小麦秸秆增强了西瓜单作对枯萎病的防御反应和抗性

背景

小麦秸秆是全球丰富的资源。秸秆返回是减轻单种西瓜的土壤传播疾病的有效策略。以前的研究重点是土壤结构，物理和化学性质;然而，关于宿主植物的分子反应很少。

结果

人口没有显着差异Fusarium oxysporumF.SP.．奈姆在控制（不添加小麦秸秆）和处理的组之间发现了根际土壤中的参数（FON1）（添加1％（T1）或2％（T2）麦秸秆）。RNA-SEQ分析表明，将3419个差异表达基因聚集成8种型材。Kegg分析表明，苯丙醇丙酮化生物合成和植物激素信号转导参与单殖民科西瓜中的小麦秸秆诱导的反应。发现木质素生物合成中的基因被发现是上调的，与对照相比，T1和T2的木质素和唾液含量较高。木质素还富集，并在用麦子秸秆处理的西瓜根中，FON1人口减少。苯丙氨酸氨酶和过氧化物酶的酶活性增加。

结论

我们的数据表明，通过增加木质素和生长生物合成，增加小麦秸秆对西瓜的FON1感染的抗辩反应。

西瓜(Citrullus lanatus（Thunb。）matsum。＆nakai var。Lanatus）是全球主要经济作物。根据联合国的食品和农业组织，2016年收获了约11700万吨西瓜（http://www.fao.org/faostat/en.)．然而，近年来，长期的单一文化导致了镰刀枯萎病的普遍存在[1]，主要是由此引起的Fusarium oxysporum，一种土壤传播的真菌，导致全球约30-50％的西瓜产量损失[2］．Fusarium Wilt先前已被土壤熏蒸的主要控制[3.,杀真菌剂4]，以及抗性品种的使用[5］．然而，这些控制措施并不理想，会直接增加环境污染。近年来，利用天然拮抗剂而非化学药剂来减少害虫数量的生物防治已成为一种流行的植物病害防治方法[6，7］．

作物秸秆在世界范围内的现代农业中广泛使用，也是缓解单一栽培问题、提高作物产量和质量的最古老和最经济的管理方法。作物秸秆对减少土传病原菌的作用已得到广泛的观察。已有研究表明，生菜入土可有效防治黄瓜根腐病;葡萄渣和大蒜秸秆分别对番茄枯萎病和根结线虫有抑制作用[8，9，10.］．

根据植物微生物相互作用原理，有两种方法可以抑制土壤传播的疾病：提高宿主的病原体，或降低病原体攻击[11.，12.］．因此，对西瓜的基因表达和生理响应进行分析具有重要意义。植物已经发展出不同的防御机制来保护自己免受微生物感染。有些植物有物理屏障来阻止潜在的病原体进入[13.];和一些产生植物激素和防御相关蛋白质响应于感染[14.］．以往的研究表明，间作和/或伴作相比单作寄主植物的致病相关蛋白、防御酶和木质素合成显著增加[15.，16.，17.］．然而，关于作物秸秆添加如何通过宿主植物在草返回系统中通过饲养植物增强对土壤疾病的抵抗力的机制。

近年来，转录和生理工程分析被广泛应用于研究病原菌感染的病理生理和基因变化。对许多植物来说，RNA-Seq转录组分析是了解植物抗病机制的一个突破点。转录和生理分析表明，木质素代谢参与其中Botrytis-番茄中的诱导反应[18.］．RNA-SEQ分析阐明了抵抗力反应中的分子机制Ralstonia solanacearum在番茄19.］．RNA-SEQ分析还显示出许多光合作用相关基因在菊花和芒果中的病原体存在下差异转录[20.，21.］．

目前，小麦秸秆诱导寄主植物抗病的分子机制尚不清楚。本研究以对枯萎病敏感的西瓜品种早家84-24和小麦秸秆D125为材料，通过RNA-Seq技术和生理试验研究其抗病性来源。我们的研究结果为小麦秸秆诱导西瓜对枯萎病抗性增强的潜在分子响应提供了重要的见解。这为进一步研究植物抗病机制奠定了基础。

小麦秸秆对单栽培西瓜发病率、病害严重程度及植株生长的影响

盆栽试验中，3个处理(CK，不添加麦秸;T1，添加1%麦秸;研究了添加2%麦秸(T2)对西瓜单株病害发生率和植株生长的影响。不同时间点T1和T2均显著低于CK，且在2017年秋季试验中T1显著低于T2和CK。而2017年春季与2018年春季T1与T2之间无显著差异(图1)。1a).疾病指数的变化趋势与发病率的变化趋势相似(图1)。1b).此外，各时间点T1和T2的根长和株高均高于CK，而T1和T2的根长和株高与CK相似(图2)。1C，D）。这些结果表明，小麦秸秆降低了单一种质西瓜的疾病发病率，促进西瓜生长，与小麦秸秆添加量无关。

小麦秸秆添加对根际土壤FON1人群的影响

从西瓜根际土壤中采集不同处理的DNA和拷贝数Fon1通过实时PCR确定。在三种治疗中，在第1族人群中没有观察到显着差异（图。2)．小麦秸秆分解对Fon1菌丝生长和孢子萌发均无影响1:图S1A和B，表S1)。结果表明，小麦秸秆对西瓜土壤中病原菌无抑制作用，秸秆分解对Fon1生长和萌发无影响。

RNA-SEQ分析和参考基因组的对准

如图1所示。1A，在2017年春季进行了CK组和T1 / T2组之间的疾病发病率最大的差异。因此，选择2017年春季的西瓜根用于RNA-SEQ分析。

九个RNA-SEQ文库，包括CK组中的三个（CK-1，CK-2和CK-3），T1组中的三个（T1-1，T1-2和T1-3），以及T2组中的三个（T2-1，T2-2和T2-3）被测序。在原始序列的质量控制和数据滤波后，选择共495万份干净的配对盖（≥150bp）进行进一步分析。这些清洁读数被存入国家生物技术信息中心（NCBI）的序列读取档案数据库（Resciveion SRP158956）中。将所有样品的读数映射到高质量的西瓜参考基因组（附加文件2：图S2）。映射百分比为98.55％，标准偏差为1.1％（表1)．

RNA-Seq结果验证

使用定量实时PCR（QRT-PCR）用于验证使用17个基因特异性引物的转录组分析的可靠性，包括11个苯基丙二醇代谢物途径基因，1个Saur基因和5个其他下调基因（附加档案3.:表S2)。我们的结果表明，PAL的表达模式（Cla008727), C4H (CLA013420), 4 cl (CLA017226.),转移酶(CLA010664.)、豆荚(Cla016012和CLA014249.）与测序结果一致（图。3.)．观察到QRT-PCR和RNA-SEQ数据之间的显着强烈正相关（R²= 0.9203)(图4，附加文件4:图S3)。

小麦秸秆对西瓜根系响应的差异表达基因分析

对于所有的处理，严格要求FDR < 0.05和|log绝对值₂以FC| > 1为阈值对差异基因进行分类，鉴定CK与T1、CK与T2、T1与T2之间基因表达的显著差异(补充文件)5:表S3)。数字5a和d显示CK与T1之间有2892个DEGs，其中1591个表达上调，1301个表达下调。共鉴定出2262个CK和T2之间的deg，其中1142个表达上调，1120个表达下调(图2)。5B和D）。在T1和T2之间仅鉴定出204℃，其中上调138，下调66例（图。5C和D）。这些结果表明，添加了1％或2％的小麦秸秆对西瓜根中的相对基因表达模式几乎没有影响。

去分析舞台

使用短时间系列表达式矿工（Stew），共聚集了3419次曲线[22.］．八个人资料（p < 0.05) included three groups. The first group included three types of early upregulated patterns: profile 5, profile 6 and profile 7. The second group included three types of early downregulated patterns: profile 0, profile 1 and profile 2. The last group included two types of early expression genes whose patterns did not change: profile 3 and profile 4 (Fig.6)．具体来说，2714个DEGs聚类为两个profile，其中一个是下调模式(profile 1)，另一个是上调模式(profile 6)。由于profile 6和profile 1中包含的DEGs比其他profile多，因此profile 6和profile 1中DEGs显著富集。使用GO项分析进一步分析了概要1和概要6中的deg。这些DEGs被划分为三个核心类别:细胞成分、生物过程和分子功能。在细胞组分中，以细胞、细胞部分、细胞器、膜和膜部分含量最高。在生物过程组中，大多数DEGs可分为代谢过程、细胞过程、刺激反应和单生物过程。在分子功能基团下，氧化石墨烯催化活性和结合活性最为丰富，其次是转运体活性、核酸结合转录因子活性和抗氧化活性(图2)。7)．

DEGs的KEGG通路分析

当映射到Kegg中的参考注释途径时，将16.99％（581/3419）的DEG被注释为108个不同的代谢途径（附加文件6:表S4)。我们对前10个高富集KEGG通路进行了注释，它们在所有8个谱图中都存在(表)2)．在这些Kegg途径中，淀粉和蔗糖新陈代谢（KO00500）是最丰富的术语，构成10.50％（61/581）的果酒。另一种高度富集的途径包括苯丙醇丙酮化生物合成（KO00940），植物激素信号转导（KO04075），戊糖和葡糖醛酸酯互联（KO00040），氨基糖和核苷酸糖代谢（KO00520），内质网（KO04141）中的蛋白质加工，植物 - 病原体相互作用（KO04626），碳代谢（KO00900），氨基酸生物合成（KO01230）和内吞作用（KO04144）。对于型材6，显着富集的DEG在前20个途径中（图。8b，附加文件7:表S5b)。DEGs含量最高、数量最多的途径是苯丙类生物合成途径。苯丙素生物合成也是最显著的富集途径之一，Q值最低。与图6相似，图1的前20条通路中，DEGs显著富集(图6)。8一个额外的文件7：表S5A）。植物激素信号转导途径具有最多的DEG数量以及最低Q值。这些结果显示出苯丙烷化生物合成，植物激素信号转导是浓度枯萎的麦秸中的关键代谢途径。

麦草能激活苯丙素代谢途径，促进木质素的合成

苯丙素代谢途径是植物防御的早期指标。RNA-Seq分析显示，共有57个deg与苯丙类生物合成途径相关。其中14个编码苯丙氨酸解氨酶(朋友，Cla008727），反式肉桂酸酯-4-单氧基酶（C4H，CLA013420)、莽草酸o -羟基肉桂酰基转移酶(HCT，CLA022713和CLA009995.)、4-香豆酸-辅酶a连接酶(4 cl，CLA017226.和CLA006818），Caffeoylshikimate酯酶（CSE.，Cla012691和Cla006446），香豆酰基素3'-单氧基酶（C3.，Cla017432），咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT的，CLA010664.), caffeoyl-CoA-O-methyltransferase (CCoAOMT，Cla016012), ferulate-5-hydroxylase (F5H，Cla014265）和Coniferyl-醛脱氢酶（REF1，CLA012342）;22编码过氧化物酶（POD）和7个编码的β-葡糖磷脂，所有这些β-葡糖苷簇聚集成轮廓6（表3.，附加文件8与对照相比，T1和T2诱导的PAL、C4H、4CL、COMT和POD表达上调。这些酶都参与木质素的生物合成[23.］．它们的表达水平在T1中达到峰值并在T2的高水平保持（图。9)．β -葡萄糖苷在纤维素降解中起重要作用[24.与T2和CK相比，T1表达量显著上调，且T2表达量高于CK。

进一步测定PAL和POD活性，结果表明，与对照相比，T1和T2处理PAL和POD活性增加，但与T2处理无显著差异(图2)。10.A和B）。为了进一步验证这种观察，通过光学显微镜检查每种处理中西瓜的根尖中木质素的分布（图。10.C）。在T1的皮质和血管束细胞的细胞壁中观察到更多木质素（图。10.CII）和T2（图。10.CIII）比在CK中（图。10.cI)。进一步对木质素含量的定量分析表明，T1和T2木质素含量显著高于CK，而T1和T2之间无显著差异(图2)。10.d）。上述结果表明，小麦秸秆活化了苯丙醇丙烷代谢途径并诱导了木质素生物合成。

小麦秸秆激活养羊酸生物合成

Kegg分析表明，48只植物激素的信号转导途径涉及植物激素的信号转导途径，包括生长素，细胞素，赤霉素，脱落酸（ABA），乙烯（ET），芸苔类固醇（BRS），茉莉酸（Ja）和水杨酸（SA）（桌子4，附加文件9:图S6)。

在13°中的养蛋白的信号转导途径中，其中6位，包括砧辊流入载体（AUX1，CLA006581.)，一种生长素反应蛋白(AUXIAA，Cla007545）和四个小型植物瘤RNA（Saur）家族蛋白质（Saur.，CLA015870，Cla005678，CLA005501.和CLA001500.），被聚集到概况6中并被上调。五AUXIAA（Cla021419，CLA014808.，Cla012649，Cla007544和CLA002975.)聚类到剖面1，呈下降趋势。此外，SAUR可能是最大的早期生长素反应基因家族，在陆生植物物种中广泛存在[25.］．T1和T2分别在CK中分别在T1和T2中表达较高8.8％和7.8倍（图。11.a). T1和T2的生长素含量也高于CK(图2)。11.b).在ET、ABA、细胞分裂素和BR信号转导通路中也观察到类似的结果。在JA信号转导途径中，7个DEG中有3个呈现下调趋势(profile 1)，而没有一个DEG呈现上调趋势(profile 6)。在SA信号通路中，只有1个编码转录因子TGA (TGA.，Cla007982）显示了下调的趋势，同时没有参数出现上调趋势。此外，Phytochrome相互作用因子4的egs（PTF4，CLA023247.）对于Della蛋白（Della.，CLA012302）上调。在葛霉素信号途径中，在上调和下调的次数之间观察到没有差异。上述结果表明，小麦秸秆活化了蟾蜍素生物合成，但对JA和SA代谢途径的抗病基因效果不大。我们推测小麦秸秆剂量不会诱导单一种植体西瓜的抗性，但通过促进单一种质西瓜的生长来增强基础防御反应。

生理和生化研究表明大部分镰刀菌素抗性西瓜品种具有强细胞结构，例如加厚的木耳，以防止病原体进入[26.］．木质素是次生细胞壁的重要组成部分之一，次生细胞壁形成物理屏障，增强机体抵御病原体感染的能力[27.，28.，29.］．在我们目前的研究中，与对照组的根相比，治疗和对照组之间的根木质素含量分析表明，与对照组的根相比，T1和T2基团的根部的木质素含量不起作用（图。10.d）。结果表明，小麦秸秆可能将FON1感染限制为西瓜根。此外，组织化学分析表明，与对照组相比，治疗组中西瓜根的木质素分布显着增加（图。10.c)，进一步说明木质素的富集可以增强细胞壁结构和对Fon1侵染的抗性。

木质素等次生代谢产物在植物防御病原菌侵染中起着至关重要的作用。木质素生物合成是一个复杂的过程，需要许多酶的参与[30.］．PAL是苯丙酸途径中的关键酶之一，也是苯丙酸途径中的第一个限速酶[31.］．Kim等人[32.[据报道，PAL与植物防御密切相关，并且由病原体诱导。POD是一种含血红素的酶，其使用H催化许多不同的基材₂O₂作为氧化剂[33.］．番茄碱性过氧化物酶的过度表达显着增加了木质素含量[34.，35.］．在我们的研究中，RNA-Seq分析显示，处理组(T1和T2)中若干木质素生物合成相关基因上调。DEGs分析显示，与对照组相比，处理组中涉及苯丙氨酸代谢途径的基因表达也增加了(附加文件)8：图S5A）。通过QRT-PCR分析证实了这些观察结果朋友，荚，4 cl，C4H和克斯基因（图。3.)，是木质素生物合成的关键基因。抑制4 cl表达式或朋友要么C4H表达显着降低了转基因烟草中的木质素含量[36.，37.］．

植物激素是调节植物生长和应对各种逆境的重要因素。生长素被认为在整个植物水平上调节或影响胁迫反应[38.，39.[及其生物合成和信号传导与Saur蛋白密切相关[40］．例如，Saur基因BRA019369.与油菜的病原体敏感植物相比，病原体具有更高的表达[41］．OsSAUR45通过影响生长素综合而参与水稻生长[42］．在目前的研究中，CLA015870编码SAUR家族蛋白的基因在T1相对于CK(10.4倍)和T2相对于CK(9.8倍)高度诱导(附加文件5:表S3)。这一结果提示小麦秸秆促进西瓜生长可能与生长素合成基因的上调有关。

JA，SA和ET在对生物养殖病原体的宿主抵抗中发挥着至关重要的作用[43，44，45，46，47，48］．然而，在目前的研究中，与JA和ET生物合成，代谢或信号传导过程相关的术语没有显着变化，并且在T1和T2中，与CK相比，SA生物合成在t1和T2中进行了下调（表格4)．麦子秸秆可能没有诱导SA，JA和ET信号通路，以响应于单一种质西瓜的FON1感染。

为了进一步确认木质素是否会阻碍FON1侵扰西瓜根，绝对表达Fon1在西瓜根中测量。结果表明绝对表达Fon1T1和T2低于CK(数据未显示)。可见，麦秸的添加阻止了Fon1进入西瓜根部。上述结果表明，小麦秸秆的添加可提高木质素和生长素的生物合成，增强单作西瓜对枯萎病的抗性。但小麦秸秆诱导寄主植物木质素和生长素含量增加的机理尚不清楚，值得进一步研究。

总之，我们的研究表明，小麦秸秆可以显着提高对西瓜单一栽培中的FON1的抗病性。我们的数据表明，添加小麦秸秆触发上调苯丙烷途径相关基因，这些基因增加了木质素和生长素水平的生物合成。增加木质素和养蛋白增强细胞结构，例如加厚的木质素，以防止病原体进入。

实验材料

D125小麦秸秆由中国东北农业大学园艺和景观建筑学院蔬菜生理生态实验室提供。小麦秸秆自然空气干燥并压碎成近似长度为0.5-1cm的碎片。西瓜种子（Citrullus lanatus（Thunb。）matsum。＆nakai var。Lanatus）品种Zaojia 84-24，由中国新疆农业科学院提供。这种西瓜品种易受镰刀菌枯萎的影响。从东北农业大学湘坊农场的表面层收集单一栽培西瓜土壤。该农场已用于西瓜生长5年，并感染Fusarium oxysporumF。sp。奈姆比赛1 (Fon1)。

盆栽实验

所有锅实验都在东北农业大学的温室中进行。将西瓜种子在55℃下用无菌蒸馏水浸泡30分钟，然后用水冲洗三次。种子在泥炭的混合物中发芽：珍珠岩（1：1 v / v）至其四个休假阶段（约30天）。然后将幼苗转移到塑料盆（25cm×25cm）中，用含有0g（ck），50g（t1）或100g（t2）的小麦秸秆的5kg单培养西瓜土壤。每壶含有一个西瓜幼苗。移植后七天，用20mL孢子悬浮液接种CK，T1和T2基团的幼苗（5×10⁶孢子/ ml）FON1溶液通过倒入每个西瓜幼苗的根际。在包括12小时之后，收集随机选择的5种西瓜根用于RNA提取物。

西瓜镰刀菌枯萎发生率，疾病指数，根长和植物高度的测量

每个处理包括20个随机安排的花盆。植物受到典型的管理和等量的灌溉。在开花期(转入植株后20天)观察和计算枯萎病的发病率，发病率表示为患病植株占植株总数的百分比[49］．随后，从盆中除去植物，然后将整个植物浸没在水中。轻轻地除去土壤颗粒以避免损坏根部。将根部洗涤以进行测量。仪表标尺用于测量从子叶到西瓜顶部的距离。实验重复三次（2017年春天，2017年秋季和2018年春天）。

土壤中FON1人口的测量

每种治疗中随机5种西瓜根际土壤的一个G混合土壤，并根据制造商的说明使用PowerSoil R DNA分离套件（Mo Bio，USA）提取基因组DNA，并储存在A - 20°C冷冻机中。

实时PCR（RT-PCR）用于分析FON1群体。这Fon1引物是5'-cgattagcgaagacattcacaAgact-3'和5'-Acggtcaag aagatgcagggtaaaggt-3'[50］．使用Analytik PCR系统进行RT-PCR（Analytik Jena Ag，德国）进行。总反应体积为20μL，包括2μLcDNA，0.5μl底漆/每项，10μl2×真正的Sybr混合物（天根生物技术，中国）和7μl水。PCR条件为：94℃5分钟;95℃，30s，54℃，30s，72℃，30秒，共35个循环。72℃的最终伸长3分钟。

从Fon1基因组DNA中提取目的基因，构建质粒标准品f1量化。Fon1 DNA拷贝浓度如前所述计算[51］．3个重复进行PCR检测。

RNA-Seq文库的生成和测序

2017年春季采集西瓜根进行RNA-Seq分析。采集5株西瓜幼苗根系作为一个样本。每种处理制得3个样品，分别命名为CK-1、CK-2、CK-3、T1-1、T1-2、T1-3、T2-1、T2-2和T2-3。采集后立即用液氮冷冻，然后转移到−80°C的冰箱中。

用DNase I处理提取的总RNA，以在制造商的指导之后使用RNAPREP纯植物套件（天根，北京）除去所有DNA残基。评估总RNA的质量，数量和完整性。使用分光光度计（纳米光计，旨在CA，USA）评估质量;使用荧光计（Qubit 2.0，Life Technologies，CA，USA）的数量以及使用BioAnalyzer 2100系统（Agilent Technologies，CA，USA）的完整性。获得高质量的总RNA后，通过寡核苷酸（DT）珠粒（用于真核mRNA）或通过去除rRNA（用于原核mRNA）来富含mRNA。富集的mRNA是片段化的，随机引物用于逆转将MRAN转化为cDNA，其用作用于合成第二链cDNA的模板。纯化后，对cDNA片段进行结束修复并加入聚（a）尾部。将测序适配器连接到每个片段中，并通过PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分离连接的片段，并使用Illumina Hiseq TM 2500系统（Gene Denovo Biotech Co.，Gengzhou）进行测序。

转录组件和DEGS分析

为了获得高质量的clean reads，对原始测序reads进行过滤，并从进一步的分析中删除以下reads: 1)包含适配器的reads;2)含有10%以上未知核苷酸的读本;3)含有50%以上低质量(q值≤10)碱基的reads;4)包含rRNA序列的reads。其余高质量reads使用Bowtie2比对参考转录组[52］．基因丰度计算为每千万分之读数(FPKM) [53］．edgeR软件(http://www.r-project.org/)用于鉴别二歧杆菌。显著差异为:fold change (FC)≥2,false discovery rate (FDR) < 0.05。

基因本体论(GO)术语分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集

来自西瓜根的所有鉴定的未成年人被注释为术语（http://www.geneontology.org.)，以UniProt及Pfam数据库为基础[54］．然后将注释的未成语映射到特定于植物的Go Slim本体学（http://www.geneontology.org/）[55］．路径工具计划[56]用于预测排列成病理格式的西瓜unigenes的生化途径。

西瓜根系中苯丙氨酸氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）酶活性的测定

采用苯丙氨酸解氨酶试剂盒和过氧化物酶试剂盒(中国江苏柯明)，按照制造商的说明分别测定PAL和POD活性。采用微孔板读卡器(Bio Tek Instruments, Inc.， Highland Park, USA)在290 nm处测定PAL和470 nm处测定POD的吸光度。

西瓜根系木质素含量及分布的测定

将西瓜根样品在80°C下晾干，然后粉碎，通过40目筛。根据制造商的说明，使用木质素含量试剂盒(中国江苏柯明)测定木质素含量为2 mg。使用microplate reader (Bio Tek Instruments, Inc.)在280 nm处测量吸光度。

木质素在西瓜根细胞壁中的分布是通过光镜和石蜡包埋薄片鉴定的[57］．简而言之，洗涤西瓜根，除去根尖并浸入固定溶液中48小时。然后用乙醇逐渐脱水根尖并嵌入石蜡中。用切片体切割8-10μm的截面。切片逐渐再水化，用Safranin O和Fast Green FCF染色。使用光学显微镜（广州Minghui Technology Co.，中国广州）观察和成像染色部分。

SAUR基因表达和生长素含量的测定

PCR用于测量4 saur基因的表达（CLA001500.，CLA015870，CLA005501.和Cla005678．这4个基因和控制基因(肌动蛋白)的引物列于(附加文件)10.：表S6）。PCR条件是：95°C 10秒;35循环95℃，10s，56℃，30s和72℃，30秒。通过以0.5℃/ 5s的速率将温度从55℃升高至95℃，进行最终熔化曲线的分析。2^-ΔΔct方法(58的相对定量计算Fon1表达，归一化到肌动蛋白基因[59］．使用三个生物重复重复该实验三次。

如前所述，生长素含量采用液相色谱-质谱法(ab5500，中国北京)测定[60］．

real-time PCR (qRT-PCR)验证RNA-Seq

使用QTower 2.0实时PCR系统（Analytik Jena Ag，德国）使用QRT-PCR来验证RNA-SEQ结果。选择对木质素生物合成，一个Saur基因和五种随机选择的下调基因很重要的11个基因。主底漆设计有引物总理（V 6.0）软件[61]并列入（附加文件3.:表S2)。

总反应体积为20μL，包括1μLcDNA模板，每对1μl的CDNA模板，10μlSSYBR绿母混合物（Toyobo，Osaka，Japan）和8μl水。PCR条件为：95°C 10秒;35循环95℃，10s，56℃，30s和72℃，30秒。使用三个生物重复重复该实验三次。

统计分析

所有数据均以均数±标准误差表示。采用SPSS 16.0软件(SPSS Inc.， USA)和Microsoft Excel进行统计分析。p< 0.05被认为有统计学意义。

支持本手稿中结果的数据集包括在文章(及其附加文件)中。在NCBI Sequence Read Archive数据库(SRP158956)中可以获得9个已排序库的原始读取。

4 cl:

4-香豆素 - COA连接酶

阿巴：

脱盐酸

AUX1:

生长素载体涌入

Auxiaa：

一种恒生响应蛋白

br:

芸苔类固醇

摘要::

香豆酰基素3'-单氧基酶

C4h：

反式肉桂酸酯-4-单氧基酶

CCoAOMT:

Caffeoyl-CoA-O-methyltransferase

CK：

不添加麦秸

COMT的:

咖啡酸3-O-甲基转移酶

CSE:

Caffeoylshikimate酯酶

可见：

差异表达基因

德拉：

德拉蛋白质

等:

乙烯

F5H：

Ferulate-5-hydroxylase

FON1：

Fusarium oxysporumF.SP.．奈姆比赛1

去：

基因本体论

HCT:

Shikimedo-羟基琥珀酰莫 - MoY1转移酶

JA：

茉莉酸

Kegg：

Kyoto基因和基因组的百科全书

朋友:

苯丙氨酸ammonia-lyase

圆荚体:

过氧化物酶

PTF4:

Phytochrome-interacting因子4

QRT-PCR：

定量实时PCR

REF1:

Coniferyl-醛脱氢酶

RNA-Seq:

Illumina RNA测序

SA：

水杨酸

阿富汗二月:

小型植物

干：

短时间序列表达式Miner

T1：

添加1％的小麦稻草

T2：

添加2%麦秸

TGA：

转录因子TGA

不适用。

该研究得到了在中国东北寒地（2016YFD0201004）的温室蔬菜中减少肥料和农药的技术模型的建立和示范，是中国和经济作物国家重点研究和发展计划的子项目（蔬菜）在黑龙江省现代农业工业技术创新体系（HNWJZT201701），东北农业大学年轻人才项目（16季度）。

隶属关系

1. 东北农业大学，哈尔滨，黑龙江，中华民国150030，哈尔滨园艺与景观建筑学院

   唐丽丽，聂绍瑞，李文辉，范超，王思琦，吴凤芝，潘凯

2. 2 .黑龙江省农业科学院经济作物研究所，黑龙江哈尔滨150086

   丽丽唐

3. 黑龙江农业科学院，哈尔滨农业科学院作物培养与耕作研究所，150086，黑龙江，中国

   赵粉丝

贡献

LT，SW和Sn进行样品收集，文库制备，基因注释和QPCR分析，并参与生物信息学和统计分析。KP，FW和WL构思了这项研究，解释了结果并为稿件的准备做出了贡献。LT和KP有助于解释与生物信息学管道相关的数据，设计和执行统计分析并写了稿件。CF对语法修订和语言校对作出了巨大贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应于Kai锅．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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再版和权限