆虫食草动物，植物已经进化了复杂和动态的防御系统。植物激素在调节植物防御方面发挥着重要作用[7，8，9］．植物激素茉莉酸(jasmonic acid, JA)和水杨酸(salicylic acid, SA)及其衍生物在植物防御病原体和草食昆虫的信号转导中发挥着重要作用[10.，11.］．植物激素可以调解植物防御的下游调节，包括直接防御机制，如防御蛋白质和酶的生产，以及涉及挥发性混合物的间接防御机制[12.，13.，14.］．

植物挥发物自然释放，它们的排放可以响应不同的应力因子而变化[15.，16.］．通过植物 - 昆虫共同进化，食草动物诱导的植物挥发物（HIPVS）已成为植物防御的节省成本武器，并且可用于吸引食草动物的天敌[17.，18.，19.］．自然敌人的主机识别是具体的，因为它们识别来自各种植物物种的挥发性混合物。然而，自然敌人的能力在于将HIPVS源区分取决于自然敌人对提示的距离[20.，21.，22.］．

植物与食草动物的相互作用冲突以感知开始。有趣的是，植物可以识别来自不同昆虫物种的攻击，并安装几种防御[23.，24.］．植物能感知昆虫的活动，如产卵、取食、在叶子表面行走，以及昆虫口腔分泌物和草渣提供的化学线索[25.，26.，27.］．纺纱是丝绸生产昆虫的重要活动。生产丝绸的能力在许多昆虫中演变，并且用于完成增强生存的各种活动[28.，29.，30.］．据报道，一些昆虫的蛛丝能吸引寄生蜂。例如,美纳甜蜜素（Ratzeburg）（Hymenoptera：Braconidae）对吉普赛蛾丝和丝绸提取物具有积极的反应Plodia interplyplyla（Hübner）（Lepidoptera：Pyralidae）幼虫也会吸引寄生黄蜂[31.，32.］．然而，没有研究纺纱后的滚动行为是否可以介导植物防御。

在亚洲，米叶文件夹，Cnaphalocrocis medinalis.guenée（鳞翅目：帕尔育植物）是稻田最重要的害虫之一[33.］．这种害虫的严重喂养通常会影响水稻植物的生长，导致屈服损失[34.，35.］．各种寄生蜂C. medinalis.通常存在于稻田中，如Itoplectis naranyae（Ashmead）（Hymenoptera：Ichnneumonidae）和ApantelesSP.．(膜翅目:茧蜂科)(36.，37.］．特征行为C. medinalis.幼虫在进食前先吐丝，纵滚叶片[38.，39.］．有报道表明喂养行为C. medinalis.可以诱导水稻防御，但没有证据表明是否在害虫之前单独携带叶片，可以通过工厂感知[40，41.］．

早期检测食草动物有利于植物发展有效和可持续的防御。因此，确定水稻植物是否可以检测到早期威胁是重要的C. medinalis.叶滚动，通过对害虫引发防御[42.］．在这项研究中，我们研究了水稻植物反应的动态C. medinalis.叶子滚动，C. medinalis.叶子轧制和喂养和人造叶子滚动，并与未损坏的植物相比。为了实现这一目标，我们综合来自WASPS的行为测定，植物挥发性谱，植物转录和植物激素谱的结果。

自然敌人的行为

我们假设叶片滚动行为C. medinalis.幼虫可以触发水稻植物防御。因此，我们测试了两只寄生虫的偏好（I. Naranyae.和ApantelesSP.．） 有关联C. medinalis.幼虫。Itoplectis naranyae与未受损植株相比，12 h后明显首选自然滚动处理(X² = 6.3684,DF. = 1,P = 0.0116) (Fig.1一种）。然而，与未损坏的植物相比，两种黄蜂物种对24小时诱导后，对天然轧机没有显着偏好（图。1b）。为了探索天然敌人可以检测到植物叶的鞋底滚动，我们还测试了在未损坏的植物和人工轧制厂之间的黄蜂的行为选择。然而，在12和24小时后观察到在未损坏的植物和人工轧制植物之间对两种黄蜂物种的偏好偏差（图。1C和D）。

水稻植物挥发物分析

为了探讨天然敌人行为的原因，我们分析了植物挥发物在未造成的植物，人工轧制厂和天然轧制厂。共有22种挥发性组分，包括几种萜烯，醛，酮和酯（表1）。通常，这些组分在未损坏的植物和人工轧制厂的顶部空间中发生较低量，并且在天然轧制厂的顶部空间中较高。在42种成分中，在自然轧制厂的顶部空间中，六个在12和24小时后显着提高了六个（P <0.05）。主成分分析还表明，未损坏的植物和人工轧制厂的顶部空间挥发物具有相似的，但自然轧制厂的顶部空间挥发物从未造成的植物和人工轧制厂（P <0.05），特别是在12小时后损坏（图。2A和B）。

米叶的全局转录组变化响应Cnaphalocrocis medinalis.侵犯

我们使用高通量测序来阐明水稻中全球转录本的丰度，然后比较人工碾压、自然碾压和碾压饲养植物与未受损植物的表达谱。与未受损植株相比，碾压和饲养处理引起了水稻植株转录水平的剧烈变化，而人工碾压引起了轻微变化(图2)。3.）。与未润润的植物相比，上调1073个基因，分别在天然轧制工厂中调节870个基因，分别在轧制和饲养植物中上调和下调2899和1807个基因（表2）。Kegg浓缩分析表明，激活了许多防御或应力相关的途径，包括植物激素途径（见附加文件1：图S1）。此外，使用GO工具鉴定了与本研究中使用的不同治疗相关的水稻植物JA和SA途径的转录响应（图。4）。其中，基因如脂氧合酶（熏鲑鱼），氢过氧化物脱氢酶（AOS.），联烯氧环酶（AOC.），12-苯二甲二烯酸还原酶（opr.）与JA途径相关的同源物被上调，特别是在轧制和进料处理之后（图。4一种）。对于SA途径，TGA转录因子（矫正性大动脉转位），致病相关（PR.）蛋白质和调节蛋白NPR1（NPR1.)基因在自然滚动处理中上调，而苯丙氨酸解氨酶(朋友），矫正性大动脉转位和NPR1.与未湿润的处理相比，基因在滚动和喂养处理中进行上调（图。4b）。

茉莉酸和水杨酸分析

基于与激素信号传导相关的转录物轮廓变化，我们测量了天然轧制，轧制和喂养和人工轧制处理中的JA和SA水平，并通过使用LC / MS与未损坏的植物相比。在所有测试时间点的人造滚动处理和天然滚动处理中，观察到JA和SA生物合成水平的类似和增加趋势（图。5）。JA的积累比其他12小时的其他治疗更大。自然滚动处理中的茉莉酸水平显示出与0小时至24小时的显着差异，但与其在人工轧制厂的水平相比（P <0.01,无花果。5一种）。在2小时和12小时后，水杨酸水平显着高于其他治疗（P <0.01)。然而，滚动和喂饲处理24 h和36 h后的SA水平显著高于其他处理(P <0.01,无花果。5b）。

近年来植物和昆虫之间的关系受到了很大的关注，大多数研究侧重于植物对食草昆虫的抗性[43.，44.］．植物 - 昆虫共同进化对于物种多样性和生存至关重要[5］．为植物制定有效和可持续的防御侵略者，早期发现侵略者是必不可少的[45.］．在我们的研究中，米叶滚动C. medinalis.导致植物JA和SA水平增加，并在植物挥发性混合物的释放中帮助植物吸引食草动物的天敌(图。6）。

寄生脂肪通常使用不同的线索来定位他们的主持人[22.］．在我们的研究中，我们观察到I. Naranyae.在害虫侵袭12小时后明显优选的自然轧制植物在未损害植物上。然而，与未损坏的植物相比，两种黄蜂物种对24小时诱导后，对天然轧制的植物没有显着偏好。同样，在12和24小时后，两种黄蜂物种都不是优选的未润润，也不是人工轧制的植物。在定位目标主体时，这两个黄蜂采用的主机提示没有报告。因此，应该进行进一步的研究，以解开涉及WASPS主机位置策略的提示。

在感知后，植物在一系列步骤中响应压力[46.，47.］．一般来说，伤口可以诱导直接和间接的植物防御，例如植物挥发物的变化，并吸引攻击者的自然敌人[48.，49.］．我们的研究结果表明，天然卷稻叶C. medinalis.显着增加了六种挥发性组分，而在诱导12小时后，人工轧制显着增加了一个挥发性组分。主要成分分析表明，天然轧制处理厂的顶部空间挥发物显着差异，特别是在12小时后损坏。我们还发现黄蜂物种对从植物发出的异味的强烈反应C. medinalis，与未损坏的植物相比，可能是由于HIPVs，其改性其挥发性有机化合物（VOC）型材。

与人工轧制的植物相比，水稻植物植物植物植物植物植物植物植物植物植物植物综合存在显着差异：2小时后2小时后SA，以及JA。与人造轧制相比，叶片滚动行为对植物免疫具有叠加的影响。因此，我们的结果表明植物防御联系的相关性C．麦格文里斯叶滚动行为。蛋白质组学Bombyx Mori.Linnaeus（Lepidoptera：Bombycidae）是一种丝绸生产昆虫，揭示了许多酶，蛋白酶抑制剂和其他未知蛋白质涉及植物防御措施。其中，将40种蛋白酶抑制剂鉴定为参与调节或保护宿主植物免受侵扰[50.］．但是，丝绸部件来自C. medinalis.可能在当前的研究中确定了可能引发植物反应的植物反应。未来的研究应解开这些特定的组件和涉及的活性成分C. medinalis.丝绸生产和伴随的植物防御。此外，可能需要涉及丝绸的应用和使用丝绸的应用，以丝绸的应用，以评估本研究中报告的植物的类似防御反应。

我们的研究还调查了植物对取食行为的防御，以探索水稻在转录组和代谢水平上翻滚和取食行为之间的防御差异。植物转录组分析显示，在滚动和饲养处理中，ja相关基因表达上调(图。4a).一些sa相关基因在自然滚动、滚动和饲养处理中也上调。本研究结果表明，水稻植株均能感知自然碾压和碾压和饲养处理，但植株的防御机制在激素水平上存在差异。茉莉酸是植物抵御昆虫侵害的重要物质。显然，与其他处理相比，饲粮大大增加了茉莉酸的含量。水杨酸在早期防御草食昆虫中也起着重要作用。例如,两个Helicoverpa Zea（Boddie）（Lepidoptera：Noctuidae）和Pieris Rapae（Linnaeus）（Lepidoptera：Pieridae）分别在棉花和拟南芥中升级[14.，51.]．我们建议进一步研究，以确定是否可以在基因表达水平上进行JA-SA协同作用C. medinalis.- 挑战MH63稻植物。还需要进一步的研究来确定该胎选系统中涉及的机制，振动器和偶联的气相色谱/电器色谱检测活性组分。

我们的研究表明，类似于其他胎选系统，HIPV和植物激素JA和SA介导的米饭 -C. medinalis.-I. Naranyae.胎选性互动[22.，52.］．我们提供第一个证据表明米叶滚动C. medinalis.诱导JA和SA信号传导途径和HIPVS发射作为植物防御。此外，我们的研究表明人造轧制，天然轧制和轧制和饲养治疗中的水稻防御差异。这可能是由于大米检测和捍卫其侵略者的不同elictors的存在。我们的调查结果还提供了一种新的开始，探讨了叶片轧制对相关植物和天敌的蚕昆虫的影响。

植物和昆虫

在这项研究中，我们使用了米饭（栽培稻籼稻品种明恢63 (MH63)是一种具有遗传稳定性的恢复系。在华中农业大学大棚内，将MH63种子单粒预萌发后播种于直径10 cm ×高8 cm的塑料盆中，灌施0.5 g复合肥(N:P:K = 14%:16%:15%)。植物生长在28±4°C，相对湿度75±5%，光周期比12/12 h，光/暗的自然光照条件下。这些植株每天浇水，在分蘖期用于饲养和试验。

的C. medinalis.从自然发生的个体开始，从Xiaogan（113.91°E; 31.92°N）收集的自然发生的个体。将昆虫保持在水稻的实验室，在26±2°C，75±5％的相对湿度，6/8小时，光/暗的光周期比。昆虫害虫的第五龄阶段用于所有实验。

的成年人I. Naranyae.和ApantelesSP.．均采自孝感县稻田，用于y型管嗅觉体试验。实验前，每个寄生蜂种的成虫喂食10%的蜂蜜溶液直到交配。交配后，将寄生蜂转移到行为实验室，至少在生物测定前30分钟，使其适应实验条件。

植物治疗

对水稻植株旗叶进行以下处理:(一)未受损(健康水稻);(2)人工滚动;(iii)自然卷叶(叶片卷叶无需喂饲C. medinalis.）;及(iv)滚轧和喂料(C. medinalis.滚动和喂养叶子）。对于人造轧制处理，我们使用由无机材料制成的白色薄螺纹，以围绕米叶扎成模仿C. medinalis.丝绸纺纱和叶片行为。对于天然轧制处理，在完成轧制后，仔细观察并从叶片中仔细观察并从叶片中除去昆虫，以防止在叶子上饲喂。在嗅觉计测定和挥发性分析之前，通过人工轧制和天然轧制诱导单个植物12或24小时。通过人工轧制，天然轧制和轧制和进给12小时，并通过人工轧制，天然轧制和轧制和植物前进给2,12,24，或36小时，促进植物12小时。健康的未损坏植物充当控制。

寄生虫种类的行为响应Cnaphalocrocis medinalis.诱导宿主植物挥发物

回复I. Naranyae.和Apantelessp。使用Y管嗅觉（ARM长度：18cm和内径：1.5cm）测试不同植物气味源的女性对不同植物气味源的雌性进行测试。管的一个臂与气味源和另一个臂连接到控制处理。提供60 W的白炽灯灯泡提供照明。用200mL min的流速将炭过滤的清洁空气通过Teflon管进入嗅觉计的每个臂中^{- 1}并以相同的速率，通过电池供电的便携式真空泵（Sensen，浙江，中国）以相同的速率从嗅觉计的主臂中拉出。

雌寄生蜂在y管主臂一次释放1个。研究人员打开这个泵系统，以测试女性对测试气味或控制气味的偏好，每位女性有5分钟的时间做出选择。每隔3次寄生蜂试验后，改变y管试验臂和控制臂的位置，以避免位置偏倚。六次试验后，常规更换了连接特氟隆管和植物处理。每对试验使用至少15个雌性寄生蜂个体作为重复，并控制气味来源。如上所述，生物检测室保持同样的环境条件。

收集和分析植物挥发物

我们使用闭环动态顶空挥发收集系统来收集8小时的挥发物，如Sun等人所述。[53.］．将净化的空气推入含有500ml min的每个植物处理的玻璃瓶子里^{- 1}并通过含有真空捕获的真空从罐子中汲取，用Super Q吸附剂（每个; Alltech Associates Inc. Deerfield，IL，USA）包装。空气净化系统由（1）炭（1）炭（活性炭，6至14目，Fisher Scientific），（2）5A分子筛（珠子，8至12目，Sigma-Fluka）和（3）硅胶橡胶（干燥剂不含金属盐，硅胶，西格玛群）。每个气味源复制四次集合。

在使用超Q挥发捕集后8小时后，用1ml正己烷乙酸盐洗脱每个过滤器，用10μl内标（0.1mg / ml壬酯，Sigma）掺入，并储存在-40℃直至化学分析。通过偶联的气相色谱/质谱（GC / MS）（QP-2010，Shimadzu，Shiga，Japan）分析挥发性提取物，配备HP-5 MS熔融二氧化硅柱（30m×0.25mm×0.25μm）（安捷伦科技，美国）。氦气（1毫升^{- 1}）用作载气，保持40℃的初始烘箱温度1分钟，在8°C min时升高^{- 1}到300°C，并保持5分钟。使用拟分子离子鉴定化合物。此外，在用于粗挥发分析的相同条件下，使用GC / MS上的GC / MS上的真实标准证实了几种化合物的结构分配。定量基于由所鉴定的化合物的真实标准产生的校准曲线（峰面积）。将每个组分的峰面积与内标峰面积的相对量的百分比进行比较。

RNA隔离，图书馆施工和测序

使用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies）进行植物叶的总RNA提取。使用Nanodrop ND 1000仪器（Nanodrop Technologies，Wilmington，De，USA）测定RNA纯度和数量。使用Truseq RNA样品制备试剂盒（Illumina，San Diego，Ca，USA）产生测序文库。每种治疗包括三种生物重复。

生物信息学分析

使用cutadapt（v1.15）软件聚集基因表达模式以过滤测序数据并产生高质量序列（清洁数据）以进行进一步分析。基因被映射到基因本体中的“术语”数据库，并且每个术语计算差异富集的基因的数量。DESEQ（1.30.0）用于分析差动基因表达，如下筛选条件：表达差异多次₂FoldChange| > 1和意义P< 0.05。然后，通过超几何分布计算差异富集基因显著富集项。利用GO富集分析获得差异表达基因显著富集的GO功能项，揭示可能的功能。采用京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径富集分析对差异表达基因进行富集分析。我们统计了KEGG通路不同水平上差异表达基因的数量，确定了差异表达基因主要参与的代谢通路和信号通路。对于每个处理，从单个植物中提取3个生物重复。

茉莉酸和水杨酸分析

收集水稻叶（大约50mg鲜重），立即冷冻在液氮中，并在-80℃下储存直至分析。如前所述进行分析[55]进行。在液氮中研磨后，在500μL萃取溶剂中萃取50mg各样品（2-丙醇/小时₂o /浓缩的HCl，v / v / v）在2：1：0.002的比例中，并用10μl内标（5μg/ ml二羟基酸和5μg/ ml d4-水杨酸; sigma）。将样品在恒温混合器（MTC-100，中国，中国）以100rpm和4°C的恒温混合器（MTC-100，中国）均质化。然后，将1ml二氯甲烷加入到样品中并在相同条件下均化。将样品以13,000g和4℃离心5分钟，并将底部水相收集到清洁的2ml安静瓶中。然后使用氮蒸发器完全干燥样品，并通过加入100μl甲醇溶解。使用0.22μM有机过滤膜纯化样品并在-20℃下储存直至分析。

使用液相色谱/质谱（LC / MS）系统（XEVO G2-XS QTOF）分析样品并在4℃下保持在恒温器控制室中。茉莉酸和SA水平由内源激素峰值和已知的内标比率计算。将每个组分的峰面积与内标峰面积的相对量的百分比进行比较。对于每种治疗，对四到六次重复进行采样。

数据分析

用于表现出不同类别的宿主植物气味的寄生虫种类的差异。单向ANOVA用于显示不同治疗类别的植物激素（JA和SA）水平和挥发性组分的差异。使用SIMCA软件进行植物挥发物的主要成分分析。高通量测序用于阐明水稻植物中的全球转录性丰度，并比较未损坏，人造轧制，天然轧制和轧制植物治疗的表达谱。所有测试都进行了P < 0.05 statistical significance level and all data were analyzed in SPSS version 19.0 software.

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。

GC / MS：

气相色谱/质谱

HIPVs:

草食虫诱导的植物挥发物

JA：

茉莉酸

LC / MS:

液相色谱/质谱

MH63：

明辉63.

山:

水杨酸

VOC：

挥发性有机化合物

在实验室实验期间，我们了解华中农业大学工作人员的检测和分析中心，以获得技术援助。

该研究得到了国家重点研究和发展方案（2017年FFE0113900号）和湖北省专项技术创新（2017年146号）的财政支持。资金机构在研究和收集，分析和解释方面没有在数据和写作稿件的设计中没有作用。

隶属关系

1. 华中农业大学植物科学与技术学院，武汉，430070，中华人民共和国

   金华士，泽太阳，新军胡，环南金，卡罗琳·尼戈普菲亚岛，郝柳，朝王，乐刘，冯峰李和人王王

贡献

J-HS，ZS，HL和M-QW构思和设计了实验;J-HS，X-JH，CW，LL和CNF进行了实验;J-HS，ZS，H-NJ和F-FL分析了数据;J-HS，ZS，CNF和M-QW写了纸张。所有贡献作者都同意了稿件的最终版本。

通讯作者

对应到王某．

伦理批准和同意参与

我们研究中使用的所有植物材料（包括种子）被允许并从华中农业大学作物遗传改善国家重点实验室获得。植物的实验研究，包括植物材料的收集，符合机构，国家或国际指南。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益..

出版商的注意事项

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