生长素保护gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba来自纤维素生物合成抑制剂诱导的编程细胞死亡的细胞悬浮培养物Thoxtomin A和isoxabengydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

Thaxtomin A (TA)是由马铃薯常见的疥疮致病菌合成的天然纤维素生物合成抑制剂(CBI)gydF4y2Ba链霉菌属疥疮gydF4y2Ba．TA抑制纤维素合成损害细胞壁的组织和完整性，导致非典型细胞死亡程序(PCD)的诱导。这些过程可以促进gydF4y2Ba美国疥疮gydF4y2Ba进入植物组织。为了研究抑制纤维素合成诱导细胞死亡的机制，我们使用了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用两个结构不同CBI，TA和除草剂异氧（IXB）处理的细胞悬浮培养物。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

合成生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d)和天然生长素吲哚-3-乙酸(IAA)预处理后，TA和IXB对细胞的诱导作用消失。生长素外排抑制剂的加入也抑制了cbi介导的PCD的诱导。这种效应可能是由于生长素在细胞内的积累。生长素在植物细胞中有广泛的作用，包括控制细胞壁组成和硬度，以促进细胞伸长。利用原子力显微镜(AFM)为基础的力谱分析，我们发现TA和IXB对悬浮培养细胞中纤维素合成的抑制降低了细胞壁硬度，其水平与生长素引起的略有不同。然而，在CBI处理前用生长素处理过的细胞的细胞壁硬度与只用生长素处理过的细胞相当。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

添加生长素gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮培养可防止TA和ixb介导的细胞死亡。在cbi处理过程中，生长素极性运输的抑制也刺激了细胞的存活。抑制纤维素合成扰乱细胞壁力学性能gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞。生长素单独或与CBI一起处理也降低了细胞壁硬度，表明受CBI干扰的细胞壁力学性能没有被生长素恢复。然而，由于生长素对细胞壁硬度的影响明显超过了cbi诱导的，我们认为生长素可能通过恢复其自身的运输和/或稳定质膜-细胞壁-细胞骨架连续体来限制cbi的影响。gydF4y2Ba

植物细胞壁在植物生长发育中起着至关重要的作用，通过调节细胞的伸长、粘附和水分运动等过程来决定细胞的形状和大小。它还参与细胞间的交流，并提供细胞保护以抵御生物和非生物的攻击[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．原代细胞壁是一种强大但动态的结构，可以被酶和非酶蛋白修改，以调节其弹性和延展性，以响应生长信号或环境变化[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

纤维素是植物细胞壁的主要结构成分。这种多糖由β-1-4葡萄糖亚基链组成，通过氢键相互连接形成微纤维，微纤维嵌入在胶状基质中，由果胶、半纤维素和蛋白质组成[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．纤维素微纤维是细胞壁的最强分量[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．植物细胞壁组织的最新概念模型之一提出，微纤维通过纤维素微纤维之间的直接接触以及微纤维与木葡聚糖缠绕的承重连接处形成束[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]．这些相互作用是增加细胞壁机械阻力所必需的。果胶结合纤维素的亲水表面，填充微纤维之间的空间，以调节细胞壁弹性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．果胶也涉及在盐胁迫期间保持和感测细胞壁完整性[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]病理学互动[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

纤维素生物合成是由不同的纤维素合酶(CESA)蛋白在纤维素合成复合物(CSCs)中组装而成的多蛋白复合物介导的，它可以被看作是质膜中的玫瑰花状结构[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]．预组装的CSCs通过高尔基体、反高尔基体网络运输到质膜，最终进入与微管相关的小隔间[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．纤维素生物合成抑制剂(CBIs)引起的纤维素生物合成中断扰乱细胞壁的功能和组织，改变细胞扩张和细胞壁完整性[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

几种植物病原体可以扰乱细胞壁合成或组织以进行植物组织进行殖民。特别是马铃薯常见的结痂病原体gydF4y2Ba链霉菌属疥疮gydF4y2Ba(syngydF4y2Ba．scabieigydF4y2Ba)在感染过程中合成一种称为thaxtomin a (TA)的植物毒素，它是一种天然纤维素生物合成抑制剂(CBI) [gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2BaTA是导致常见结痂症状的主要致病性决定因素，因为用TA处理马铃薯块茎可诱导结痂样症状[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]，抑制正常致病性菌株的TA合成可消除受感染结节上结痂样症状的形成[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．有人提出放线菌gydF4y2Ba美国疥疮gydF4y2Ba会利用TA促进细菌渗透植物细胞壁[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba]．然而，TA对细胞壁组织和完整性的具体作用尚不清楚。gydF4y2Ba

在植物水平上，TA的作用与众所周知的CBI异沙苯(IXB)诱导的作用非常相似。在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗，塔会导致生长，根肿胀，诱导异位瘫痪和无国防相关的基因表达[gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．虽然IXB专门针对CESA3和CESA6 [gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba] Ta的特定分子靶标未知。然而，由于IXB的突变体与IXB的突变体不具有抵抗TA的突变体，它最可能与IXB的差异不同gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．此外，TA诱导的异位木质素化模式与IXB诱导的不同，而IXB处理并不完全模拟TA诱导的基因表达变化[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮液、IXB或TA抑制纤维素生物合成引发细胞肥大并诱导非典型细胞死亡程序(PCD) [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．但是，对于这种不寻常的PCD的调节，很少。结果表明，TA诱导的PCD取决于钙流入，通过转录和翻译抑制剂消除[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．TA引起的PCD与H无关gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产，并不涉及与防御相关的丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号传导[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．由于TA是马铃薯赤霉病的主要致病因子，因此减少TA对植物细胞的影响是防治马铃薯赤霉病的一个有前景的策略。据报道，在马铃薯块茎诱导时，喷施合成生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d)可提高马铃薯植株对普通疮痂病的抗性，这一效应归因于减少块茎中的TA毒性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．同样，TA抑制gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba人工合成的生长素2,4- d或天然生长素吲哚-3-乙酸(IAA)可逆转幼苗生长[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．然而，目前尚不清楚生长素处理如何减少块茎或幼苗中的TA毒性。gydF4y2Ba

在这项工作中，我们使用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在细胞水平上研究TA诱导细胞死亡的机制。结果表明，人工合成和天然生长素预处理对ta诱导的细胞死亡均有保护作用。这种保护并不是TA分子本身所特有的;生长素预处理也可消除IXB诱导的细胞死亡。此外，钙内流抑制剂和生长素外排抑制剂降低了两种cbi诱导的细胞死亡。生长素诱导细胞壁组成变化，使细胞壁松弛，有利于细胞伸长。在力测量模式下使用AFM，我们发现TA或IXB处理导致细胞壁硬度下降，其水平与生长素处理显著不同。然而，结合生长素预处理后添加CBI，细胞壁硬度降低到与单独生长素处理相同的水平。我们讨论了生长素如何通过刺激质膜-细胞壁界面的快速变化来抑制抑制纤维素合成的影响。gydF4y2Ba

CBI诱导的细胞死亡是必需细胞溶质钙的增加gydF4y2Ba

已经测量了快速和短的钙流入gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞及幼苗对TA处理的反应[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．用钙通道抑制剂氯化镧的细胞培养物预处理（LACLgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)抑制TA诱导的细胞死亡，表明胞质钙的增加是激活信号级联导致TA诱导细胞死亡的必要条件gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞 [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．纤维素合成IXB的抑制剂也活化了与TA诱导的细胞死亡程序非常相似，但从未研究过IXB诱导的细胞死亡中钙的含义。为了确定IXB诱导的细胞死亡是否需要钙流入，我们使用不同的钙转运抑制剂（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）;LaClgydF4y2Ba_{3，gydF4y2Ba}钌红(ruthenium red, RR)被认为可以阻断细胞内储存的钙的释放，并抑制线粒体钙单受体[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．将这些抑制剂加入到中gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞培养30分钟后加入TA或IXB。如前所述[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]，lacl.gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba显着降低了TA处理细胞中细胞死亡百分比从72％降至56％（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa). LaCl的作用gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba在ixb处理的细胞中更为重要，细胞死亡从84%下降到19%(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac). RR预处理也抑制了两种CBIs介导的细胞死亡诱导，ta处理的细胞死亡降低了36%，IXB处理的细胞死亡降低了54%(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab和d)。两种治疗方法也抑制了CBI反应中观察到的典型细胞肿胀[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，并减少平均单元格大小(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明这些抑制剂可能影响细胞伸长。gydF4y2Ba

生长素保护gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba来自CBI诱导的细胞死亡的细胞gydF4y2Ba

自2,4- d被提出减少TA的毒性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗及马铃薯块茎[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，我们确定了它是否也能在细胞水平上保护ta诱导的细胞死亡。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮培养用合成生长素2,4- d预处理30分钟，然后用TA诱导细胞死亡。在72 h内定期计数死亡细胞。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，添加TA后48 h的死亡细胞百分比为79%，而添加TA前的2,4- d处理的培养细胞只有18%的死亡细胞(图4)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).这种对细胞死亡的显著抑制可能特别归因于2,4- d，也可能是对生长素的一种更普遍的反应。为了回答这个问题，我们用天然生长素IAA或合成生长素1-萘乙酸(NAA)预处理细胞，然后加入TA。如附加文件所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba结果表明，IAA单独预处理使细胞在48 h内死亡的百分比增加到48%，但显著降低了TA诱导的细胞死亡百分比，IAA预处理的细胞死亡比例为49%，而TA单独处理的细胞死亡比例为79%。低浓度(1 μM和10 μM) NAA预处理对TA诱导的细胞死亡无明显保护作用。当我们使用更高的浓度(30 μM;附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba），单独的Naa-pretreatment在类似于Ta诱导的水平上增加细胞死亡，使得不可能确定NAA是否可以有效改变对TA的反应。gydF4y2Ba

生长素可能直接对TA分子本身发挥保护作用(例如，竞争，相互作用)，或者可能保护细胞免受TA抑制纤维素合成的能力或其下游后果的影响。为了区分这些可能性，我们重复了之前的实验，使用了一种结构不同的纤维素生物合成抑制剂IXB，它也诱导PCDgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞培养物[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮培养用不同浓度的2,4- d、IAA或NAA预处理30 min，然后用IXB处理。所有浓度为1 μM的生长素预处理均能显著降低IXB诱导的细胞死亡百分比，但在2,4- d预处理的细胞中，这一降低率仅为11%gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.天然生长素IAA对IXB的保护作用见图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba湾在IXB之前的IAA预处理在添加IXB后，在IXB处理的细胞中，在IXB处理的细胞中的84％降低了104％的细胞死亡百分比。gydF4y2Ba

抑制生长素外流可以保护细胞免受cbi诱导的细胞死亡gydF4y2Ba

减少纤维素合成的TA和IXB在48小时内显著降低细胞伸长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮培养(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.然而，CBI诱导悬浮培养细胞末梢细胞径向扩张(肥大和鼓胀)([gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba];有趣的是，在TA或IXB作用下，肥厚细胞的存活时间比其他细胞长。这一观察表明，在细胞档案的末端，化合物或信号的极化积累将刺激细胞存活。生长素作为一种很好的候选激素脱颖而出，因为这种激素在植物和烟草BY-2细胞悬浮培养中以定向和极化的方式运输[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．根据我们的结果，我们假设肥大细胞的增强存活可能与细胞文件结束时的极性传输和积聚的极性传输和积累相关联。因此，对细胞培养物添加外源性养肝剂将增加养肝细胞内的细胞内水平，因此甚至在CBI治疗后甚至在大多数细胞中促进细胞存活。gydF4y2Ba

为了评估CBI对细胞死亡诱导中极性植物素转运的重要性，我们用两种不同的养蛋白流出抑制剂处理细胞悬浮液，即，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-1-萘氨基苯氨基酸（NPA）和三碘苯甲酸（TIBA），以及两个助潮剂抑制剂，即3-氯-4-羟基苯基乙酸（CHPAA）和2-萘乙酸（2-NOA）。由于NPA和TIBA在植物细胞中具有其他影响，包括囊泡贩运和细胞骨架的扰动，我们使用了每种化学物质的浓度，所述化学物质不会改变细胞骨架[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．加入NPA或TIBAgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在CBI处理之前30分钟的细胞悬浮液。在48小时的时间内计算死细胞。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA，通过将NPA和TIBA的预处理分别为87％至65和40％，通过预处理显着降低TA处理细胞中死细胞的百分比。相比之下，具有促进毒素中流量抑制剂的预处理，这种CHPAA和2-NOA对TA诱导的细胞死亡没有影响。同样，由于在IXB处理的细胞培养物中观察到，细胞死亡的这种降低没有特异于TA分子本身。在添加IXB之前用NPA或TIBA预处理的细胞培养物比IXB处理的细胞培养物更少（25至28％）（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).这一数据表明，使用TIBA和NPA阻断生长素外排可提高cbi处理细胞的存活率。gydF4y2Ba

CBI和养素减少细胞壁刚度并抑制细胞伸长率gydF4y2Ba

TA和IXB对纤维素合成的抑制作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞培养和幼苗诱导细胞壁合成和木质素异位积累相关基因的表达[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．这些反应被认为在增强因纤维素合成受损而受损的细胞壁中起作用。这可以维持细胞存活、伸长和生长所需的细胞壁力学特性和完整性[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．生长素对控制细胞壁组成也很重要，可以诱导细胞壁松动，这是细胞伸长所必需的。由于CBI和生长素都对细胞壁有影响，因此生长素对CBI的保护作用可能与它们对细胞壁力学特性的选择性作用有关。gydF4y2Ba

为了确定TA和IXB的影响以及植物素对细胞壁机械刚度，我们使用原子力显微镜（AFM）的力光谱，以测量以前描述的细胞壁的弹性模量表示的机械性能，如前所述［gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．这里，该技术允许对细胞进行非破坏性分析，以评估CBI对接受PCD的活细胞中细胞壁的机械性能的影响。杨氏模量从记录在处理24小时的细胞上记录的荧光缩进曲线，每次CBI，植物素或两者的组合（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.我们选择在液体培养基中对非质粒分解的细胞进行AFM测量，因为质粒分解可能会改变细胞对CBI或生长素的反应。特别是，质壁分解可以重现IXB治疗的一些效果[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．质壁分解和IXB修饰PIN生长素外排转运体的质膜定位，从而改变生长素的极性转运[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．等离子溶解还可以扰动质膜 - 细胞壁 - 肌动蛋白细胞骨架连续体，因为它显示出改变肌动蛋白的重塑和Golgi Body Motility [gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．最后，我们发现胞浆分离处理可以略微降低cbi诱导的PCD(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，说明质膜分离对质膜-细胞壁界面的扰动可以改变CBI(本研究的对象)对PCD的诱导。gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba用指示浓度的生长素和CBI处理的细胞与来自同一培养物的对照细胞进行比较。因此，细胞表面弹性模量(杨氏模量)的任何差异都可以归因于不同的CBI和生长素处理所引起的变化。直方图如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba显示测量杨氏模量的分布百分比，其值范围为0至5MPa，每个治疗。我们还计算了每种治疗的杨氏模量值的平均中值，如图2所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaH。gydF4y2Ba

在控制单元格(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa），杨氏模量值在宽范围内分布，接近39％的值，低于0.2MPa，50％在0.2和1MPa之间。控制细胞中细胞壁的平均杨氏模量值为0.355MPa，其与也获得的结果相当gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaRadotić等人的悬浮细胞。（2012）。与对照细胞相比，我们观察到用Ta和Ixb处理的细胞中细胞壁刚度的陡峭降低（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab和e)分别有超过67和68%的测量值低于0.2 MPa。因此，杨氏模量的平均值中值(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah)，分别为0.078 MPa和0.089 MPa，均低于对照细胞杨氏模量平均中位数(0.355 MPa)，表明细胞壁刚度明显下降。这表明纤维素合成的抑制极大地扰乱了细胞壁的力学性能。gydF4y2Ba

还评估了植物素对细胞壁机械性能的影响。在2,4-D处理的细胞中（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac），超过83％的杨氏模量值在0.1MPa下发现，接近94％，低于0.2MPa，表明与对照细胞相比，细胞壁刚度的急剧降低。2,4-D和Ta处理的组合降低了细胞壁刚度至与2,4-D引起的水平相当的水平（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad），接近87％的杨氏模量值，低于0.1MPa，高达96％，低于0.2MPa。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah时，单独2,4- d处理细胞的平均杨氏模量中值(0.049 MPa)或与TA联合处理细胞的平均杨氏模量中值(0.026 MPa)均低于TA处理细胞的平均杨氏模量中值(0.078 MPa)。虽然2,4- d和TA联合处理可能有助于增强细胞壁刚度的降低，但2,4- d和TA联合处理后的杨氏模量分布与2,4- d处理细胞的杨氏模量分布相似，说明2,4- d在一定程度上取代了TA的作用。gydF4y2Ba

与对照细胞相比，单独使用天然生长素IAA处理的细胞细胞壁硬度降低，杨氏模量在0.1 MPa以下的比例为37%，在0.2 MPa以下的比例为58%。gydF4y2Ba4gydF4y2BaF）。杨氏模量中位数为0.149MPa（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah)。IAA和IXB处理组合时(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaG），杨氏的模量分布与单独治疗后观察到的值相当，较小40％的杨氏模量值低于0.1MPa，接近0.2MPa以下的52％。在这种情况下，合并处理的平均杨氏模量值为0.137MPa（图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaH）高于仅用IXB处理的细胞中获得的平均杨氏模数值（0.089MPa），表明IXB诱导的细胞壁刚度的降低至少部分地被IAA的作用覆盖。gydF4y2Ba

尽管细胞壁刚性降低，但我们观察到这一点gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用树脂或CBI处理的细胞培养物表现出比对照细胞更小的细胞比例（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.响应于TA或IXB的48 H处理，76％和68％的细胞分别在40μm细胞短于40μm，相比于44％的对照细胞。在IAA处理的细胞培养物中，该比例类似，10-40μm类别中具有72％的细胞。用2,4-D减少细胞伸长率，甚至超过CBI或IAA，在10至40μm的类别中具有超过89％的细胞。此外，在对照细胞中仅在2,4-D或IAA处理的细胞中仅在2,4-D或IAA处理的细胞中仅为3至10％的细胞较长，而对照细胞中的26％相比，60μm。这些结果表明，CBI和养素型均在这些实验条件下降低了细胞伸长率。gydF4y2Ba

TA和IXB对纤维素生物合成的抑制作用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞培养诱导非典型程序性细胞死亡[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．在大多数情况下，与防御相关的PCD发生在钙内流之前，钙内流与氧化爆发有关，其特征是产生HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba和激活MAPK信号通路[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]．然而，TA不诱导H的产生gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba也不是激活的防御相关的MAPK途径[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba[表明诱导的PCD与古典防御相关的PCD不同。但是，在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞和幼苗，TA诱导快速和短的钙内流，这对诱导细胞死亡和抑制生长至关重要[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．可以响应于植物病原体，特异性诱变剂和毒素而且响应机械刺激而检测细胞溶质钙的快速积累。gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．据报道，ta诱导PCD [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]， IXB诱导的细胞死亡被阻断钙内流(LaCl)的药物抑制剂抑制gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba)和钙从内部储存(RR)释放(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.这些结果提供了证据，表明胞质钙的变化，发生在抑制纤维素合成之后，是导致PCD的信号级联的早期步骤，正如在几种类型的PCD中观察到的[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

TA是一种天然生物合成抑制剂和主要致病性因子gydF4y2Ba链霉菌属疥疮gydF4y2Ba，一种丝状放线菌，引起马铃薯块茎病常见的结痂[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．TA抑制根生长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，西红柿和马铃薯[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba)和扰乱gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba幼苗生长，可以通过合成毒素2,4-D或天然养蛋白IAA逆转的效果[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．在这项工作中，我们研究了使用的植物蛋白对蜂窝水平的TA诱导细胞死亡的影响gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬液的文化。预处理的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba与对照细胞相比，细胞悬浮培养物或具有2,4-D或天然助体IAA的细胞悬浮蛋白显着增加了TA处理细胞的细胞存活率（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种;附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.合成的助体素2,4-D比IAA更有效地保护TA诱导的细胞死亡。与代谢稳定的2,4-D相比，这可以部分地解释IAA的速度更快的代谢降解[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．这些结果表明，无论是天然生长素IAA还是人工合成的生长素2,4- d都能显著地保护植物细胞免受TA的影响。合成和天然生长素在应答IXB时也能非常有效地抑制细胞死亡，IXB是另一种与TA结构不同的CBI(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB;附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.在这种情况下，即使是低水平(1 μM)的各种生长素也能显著降低细胞死亡。其中NAA的生长素效率最高，2,4- d的生长素效率最低。gydF4y2Ba

总的来说，这些结果表明，生长素保护细胞免受纤维素合成抑制的影响，而不是直接对抗TA或IXB分子。然而，对细胞死亡的保护水平取决于使用的生长素化合物和CBI。这些变化可能是由于每个生长素分子在摄取、活性或代谢降解速率上的差异[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba或TA和IXB的不同作用方式。gydF4y2Ba

预处理的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞培养物具有促进型流动抑制剂NPA和TIBA的细胞和TIBA也增加了CBI处理的细胞中的细胞存活率（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.相比之下，促进型流入抑制剂CHPAA和2-NOA对CBI诱导的细胞死亡没有影响（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.有几个例子表明，利用NPA和TIBA阻断生长素外流可以增加植物细胞和植物组织中生长素的积累[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．例如，烟草细胞和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba悬浮培养在有放射性标记生长素和生长素外排抑制剂TIBA和NPA存在的情况下生长，有增加的放射性标记生长素积累[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．烟草细胞中细胞分裂的同步，取决于极性养蛋白转运的过程，也扰乱了NPA;这种效果归因于由于减少的胃辘术减少而增加养肝细胞内浓度[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．在另一个实验中，利用柑橘外植体表达一种生长素诱导物gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba结果表明，NPA处理干扰了茎切端生长素的极化积累，使生长素在外植体上均匀分布[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．最后，通过豆叶叶片中的NPA阻断生长素流动显着增强了叶片中自由IAA的积累[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]．基于这些结果，我们认为生长素外排抑制剂抑制cbi诱导的细胞死亡最有可能是由于内源性生长素在细胞中的积累。然而，阻断生长素的转运也会扰乱植物细胞内生长素的稳态。为了控制细胞内生长素水平，各种细胞机制可能被激活，包括减少生长素合成和结合或氧化为非活性形式[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]．这些机制是否参与了cbi诱导的细胞死亡的抑制还没有被研究。gydF4y2Ba

其他报告还表明，植物荷敏累积可以抑制在植物开发期间发生的PCD或响应应力。例如，挪威云杉的发展（gydF4y2Ba挪威云杉gydF4y2Ba)体细胞胚涉及PCD程序化消除胚柄和胚管细胞[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]．利用NPA抑制生长素运输抑制了胚柄细胞和管状细胞中的PCD，表明生长素在这些细胞中的积累扰乱了PCD和胚胎模式[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]．植物蛋白还参与了在根组织中冷却应激诱导的PCD的干细胞利基保护[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．在正常条件下，根茎茎细胞中的植物素浓度在静态中心（QC）中最大，并且在根尖处遵循局部梯度。这种制氮分布允许根茎干细胞分裂并抑制核菌茎细胞（CSCD）的分裂，致力于区分。冷却应激导致DNA损伤特异性地诱导CSCD中的PCD，而来自根茎干细胞的其他细胞生存。寒冷的压力也渗透了养羊酸的分布;低养型水平有助于CSCD的PCD，其反过来在干细胞Niche中重新建立毒素最大值，以保护通过冷却应力引起的分裂和DNA损伤的根茎干细胞[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．这些例子和我们的结果表明，生长素在特定的发育阶段或对各种外部条件的响应中发挥促进细胞生存的作用。然而，生长素如何在这些情况下抑制细胞死亡还没有被阐明。gydF4y2Ba

在CBI诱导的PCD的情况下，植物素可以在细胞壁的水平上直接发挥其保护作用。蟾蜍蛋白诱导细胞壁壁相关基因的表达，并刺激含有新细胞壁材料的囊泡的运输[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．生长素还可以调节多种细胞壁修饰酶，包括扩张素和果胶甲基酯酶，以控制细胞伸长[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]．制冷素的细胞伸长调节涉及细胞壁的机械性能的变化。“酸生长理论”解释了这种效果，其规定了蟾蜍蛋白引起的细胞外酸化诱导细胞壁松动，以增加细胞壁可伸展性和细胞膨胀[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．生长素还可以通过果胶同半乳糖醛酸的去甲基化作用来降低细胞壁的硬度gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在器官过度之前[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]．因此，生长素介导的细胞壁力学性能的变化可能限制了CBI的影响。gydF4y2Ba

采用基于afm的力谱分析方法，研究了CBI和生长素对黄瓜细胞壁力学性能的影响gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba悬浮细胞。该技术是非破坏性的，可用于活细胞。细胞壁的机械性能表示为如前所述的弹性模量（杨氏模量）表示为弹性模量（杨氏模量）gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，对照细胞的细胞壁的平均杨氏模量值分别为0.355MPa，而该值分别在TA和IXB处理细胞中降至0.078和0.089MPa。这表明CBI导致细胞壁刚度的急剧下降。这还证明了响应TA和IXB的细胞壁基因的诱导表达[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba并不足以弥补CBI造成的变化。同样，生长素处理也降低了细胞壁硬度;2,4- d和IAA处理的细胞平均杨氏模量中值分别为0.049和0.149 MPa。有趣的是，生长素和CBI联合处理的细胞杨氏模量的分布模式与生长素单独处理的细胞非常相似(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.用2,4-d治疗诱导的变化似乎克服了TA诱导的那些（图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB-D）。然而，通过使用IAA预处理细胞部分克服IXB引起的刚度的降低。gydF4y2Ba

总的来说，这些结果表明，与对照细胞相比，CBI和生长素处理均降低了细胞壁硬度。此外，这些数据表明，生长素处理并不能通过恢复cbi处理的细胞的细胞壁硬度来提高细胞存活率。另一方面，AFM数据也表明生长素处理对细胞壁硬度的影响至少部分超过了CBI的影响。gydF4y2Ba

通常需要生长素增加细胞壁的伸长来刺激细胞的快速伸长。然而，我们观察到gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba用养蛋白处理的细胞培养物含有比对照细胞小的高比例细胞（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），表明尽管细胞壁刚度降低，但是蟾蜍素减少了细胞伸长率。虽然植物蛋白通常刺激细胞伸长，但高中毒素浓度是根组织中的抑制作用[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]．在深生悬浮细胞培养物中获得的结果可以部分模拟根组织中观察到的效果。最近，结果表明，在根组织中增加了内源性或外源水平的生长素诱导了瞬态的胰腺炎碱化，其负责抑制根伸长率[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]．如在根中观察到的，添加外源性养蛋白降低的细胞伸长率gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba悬浮培养细胞(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.类似地，抑制TA和IXB的纤维素合成也降低了细胞伸长率gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）之前，之前被证明造成幼苗的根本生长[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．有趣的是，TA处理后pH值的双相变化被测量gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞悬浮液，酸化期短，随后发生大的碱化[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．这可能是生长素和CBI的pH变化对细胞生长的抑制作用。总的来说，这些结果表明细胞壁刚度的降低不一定与细胞伸长的刺激有关。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，促进剂在促进CBI处理细胞中促进细胞存活的作用方式显然不限于细胞壁机械性能的变化。需要探索几种其他可能性，以完全理解疾病如何保护CBI。例如，显示通过IXB诱导细胞壁缺陷的扰动栓塞销转运蛋白的偏振定位，从而改变偏振的制氮传输[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]．纤维素的合成是由微管控制的，微管控制CSC运动的方向，引导纤维素微纤维的方向。此外，微管似乎以细胞特定的方式控制PIN极性[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]．PIN生长素外排载体定位于与纤维素合成的CSCs相关的膜微域。因此，扰乱纤维素合成可能会破坏微管的稳定性，改变PIN定位并抑制细胞伸长[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]．因为生长素本身可以增强PIN转运体的表达并重建其极化定位[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba[植物素治疗可以潜在恢复被细胞壁缺陷扰动的植物素转运。销定位的恢复可以通过恢复细胞壁合成来稳定其与CSC的关联，这可以通过恢复细胞壁合成来部分恢复细胞壁完整性。该假设还可以解释为什么植物蛋白介导的细胞壁刚度的降低似乎覆盖CBI诱导的。gydF4y2Ba

微管似乎与肌动蛋白丝一起工作以维持生长素通量并建立生长素最大值。因此，肌动蛋白细胞骨架结构的改变也可能在生长素介导的抗CBI中发挥作用。IXB诱导细胞壁缺陷可刺激肌动蛋白束束[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]，这是PCD的早期和重要事件[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]．生长素处理可恢复正常的肌动蛋白结构[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]．它被昌等人所示。（2015）将正常肌动蛋白配置的重新建立涉及蛋白酶Elicitor Harpin在烟草叶中诱导的PCD保护的毒素介导的保护[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]．生长素的保护作用依赖于肌动蛋白组织水平的改变及其与质膜的相互作用[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]．因此，可以通过恢复正常的肌动蛋白构造，植物素可防止CBI诱导的细胞死亡又将依次稳定血浆膜 - 细胞壁 - 细胞骨架连续体。gydF4y2Ba

我们已经表明，外源性添加了合成和天然的吸管gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞培养能抑制两种结构不同的cbi (TA和IXB)诱导的PCD。对于这两种cbi，细胞死亡的启动都依赖于胞质钙的增加，这表明钙参与了导致cbi诱导PCD的信号级联的早期步骤。添加生长素外排抑制剂(NPA和TIBA)可以增加生长素的积累，也可以保护细胞免受cbi诱导的PCD。这些发现支持了其他人的研究，他们表明生长素可以抑制特定的发育或防御相关的PCDs。生长素还可以通过诱导细胞壁组成和组织的变化来弥补纤维素合成的减少，从而保护细胞免受cbi诱导的细胞死亡。然而，由于基于afm力谱评估的细胞壁刚度发现，cbi诱导的PCD和生长素都降低了细胞壁刚度，我们得出的结论是，生长素介导的对cbi诱导的PCD的保护并不依赖于细胞壁的增强。我们认为，生长素可能通过刺激质膜-细胞壁界面的快速变化来弥补细胞壁缺陷，从而恢复生长素的运输和/或通过重建对细胞生存至关重要的质膜-细胞壁-细胞骨架连续体来弥补细胞壁缺陷。需要进一步的调查来评估这些可能性。gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba加入岩土牌gydF4y2BaerectagydF4y2Ba细胞悬浮培养由Dr. Jean Rivoal (IRBV, Montréal, PQ, Canada)提供。所有化学品均购自Sigma Aldrich，除非另有说明。细胞悬液在45 mL MS (pH 5.7)中生长，MS中添加了B5维生素和1 mg LgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d)在125毫升Erlenmeyer烧瓶中保持在22°C的旋转振动筛(120 rpm)上。gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba将15 mL细胞稀释到新鲜培养基中，每7 d传代一次。传代后3至4 d，使用10 mL log-phase细胞进行处理。Thaxtomin A (TA)的制备方法如前所述[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．TA(库存1 mM)和异沙苯(IXB;在甲醇中制备，加入最终浓度为1 μM。将相同体积的甲醇(小于最终体积的0.1%)加入到对照细胞中。2,4- d和IAA在乙醇中溶解，1-萘乙酸(NAA)溶于水。这些化学物质是按每次实验中规定的最终浓度添加的。生长素转运抑制剂三碘苯甲酸gydF4y2BaNgydF4y2Ba-1-萘基酞酸(NPA)、2-萘基乙酸(2-NOA)和3-氯-4-羟基苯乙酸(CHPAA)溶于乙醇中，加入最终浓度为10 μM的细胞培养物中。钙抑制剂钌红(RR)和氯化镧(LaClgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）在水中稀释并过滤。用终浓度为50nm的RR和500μm的LacL处理细胞gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细胞死亡分析gydF4y2Ba

使用如前所述的台盼蓝染色评估细胞死亡[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．对于微观评估，将细胞在含有荧光素二乙酸酯（FDA）的新鲜培养基中孵育5分钟，以终浓度为2.78μm的终浓度为50μm和碘化丙啶（Pi）。用Zeiss Imager Z1显微镜（Carl Zeiss Canada Ltd.，Canada，Canada）拍摄了图像，配备了使用AxioVision 4.8.2版的单色相机。检查四十μL细胞培养物用于活细胞（FDA荧光）和死细胞（PI荧光）。通过激发波长为488nm的激发波长可视化FDA，并在510至530nm之间收集排放。PI在540nm激发并在590nm以上收集排放（590Lp）。对于每种病症，计算100组中的至少500个细胞。每个实验至少重复三次。gydF4y2Ba

电池尺寸的测量gydF4y2Ba

使用斐济软件确定细胞尺寸[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba通过三个独立的实验，在每个条件下测量300个细胞的长度。gydF4y2Ba

细胞表面力学gydF4y2Ba

单个细胞的弹性模量(杨氏模量)由原子力显微镜(AFM)记录的力/针尖-样品分离曲线定量。用不同浓度的甲醇(对照)、TA、IXB、2,4- d或IAA组合预处理细胞24 h。每一种培养物取40 μl放在poly-L-lysine (0.1 mg mL-1)包被玻片盖玻片上5分钟，使其粘附。盖片用培养基冲洗三次，然后用微量真空润滑脂固定在装有2ml培养基的小培养皿中，然后进行分析。AFM分析在接触模式下进行，如前所述[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．简而言之，使用JPK仪器Nanowizard®4V.6（德国）进行AFM研究安装在倒蔡司成像仪Z1显微镜（Carl Zeiss Canada Ltd.，安大略省，加拿大）的顶部。使用标称弹簧常数的MLCT悬臂器A为0.07 n / m（Bruker Afm Probes，California，USA）。对于这种悬臂，我们通常使用热噪声技术获得0.05至0.11n / m的弹簧常数[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]．杨氏模量计算使用赫兹模型适用于一个四边金字塔压头，内置JPK分析软件。玻璃盖滑移的杨氏模量被认为是无限刚性的，当与被测细胞的杨氏模量相比。所有研究都是在室温下进行的。在细胞表面5 μm半径范围内的5个不同任意位置记录力曲线，共5批，每个细胞30至50点。每个实验用3到4个细胞。每个实验重复3次。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

采用GraphPad Prism 7进行统计学分析。在细胞死亡试验和测量中，每组100个细胞计数，并从3到15个重复计算平均值。每个实验至少重复三次。数据分析采用t检验，然后采用Holm-Šídák方法，alpha = 0.05。结果被认为在统计学上有所不同gydF4y2BapgydF4y2Ba-value < 0.05。gydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。gydF4y2Ba

2,4-D：gydF4y2Ba

2,4-二氯毒乙酸gydF4y2Ba

AFM:gydF4y2Ba

原子力显微镜gydF4y2Ba

CBI:gydF4y2Ba

纤维素生物合成抑制剂gydF4y2Ba

中国极限运动协会:gydF4y2Ba

纤维素合成酶gydF4y2Ba

CSC：gydF4y2Ba

纤维素合成复杂gydF4y2Ba

Ctrl：gydF4y2Ba

控制gydF4y2Ba

IAA：gydF4y2Ba

Indole-3-Acetic酸gydF4y2Ba

IXB:gydF4y2Ba

IsoxabengydF4y2Ba

纤毛运动:gydF4y2Ba

程序性细胞死亡gydF4y2Ba

助教:gydF4y2Ba

Thaxtomin一gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

这项工作得到了加拿大国家科学和工程委员会(NSERC)和Université de Sherbrooke to N. Beaudoin的Faculté des Sciences的支持。资助方没有参与研究的实验设计、数据收集、分析和解释，也没有参与手稿的撰写。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. CenterSève，DépartementdeBiologie，UniversitédeSherbroke，Sherbrooke，Québec，J1K 2R1，加拿大gydF4y2Ba

   Fatima awwad＆nathalie beaudoingydF4y2Ba

2. 现住址:Groupe de Recherche en Biologie végétale, Département de chimie, biochimie et体质，Université du Québec à Trois-Rivières, Trois-Rivières, Québec, G9A 5H7，加拿大gydF4y2Ba

   法蒂玛AwwadgydF4y2Ba

3. Institut de Pharmacologie de Sherbrooke，De Pharmacologie et Physiologie，UniversitédeSherbrooke，Sherbrooke，Québec，J1H 5N4，加拿大gydF4y2Ba

   Guillaume Bertrand＆Michel GrandboisgydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

FA和NB构思和设计了大部分实验。FA和MG设计了AFM实验。FA进行了大部分实验。FA和GB进行了AFM实验。FA、GB、MG对AFM数据进行分析解释。FA和NB对剩余数据进行分析并撰写稿件。所有作者阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaNathalie BeaudoingydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba