全基因组鉴定和鉴定GDP-L-galactose磷酸化酶面包小麦的基因家族

背景

抗坏血酸是植物中一种强大的抗氧化剂，也是人体必需的微量营养素。的GDP-L-galactose磷酸化酶（GGP)基因编码l -半乳糖途径的限速酶，这是植物中主要的抗坏血酸生物合成途径，是增加作物抗坏血酸的一个有希望的候选基因。除了转录调控外，GGP的产生在翻译水平上通过长5 ' -非翻译区(5 ' utr)的上游开放阅读框(uORF)进行调控。的GGP面包小麦(小麦l)，是人类最重要的粮食来源之一。

结果

面包小麦染色体组4和5各含有3个同源基因TaGGPA、B和D亚基因组上的基因(TaGGP2-A/B/D和TaGGP1-A/桶在所有6个基因的长5'UTR中均存在高度保守的uORF。系统发育分析表明TaGGP基因分离成两个不同的组，并确定了一个重复事件GGP祖先的基因Brachypodium/ Triticeae血统。微同步分析显示TaGGP1和TaGGP2亚染色体区域没有共同的synsyny，这表明TaGGP2可能是通过转座元素复制的。这两组TaGGP基因有不同的表达模式TaGGP1同源物在不同组织和发育阶段广泛表达TaGGP2同源物在花药中高度表达。的瞬态变换TaGGP编码序列烟草benthamiana叶片组织使抗坏血酸浓度增加了5倍以上，证实了它们在抗坏血酸生物合成中的功能作用在足底．

结论

我们已经确定了六个TaGGP每个基因都有一个高度保守的uORF。系统发育和微同步分析强调，转座元件可能负责的复制和特化表达GGP2在花药中Brachypodium/ Triticeae血统。的瞬态变换TaGGP编码序列n benthamiana展示他们的活动在足底．六个TaGGP本研究鉴定的抗坏血酸基因和uorf为提高面包小麦抗坏血酸浓度提供了宝贵的遗传资源。

抗坏血酸又称维生素C，是植物细胞中含量最丰富的水溶性抗氧化剂，在光合作用和抗逆性中起着重要作用[1，2]。抗坏血酸可以减轻由正常或应激细胞代谢产生的活性氧(ROS)的有害影响，直接作为活性氧清除剂或间接作为抗坏血酸过氧化物酶的底物[3.]。模型和作物中抗坏血酸的生物合成增加表明，即使抗坏血酸的少量增加也能增强对广泛的非生物胁迫的耐受性[4，5]。抗坏血酸在植物细胞中的其他作用包括:作为酶促辅助因子[6]和有机酸的前体[7]，以及影响细胞周期[8]，细胞壁膨胀[9]、花期和衰老[10]。

在人类中，抗坏血酸是一种必需的微量营养素，由于失去功能的突变L-gulono-1, 4-lactone氧化酶编码负责催化脊椎动物抗坏血酸生物合成最后一步的酶的基因[11]。除了在预防坏血病方面公认的作用外，抗坏血酸还在许多对人体健康重要的生理过程中发挥关键作用，包括在人体消化过程中促进和调节膳食铁的吸收[12]并作为参与表观遗传程序的酶的辅助因子[5，13]。虽然抗坏血酸缺乏被认为是一种历史疾病，但目前在发展中国家和发达国家，抗坏血酸的摄入量都不理想[14]，在澳大利亚，由于不良的饮食习惯，坏血病的重新出现也有记录[15]。

植物中抗坏血酸的生物合成有四种途径:l -半乳糖、l -葡糖、myo-肌醇和d -半乳糖酸途径尽管有证据表明这些途径在植物中都存在，但l -半乳糖途径是导致植物中抗坏血酸生物合成的主要途径，它通过8个酶促步骤将d -果糖-6- p转化为抗坏血酸拟南芥［16，17，18]，西红柿(茄属植物lycopersicuml .) [19]，米饭(栽培稻l .) [20.]和绿藻(衣藻reinhardtii) [21]。l -半乳糖途径中最后一个被鉴定的基因，GDP-L-galactose磷酸化酶（GGP也被称为VTC2)，是在拟南芥2007年[16，22，23]。GGP酶催化gdp - l -半乳糖转化为l -半乳糖-1- p，代表了抗坏血酸生物合成的第一步。现在有几项研究已经确定GGP酶是l -半乳糖途径中的限速步骤[22，24，25，26]并作为抗坏血酸生物合成的关键调节酶[27]。过度的GGP基因使抗坏血酸浓度增加了4.2倍拟南芥［24，26]、马铃薯(茄属植物tuberosuml .) [28， 2.1倍草莓(Fragaria x ananassa) [28]， 6.2倍于番茄[28，29，是烟草的1.4倍(烟草l .) [30.]和2.6倍的米[25，31]。

高度保守的上游开放阅读框(uORF)是一类位于mrna的5 ' -非翻译区(5 ' utr)的蛋白质编码主要orf (morf)上游的小orfGGP基因已经被证明有调节作用GGP翻译和抗坏血酸浓度[32，33，34，35]。虽然uORF在植物基因组中含量丰富，估计多达60%的基因含有uORF，但在植物物种之间保守的不足1% [36，37]。高度保守的uORFs对细胞代谢物水平的翻译调节已经在几项植物研究中得到证实。例如，已证明uorf可以调节基因的翻译拟南芥s -腺苷蛋氨酸脱羧酶和多胺氧化酶基因对多胺的反应[38，39，40，41),拟南芥S1类basic-leucine拉链和番茄鸟氨酸脱羧酶对蔗糖有反应的基因[42，43，44),拟南芥磷酸乙醇胺n -甲基转移酶对磷胆碱反应的基因[45]，而拟南芥热休克转录因子B1基因对半乳糖醇的反应[46]。在这个例子中GGPuORF是一种编码肽，被预测从非规范的AUC或ACG起始密码子启动，被认为会导致核糖体停滞，从而阻止下游的翻译GGP在高抗坏血酸浓度下的mORF，而在低抗坏血酸浓度下，uORF被跳过GGPmORF翻译[33]。抗坏血酸如何影响uORF或mORF核糖体起始的确切机制尚未阐明。中断GGP通过关键残基突变的uORF干扰了抗坏血酸翻译的反馈调节，并在短暂转化时增加了抗坏血酸的浓度烟草benthamiana［33]。最近，CRISPR/Cas9基因组编辑已被用于破坏基因GGPuORF在拟南芥、生菜(摘要以)和番茄，以增加抗坏血酸浓度和增强氧化应激耐受性[34，35]。

尽管……很重要GGP抗坏血酸生物合成与调控的基因GGP禾本科物种内的基因仅限于水稻和玉米(玉米l .)。水稻和玉米都有一个基因拷贝GGP这些基因分别位于染色体Os11和Zm6上。完成击倒OsGGP该基因使水稻叶片抗坏血酸浓度严重降低80%，并与光合效率降低、生物量降低、对臭氧胁迫和锌缺乏的耐受性降低相关[qh]20.]。在玉米中ZmGGP基因在胚乳发育过程中表达，其表达水平与基因型有关[47]。

就土地面积而言，小麦是世界上种植最多的作物，占人类消耗的卡路里的五分之一[48]。干旱、盐度和高温等非生物胁迫是全球小麦产量的主要限制因素[j]。49]。增加小麦中的抗坏血酸浓度有助于减轻与这些非生物胁迫相关的产量损失。像许多其他谷物一样，成熟的小麦中抗坏血酸的含量可以忽略不计[50因此，小麦谷物中抗坏血酸的富集也可以提供一种新的方法来改善人类饮食中这种必需维生素的摄入量。

在这里我们扩展我们的知识GGP通过描述禾本科物种的基因TaGGP面包小麦的基因家族。我们描述了染色体的位置，确认了高度保守的uorf的存在，提出了系统发育关系、基因的同质性、组织和发育表达模式，并证明了uorf的活性TaGGP中的瞬态变换编码序列n benthamiana．

六个TaGGP在面包小麦染色体第4组和第5组上鉴定了基因

一共6个TaGGP在面包小麦基因组中鉴定了基因，并确定了它们的基因组位置。染色体组4和5各含有3个同源染色体TaGGP位于A、B和D亚基因组上的基因(TaGGP2-A/TaGGP2-B/TaGGP2-D和TaGGP1-A/TaGGP1-B/TaGGP1-D分别)。所有六个基因都位于各自染色体群的短臂上，除了TaGGP2-A它位于长臂上。除了这六个TaGGP基因，我们确定了两个HvGGP大麦的基因(大麦芽) 4号和5号染色体上的基因组(HvGGP2和HvGGP1，分别)，两个BdGGP基因Brachypodium distachyon（Brachypodium(下)第4号染色体上的基因组(BdGGP1和BdGGP2),两个AetGGP基因山羊草属tauschii4号和5号染色体上的基因组(AetGGP2和AetGGP1,分别是)和1SbGGP基因高粱二色的L. 8号染色体上的基因组。

六个TaGGP基因组序列的长度从2922 bp到4163 bp不等，这主要是由于内含子序列长度的差异(图2)。1)，在大小和结构上与其他禾本科植物相似GGP基因(附加文件)1:图S1)。6人基因组序列比较TaGGP基因显示，他们的同一性在36.0%到94.9%之间。的TaGGP1和TaGGP2蛋白质的长度分别为430和431个氨基酸，6个氨基酸的序列比较TaGGP蛋白质显示他们有78.1到99.3%的相同之处。小麦、大麦、水稻、玉米、高粱、Brachypodium,答:tauschiiGGP蛋白鉴定出了蛋白内部的高度保守区域，HIT蛋白超家族的保守组氨酸三联体(HIT)基元，保守的KKRP核定位信号(NLS)，以及这些物种中区分GGP2蛋白和GGP1蛋白的13个残基(图2)。2）.

每一个TaGGP基因含有高度保守的uORF

对于所有六个人TaGGP在非规范AUC(异亮氨酸)或ACG(苏氨酸)起始密码子启动的mRNA的长5'UTR中鉴定出高度保守的uORF。的uORF肽TaGGP1homoeologs和TaGGP2同源物的长度分别为56个和47个氨基酸，并对6个同源物进行了序列比较TaGGPuORF肽显示它们的同源性在67.9%到100%之间。的氨基酸序列比对GGP来自一系列禾草和非禾草物种的uORF肽在肽内鉴定出高度保守的区域，并且在水稻的第一个残基上发现赖氨酸而不是在所有其他物种中高度保守的异亮氨酸，截断了11个残基TaGGP2，HvGGP2，BdGGP2,AetGGP2uORF肽相对于TaGGP1，HvGGP1，BdGGP1,AetGGP1uORF肽，以及区分禾本科物种(丙氨酸)和非禾本科物种(谷氨酸)的单个氨基酸变化(图2)。3.）.

禾本科GGP蛋白分为两组

通过对一系列禾本科和非禾本科植物GGP蛋白序列的系统发育分析，确定了两个GGP蛋白分支，分别属于禾本科和非禾本科植物(图2)。4）.GGP蛋白的禾状分支进一步分成两组，TaGGP1蛋白与HvGGP1、BdGGP1、AetGGP1、OsGGP、ZmGGP和SbGGP组成一组，TaGGP2蛋白与HvGGP2、BdGGP2和AetGGP2组成第二组。禾本科GGP蛋白第1组和第2组的分类进一步得到了禾本科系统发育分析的支持GGP编码序列清楚地表明TaGGP1homoeologs,HvGGP1，BdGGP1,和AetGGP1与?关系更密切OsGGP ZmGGP,和SbGGP在进化距离上比TaGGP2homoeologs,HvGGP2，BdGGP2,和AetGGP2(附加文件1:图S2)。植物的系统发育分析GGPuORF肽序列显示与GGP蛋白序列相似的关系(附加文件)1:图S3)。

的TaGGP1和TaGGP2亚染色体区域不共享同音性

选择上游和下游各10个基因TaGGP六条染色体上的基因，被称为TaGGP亚染色体区域(SR)，分析基因密度和合性(图2)。5和附加文件2:表1)。的物理长度TaGGP1-A，TaGGP1-B,和TaGGP1-DSRs分别为18、14.8和8.7 MbpTaGGP2-A，TaGGP2-B,和TaGGP2-DSRs分别为3.4、4.8和3mbp。中没有发现共享的同音TaGGP1和TaGGP24和5号染色体组上的sr，除了TaGGP基因本身。之间的同音性TaGGP1同源SRs远低于TaGGP2同源SRs只有19个基因具有相同的同源性TaGGP1同源基因是所有三个同源ssr上唯一具有同源性的基因TaGGP2同源SRs共有37个基因。的TaGGP1同源物是在它们各自染色体的着丝粒区发现的TaGGP2同源物存在于它们各自染色体的间质区，即在端粒区和中心粒区之间。

这两组TaGGP基因在面包小麦组织中有不同的表达模式

对面包小麦组织和发育阶段的定量逆转录pcr分析揭示了不同的表达模式TaGGP1和TaGGP2基因(图。6）.的TaGGP1同源物在不同组织和发育阶段广泛表达，在幼苗叶片、苞片和花药中表达水平最高(图2)。6一个)。TaGGP1同源物表现出不平衡表达的趋势TaGGP1-D同源物在所有组织中的表达水平较低TaGGP1-A和TaGGP1-B．与TaGGP1homoeologs,TaGGP2同源物在花药中高度表达，与其他组织相比，花药中的表达量高约50至580倍(图2)。6b)。TaGGP2同源物也表现出不平衡表达的趋势TaGGP2-B同源物在所有组织中的表达水平较低TaGGP2-A和TaGGP2-D．总的来说，TaGGP3 ~ 5个基因在花药、幼苗叶和苞片中表达量最高，在冠、幼苗根和颖果中表达量最低。

我们在该基因的1kb启动子区寻找花药/花粉特异性顺式调控元件TaGGP鉴定基因是否高表达TaGGP2花药中的同源性可以通过这些调控元件的差异来解释1:图S4)。然而，高水平的表达TaGGP2花药中的同源物似乎与花药/花粉的密度无关独联体-转录起始位点(TSS)周围的调控元件，具有较高的花药/花粉密度独联体而不是出现在TSS周围的区域TaGGP1同源物(附加文件1:图S4)。

的瞬态变换TaGGP基因在n benthamiana叶片增加抗坏血酸浓度

的编码序列TaGGP1-A，TaGGP1-B，TaGGP1-D，TaGGP2-A,TaGGP2-B瞬时转化基因增加抗坏血酸浓度n benthamiana叶片相对于控制(图2)。7）.转换时TaGGP1-D与对照组相比，抗坏血酸浓度增加最多(5.3倍)。抗坏血酸浓度的类似倍增也观察到转化TaGGP1-B(4.1倍),TaGGP2-A(4.4倍)TaGGP2-B(4.5倍)。转换时TaGGP1-A与对照组相比，产生了2.4倍的增加，这是观察到的抗坏血酸浓度最低的增加。根癌土壤杆菌包含TaGGP2-D构造无法恢复。抗坏血酸的高倍增长观察到一些TaGGP与阳性对照相关的基因AcGGP这可能是由用于驱动转基因表达的启动子的强度来解释的:双35S启动子用于驱动TaGGP基因是一个比用于驱动的单个35S启动子更强的启动子AcGGP．

的TaGGP基因是高度保守的，功能性的，并且具有适合基因组编辑的uORF

我们确定了6个TaGGP面包小麦基因组中的基因，由三个组成TaGGP1染色体第5组和第3组的同源物TaGGP2染色体第4组同源物。其中五个基因位于各自染色体群的短臂上;的TaGGP2-A基因位于染色体4A的长臂上，这是由于染色体长臂和短臂之间存在已知的周中心倒置[51]。我们还发现了两份GGP大麦中的基因，Brachypodium,答:tauschii基因组，以及高粱基因组的一个拷贝。据我们所知，这是第一次HvGGP1，HvGGP2，BdGGP1，BdGGP2，AetGGP1，AetGGP2,SbGGP基因已被报道。

的TaGGP蛋白质序列高度保守，特别是在同源物之间，高达99.3%的蛋白质序列具有相同的同源性(图3)。2）.考虑到六倍体小麦基因组的遗传冗余性，这种高水平的保守性是惊人的，六倍体小麦基因组通常表现出相对于二倍体生物(如小麦)的编码序列进化速度加快Brachypodium并建议所有六个TaGGP基因在小麦发育过程中起着重要的功能作用，因此可以抵抗遗传漂变[52]。这个假设与我们的发现是一致的TaGGP基因瞬间转化为n benthamiana叶片抗坏血酸浓度相对于对照增加，证实了它们在抗坏血酸生物合成中的功能作用在足底(无花果。7）.我们还可以从瞬时转化中得出结论，区分禾状GGP2蛋白和GGP1蛋白的13个残基似乎并不影响GGP2蛋白的功能。抗坏血酸浓度的大幅增加n benthamiana观察到的叶子TaGGP基因与GGP作为植物抗坏血酸生物合成的限速步骤是一致的[22，24，25，26]，并特别展示了利用这些基因的潜力TaGGP1-D增加抗坏血酸浓度，不仅在小麦中，也在其他作物中。

所有六个TaGGP蛋白都含有高度保守的HφHφQ基序列(其中φ是一个水性氨基酸)，这是HIT超家族的半乳糖-1-磷酸尿苷基转移酶分支的特征。2) (22，23，53]。它们也都拥有高度保守的KKRP NLS，这可能负责定位TaGGP除了大多数抗坏血酸生物合成发生的细胞质外，蛋白质也被运送到细胞核(图2)。2) (54]。的融合蛋白AtGGP1: YFP,SlGGP1“绿色荧光蛋白”,SlGGP2:GFP已被发现定位于细胞质和细胞核，这表明GGP可能是一种具有酶和调节作用的双重功能蛋白[54，55，56]。确定这种NLS影响GGP亚细胞定位的程度以及GGP在细胞核中可能发挥的作用有待进一步研究。

我们还在mRNA的长5'UTR中发现了一个高度保守的uORFTaGGP基因(无花果。1和3.）.值得注意的是，uORFTaGGP2同源物相对于序列有11个残基截断TaGGP1同源性和11个残基的相同截断也被观察到BdGGP2和HvGGP2相对于BdGGP1和HvGGP2uORFs，表明这种截断发生在进化分化之前Brachypodium和麦提喀族(图2)。3.）.如果这些是禾本科的GGP2uorf仍然具有功能，这表明这11个残基对肽的功能并不重要。中断GGP通过基因组编辑的uORF最近被证明是一种增加各种植物中抗坏血酸浓度的可行策略[34，35]。例如，CRISPR/ cas9靶向诱变的AtGGP1uORF在拟南芥和LsGGP1和LsGGP2uorf破坏生菜的功能，使叶片抗坏血酸浓度分别增加1.7倍、1.4倍和2.6倍。此外，生菜中抗坏血酸浓度的增加增强了对甲基紫罗兰素诱导的氧化应激的耐受性[35]。同样的，CRISPR/ cas9靶向的基因突变SlGGP2破坏番茄的功能，使叶片抗坏血酸浓度增加约1.4倍[34]。由于小麦六倍体基因组的可塑性，操纵单个或多个TaGGP使用CRISPR/Cas9等基因组编辑工具的uorf代表了一种很有前途的策略，可以生产富含抗坏血酸的小麦植株，同时还可以最大限度地减少由于基因破坏而可能对植物发育产生的任何多效性影响GGPuORF。

一个突变类转座因子可能负责的复制和特化的基因表达GGP2在Brachypodium/ Triticeae血统

我们已经把禾本科分类了GGP根据系统发育，本手稿中被描述为第1组或第2组的基因。的蛋白质和编码序列TaGGP1homoeologs,AetGGP1，HvGGP1,BdGGP1关系更密切吗OsGGP，ZmGGP,SbGGP在进化距离上比TaGGP2homoeologs,AetGGP2，HvGGP2,BdGGP2(无花果。4)。这一组禾本科植物GGP1和GGP2基因也与染色体的位置一致GGP基因和已知的草基因组进化史。例如，小麦染色体组Ta5，大麦染色体组Hv5，Brachypodium染色体Bd4、水稻染色体Os12和高粱染色体Sb8，它们各自包含GGP1基因，都来自祖先草的染色体A12 [57]。而小麦染色体组Ta4、大麦染色体组Hv4和Brachypodium染色体Bd4，每条染色体都包含其中GGP2基因，都是从祖先草的染色体A11 (inBrachypodiumA11和A12融合形成单染色体Bd4) [57]。考虑到水稻、玉米和高粱各有一个拷贝GGP小麦，大麦，Brachypodium,答:tauschii各有两份GGP，看来GGP从A12到A11可能在Brachypodium/ Triticeae血统。这种复制事件可能发生在进化分化之后Brachypodium大约3350万年前(MYA)，但在进化分化之前Brachypodium而Triticeae部落大约在24.5亿年前[57]。

我们的微合成分析TaGGP基因显示TaGGP1和TaGGP2除了。之外，sr没有共享同步TaGGP基因本身(图2)5)。我们也没有发现两者之间有任何共享的同步BdGGP1和BdGGP2SRs的Brachypodium(附加文件2:表2)或两者之间HvGGP1和HvGGP2大麦中的SRs(附加文件)2表S3)。这两者之间缺乏谐音GGP1和GGP2小麦的SRs;Brachypodium大麦表明了这一点GGP2可能是通过在祖先的换位被复制的Brachypodium/小麦系，因为其他的基因复制方法保留了基因的一致性[58]。考虑到小麦的内含子和基因结构，Brachypodium和大麦GGP2II类转座因子(DNA转座子)通过DNA中间体转座，可能是导致这种转座的原因。我们建议突变样转座因子(MULE)是一类DNA转座子，在植物中普遍存在，能够捕获、动员和扩增基因片段GGP2［59]。然而，考虑到之后的进化时间GGP2是重复的(24.5至33.5 MYA)，转座因子的任何特征到现在都会退化，不再被检测到[58]。

我们发现了不同的表达模式TaGGP1和TaGGP2基因TaGGP1同源物在不同组织和发育阶段广泛表达TaGGP2同源物高度特化，与其他组织相比，花药中的表达高约50至580倍(图2)。6)。我们的TaGGP提取的基因表达数据支持基因表达结果http://bar.utoronto.ca/这也证明了TaGGP1同源物在不同的组织和发育阶段广泛表达TaGGP2相对于其他组织，同源物在花药和叶片中高度表达1:图5)。类似的GGP其他禾本科植物的表达谱也被观察到，相对于其他组织，花药和/或叶片中的表达量更高(附加文件)1:图S5和S6)。据我们所知，这是a的专门化表达式第一次GGP然而，先前的一项研究发现，在曼陀罗的花药中，高抗坏血酸浓度与高RNA浓度相关。曼佗罗l .) [60]。总之，这些表达数据表明，抗坏血酸可能在小麦和其他禾科植物的花药发育中发挥重要作用，例如保护花粉免受环境胁迫诱导的ROS [61]。确定是否高表达GGP与其他组织相比，花药中抗坏血酸浓度较高，值得进一步研究。

关于起源的问题独联体-负责高表达的调控元件GGP2小麦花药中与其他组织相关的基因，Brachypodium我们提出了两个假设:(i)在重复之后，基因的调控区域GGP2基因分化是由于选择压力的减少，这随后产生了新生独联体-监管要素，或(ii)独联体调控区的调控元件继承自一个转座元件，该转座元件可能负责基因的复制GGP2。为了支持第一种假设，对小麦的1kb启动子区域进行了序列比对，Brachypodium和大麦GGP基因表明，启动子区域GGP2基因与dna的启动子区域具有共性GGP1基因，但在其他方面显著分化(附加文件1:图S7)。这是可能的序列改变的启动子区域GGP2基因产生了新生独联体-负责高表达的调控元件GGP2花药中的基因。另一方面，转座因子已知会影响转座基因的表达[58]。例如，骡子——包括任何被骡子捕获、动员和扩增的序列——已被证明在生殖组织中优先表达[58，62]。MULEs的末端倒置重复序列(TIR)被认为是MULEs表达的调控区域，包括任何转置的基因片段[58，62]。如果GGP2在?的祖先中被MULE调换了位置Brachypodium/小麦系，有可能GGP2继承了独联体-负责高表达的调控元件GGP2直接从MULE的TIR提取花药。

在植物育种中的应用

非生物胁迫，如高温，是造成全球小麦产量重大损失的原因，并且预计由于气候变化将加剧[63]。确定减轻或抵消这些损失的遗传策略对于维持全球小麦生产水平至关重要。许多研究表明，向小麦植株外源施用抗坏血酸可以缓解盐和干旱诱导的氧化应激[64，65，66，67，68，69]。高抗坏血酸面包小麦品种的过表达TaGGP一个或多个基因或基因组编辑TaGGP破坏其功能的uORFs可以帮助减轻非生物胁迫造成的小麦产量损失，而无需外源施用。

就人类营养而言，抗坏血酸水平升高的面包小麦产品的发展可能受到限制，因为在谷物成熟过程中，抗坏血酸会下降到可以忽略不计的水平，这可能很难克服[70，71]。然而，由发芽谷物制成的小麦产品可能为抗坏血酸生物强化提供载体，因为发芽谷物相对于未发芽谷物含有相当高水平的抗坏血酸[72，73]。具有增强抗坏血酸生物合成能力的面包小麦品种的发芽籽粒可能为提高人类膳食抗坏血酸摄入量提供了一种新的途径。

我们确定了6个TaGGP每个基因都有一个高度保守的uORF。系统发育和微合成分析表明GGP2可能是通过祖先的转座元素复制的Brachypodium/ Triticeae血统。的TaGGP2同源物在花药中有特化表达，可能遗传自MULE的TIR。的瞬态变换TaGGP编码序列n benthamiana叶片使抗坏血酸浓度增加了5.3倍，证实了它们的活性在足底．我们建议六TaGGP本研究将为增加面包小麦抗坏血酸生物合成提供宝贵的遗传资源，以提高小麦的非生物胁迫耐受性和人类营养。

识别和命名GGP基因和uorf

的OsGGP利用国际小麦基因组测序联盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium, IWGSC)的RefSeq v1.0组装版进行BLASTN检索，以编码序列LOC4351698作为查询。中国的春天[48]识别TaGGP编码序列。每一个TaGGP根据同源分组及其各自的亚基因组，按照小麦基因符号的推荐规则(http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/98/Intro.htm）.从IWGSC数据库中获得基因预测模型，包括预测编码序列和蛋白质序列。的OsGGP编码序列也被用作大麦基因组序列数据库(IBSC_v2)的BLASTN检索查询。Brachypodium(Brachypodium_distachyon_v3.0),答:tauschii(Aet_v4.0)https://plants.ensembl.org和高粱(Sorghum_bicolor_NCBIv3)来自https://www.ncbi.nlm.nih.gov．的结构GGPSplign (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi) [74]。的GGPuORF编码和肽序列在5'UTR中被人工识别GGP从高度保守的编码异亮氨酸的AUC密码子开始的基因，如前所述[33]。

克隆和基因测序

的全长基因序列TaGGP1-A和TaGGP2-A无法从小麦基因组的IWGSC RefSeq v1.0组装中检索到。中国的春天[48因为每个基因在内含子2上都有一个缺失序列的间隙。设计了PCR引物，用于扩增跨越间隙的基因片段TaGGP1-A和TaGGP2-A基因来自cv。使用相应的IWGSC基因序列和Primer3软件测定中华春基因组DNA [75，76]。的TaGGP1用正向引物5′- GGCAATCTGTTAGGCAAGCA−3′和反向引物5′- TGTCAAAAACAGGTATCAGCAATTT - 3′扩增基因片段。的TaGGP2用正向引物5′- AGTTCTTCCTAAATTCTCTCCTCCTT - 3′和反向引物5′- TTGAGGAATCACCTCACCCTA - 3′扩增基因片段。PCR扩增周期为1个周期= 1 m, 95℃;35次循环= 20秒95℃，30秒61℃，30秒72℃;1循环= 5m 72℃。根据制造商的说明，在20 μL的终体积中对MyTaq™HS红色DNA聚合酶(Bioline, MA, USA)进行pcr。PCR产物用DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research, CA, USA)纯化，并根据制造商说明克隆到pGEM®-T Vector System (Promega, WI, USA)。使用pvii (New England Biolabs, MA, USA)根据制造商说明，在pGEM®-T中对克隆的PCR产物进行限制性内切酶切，以区分TaGGP1-A和TaGGP2-A在澳大利亚基因组研究设施有限公司进行Sanger测序之前，从各自的B和D同源基因片段中提取基因片段。http://www.agrf.org.au/）.

GGP和uORF序列比对及系统发育分析

基因序列比对及系统发育分析GGP在genes10.2.2中使用ClustalW与默认参数和PhyML genes插件[77]，核苷酸序列采用K80替代模型，氨基酸序列采用LG替代模型，自举值为1000。的GGP在序列比对和系统发育分析中使用的基因在附加文件中提供2表S4。

微同步分析TaGGP，BdGGP,HvGGP基因

上游有十个高置信度基因，下游有六个TaGGP,两个BdGGP，二HvGGP基因从小麦基因组的IWGSC RefSeq v1.0组装中检索。中国的春天[48的Brachypodium_distachyon_v3.0程序集Brachypodium基因组(https://plants.ensembl.org)，以及大麦基因组的IBSC_v2组装(https://plants.ensembl.org)，分别排除与反转录转座子和反转录病毒相关多蛋白相关的基因，并以e值阈值为1e作为BLASTN对各自数据库的查询序列⁻¹⁰．根据基因的基因组定位和序列一致性(≥90%)，认为这些基因是同源的。用于这6个基因微合成分析的基因列表TaGGP,两个BdGGP，二HvGGP基因及其各自的位置和基因功能在附加文件中提供2:表S1、表S2、表S3。

定量反转录pcr分析TaGGP基因

面包小麦10个不同组织和发育阶段的cDNA文库。中国的春天以前是这样产生的[78]。6株的定量逆转录pcr分析TaGGP采用亚基因组特异性PCR引物对(附加文件2:各表5)TaGGP如前所述[79]。用cv验证了引物对的亚基因组特异性。中华春非四体DNA [80]。引物效率均≥97%。最稳定的管家基因的三个基因正常化因子TaActin，TaCyclophilin,TaELF如前所述，将qRT-PCR表达数据归一化[78，81]。补充GGP使用附加文件中提供的相应基因标识符提取基因表达数据2:表S4http://bar.utoronto.ca/对于小麦[82]，大麦[83]和玉米[84]，从https://www.ebi.ac.uk为Brachypodium、大米和高粱[85]。

分析TaGGP启动子区域

为每一个TaGGP基因，第一个外显子以及上游1kb区域，被认为是启动子区域，从基因组序列数据库中提取t . aestivum(IWGSC)https://plants.ensembl.org．这些序列被用作BLASTN对NCBI表达序列标记(EST)数据库的查询t . aestivum（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)识别TaGGP帽捕获全长cDNA序列与TTS。花药/花粉的鉴定独联体-作用元素在genous 10.2.2中执行，如前所述[79]。1 kb启动子区的序列比对GGP在gene10.2.2中使用MAFFT gene插件[86用L-INS-i算法。

的瞬态变换n benthamiana叶子

面包小麦cv。剑兰来自澳大利亚谷物基因库(https://www.seedpartnership.org.au/associates/agg）.设计PCR引物，扩增该基因的编码序列TaGGP1homoeologs和TaGGP2来自面包小麦的同源物。基于Primer3软件的剑兰cDNA分析[75，76]。的TaGGP1用正向引物5′- ATGAAGCTGACGATTAAGAGGGTA−3′和反向引物5′- TCACGGAATTACGAGGCAG - 3′扩增同源物。的TaGGP2用正向引物5′- ATGGAGATGAAGCTGACGAT - 3′和反向引物5′- TCACTGAAGGACAAGGCAAC - 3′扩增同源物。PCR扩增周期为1个周期= 30 s 98°C;35次循环= 10秒98℃，15秒61℃，45秒72℃;1循环= 5m 72℃。根据制造商的说明，在50 μL的终体积中进行pcr，用于Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)。PCR产物用DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research)纯化，A悬架添加MyTaq™HS DNA聚合酶(Bioline)，使用PCR™8/GW/TOPO®TA克隆试剂盒(Invitrogen, CA, USA)连接到pCR8/GW/TOPO载体体系，并重组到pMDC32载体体系中[87根据制造商的说明，使用Gateway™LR Clonase™II酶混合物(Invitrogen)。正确的基因家族成员的克隆和基因定位被澳大利亚基因组研究设施有限公司的桑格测序证实。农(GV3101 pMP90)，包含感兴趣的结构(除了TaGGP2d)被共同渗透农包含P19结构[88以防止转录后基因沉默进入6周大的嫩叶n benthamiana在植物生长室内(16 h日长，24°C)培养的植物(LAB菌株)[89]。渗透条件如前所述[90]。渗透与农单独包含P19构建体作为对照。渗透与农含有猕猴桃AcGGPpGreen载体系统中的基因[24，91]作为阳性对照。浸渍7 d后，采集叶片进行抗坏血酸测定，并在干冰上冷冻。

抗坏血酸盐测量

总抗坏血酸提取和测量如前所述，修改[92]。简单地说，从碾碎的冻干组织中提取总抗坏血酸，在含有8%偏磷酸、2mm EDTA和2mm TCEP (Sigma-Aldrich, MO, USA)的萃取液中均质，在40°C下提取2小时。提取液离心后，取5 μl上清液，以1 mL/m的流速注入C18 3 μm 33 × 7 mm Alltima Rocket柱(Hichrom Limited, UK)。以抗坏血酸为标准品(Sigma-Aldrich)，在日本岛津8050 (RT 1.43 m)反相高效液相色谱(HPLC) -紫外检测(245 nm)下测定其浓度。洗脱过程采用流动相A: MS级水- 1%甲酸(Sigma-Aldrich)和B: MS级乙腈- 1%甲酸(Sigma-Aldrich)梯度洗脱。采用l -抗坏血酸分析标准品(Sigma-Aldrich)和HPLC-MS多反应监测(MRM)扫描，证实该峰为抗坏血酸，限定符跃迁m/z(+) = 177.05 > 95.00。

统计分析

采用单因素方差分析检测均数之间的统计学显著差异，然后采用Minitab®17.1.0进行95%置信水平的Tukey事后检验(http://www.minitab.com/en-us/）.

的GGP和uORF序列，以及本研究中分析的补充基因表达数据可从公共数据库中获得，如材料和方法以及补充材料所述。面包小麦的GenBank加入编号。短剑TaGGP本研究生成的编码序列为:TaGGP1-AMK514258;TaGGP1-BMK514259;TaGGP1-DMK514260;TaGGP2-AMK514261;TaGGP2-BMK514262;和TaGGP2-D, MK514263。GenBank的加入编号将在2020年2月13日之后或一旦加入编号出现在印刷品中即可检索。本研究过程中产生的剩余数据集可应通讯作者的合理要求向其提供。

5 'utr:

5 '未翻译区

美国东部时间:

表达序列标签

GGP:

GDP-L-galactose磷酸化酶

冲击:

组氨酸三

mORF:

主要开放阅读框

骡子:

突变像转座元素

NLS:

核定位信号

ROS:

活性氧

SR:

Subchromosomal地区

行动:

末端反向重复

TSS:

转录起始位点

uORF:

上游开放阅读框

作者要感谢Margaret Pallotta提供的小麦简历。本研究使用的中华春非四体DNA。

本研究未获资助。

作者指出

1. 罗南·c·布罗德和朱利安·p·博诺应该被认为是共同的第一作者

从属关系

1. 墨尔本大学生物科学学院，墨尔本，维多利亚，3010，澳大利亚

   罗南·c·布罗德，朱利安·p·博诺，杰西·t·比斯利和亚历山大·a·t·约翰逊

2. 昆士兰科技大学未来环境研究所热带作物和生物商品中心，澳大利亚昆士兰州布里斯班，4001

   莎莉·罗登，约书亚·g·菲利普斯和罗杰·p·海伦斯

3. 阿德莱德大学农学院，南澳大利亚阿德莱德，澳大利亚5064

   Ute鲍曼

贡献

JPB, RPH, AATJ构思并设计了本研究。JPB确定了GGP基因、uorf和RCB的结构可视化。RCB和JTB进行了系统发育分析。jbp和UB进行了微同步分析。JTB确认亚基因组引物的特异性，用于定量逆转录pcr分析，并对数据进行分析。JPB分析了补充的基因表达数据。JPB, RCB和UB分析了启动子区域。RCB、SR和JGP进行了瞬态转化n benthamiana并量化了抗坏血酸浓度。JPB, RPH和AATJ监督了这项研究。RCB起草了手稿。所有作者都阅读并认可了稿件。

相应的作者

对应到亚历山大·a·t·约翰逊．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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