利用高密度遗传图谱鉴定野生大豆α-生育酚合成增加的数量性状位点gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

大豆是生育酚(Toc)最重要的作物来源之一。然而，α-Toc(人类维生素E活性最高的一种亚型)的含量在大多数品种中很低。为了拓宽遗传变异，我们对野生大豆中检测到的一个高种子α-Toc性状进行了QTL分析，并对γ-生育酚甲基转移酶(gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba）基因的潜在候选人。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

利用低α-Toc育种系TK780与高α-Toc野生种系B04009杂交，建立了重组自交系群体。种子中的α-Toc含量与α-Toc与γ-Toc含量的比值密切相关。利用7710单核苷酸多态性（SNP）构建的高密度图谱进行QTL分析通过限制性位点相关DNA测序检测到6个涉及α-Toc生物合成的QTL。其中，染色体（Chr）9、11和12中的3个在2年的试验中产生了一致的效应。Chr9和Chr12中QTL上的B04009等位基因和Chr11中QTL上的TK780等位基因都促进了γ的转化gydF4y2Ba-gydF4y2BaTOC到α-TOC，其中升高的种子α-TOC的内容。在三个父母之间进行检测SNP和插入缺失gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因(gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Baγ-TMT2,gydF4y2Ba和gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba）共同位于CHR 9和Chr12的QTL，其中一些在种子发育和功能相关的顺式调控元件的存在。在不成熟的子叶，gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba与TK780相比，B04009在两种热条件下的表达水平更高，而gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba2在高温下明显上调，尤其是B04009。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们识别QTLS在2年试验中始终如一地控制野生大豆种子中的α-TOC生物合成。CHR9上的QTL先前已在大豆中识别，而CHR11和CHR12上的QTL是新颖的。QTL的进一步分子解剖和表征可以促进在大豆育种中使用来自野生大豆的高α-TOC等位基因，并对大豆种子中α-TOC生物合成的分子机制的理解。gydF4y2Ba

生育酚(维生素E家族)是亲脂抗氧化剂，可以防止不饱和脂肪酸的氧化。生育酚有四种亚型:α-、β-、γ-和δ-生育酚，其中α-生育酚(α- toc)与肝脏生育酚转移蛋白的亲和力最高，因而具有人类最高的维生素E活性[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．除了维生素E的活性，α-Toc还在预防与衰老有关的疾病，如心血管疾病和癌症中发挥作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

大豆（gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2Ba大豆 - ）是世界上最重要的农作物之一，因为它是油，蛋白质，淀粉，膳食纤维，矿物质和维生素的主要来源，并用作生产生物柴油，饲料和化妆品的材料。与其它油籽作物相比大豆油具有相对高的总生育酚含量，最主要形式是γ-TOC。该α-TOC含量通常小于10％的总TOC含量的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]考虑到大豆是一个主要的石油来源，提供了全球总石油消费量的30%，增加种子α-Toc含量可能为大豆的新食品和工业用途开辟机会。gydF4y2Ba

植物中生育酚的生物合成已被很好地描述[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.富含同型酸甲酸（HGA）的芳香头和同型植物植物植物植物植物植物的聚丙烯侧链之间产生2-甲基-6-PHYTYL-1,4-苯醌（MPBQ），其通过MPBQ甲基转移酶（MPBQ-MT）进一步甲基化至2，3-二甲基-6-phytyl-1,4-苯醌（DMPBQ）。MPBQ和DMPBQ通过生育酚环化酶分别通过HGA头环化转换为γ-TOC和Δ-TOC。生育酚生物合成途径的最终步骤是通过γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）的γ-TOC和Δ-TOC至α-TOC和β-TOC的转化。MPBQ-MT和γ-TMT在确定种子生育酚组合物方面是至关重要的。γ-TMT活性以α-TOC /γ-TOC比率反映，而MPBQ-MT活性反映在（α-TOC +γ-TOC）/总TOC比中（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， MPBQ-MT和γ-TMT由gydF4y2BaVTE3gydF4y2Ba和gydF4y2BaVTE4gydF4y2Ba分别为(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．这gydF4y2BaVTE4gydF4y2Ba过表达在大豆种子被报道提高了通过了α-TOC比至70％[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．gydF4y2BaVTE3gydF4y2Ba和gydF4y2BaVTE4gydF4y2Ba共表达进一步增加了α-TOC比至90％和在大豆种子中降低了δ-TOC和γ-TOC比二者[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

大豆品种有不同的种子Toc含量和组成[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]，这自然变异的基础的遗传和分子基础已被广泛研究[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]Dwiyanti等人（2011年）[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba] detected a major quantitative trait locus (QTL) in chromosome (Chr) 9 which accounted for 55% of the phenotypic variation in a recombinant inbred line (RIL) population of a cross between the Japanese standard soybean cultivar Ichihime (α-Toc ratio < 10%) and a high α-Toc cultivar from Eastern Europe, Keszthelyi Aproszemu Sarga (KAS; α-Toc ratio > 20%). The QTL region contained a γ-tocopherol methyltransferase gene designated asγ-TMT3gydF4y2Baβ-葡萄糖醛酸酶报告子辅助分析gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba进一步证实KAS启动子比Ichihime启动子具有更高的活性，可能是由顺式调控元件中的单核苷酸多态性(SNPs)以及启动子中的MYBCORE和CAAT盒基序引起的[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．基于这些结果，Dwiyanti等。（2011）[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]建议使用gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba与来自KAS高启动子活性可以提高大豆种子的α-TOC内容的手段。γ-TMT3的作为γ-TOC甲基转移函数是由纯化的酶的催化试验在异源表达的确认gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

另外大豆有两种紧密联系gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba的基因,gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba和gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba，在第12页[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．三个TMT蛋白(γ-TMT1、γ-TMT2和γ-TMT3)之间氨基酸相似性高达90.5 ~ 94.4%。根据质体过境肽预测，只有γ-TMT2具有质体过境肽信号[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba表达被报道提高种子α-TOC含量3-4.5倍和4-6在玉米中过表达时折叠（gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba分别为(gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]．因此，它也可能参与大豆种子α-Toc的生物合成。gydF4y2Ba

野生大豆(gydF4y2Ba甘氨酸大豆gydF4y2Ba)是一个巨大的大豆品种改良的潜在有用变异库。迄今为止，它已被用于提高大豆育种中种子的产量、抗逆性、抗病性和营养成分[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．根据来自日本和韩国，Dwiyanti等的各个区域收集了528个野生大豆种质进行了调查。（2016）[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]发现11份高α-Toc比值的植物。启动子和5 ' -非翻译区序列分析gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba将11份材料分为4个单倍型，其中1份与单倍型相同gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba内的序列。对野生材料，特别是新材料高α-Toc的分子遗传学研究gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba因此，启动子单倍型可用于扩展大豆中α-TOC生物合成的遗传多样性。gydF4y2Ba

本文报道了野生种质B04009检测到的一个高α-Toc性状的QTL分析结果，并对其进行了测序和表达分析gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因作为潜在的候选QTL。本研究的目的是，首先要确定是否在B04009升高的α-TOC比用相同QTL控制如结合KAS交叉检测，并且第二发现新基因，以改善野生登记的种子α-TOC内容．gydF4y2Ba

不同热条件下的生育酚含量和父母大豆品系的比率gydF4y2Ba

比较了20℃和30℃成熟的种子Toc含量和组成，发现TK780和B04009具有不同的种子Toc生物合成特性。在种子发育过程中，无论温度如何，TK780的种子生育酚含量都比B04009高约两倍(见表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在20°C下，B04009的α-Toc含量均高于TK780 (gydF4y2BatgydF4y2Ba= 8.36,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 1.6 × 10gydF4y2Ba^{- 4.gydF4y2Ba})及在30°C (gydF4y2BatgydF4y2Ba= 5.71,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 1.3 × 10gydF4y2Ba^{- 3.gydF4y2Ba}），尽管其较低的总TOC含量的。这α-Toc content elevation in B04009 was associated with increments of both the (α + γ)/total ratio (ratio of the sum of α-Toc and γ-Toc contents to the total Toc content) and the α/γ ratio (ratio of the α-Toc content to the γ-Toc content), reflecting the extent of conversions from MPBQ to DMPBQ and from γ-Toc to α-Toc, respectively. The α-Toc contents increased as temperatures increased in both B04009 (tgydF4y2Ba= 7.57,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 1.3 × 10gydF4y2Ba^{- 4.gydF4y2Ba}）和TK780（gydF4y2BatgydF4y2Ba= 3.80,gydF4y2BapgydF4y2Ba = 0.032），如先前研究所述[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．这（α + γ)/total and α/γ ratios also increased as temperatures rose, and the increase in the α/γ ratio of B04009, which increased 5.5-fold more at 30 °C than at 20 °C, was particularly marked (Table1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

α-生育酚含量的变异和群体群体中的比例gydF4y2Ba

九十四重组自交系群体通过从F单粒传法开发gydF4y2Ba_2gydF4y2BaTK780与B04009杂交种群。两个父母开花习性不同;札幌的下自然日照（ND）的条件下（43°07'N，141°35'E），TK780开花在七月中旬而B04009在九月下旬花。重组自交系的开花时间还父母的ND条件下开花时间的范围内广泛地变化（数据未显示）。To reduce the variation induced by different thermal conditions associated with flowering and maturing times, the RILs were grown under short-day conditions in a greenhouse where the air temperature was controlled at 25 °C.

种子Toc含量在δ-Toc、γ-Toc和总Toc的亲本值范围内持续变化，但α-Toc含量略高于亲本值(2016年和2017年)(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.α-Toc含量2016年为7 ~ 115 μg/g (TK780种子24 μg/g, B04009种子62 μg/g)， 2017年为9 ~ 91 μg/g (TK780种子32 μg/g, B04009种子46 μg/g)。各指标间年相关系数均显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01);α-Toc含量最高(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.772)，说明与其他生育酚含量相比，α-Toc的生物合成相对稳定(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2BaA).两年中α-Toc含量与δ-Toc和γ-Toc含量均无相关性(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2BaB），但弱与总有机碳含量相关;的相关系数（gydF4y2BargydF4y2Ba = 0.292）仅在2016年显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和b)。相反，两者之间有很强的正相关性(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.747 ~ 0.931)， δ-Toc、γ-Toc和总Toc内容(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

接下来，我们调查了(α + γ)/总和α/γ比值在RIL群体中的变化。(α + γ)/总比值在亲本值范围内持续变化，但部分品系的α/γ比值高于B04009(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.两项比率均显示显著性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)年间正相关，α/γ比值(gydF4y2BargydF4y2Ba = 0.768) than the (α + γ)/total ratio (rgydF4y2Ba= 0.474)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。两个比率进一步正与在这两个年度的α-TOC内容相关;the correlation with the α-Toc content was stronger for the α/γ ratio than the (α + γ)/total ratio (Fig.3CgydF4y2Ba到gydF4y2Ba3F.gydF4y2Ba）.这two ratios also exhibited significantly positive (P < 0.01) correlations with each other (rgydF4y2Ba= 2016年0.541，gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.472)。综上所述，RIL群体种子α- toc含量主要与α/γ比值(γ- toc向α- toc转化的程度)有关，其次是(α + γ)/总比值(MPBQ向DMPBQ转化)，但与总生育酚产量关系不大(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和b)。gydF4y2Ba

高密度连锁图谱的构建gydF4y2Ba

在进行QTL分析之前，我们构建了一个基于snp的全基因组遗传图谱，共包含从限制性位点相关DNA测序中获得的7710个snp。使用IciMapping软件构建联动图[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．这entire length of the linkage map was 3211.6 cM, and the length of each chromosome ranged from 121.3 cM for the smallest linkage group of Chr9 to 221.1 cM for the largest one of Chr11. The average genetic distance between neighboring SNP markers was 1.4 cM; the largest gap between SNPs in each chromosome ranged from 5 cM in Chr3 and Chr4 to 34.1 cM in Chr11. The gaps were mostly caused by a lack of SNPs available to map between the two lines.

QTL的有机碳含量gydF4y2Ba

QTL分析采用QTL IciMapping中添加性QTL的包含复合区间作图[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．根据置换，如果赔率（LOD）得分的对数超过3.576两个年度（QTL可显著gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。我们检测到了显著的cr5 (gydF4y2Ba问αTC-5gydF4y2Ba), Chr9 (gydF4y2Ba问αTC-9gydF4y2Ba），CHR11（gydF4y2BaqαTC-11gydF4y2Ba），和Chr12（gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba)在2016年，并在Chr9 (gydF4y2Ba问αTC-9gydF4y2Ba)和Chr12(gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.此外,gydF4y2BaqαTC-11gydF4y2Ba在2017年的Chr11检测到LOD评分为3.2，尽管这低于显著性阈值。Chr9、Chr11和Chr12 3个qtl的图谱位置在2年之间相同或几乎相同，表明该效应是由相同的qtl引起的。B04009等位基因增加了α-Toc含量gydF4y2Ba问αTC-9gydF4y2Ba和gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba但在gydF4y2Ba问αTC-5gydF4y2Ba和gydF4y2BaqαTC-11gydF4y2Ba．这些，gydF4y2Ba问αTC-9gydF4y2Ba具有最高的LOD值（14.3在2016年，13.1 2017年）与α-TOC含量最大的累加效应。共同地，检测到的QTL占56.4％（2016），并在RIL群体中观察到的表型变异的54.2％（2017）。gydF4y2Ba

δ-Toc含量的qtl仅在2017年检测到。三个法(gydF4y2Ba问δTC-4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba问δTC-6gydF4y2Ba,gydF4y2BaqδTC-19gydF4y2Ba)的δ-Toc含量;野生等位基因增加了δ-Toc含量gydF4y2Ba问δTC-4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba问δTC-6gydF4y2Ba并减少它在gydF4y2BaqδTC-19gydF4y2Ba．这些，gydF4y2BaqδTC-19gydF4y2BaLOD得分最高(14.1)，仅占RIL群体表型变异的32%。三个法(gydF4y2Ba问γTC-6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba问γTC-13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba问γTC-14gydF4y2Ba）在2017年的γ-TOC含量进行检测;野生等位基因在两个的QTL，它们共同占整个变化的20.2％增加了γ-TOC的内容。在CHR 7，检测到了在2016年γ-TOC含量的QTL。只有一个QTL（gydF4y2Ba昆士兰旅游观光公司-1gydF4y2Ba）在2016年在α-TOC内容中检测出的四个的QTL，因此总-TOC内容中检测，没有重叠的那些为δ-TOC，γ-TOC，和总-TOC内容，与不存在一致的α-TOC的内容和其它内容（图之间的相关性。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA和B，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

QTL用于TOC比率gydF4y2Ba

同时对(α + γ)/总和α/γ比值进行qtl分析。仅检测到α/γ比值显著的qtl: 4个qtl在Chr9 (gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba），CHR11（gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba），和Chr12（gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaqαγR-12.2gydF4y2Ba）在CHR 9 2016和四个的QTL（gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba），CHR11（gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba), Chr12 (gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba)和Chr17 (gydF4y2Ba问αγR-17gydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.因为他们有相同或几乎在2年同一地图位置的3个QTL，gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba,gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba在此期间，始终控制所述α/γ比率。所述B04009等位基因正控制的α/γ比率在gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba和gydF4y2Ba问αγR-12gydF4y2Ba．gydF4y2Ba1gydF4y2Ba但负面gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba，gydF4y2BaqαγR-12.2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba问αγR-17gydF4y2Ba．gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba曾在这两年的最高LOD值（18.2在2016年，21.1在2017年）。总的来说，这四个的QTL占63.3％（2016），并在RIL群体检测出的整个变化的68.2％（2017）。单核苷酸多态性侧翼gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba,gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba是相同的或附近的那些QTL的α-TOC内容的（gydF4y2Ba问αTC-9gydF4y2Ba，gydF4y2BaqαTC-11gydF4y2Ba,gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba)，表明它们控制α/γ-Toc比和α- toc含量。gydF4y2Ba

3个qtl对α/γ比值的加性效应gydF4y2Ba

接下来，我们评估了三个主要qtl的加性效应(gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba,gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba)为α/γ比值。根据qtl的侧边SNPs将ril分为8个基因型，并比较各基因型之间的平均α/γ比值。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，来自B04009的等位基因gydF4y2Ba问αγR-9gydF4y2Ba和gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba还有TK780的gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba每两个相加年增加了α/γ比率。gydF4y2Ba

α-Toc生物合成qtl候选γ-TMT基因的序列多态性gydF4y2Ba

我们对Williams 82基因组序列(Phytozome v12.1/)中Chr9、Chr11和Chr12 qtl基因组区域的α- toc含量和α/γ比值进行了分析gydF4y2Ba甘氨酸最大gydF4y2BaWm82.a2.v1）gydF4y2Ba问αTCgydF4y2Ba/gydF4y2BaαγR-9gydF4y2Ba区域包含gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba(Glyma.09G22280，物理位置:44,341,1974 - 44,346,311);本研究已鉴定为高α-Toc大豆品种与低α-Toc大豆品种杂交的高α-Toc QTL候选[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]我们在最近的两个基因标记之间没有发现直接参与生育酚生物合成的基因gydF4y2Ba问αTCgydF4y2Ba/gydF4y2Baαγr - 12.1gydF4y2Ba， 但gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba(glyma . 12g0143001，物理位置:1,033,151-1,037,054)和gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba(Glyma.12G014200.1，物理位置:1,025,584-1,029,095)除侧边标记S12 1,740,699外，分别位于703 kb和711 kb。gydF4y2Ba

有31个基因位于gydF4y2Ba问αTCgydF4y2Ba/gydF4y2BaαγR-11gydF4y2Ba标记S11_31748669和S11_32039088（表之间的区域gydF4y2Ba2gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.其中，18个基因在发育中的种子和豆荚中表达(SoyBase;gydF4y2Bahttps://soybase.org/gydF4y2Ba）;然而，目前尚无基因参与Toc生物合成。候选基因可能位于QTL附近。因此，我们对其侧翼区域进行了研究，并在上游和下游选择了大约35个基因，包括一个400 kb的区域。在100个筛选的基因(Glyma.11G219000 ~ Glyma.11G228900)中，有4个锌指转录因子。其中两个基因在种子和豆荚中表达，RING-H2 FINGER C2A (Glyma.11G220400)和Znf_GATA (Glyma.11G226400)(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2BaSoyBase;gydF4y2Bahttps://soybase.org/gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

我们比较了三个序列gydF4y2BaγtmtgydF4y2BaTK780和B04009之间的基因。启动子区1350 bp序列gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba已经在B04009被确定和示出从KAS [相对于不同〜21个SNP和四个插入缺失gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．TK780和B04009具有与大豆参考基因组威廉姆斯82（Glyma.09G222800.1）相同的编码序列，但是在已知的顺式联合元素中有13个SNP，其中10位（附加文件）gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.TK780具有2SSEEDPROTBANAPA，这是在许多储存蛋白基因启动子中保存的顺式元件[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba和种子特异性顺式元件CANBNNAP [gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]，而B04009中含有MYB1AT和CAATBOX1，这两种元素以前被检测为高α-Toc比值的品种所特有的顺式元素[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在的外显子5中检测到的非同义置换gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba；在Williams 82 (glyma . 12g0143001)和B04009 (Additional file . 12g0143001)中，TK780的氨基酸残基为丝氨酸，而不是苏氨酸gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.在两个亲本的启动子和内含子中共检测到46个DNA多态性、38个SNPs和8个插入子gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.其中，8个多态性位于已知的顺式元件内:B04009具有DRE2COREZMRAB17，这是一个在胚胎发生后期表达并由脱落酸诱导的基因的顺式元件[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]和SEF4MOTIFGM7S，大豆胚胎因子4结合的顺式元件[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

的编码序列gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2BaTK780和B04009与Williams 82 (Glyma.12G014200.1;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.在启动子和内含子中检测到17个SNPs和12个插入子gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba，其中7个多态性位于已知的顺式元件内;有13 B04009特异性和TK780四顺式元件，其中PYRIMIDINEBOXHVEPB1和RYREPEATBNNAPA在B04009已知参与种子发育和功能[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在亲本系TK780和B04009γ-TMT基因表达概况gydF4y2Ba

最后，我们分析了表达水平gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba,gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba在开花后在两种不同温度条件下生长的TK780和B04009植株的全种子大小的未成熟子叶中gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba在20℃时，TK780显著高于B04009，而在30℃时，TK780显著低于B04009(图4)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.这gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba在20℃时，B04009的表达水平低于TK780 °C，尽管差异不显著gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba尽管B04009的表达量远高于TK780，但在30℃时，两种细胞系的表达量均显著上调(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.表达水平gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba均B04009显著高于在两个热条件（图TK780。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

三个qtl一致控制α-Toc生物合成gydF4y2Ba

QTL定位和全基因组关联研究揭示了种子生育酚含量和组成自然变异的分子和遗传基础gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]和主要农作物，如玉米[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba],大麦[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba)、大米(gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]， 番茄 [gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]，大豆[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba),而gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．α-Toc含量与浓度呈强相关gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba（gydF4y2BaVTE4gydF4y2Ba)在玉米中[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]和米[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．用543个玉米不同品系进行GWAS分析，发现其中有2个插入/缺失(InDels)gydF4y2Bazmvte4.gydF4y2Ba与α-生育酚含量极显著相关。一个InDels位于gydF4y2Bazmvte4.gydF4y2Ba启动子区域与基因表达水平相关[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．在番茄中，MPBQ-MT (gydF4y2BaVTE3gydF4y2Ba)影响gydF4y2BaVTE3gydF4y2Ba表达水平，并用γ-TOC内容[负相关gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]．以及那些在生育酚生物合成途径，新基因也显示出伴随γ-TOC，δ-TOC，和总TOC的内容，包括两个基因为原叶绿素还原酶叶绿素的生物合成和基因为长链酰基辅酶A合酶在玉米的脂肪酸途径[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．最近，一个候选基因关联分析表明，5/8-bp的插入/缺失的启动子区gydF4y2BaZmPORB2gydF4y2Ba编码原叶绿素氧化还原酶在玉米有关的总生育酚含量[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

大豆籽粒α-Toc含量的qtl已有报道[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]．Li et al. (2010) [gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba]在鉴定品种和丰25. Shaw等人的高α-TOC加拿大品种OAC贝菲尔德和低α-TOC中国之间的交叉用于通过单标记分析α-TOC内容4点的QTL。（2017）[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]发现9点5的QTL，通过分别单标记分析和区间作图，对于α-TOC内容与OAC贝菲尔德和低α-TOC OAC郡的横跨三个位置超过2年，其中QTL标记由Satt117（CHR 15）具有最大的效果，占的表型变异高达32％。刘等。（2017）[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba]在与中国高α-Toc地方品种北风9号杂交的RIL群体中共报道了18个α-Toc含量的qtl，其中Chr15中的4个qtl在6种环境下均具有稳定且显著的加性效应。这些研究同样检测到了Chr15的qtl，尽管候选基因尚未确定。然而，这些QTL区域中并没有直接参与α-Toc生物合成的酶的编码基因。与高α-Toc品种KAS杂交的QTL中只有一个QTL存在gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba；KAS种子α-Toc升高的原因可能是启动子活性较高gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在高α-Toc野生种质B04009和低α-Toc选育系杂交的RIL群体中，我们鉴定了3个qtl，这3个qtl在2年的试验中一致检测到。在RIL群体中，α- toc含量的变化与γ- tmt介导的γ- toc向α- toc转化效率的指标α/γ比值密切相关;α-Toc含量与总Toc及其他同型Toc含量无显著相关性。检测到的3个qtl均与α- toc含量和α/γ比值有关。因此，这些qtl可能通过增强γ-Toc向α-Toc的转化，促进了种子中α-Toc的积累。效应最大的QTL位于Ichihime和KAS杂交中之前检测到的Chr9的QTL附近(表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，表明B04009高α-Toc性状可能受KAS检测到的QTL控制。因为B04009和TK780有相同的gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba编码序列高于前者gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba表达与后者（附加文件相比gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)， QTL可能与不同的启动子活性有关gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba如前所述[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

种子α-Toc比值较高的野生大豆品种(包括B04009)在1350 bp的启动子序列中表现出不同的DNA多态性gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba．B04009与14个SNP不同，来自KAS的四个indels [gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．然而，所有高α-Toc的野生品种都有3个与KAS相同的SNPs，这些SNPs与低α-Toc的品种相鉴别[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．通过对不同种质资源的调查，可以确定这些单核苷酸多态性与种子α-Toc含量/比值之间的关系，对关键顺式元素(s)的鉴定有助于了解种子α-Toc含量的控制gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

另外两个qtl，gydF4y2Ba问αγR-11gydF4y2Ba/gydF4y2BaqαTC-11gydF4y2Ba和gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba/gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba是小说。基因组区域gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba/gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba接近链接的对gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba的基因,gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba和gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba，表明任何基因都是可能的候选者gydF4y2BaqαγR-12.1gydF4y2Ba/gydF4y2BaqαTC-12gydF4y2Ba．在不同热条件下产生的未成熟子叶的表达分析仅显示gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba三者gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因被更高的温度上调，并且亲本之间的热反应不同（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.高温下B04009 α-Toc含量升高，可能是由于B04009较强地上调了α-TocgydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba高温诱导的表达。gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba两个亲本序列显示在启动子的非同义置换，许多DNA多态性。进一步的研究，如精细作图，过表达和互补基因研究中，需要确认在核苷酸变异的关联gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba具有高α-TOC的内容。gydF4y2Ba

Chr11的QTL与其他两个QTL的作用相反，可能导致RIL群体中种子α- toc含量和α/γ比值发生海侵分离。该QTL基因组区不包含与Toc生物合成相关的基因，但包含两个锌指转录因子(Glyma.11G220400和Glyma.11G226400)。其中，gata型锌指是已知的gata结合转录因子，控制胚胎发育gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．此外，合成的锌指转录因子融合到一个核定位信号和玉米C1激活域，成功上调gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba通过在启动子结合到顺式元件升高在种子α-TOC比gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]．另外的研究，例如在低温和高温的制度两个亲本系的转录分析，需要确定这些锌指转录因子是否是用于QTL可能的候选，并在热响应来调查其它候选基因的角色。gydF4y2Ba

热响应的gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba种子发育过程中α-Toc生物合成的基因gydF4y2Ba

种子发育过程中的温度是影响种子[α-有机碳含量和比率的环境因素之一gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．α-TOC内容和比率随着温度种子成熟期间上升[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．如预期的那样，本试验亲本种子中α- toc含量随温度从20℃升高到30℃而升高，(α + γ)/总量和α/γ比值也随温度升高而升高(见表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.B04009中α- toc含量的增加尤为明显，这很可能是由γ- tmt介导的γ- toc向α- toc转化效率的α/γ比值的增加引起的。三的表达式gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba未成熟子叶中的基因由两个品系之间的不同调节系统控制：gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba在两种热条件下，B04009的表达水平高于TK780，而gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba在父母双方的较高温度下，2在较高温度下上调，但响应特别标有B04009（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.由于α-Toc在种子中积累的增加与较高的上调相吻合gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba在B04009中通过更高的温度表达，这将是有趣的gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba负责QTL并且如果B04009等位基因的效果是温度依赖性的。gydF4y2Ba

三gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba大豆基因之间氨基酸相似性较高，但n端仅在其中gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba具有质体过境肽信号[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．储存在SoyBase的rna测序数据(gydF4y2Bahttps://soybase.org/gydF4y2Ba)进一步表明，在种子发育过程中，这三个基因在未成熟子叶中的表达水平相对较低，但在其他组织中的转录丰度存在差异;与其他相比gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因，表达gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba（Glyma.12 G014300）和gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba(Glyma.09 g222800)分别在幼叶、全尺寸荚果壳和根中上调[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba]．因此，本研究中观察到的不同的蛋白质结构和基因表达谱及其热反应可能表明三者之间的作用存在差异gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba在不同发育阶段对氧化应激的适应基因。gydF4y2Ba

生育酚是亲脂性抗氧化剂，以及它们的主要功能是种子贮藏，萌发，幼苗和早期发育[期间限制非酶促脂质氧化gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]．先前使用的遗传研究功能失调gydF4y2BaVTE2gydF4y2Ba突变体(gydF4y2BaMPBQ-MTgydF4y2Ba)的研究表明，生育酚对种子寿命、萌发和幼苗生长至关重要[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]．然而，不同的亚型可能具有不同的功能，以氧化应激。gydF4y2Ba

在烟草,gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba在其中α-TOC含量降低多达95％的叶沉默的植物显示出提高的敏感性朝向盐胁迫，但朝向从甲基紫精诱导活性氧渗透和氧化胁迫减弱敏感性，表明γ-TOC是比α-TOC更有效在赋予脱水耐性[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]．该β-TOC含量被报告到负相关，在水稻种子寿命[gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]．此外，过度表达异源gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，gydF4y2BaPerilla frutescens.gydF4y2Ba,gydF4y2BaB. Napus.gydF4y2Ba通过大豆种子特异性启动子成功地将γ-Toc转化为α-Toc，使α-Toc在总Toc中的比例提高到≥70% [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba]．Tavva等人(2007)[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba研究发现，转基因植物种子中α-Toc含量的增加与种子及正在萌发的种子中脂质过氧化产物的减少有关，但在种子萌发和幼苗生长方面野生型与转基因植物无明显差异。α-Toc在种子中产量的增加伴随着gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba因此，较高的温度可能反映了它在种子储存、萌发和幼苗早期发育方面的适应功能gydF4y2Ba甘蓝型油菜γ-TMTgydF4y2Ba-过度表达的大豆植株，其产生的种子具有更多的α-Toc，以减少脂质过氧化产物[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

我们通过促进γ-TOC，以α-TOC的转化在从跨具有高α-TOC水平和大豆具有野生大豆之间衍生的RIL群体确定了两个主要的QTL和一个次要QTL赋予更高α-TOC内容低α-TOC水平。包含一个QTLgydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba已经在大豆中被发现，这表明gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba控制大豆和野生大豆中的α-Toc含量。Chr12中的新QTL位于gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba和gydF4y2Baγ-TMT2。gydF4y2Baα-Toc含量随温度升高而增加，与表达量的上调一致gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba在高温下。三种功能的验证gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因转化将增加我们对α的认识gydF4y2Ba-gydF4y2Ba野生大豆和栽培大豆中Toc的生物合成及其热响应及其遗传多样性。除了有助于提高维生素E的活性(这可以改善人类健康)外，确定不同生育酚亚型在植物发育过程(如种子发育和长寿)中的功能也很重要。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

本研究以大豆育种系TK780和野生种质B04009为材料。TK780是一个早花系，种子α-Toc含量和比值较低。原产于日本山梨县的野生大豆品种B04009种子α-Toc含量及比值较高[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．B04009的种子来源于National Genebank。gydF4y2Ba

日本筑波县农业和食品研究组织（NARO），人口94gydF4y2Ba_8gydF4y2Ba(2016)和FgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba(2017)系是由一个单种子后代方法从一个FgydF4y2Ba_2gydF4y2BaTK780与B04009杂交种群。2016年和2018年2月至5月期间，空气温度设置为25°C，波动范围为20°C至30°C，在短期温室条件下，RILs和亲本在盆栽中生长。配备了高强度放电灯(HONDA-T;松下公司，大阪，日本)。种子从每个株系的三到四株中大量收获，在干燥器中干燥，直到需要化验为止。亲本在温室中25°C条件下生长，开花后转入20°C和30°C条件下的生长室;种子从两株到五株分别收获。gydF4y2Ba

生育酚量化gydF4y2Ba

根据Dwiyanti等人(2011)对种子中生育酚含量进行定量分析[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba].每行10个完全干燥的种子通过多珠震动器（MB75）研磨成细粉 5. 美国；日本大阪安井基开株式会社）。将20 mg种子粉与500 mg完全混合 μL冷80%乙醇（4 °C）含5 微升 dl-Tocol溶液（10 μg/ml；日本东京Tama生化有限公司），作为内标。超声处理10分钟后 分钟，将混合物与1000充分混合 μL己烷，添加邻苯三酚作为抗氧化剂。将混合物再次超声处理10分钟 分钟，然后离心5分钟 18900时的最小值gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C。上清液采用高效液相色谱(LaChrom Elite, Hitachi High-Technologies Corp, Tokyo, Japan)，反相柱(Inertsil ODS-3, 3.0 mm × 250 mm;GL Sciences, Tokyo, Japan)，以甲醇:乙腈(10:90 v/v)为流动相，流速0.5 mL/min，恒温40°C。在295 nm处检测到生育酚异构体，dl-Tocol有一个峰，δ-Toc有三个峰，γ-Toc和β-Toc和α-Toc的总和，按保留时间排序。用dl-Tocol的峰面积比计算各异构体的含量。本研究将γ-Toc与β-Toc之和作为γ-Toc含量，因为大豆种子实际β-Toc含量很低[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．本试验共进行三次。gydF4y2Ba

基因型数据生成gydF4y2Ba

重组自交系的总DNA使用改良CTAB法[嫩叶提取gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba]．用限制性内切酶消化DNAgydF4y2BaBglgydF4y2Ba二gydF4y2Ba生态gydF4y2BaRI为双消化限制性位点相关的DNA测序创建DNA文库[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba].用51个样本进行测序 Macrogen（韩国首尔）在HiSeq2000测序仪（美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina）的一条通道中读取bp单端数据。产生的读数用Trimomatic版本0.33进行了修剪[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba使用以下参数]：LEADING：19，TRAILING：19，滑动窗口：30：20，AVGQUAL：20，和MINLEN：51。这些RAD-SEQ过程由Clockmics公司（和泉，大阪，日本）中进行。修整后的读段映射到使用Bowtie2 [大豆参照基因组Williams82.v2gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]，并设置默认参数。使用gatk -统一基因型进行SNP呼叫[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba]．使用Beagle 4.0 [进行使用亲SNP数据中重组自交系缺失基因型的插补gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba]．使用TASSEL.5.2.31对单态SNPs和有许多缺失呼叫的SNPs进行过滤，参数如下:每个SNP的最小呼叫率90%和最小等位基因频率0.05(去除单态SNPs) TASSEL (v 5.2.31) [gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba]．R中[使用自定义脚本gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba]，核苷酸信息转化为AB基因型，parentA = TK780, parentB=B04009。所有杂合基因型均转化为缺失等位基因。在R/QTL中进一步筛选重复标记或具有开关等位基因的标记[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]产生最后一组7710个snp。gydF4y2Ba

连锁群构建与QTL定位gydF4y2Ba

QTL IciMapping版本4.1 [gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]使用输入算法，在不改变输入文件中标记顺序的情况下重新估计重组频率和遗传距离，用于确定遗传图谱上标记的顺序。窗口大小为5的相邻重组频率之和用作RIPPLIP用Kosambi作图函数将连锁位点间的重组频率转化为厘米（cM）距离[gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba]．使用MapChart绘制联动图[gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba]．完整的联动图显示在附加文件中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

QTL分析采用QTL IciMapping中添加性QTL的包含复合区间作图[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．进行该置换检验以确定显著QTL的阈值。根据调查结果，超过3.576更大的LOD分数作为标准划定的QTL的显着性水平（gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。ICIMapping将满足该阈值的qtl的支持区间定义为leftCI(置信区间的左边界)和rightCI(置信区间的右边界)。gydF4y2Ba

的建设gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基于全基因组重测序数据的基因gydF4y2Ba

从Illumina Hiseq XTen测序得到的TK780和B04009的原始reads与大豆参考基因组Williams82进行了比对。a2 (gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba]．使用bowtie - 2.2.9进行对齐[gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]．对产生的比对结果进行进一步处理，以删除重复读取，并使用Picard工具(gydF4y2Bahttp://broadinstitute.github.io/picardgydF4y2Ba）.基因组分析工具包（GATK版本3.8 [gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba;)用来重新排列小针头。随后，使用GATK统一基因型功能调用变异(SNP和indeler)，该功能过滤出基础质量Phred评分低于20的reads。使用参考基因组Williams82。一个2和SNP dataset of each variety, sequences ofγtmtgydF4y2Ba利用GATK中可用的fastaalternatereference emaker功能重建基因。gydF4y2Ba

Cis-element预测gydF4y2Ba

植物顺式调控DNA元件数据库New PLACE (gydF4y2Bahttp://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/gydF4y2Ba）[gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba用来预测…的位置gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba在启动子区式作用调节元件（的起始密码子的2000-bp的上游gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba,gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2BaB04009和TK780的。gydF4y2Ba

RNA提取及表达分析gydF4y2Ba

饱满的种子期的三至四个豆荚[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba在20°C和30°C(光照12 h /黑暗12 h)条件下生长的TK780和B04009的2 ~ 5株植株上分别取样。未成熟的种子样品立即在液氮中冷冻，在−80℃保存至RNA提取。RNA提取和cDNA合成过程如下所述[gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba]．转录水平的gydF4y2Baγ-TMT1gydF4y2Ba，gydF4y2Baγ-TMT2gydF4y2Ba,gydF4y2Baγ-TMT3gydF4y2Ba通过使用Sybr Premix Ex Taq II（Takara，Japan）和以下方案的定量实时PCR确定：95℃，3分钟，然后是95°C的39个循环，10 s，57°C，为20 s，72°在CFX96实时系统（Bio-Rad，Osaka，Japan）中，C对于20 s，78°C为2秒。表达分析中使用的引物序列列于表中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．三种表达水平gydF4y2BaγtmtgydF4y2Ba基因进行归一化抗肌动蛋白（Glyma.18G222800.1）的表达水平。四个独立合成的cDNA被用作复制。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

用方差双向分析进行的温度下，亲本系及它们对生育酚生物合成的相互作用的影响。成绩单丰度的均值间显着性检验与杜克的诚实显著差异（HSD）测试进行。gydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者请求。gydF4y2Ba

感谢Edanz集团的Sarah Williams博士(gydF4y2Bawww.edanzediting.comgydF4y2Ba）编辑本手稿的草稿。gydF4y2Ba

该研究得到了“莲花和甘氨酸”国家生物资源项目的支持，由富士蛋白质研究对J. Abe，T. Yamada和M. S. Dwiyanti以及北海道大学L-Station的初创资金提供给M. S. Dwiyanti。资金来源没有参与研究，数据收集，数据诠释或书面撰写手稿。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 北海道大学农学院，札幌060-8589，日本gydF4y2Ba

   彻伍公园gydF4y2Ba

2. 北海道大学农学院，札幌060-8589，日本gydF4y2Ba

   Maria Stefanie Dwiyanti, Tetsuya Yamada和Jun AbegydF4y2Ba

3. 琉球大学农学院，日本大津520-2194gydF4y2Ba

   Atsushi j .长野gydF4y2Ba

4. 广州大学生命科学学院，广东广州510000gydF4y2Ba

   刘保会gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CP、MSD、JA进行实验。AJN和MSD利用RADseq开发SNP标记。CP和MSD进行定位和表型分析。BL和MSD进行测序分析。CP、TY进行表达分析。CP、MSD、JA共同起草稿件，BL、TY对稿件进行编辑，所有作者阅读并通过最终稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba玛丽亚Stefanie DwiyantigydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒体中不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原始作者和来源给予适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域专用豁免(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba