多糖生物合成途径分析和推定基因开采GydF4y2Ba石斛兰菊属植物GydF4y2Ba在不同组织中使用RNA-SEQGydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

石斛兰菊属植物GydF4y2Ba（Linnaeus）Swartz是由于生物活性成分导致中药中的着名植物。多糖是主要的药用成分，但没有关于多糖生物合成的研究GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．为了全面研究转录水平的多糖，我们首次进行了De Novo转录组测序以产生综合转录组GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在我们的研究中，通过转录组测序生成了一个包含562,580个unigenes(平均长度= 1115.67个碱基)的数据库。基于转录组的基因注释，我们在CAZy数据库中鉴定了1204个碳水化合物活性相关基因，包括417个糖基转移酶基因(GTs)、780个糖苷水解酶(GHs)、19个碳水化合物酯酶(CEs)、75个碳水化合物结合模块(CBMs)和44个多糖裂解酶(PLs)。在纤维素合成酶家族中鉴定出21个与多糖相关的差异表达基因(DEGs)。随后，研究了多糖途径相关基因的组织特异性表达模式，从分子水平了解DMP的生物合成和调控。鉴定了参与多糖途径的两个关键酶基因(Susy和SPS)，并利用实时荧光定量PCR分析了它们在不同组织中的表达模式。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

测定了多糖的含量GydF4y2Ba石斛兰菊属植物GydF4y2Ba在不同的组织下，通过转录组测序获得了大量的差异基因。该数据库提供了涉及多糖生物合成的候选基因池GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．此外，预计有关显着途径的综合分析和表征将对化学成分，合成特征和在该医疗草药中运行的调节机制进行更好的洞察力。GydF4y2Ba

石斛兰菊属植物GydF4y2Ba(林奈)斯沃茨，是世界上分布最广的物种之一GydF4y2Ba兰科西GydF4y2Ba家庭，这是亚洲周围广泛种植的药物作物[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba具有薄茎，小花的特点，它是中国传统医药的代表性植物，这些植物通常被加工成成熟的药材。它被广泛用作民间医学，用于解热目的，益处眼睛，作为滋补品GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba植物的主要活性成分是多糖、生物碱、联苯、芴化合物、糖苷、氨基酸和几种微量矿物元素[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．茎的茎GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba是主要的药用部位，含有粘稠的水溶性多糖。水解多糖不仅含有甘露糖和葡萄糖，还含有微量的阿拉伯糖和木糖[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．多糖已从100多种植物中成功提取，广泛用于医药和保健食品的研究和开发。它们具有调节免疫、抗肿瘤和抗氧化剂的药理作用。不同来源的多糖表现出不同的生物活性[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

多糖是由多个单糖单元组成的天然大分子。它们是一类结构多样的大分子，广泛分布于自然界，在控制细胞分裂、调节细胞生长和维持生物正常代谢方面发挥着重要作用。高等植物多糖是一种潜在的药理活性化合物来源。大量研究表明，从药用植物中分离出的多糖可以影响体内和体外的免疫反应，并具有作为免疫调节剂的潜力[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．多糖的GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba在大多数文献中，涉及水溶性多糖[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．目前，很多人都研究过它的结构。对于目前分离的多糖组分GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba，单糖组合物主要由葡萄糖和甘露糖组成，还包含阿拉伯糖，半乳糖酸，木糖，鼠李酮，半乳糖等[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．总之，甘露糖和葡萄糖是其中主要的单糖GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba物种。GydF4y2Ba

我们对药用成分研究的目的是使这些药用成分的提取物能够应用于临床实践。为了满足日益增长的药物需求，研究人员逐渐应用基因工程方法来生产这些药用成分。因此，各种活性成分的生物合成代谢途径及相关关键酶基因的挖掘成为药用植物研究的重要目标。功能基因组学方法，特别是转录组学方法，在发现药用植物次生代谢产物生物合成的关键酶基因、阐明次生代谢途径和调控机制方面具有重要的应用价值。转录组是以活细胞中蛋白质的前身(mRNA)为基础，反映生命活动的实时情况，是揭示生物生长和生理活动分子机制的一种非常有效的方法和手段[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．在药用植物研究中，转录组测序技术广泛用于新基因的发现[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]代谢途径[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]分子标记挖掘[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]，转录映射[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba等等。利用RNA-seq转录组学对大量药用植物进行了研究，如GydF4y2Ba枸杞子GydF4y2Ba[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba萨尔维亚米尔蒂希萨GydF4y2Ba[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]，GydF4y2BaCatharanthus roseus也叫GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]和美国人参[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．然而，我们首次对三个组织的转录组进行了测序，揭示了多糖的合成基因和途径GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

到目前为止，几个转录omGydF4y2Bad . officinaleGydF4y2Ba[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]已经测量了一些完整的基因组[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba物种，已经鉴定了许多参与合成和代谢途径的关键酶编码基因。然而，GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba分子生物学研究信息仍然非常有限。关键基因的分子标记和利用本研究的其他方面仍处于起步性。多糖生物合成的分子机制及相关代谢途径GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba仍然未知。在这项研究中，我们为根，茎和叶材料构建了九种转录组文库GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．鉴定了总共1335个糖基转移酶基因（GTS）和35纤维素合酶基因（CESA），我们还在它们之间分析了差异表达的基因（DEG）。通过分析测序数据，我们了解二次产物的生物合成，特别是在鉴定参与DMP生物合成中的候选基因。同时，我们验证了我们数据集的质量，并通过定量实时RT-PCR（QRT-PCR）确认了这些推定的DMP基因。GydF4y2Ba

三种不同组织中多糖的测定GydF4y2Ba

在三种不同的组织中测定多糖，包括叶，茎和根料。D的茎。GydF4y2Bamoniliforme.GydF4y2Ba它的主要药物部分，多糖主要浓缩茎。茎的多糖的最高含量为24.53％（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.从单向分析方差分析，表明茎的多糖含量GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba与根和叶子显着不同。GydF4y2Ba

Illumina测序和De Novo集装箱GydF4y2Ba

在这项研究中，九个cDNA文库由三个组织构成GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba在三个复制。这些文库被命名为:根cDNA文库:Dm_R1、Dm_R2、Dm_R3;茎cDNA文库:Dm_S1, Dm_S2, Dm_S3;叶片cDNA文库:Dm_L1, Dm_L2, Dm_L3。从所有样品中总共获得811,451,164个干净读数，总容量为119.89 Gb (Gigabase)。基本平均错误率为0.01%，平均GC含量为46.36%。Q20和Q30的平均值分别为98.14和94.57%GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

我们把所有清晰的读数组合起来GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba转录组数据库通过使用Trinity软件。用平均转录物鉴定679,321转录物是703.77碱基对（BP）。转录物和unigenes的长度分布在附加文件中显示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1。转录本和unigenes的测序长度范围为201 ~ 16515 bp。测序结果显示，共获得562480个ungenes，平均长度为567.79 bp。转录本和unigenes的N50长度分别为1177 bp和830 bp。GydF4y2Ba

功能注释，GO, KOG, KEGG分类GydF4y2Ba

使用所有五个数据库中的BLAST算法（E-VALUE <1E-5），总共针对NR，KEGG，SWISS-PROM，PFAM和字符串数据库注释了562,480个unigenes（e-value <1e-5）（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S2）。分析表明，169,702人的未成年人（48.99％）在NR数据库中具有显着匹配，瑞士 - Prot数据库中的110,415名未成年人（31.87％）和Kegg数据库中的104,684个unigenes（30.22％）。字符串数据库（37,245,10.75％）和PFAM的最低比例为65,595（18.94％）注释的unigenes。GydF4y2Ba

在Kegg数据库中，共有104,684个unigenes被注释为33个途径（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).所有unigenes被分为5类:代谢(A)，遗传信息加工(B)，环境信息加工(C)，细胞过程(D)，有机体系统(E)。涉及unigenes最多的途径是“全球和概述图”(25093)，其次是“翻译”(15778)和“信号转导”(10348)。GydF4y2Ba

此外，对标注的序列进行同源组(KOG)数据库聚类，进行功能预测和分类。KOG分类共有37245个unigenes，分为25个具体类别，涉及细胞过程、信号转导、代谢等过程(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。三个顶部术语是（j）翻译，核糖体结构和生物发生，（o）仅发生翻译，蛋白质转换，伴侣和（r）一般函数预测。GydF4y2Ba

对于GO分析，通过使用BLAST2Go将总共95,032个注释的未植入分为三个主要的本体和62个子类别（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac).在生物过程(BP)类别中，涉及“代谢过程”的基因(63,996个)较多。此外，细胞组分(cell component, CC)类主要包括涉及“细胞”(cell)(36,019)和“细胞部分”(cell part)(36,018)的蛋白质。此外，在分子功能(MF)类别中具有高度代表性的是“催化活性”(52,948)和“结合”(47,656)。GydF4y2Ba

差异表达基因（DEGS）的鉴定和聚类分析GydF4y2Ba

在本研究中，我们使用edgeR检测复制计数数据的差异表达。我们设置“FDR < 0.05& |log”GydF4y2Ba_2GydF4y2BaFC | ≥ 1” as the standard for significant differences in the expression of genes. When the log_2GydF4y2BaFC> 1，DEG被认为是上调的。相反，对于日志GydF4y2Ba_2GydF4y2BaFC <−1，认为下调。为了研究不同组织间的基因表达，我们在Dm_L和Dm_S之间鉴定了9881个DEGs，其中7788个表达上调，2093个表达下调。与Dm_R和Dm_L相比，DEGs的数量最多。其中277,625株表达下调，3987株表达上调。最后，Dm_R与Dm_S之间有15834个DEGs，其中2389个表达上调，13445个表达下调(图1)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad).“Dm_L vs. Dm_S”和“Dm_R vs. Dm_S”中分别有2294和395个DEGs单独表达。此外，在Dm_R和Dm_L之间有11,193个DEGs单独表达。在这些文库中，共鉴定出891个deg(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa - c)。deg的所有细节都显示在附加文件中GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

基于转录组数据，DEGs的层次聚类(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa）在不同的组织之间通过将FPKM与颜色组合来表示灰度的丰度。使用LOG10（FPKM + 1）的标准确定并分析了总共35,159°的含量和分析GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05．对于特定表达水平的趋势，请参阅左上角的颜色栏下的数字。左侧是基因簇的树;两个基因越接近，它们的表达越近。GydF4y2Ba

反映组织之间的主要趋势和组织特异性表达GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，将所有DEG集聚在10个表达型材中（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)采用K-means方法和具有相似规则模型和log2 (foldchange)的层次聚类。属簇4、6和8的Unigenes在茎中表达量高于其他组织;属于簇3和簇5的Unigenes在叶片中大量表达。有趣的是，所有主要在根中表达的unigenes都属于一个由2256个基因组成的集群。GydF4y2Ba

Kegg的浓缩分析和代谢路径分配GydF4y2Ba

此外，为了更好地了解函数簇和生化途径，我们对所有参数进行了Go和Kegg浓缩分析。详细说明，在“DM_L与DM_S”比较中识别了2188个术语;在“DM_R与DM_L”比较中确定了2691术语;虽然1820年GO术语在“DM_R与DM_S”比较中识别。用于GO重大浓缩的数字在附加文件中显示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S3。通过可视化氧化石墨烯富集分析的氧化石墨烯项，我们可以看到这些函数之间的相关性。GO的结构可以用有向无环图(DAG)的形式描述，其中每个GO项是一个节点，亲缘关系是一个箭头。图中显示了Dm_R与Dm_S之间分子功能的有向无环图(DAG)的缩略图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．在扩展尺寸下显示的前三个GO术语是多糖生物合成过程（GO：0000271），细胞多糖生物合成过程（GO：0033692）和细胞碳水化合物生物合成过程（GO：0034637）。多糖是主要药用组合物GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，氧化石墨烯富集的结果与之相同。GydF4y2Ba

在kegg浓缩分析中（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S4），Kegg Pathway分为七种类：环境信息处理（EIP），遗传信息处理（GIP），细胞过程（CP），有机体系统（OS），药物发育（DD），人类疾病（HD）和新陈代谢（m）。就KEGG途径而言，“DM_L与DM_S”比较涉及332个途径，8279°DEG和249,623个背景unigenes。在“DM_R与DM_L”比较中，涉及351个途径，并确定了32,085点和250,769个背景unigenes。最后，在“DM_R与DM_S”比较中，涉及343个途径，鉴定了17,090点和250,453个背景unigenes。一般来说，当纠正GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-Value <0.05，Go和Kegg浓缩被认为是显着的。顶部20kegg富集路径如图2所示。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

植物次级代谢产物在植物寿命活动的许多方面发挥着重要作用，并且许多植物次生代谢物是植物生命活动所必需的[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]．在这项研究中，总共104,684个未分配到503 kegg途径。在这些途径中，鉴定了与次级代谢物相关的20kegg途径，包括花青素生物合成（KO00942），甲状腺类化合物生物合成（KO00905），黄酮类生物合成（KO00944），咖啡因代谢（KO00232），单离药生物合成（KO00261）和其他人（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.苯丙烷生物合成（698个unigenes）途径代表了最大的unigenes基团，其次是类固醇生物合成（626个unigenes）和氰基氨基酸代谢（600个unigenes）。这些途径可以为未来的功能和过程研究提供资源GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba发展。GydF4y2Ba

糖基转移酶、纤维素合酶相关候选基因的检测GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba

碳水化合物活性酶数据库（Cazy）是可以合成或拆卸复合碳水化合物和糖缀合物的酶的数据库资源。通过功能分类的碳水化合物活性酶包括糖基转移酶基因（GTS），糖苷水解酶（GHS），碳水化合物酯酶（CES），碳水化合物结合模块（CBMS）和多糖溶液酶（PL）。我们使用BLASTX（E <0.00001）鉴定了1204个碳水化合物活性相关的未成年人，其包括417 GTS，780GHS，19 CES，75 CBM和44 PLS（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

糖基转移酶在几乎所有生物体中发现并催化糖基的转移，这是生物转化最重要的一种，并且直接参与二糖，单糖，低聚糖，烷基葡糖苷和多糖的生物合成[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．在417个糖基转移酶(GTs)基因中，我们发现了几个在这三种比较中存在的GTs的DEGs(见表)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GTS占大部分碳水化合物相关的家庭。在DM_R与DM_L比较中，鉴定了57个次数，包括7个上调和50个降低的GTS。在DEGS的岩藻糖基转移酶（导线）中，在DM_R与DM_L比较之间仅鉴定一个下调的DEG，并且在其他两个比较中没有发现DEGS。在DEG的Xylosyl转移酶（XTS）中，在DM_L与DM_S之间鉴定了两种上调的次数，并且在DM_R与DM_L比较之间发现了两个下调的次数（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

纤维素是生物圈中最丰富的有机物，也是植物的结构多糖，其细胞壁的主要成分。这GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba纤维素合成酶超家族分为一个CesA(纤维素合成酶)家族和九个Csl(纤维素合成酶样)家族。纤维素合成酶超家族相关基因参与了甘露聚糖的合成(Liepman et al.， 2005)。我们鉴定了35个推测的CesA基因GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，它分为六个家庭，CESA，CSLC，CSLD，CSLE，CSLG，CSLH。在35个CESA相关基因中，21个基因显示图21中的差异表达。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba．这些与CesA相关的DEGs被分为CesA、CslC、CslD、CslE和CslG五个家族，其中8个和5个分别属于CesA和CslD家族。GydF4y2Ba

DMP生物合成中涉及的推定基因和途径分析GydF4y2Ba

在128个代谢途径中检测到GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，与淀粉和蔗糖代谢途径相关的候选基因在前20中排名在前20中，只要有关基因的数量所涉及的数量（表GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.了解生物合成的GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba多糖（DMPS），涉及淀粉和其他相关聚合物的生物合成中的未成熟，以及与茎，根和叶组织中的碳同化相关的那些。基于Kegg数据库，我们确定了这些途径中涉及的关键酶基因（表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.将最大数量的unigenes（17个unigenes）鉴定为尿苷-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（Galu）编码基因;并且第二大数量的unigenes（14）被作为六酮酶（HK）编码基因的注释;虽然第三大数量的unigenes（11）被注释为编码基因的磷酰嘧酶（PGM）。GydF4y2Ba

在植物中，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glu）的形成，由葡萄糖-1-磷酸（GLC-1P）形成的核苷酸 - 二磷糖（NDP-糖）的关键前体。植物多糖由活性NDP-糖前体形成，通过各种糖基转移酶（GTS）的作用加入多糖和糖缀合物的残留物中[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．细胞壁的组成部分是通过NDP-糖的可用性确定以形成不同类型的壁聚合物[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．由于所有多糖由活化的NDP-糖合成，因此推断并预测DMP的生物合成途径（图。GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

以前的研究表明，DMP通过NDP-糖的聚合而形成，例如UDP-半乳糖（UDP-GAL），UDP-D-木糖（UDP-D-XEL），UDP-L-Arabinose（UDP-L-ARA），UDP-葡萄糖（UDP-GLC），UDP-rhamnose（UDP-RHA），GDP-甘露糖（GDP-MAN）和GDP - 岩藻糖（GDP-FUC）[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．DMP的生物合成可分为三个主要阶段。首先，蔗糖转化为Glc-6P和Fru-6P, Glc-6P和Fru-6P形成UDP-Glc和GDP-Man，然后在第二步转化为其他ndp -糖。许多酶在这些过程中起重要作用，如sacA [GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]，转化为GLC-6P和果糖的蔗糖，以及异构化GLC-6P至GLC-1P的PGM [GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]．香港[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]和sck [GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]还参与FRU-6P的生物合成。其次，UDP-GLC立即衍生自GLC-1P [GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，而Fru-6P则间接转化为GDP-Man [GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]．以UDP-Glc和GDP-Man为基础，其他NDP糖通过NDP-糖相互转化酶(NSEs)的作用进一步转化[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba，如GALE、UGE、UXE和GMDS等。最后，在各种多糖和糖缀合物的糖残基中加入活性单糖单元ndp -糖。GydF4y2Ba

参与转录因素GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba转录组数据集GydF4y2Ba

TFS涉及植物中的各种发育和生理作用。通过与ITAK数据库的TFS比较（GydF4y2Bahttp://itak.feilab.net/cgi-bin/itak/index.cgiGydF4y2Ba）.这些TF属于66个已知的TF家族GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba），最丰富的是C2H2家族，包括1158人的ungenes。所有这些TFS已被鉴定为其他植物中次生代谢物生物合成中的正面或负调节剂[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．以往的遗传和分子研究表明，NAC和MYB家族控制纤维、导管和花药的次级细胞壁增厚[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]及控制纤维素的生物合成及在细胞壁内的组装[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．我们在转录组中识别了133个MyB TFS和90个NAC TFS。MyB75形成官能复合物以调节二次细胞壁沉积，并通过木质素，黄酮类化合物和多糖途径整合代谢通量GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]．Susiba2，通过与ISO1启动子的糖响应元件结合参与糖信号传导的WRKY TF [GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]．在我们的研究中，我们在数据集中发现了88个Wrky TFS。通过差异表达分析，发现在根部，茎和叶中有30种差异表达的MYB，NAC和10中的10个患者。GydF4y2Ba

实时定量RT-PCR验证GydF4y2Ba

为了验证基因表达模式的变化，我们选择了与多糖生物合成相关的两种关键酶编码基因，包括蔗糖合酶（SASY）（C456394_G1，C435363_G4，C449452_G3）和蔗糖磷酸合酶（SPS）（C448416_G1，C452034_G1，C452034_G1），并在转录水平使用QRT-PCR检查这些。引物和序列在附加文件中显示GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。DEGs的定量表达如图所示。GydF4y2Ba11.GydF4y2BaA-g。在所有参数中，基因的表达模式表明根样具有两种关键酶编码基因的最低表达水平。然而，我们发现两种基因各自占叶子和茎中高表达的一半。2°的表达模式与转录组数据一致（GydF4y2BaR.GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba = 0.91431,P.GydF4y2Ba-Value = 6.81571e-9）。这些结果表明，我们的转录组分析高度可重复和可靠（图。GydF4y2Ba11.GydF4y2BaH）。GydF4y2Ba

到目前为止，这是第一次从头测序GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba已通过Illumina HiSeq平台进行。测序后获得119.89 Gb干净数据和562,480个unigenes。ungenes的平均分布长度为703.77 bp，短于自生基因GydF4y2Bad . officinaleGydF4y2Ba（728 BP）。在NR数据库中，我们将BlastX与Blastx对齐（48.99％），但在近端物种 -GydF4y2Bad . officinaleGydF4y2Ba， 70146个unigenes与Nr数据库中已知蛋白具有显著的相似性。我们注释的unigene数量几乎是之前一项研究的2.5倍，该研究集中于三种不同的组织[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．有37,245个未分配给Kog数据库的Unigenes，用于功能预测和分类。我们的注释的Unigene数量比未植入的Unigene号码少1.4倍GydF4y2Bad . officinaleGydF4y2Ba[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．这些信息提供了更有充分的资源来研究GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba物种。GydF4y2Ba

KEGG是一个主要的公共通路相关数据库，能够分析代谢过程中的基因产物和细胞过程中的相关基因功能[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]．我们在KEGG数据库中注释了104,684个unigenes。他们被分配到503个KEGG通路;其中，鉴定出20条与次生代谢物相关的KEGG通路GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．次生代谢产物种类繁多，化学结构各异。这些次生代谢物主要通过苯丙类代谢途径、异戊二烯代谢途径和生物碱合成途径在植物体内形成[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．苯丙素的生物合成在大多数植物中占有重要地位，如茶树[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]，葡萄[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba蓼属植物-GydF4y2Ba[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba对他们来说是一样的。这一结果与大多数其他研究一致。然而,在GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba，多糖是最重要的活性成分。在这项研究中，我们专注于合成GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba多糖。GydF4y2Ba

多糖是黄芪的主要活性成分GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，这对人类健康产生了积极影响。研究GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba多糖已引起人们极大的兴趣，特别是对其含量、组成和药理作用的研究[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．然而，少数关于多糖生物合成途径和基因的报道GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba物种。多糖的生物合成涉及数百种不同的GTS。最新的猫（GydF4y2Bahttp://www.cazy.org/glycosyltransfers.html.GydF4y2Ba）表示GTS分为105个家庭，其中42和43个GT家族属于GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba和GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba分别总共463和574gt基因。在这项研究中，我们确定了413个推定的GTSGydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba转录组数据库分为13个家庭。在DM_L与DM_S中，有19次糖基转移酶基因，属于3个系列（GT1，GT2和GT5）。在DM_R与DM_L中，最大数量的DEG为57，属于12个家庭。与其他两个比较相比，DM_R与DM_S具有40°的糖基转移酶基因的中间数，属于10个系列（表GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.从上述结果可以看出，在空中部位（叶子和茎）和根部的基因数量中存在显着差异GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba地上部分的叶和茎差异不显著。阀杆的GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2Ba是药物部分。药物成分全部累积在空中零件中，而根源从基质中吸收营养素，将营养物转移到空中部位，因此在根中积聚的药物成分的含量不高。GT1家族在所有三个比较中都有最大的数量。它是植物中的主要GT家族，也称为UDP糖基转移酶（UGT）[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba]．UGT家族，有大约120 UGTSGydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，包括八个不同的伪原[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]．第二组由GT2，GT20和GT48系列组成，每个家庭占该基因的约10％。糖基转移酶是广泛参与多种代谢途径的多烯烯家族，需要应对植物生长，发育环境和其他生物过程的各种变化。因此，随后对植物糖基转移酶的研究将具有重要的科学意义。GydF4y2Ba

曼纳人家族是高等植物中最广泛的多糖群[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba]．纤维素合酶（CESA）超家族基因参与甘露多糖的生物合成[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]．纤维素是植物的初级和次壁的主要成分，并且由CESA亚基的玫瑰状蛋白质复合物合成，其由六个玫瑰状亚基组成，形成较大的玫瑰花蛋白复合物[GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba]．CESAS属于糖基转移酶-2（GT-2）超家族，分为一种纤维素合成酶（CESA）家族和九种纤维素合酶样（CSL）家族。将CSL系列分为CSLA / B / C / D / E / F / G / H / j。1996年，梨等人。确定了第一GydF4y2Ba塞萨GydF4y2Ba高等植物中的基因，GydF4y2BaGhCesAGydF4y2Ba1来自GydF4y2Ba陆地棉GydF4y2Ba[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]．密歇根大学进行了克隆GydF4y2BaPtresa.GydF4y2Ba1，第一个纤维素合成酶基因在树木中GydF4y2BaPopulus Temuloides.GydF4y2Ba，一种在木质部特异表达的纤维素合酶基因，参与次生壁的形成[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba]．在那之后,10GydF4y2Ba艾尔斯卡GydF4y2Ba从GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba，18GydF4y2Ba珀斯塔GydF4y2Ba从GydF4y2BaPopulus Trichocarpa.GydF4y2Ba和一些GydF4y2Ba塞萨GydF4y2Ba基因GydF4y2BaPopulus Temuloides.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba桉树camaldulensisGydF4y2Ba被确定了[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba那GydF4y2Ba63GydF4y2Ba那GydF4y2Ba64GydF4y2Ba]．还有许多研究表明CESA和CSLA系列参与了许多植物种类中甘露多糖的生物合成。属于CSLA家族的β-甘露合酶（MANS）基因GydF4y2BaCyamopsis tetragonolobusGydF4y2Ba，创造β-1,4-甘露骨架的半乳粥[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba]．CslA蛋白质来自GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba能够生产β-甘露聚糖[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba]．这些基因的研究为其他植物纤维素合成机制的分辨率奠定了坚实的基础。我们确定了CESA的35个推定的unigenesGydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2BaRNA-SEQ数据分为六个家庭，CESA，CSLC，CSLD，CSLE，CSLG和CSLH。CESA在所有植物组织和不同类型的细胞中表达。然而，在初级壁上将该基因家族的不同成员的表达到二次壁形成是不同的。一些研究表明，CSL家族参与了甘露多糖的生物合成。例如，CSLC亚家族成员编码β-1,4-葡聚糖合成酶[GydF4y2Ba67GydF4y2BaCSLD成员涉及纤维素合成[GydF4y2Ba68GydF4y2Ba]．而CslG和CslH亚家族成员参与β-(1,3;1,4)- d -葡聚糖的生物合成[GydF4y2Ba69GydF4y2Ba那GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]．基于转录组数据库，茎中CSLG和CSLH的表达高于其他组织，其可能编码负责甘露多糖合成的一些酶GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

多糖是质量的决定性因素GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．蔗糖还提供用于积聚多糖的基材。因此，我们选择了与蔗糖密切相关的蔗糖合成酶（SASY）和蔗糖磷酸合酶（SPS），用于定量RT-PCR验证。SPS是催化细胞质中蔗糖合成的关键酶之一，并且对于蔗糖需要进入各种代谢途径是必需的。在番茄果实的研究中，n'tchobo等。考虑到SPS在增加番茄果糖含量和蔗糖积累方面发挥着重要作用。当SPS活性较高时，可溶性糖含量和蔗糖含量更高[GydF4y2Ba71GydF4y2Ba]．有研究表明，甘蔗茎叶中蔗糖含量与SPS活性呈正相关[GydF4y2Ba72GydF4y2Ba]．大多数Susy存在于细胞质中，其可以催化蔗糖的合成和分解。据推测，Susy活性直接影响植物器官中蔗糖的合成和代谢，并调节器官的蔗糖 - 淀粉代谢[GydF4y2Ba73GydF4y2Ba那GydF4y2Ba74GydF4y2Ba]．天等。发现蔗糖的积累主要受苏森在葡萄浆果和草莓果实的成熟过程中调节[GydF4y2Ba75GydF4y2Ba]．在葡萄浆果的成长和发展期间，Susy的表达水平增加，这在果实中糖代谢的调节中起着主导作用[GydF4y2Ba76GydF4y2Ba]．在GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，SPS和SASY的表达在茎和叶中显着高于根部，其也受到SPS和SUSY调节的影响。GydF4y2Ba

D. moniliforme.GydF4y2Ba是一种著名的中草药，主要分布在热带和亚热带地区。多糖是主要的药用成分。目的:阐明多糖的分子机制GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，我们收集了三个不同的组织，并对它们进行了高通量测序。9个转录组文库共获得562480个ungenesGydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．此外，鉴定了417个糖基转移酶和35个纤维素合酶基因。不同组织中转录组的比较分析GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba揭示了总共35,159只主要与代谢途径和二次代谢物的生物合成相关。我们的结果提供了对分子水平的DMP的生物合成的理解GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba．作为关于高吞吐量排序的第一个报告GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba，本研究应提供对多糖相关基因的新颖见解GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba并且应该是研究的有价值的分子基础GydF4y2Ba石斛兰GydF4y2BaSPP。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

D. moniliforme.GydF4y2Ba植物在安徽通吉笙生物科技公司，鲁安，中国的温室人为栽培。在获得本地许可后，公司由公司收集原始来源。在半突变Murashige和Skoog（MS）培养基上培养出种子萌发和生长的原子萌发和生长加入6-Ba 0.1 mg·lGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}，naa 0.5 mg·lGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}添加量为1% (30 g·L .GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}蔗糖+ 4 g·LGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}琼脂+ 20%马铃薯)，在12/12小时的光照-暗循环(约。30 mμ摩尔GydF4y2Ba^{- 2GydF4y2Ba}·S.GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}) 25±2°C。6月龄后移栽盆内，置于温度为25-27℃，光照/黑暗周期为12/12 h，相对湿度为60-70%的温室中。2017年3月，从3个生物复制中分别收获了2年的植物的根、茎和叶。所有的GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba将样品在液氮中冷冻并在超低温度冰箱中储存在-80℃，以进一步加工。凭证标本由金池张教授认证，并在江苏省南京林业大学江苏省水土保持和生态恢复，中国南京（优惠券号：17C003）。GydF4y2Ba

多糖含量测定GydF4y2Ba

从2岁肠收集叶子，茎和根样本GydF4y2BaD. moniliforme.GydF4y2Ba在成熟阶段。施用酚硫酸法以确定不同组织中的多糖含量。通过使用葡萄糖标准测定多糖含量。根据中国药典（2010年版）描述的方法提取多糖。最初，将样品（0.3g）精确称量，加入200ml水，并将样品加热并回流2小时，过滤，然后稀释至250mL。我们将5ml溶液精确地测量为50ml离心管，加入25ml乙醇，摇匀并冷藏这1小时，以4000 r·min离心GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}20分钟，丢弃上清液，并再次用20ml 80％乙醇（与上述相同）离心。我们重复这些步骤2次，倒掉上清液，并将沉淀物溶于加热的水中至恒定体积为50mL。将1ml样品溶液放入试管中，加入1ml 5％酚溶液。将溶液彻底混合，加入5ml浓硫酸，摇动并置于75℃水浴中20分钟。然后，将其冷却至室温，在490nm下使用紫外可见分光光度计测量吸光度，其中1ml作为坯料，并平行三次进行测试。GydF4y2Ba

RNA分离、cDNA文库构建及测序GydF4y2Ba

用OmniPlant RNA Kit (Cwbio, China)提取总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(IMPLEN, USA)分析总RNA的纯度。使用NanoDrop 2000分光光度计和Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)和琼脂糖凝胶电泳对总RNA的数量和质量进行评价。根据厂家说明书，使用TruSeqTM RNA样品制备试剂盒(Illumina, USA)进行测序实验。简而言之，该方案包括以下步骤:用带有oligo (dT)的小珠从总RNA中分离poly(A) mRNA，并通过添加片段缓冲液将其切割成300 bp的短片段。以这些短片段为模板，利用随机六聚体引物合成第一链cDNA，然后合成第二链cDNA，形成稳定的双链结构。通过PCR对产物进行纯化和富集，形成最终的cDNA文库。最后在Illumina Hiseq 4000平台(Illumina Inc.， USA)上进行文库测序。GydF4y2Ba

de novo转录组组件和unigenes注释GydF4y2Ba

为了获得高质量的清洁读取，我们使用SEQPrep从原始数据中删除了包含适配器，低质量的读取和Poly-N（GydF4y2Bahttps://github.com/jstjohn/seqprep.GydF4y2Ba)及镰刀(GydF4y2Bahttps://github.com/najoshi/sickleGydF4y2Ba）.同时，基于清洁读数计算Q20，Q30，GC含量和序列复制级别的计算。使用Trinity软件组装所有清洁读数[GydF4y2Ba77GydF4y2Ba基于左派。fq和正确的。Fq, min_kmer_cov默认设置为2，所有其他参数设置为默认。GydF4y2Ba

通过对五大公共数据库执行同源搜索来完成所有组装的unigenes的功能注释。所有ungigenes都是使用blastx注释的，减少电子值10GydF4y2Ba^{- 5GydF4y2Ba}作为显著性的阈值。5个数据库如下:Nr (NCBI非冗余蛋白序列，GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.GydF4y2Ba)、Pfam(蛋白家族，GydF4y2Bahttp://pfam.sanger.ac.uk/GydF4y2Ba），字符串（用于检索的互动基因的搜索工具，GydF4y2Bahttp://www.string-db.org/GydF4y2Ba)， Swiss-Prot(一个手动注释和审查的蛋白质序列数据库，http://GydF4y2Bawww.uniprot.orgGydF4y2Ba)和KEGG(京都基因和基因组百科全书，GydF4y2Bahttp://www.genomeGydF4y2Ba．jp / kegg /）。GydF4y2Ba

差异表达基因(DEGs)鉴定GydF4y2Ba

通过RSEM版本1.2.15估计每个样品的基因表达水平[GydF4y2Ba78GydF4y2Ba]．R Bioconductor包，Edger [GydF4y2Ba79GydF4y2Ba用于鉴定两个样品的差异表达的基因（DEGS）。错误发现率（FDR）标准用于计算阈值GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 在意义上进行了价值。为了判断基因表达差异的重要性，我们使用FDR <0.05并记录GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(fold change)|≥1为阈值。氧化石墨烯富集分析是由Goatools进行的[GydF4y2Ba80GydF4y2Ba]．对于途径富集分析，使用KOBAS 2.0.12进行KEGG浓缩分析[GydF4y2Ba81GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

定量实时PCR（QRT-PCR）GydF4y2Ba

研究表明，蔗糖磷酸盐合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SUSY）涉及蔗糖代谢[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．使用QRT-PCR分析这两个基因。提取总RNA，如上用新的植物材料所示，并进行了三种生物重复。DEGS的特定引物由Oligo 7软件设计。根据制造商的说明，在ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems，USA）上进行QRT-PCR在ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems）进行。SPS和SUSY的表达是针对actin的标准化[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba，一种内部参照基因。所有基因id和引物序列都列在附加文件中GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。GydF4y2Ba

所有序列数据都已在加入号码SRP139000下申请全国生物技术信息短读档案（SRA）。GydF4y2Ba

凯莉：GydF4y2Ba

碳水化合物活性酶GydF4y2Ba

CBMS：GydF4y2Ba

碳水化合物结合模块GydF4y2Ba

CES：GydF4y2Ba

碳水化合物酯酶GydF4y2Ba

CESA：GydF4y2Ba

纤维素合成酶GydF4y2Ba

CESA：GydF4y2Ba

纤维素合成酶基因GydF4y2Ba

Csl:GydF4y2Ba

纤维素合酶样。GydF4y2Ba

表演：GydF4y2Ba

有向无环图GydF4y2Ba

可见：GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

DMP：GydF4y2Ba

石斛兰菊属植物GydF4y2Ba多糖GydF4y2Ba

FDR：GydF4y2Ba

假发现率GydF4y2Ba

导体：GydF4y2Ba

FucosyltransferasesGydF4y2Ba

GHS：GydF4y2Ba

糖苷水解酶GydF4y2Ba

GTs:GydF4y2Ba

糖基转移酶基因GydF4y2Ba

Kegg：GydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书GydF4y2Ba

NR：GydF4y2Ba

NCBI非冗余蛋白序列GydF4y2Ba

PFAM：GydF4y2Ba

蛋白质GydF4y2Ba

请：GydF4y2Ba

多糖裂解酶GydF4y2Ba

SPS:GydF4y2Ba

蔗糖磷酸盐合成酶GydF4y2Ba

细绳：GydF4y2Ba

搜索工具，用于检索交互基因GydF4y2Ba

Susy：GydF4y2Ba

蔗糖合酶GydF4y2Ba

xt:GydF4y2Ba

Xylosyltransferases.GydF4y2Ba

感谢美国地质调查局湿地与水生研究中心的Donald L. DeAngelis教授的宝贵意见和建议，极大地提高了手稿的质量。GydF4y2Ba

该项目由江苏高等教育机构（PAPD），林业科技普及国家基金会（PAPD）的优先学术方案开发资助（Grant No. [2015] 17），江苏高等教育机构的主要自然科学基金（Grant No。15KJA220004）。资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 南京林业大学南京南京林业大学可持续林业联合创新中心，南京210037GydF4y2Ba

   袁英丹，张金池，刘鑫，妙静孟，林杰GydF4y2Ba

2. 江苏省水土保持重点实验室，南京林业大学水土保持与生态恢复重点实验室，南京，210037GydF4y2Ba

   袁英丹，张金池，刘鑫，妙静孟，林杰GydF4y2Ba

3. 迈阿密大学，珊瑚贵宾，33146，美国GydF4y2Ba

   Justin Kallman.GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

研究的概念与设计：YY和JZ;收购数据：JL和XL;数据分析和解释：mm;统计分析：JL;起草稿件：YY和JZ;修订稿件的重要智力内容：JK。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba济芝张GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

石斛兰菊属植物GydF4y2Ba在本研究中使用的是由茂云宇的温室培育，来自中国鲁安通吉笙生物科技公司。对样品收集不需要许可。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba