CRISPR / CAS9介导的靶向诱变GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因改变大豆株高和节间长度GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

大豆(GydF4y2Ba大豆蛋白GydF4y2Ba)是一种经济上重要的油料和蛋白质作物。株高是影响大豆产量的关键性状;然而，对大豆株高相关分子机制的研究还很缺乏。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat, clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas9 (CRISPR-associated system 9, CRISPR-associated system 9)是近年来发展起来的一种基因编辑技术，已被用于农作物基因组的编辑。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里，我们设计了四种grna使其中四种发生突变GydF4y2Ba晚细长的幼杆子GydF4y2Ba（GydF4y2BaLHY.GydF4y2Ba)基因。为了验证grna是否能够在转基因大豆植株中正常运行，我们首先利用CRISPR在转基因大豆毛状根中构建了CRISPRGydF4y2Ba发根农杆菌GydF4y2Ba应变K599。一旦确定，我们进行了稳定的大豆转化，获得了19个独立的转基因大豆植株。随后，我们得到了一个TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba无转基因纯合四倍体突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba通过自交叉。t的表型GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba结果表明，四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba表现为株高降低，节间缩短GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba低于野生型（WT），并且可以通过用外源GA3治疗来抵押缩短的间质表型。此外，四重突变体中Ga代谢途径基因的相对表达水平GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba这些结果表明GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba通过在大豆中介导GA途径来编码影响植物高度的MYB转录因子。我们还开发了用于鉴定突变体的遗传标记用于育种研究的应用。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的结果表明，CRISPR/ cas9介导的靶向突变有4种GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因减少大豆植物高度，在出现后20至35天缩短了节间（DAE）。这些发现提供了对大豆植物高度监管网络的机制洞察力。GydF4y2Ba

大豆是全球植物油和蛋白质最重要的经济源之一，植物高度，节点数，节点长度，分支数和种子大小是影响大豆产量的重要因素[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]株高是植物理想型的一个关键特征，相对较短的茎长有助于现代育种计划中的产量增加[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．因此，一些植物高度基因已经通过基于图谱的克隆在几种植物中克隆出来，如玉米[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]， 白饭 [GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba,番茄GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]和大豆[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]．例如，GydF4y2BaGA3 B-羟化酶GydF4y2Ba（GydF4y2BaZmGA3ox2GydF4y2Ba)利用候选基因关联图谱和矮秆突变体的遗传分析克隆了该基因GydF4y2BaD1-6016GydF4y2Ba并对玉米中的矮化突变做出了反应[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．这GydF4y2Ba短体细胞GydF4y2Ba（GydF4y2BaBr2GydF4y2Ba）基因通过测绘从玉米克隆，显着影响植物高度[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．最近的研究表明GydF4y2BaGmDW1GydF4y2Ba(矮子突变体)编码一种ent-kaurene合成酶GydF4y2BaGmDW1GydF4y2Ba显示植物高度和大豆中的缩短植物高度和缩短的植物GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．此外，几个转录因子（TF）家族在植物高度中起重要作用。例如，OSNAC2是NAC转录因子，以及本构型表达GydF4y2BaOsNAC2GydF4y2Ba导致米饭中的较短的间隙和较短的尖峰[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

昼夜钟表是内源性24小时振荡器，让生物预测其环境中的日常变化，通过调节植物中的转录组中的80％，在许多生物过程中发挥关键作用和应力反应[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．LHY和CCA1是中央振荡器的关键组成部分，并编码两个早晨表达的MYB TFSGydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．AtLHY/CCA1可以绑定到晚元素(EE;的启动子GydF4y2BaCAB表达的时间1GydF4y2Ba（GydF4y2BaTOC1.GydF4y2Ba）冗余行动以压制转录GydF4y2BaAtTOC1GydF4y2Ba基因白天[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．AtTOC1压制GydF4y2BaAtCCA1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtLHYGydF4y2Ba从黄昏的感应到黎明前的一点[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]LHY/CCA1在开花和胁迫反应中的其他功能已被报道[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．例如，沉默GydF4y2BaNaLHYGydF4y2Ba在连续光线条件下废除了鲜花的垂直运动GydF4y2Ba烟草属GydF4y2Ba[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．最近的一份报告显示，AtLHY可以调节脱落酸(ABA)信号元件和下游响应基因的表达，增强某些ABA响应[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．但是，潜在的功能GydF4y2BaLHY / CCA1GydF4y2Ba大豆的家庭成员仍然不清楚。GydF4y2Ba

CRISPR/Cas9系统最近被设计用于植物的基因操纵[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．CRISPR / CAS9技术的使用引起了极大的关注，并已成功应用于各种作物以进行基因组编辑，如小麦[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba)、玉米(GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]， 白饭 [GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba],大麦[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba,番茄GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]和大豆[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．有四个GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba大豆基因，命名GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba那GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba那GydF4y2BaGmLHY2a,GydF4y2Ba和GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba，但这些基因的功能尚不清楚。因此，在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9系统来靶向4个GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba大豆的基因。我们观察到T的表型GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- 自由生成的自由胚胎四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba并且发现该四倍体突变体的高度和节间明显短于野生型突变体。此外，该四倍体突变体中GA代谢途径基因的相对表达水平GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba显着低于wt。这些结果表明GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba通过介导GA途径的关键成分直接或间接调控株高。我们还开发了用于育种研究的突变体鉴定的遗传标记。我们的研究结果表明，这些基因的调控有助于提高大豆的株高和节间。GydF4y2Ba

目标网站选择，施工和豆毛根目标网站的确认GydF4y2Ba

为了鉴定大豆中AtLHY和AtCCA1的同源基因，我们进行了蛋白质序列比对，并在大豆中鉴定了四个CCA1/LHY同源基因。系统发育分析表明，这四个CCA1/LHY同源基因比AtCCA1更接近AtLHY。因此，这四个CCA1/LHY同源基因被命名为GmLHY1a(GydF4y2BaGlyma.16G017400GydF4y2Ba），gmlhy1b（GydF4y2BaGlyma.07G048500GydF4y2Ba)，GmLHY2a(GydF4y2BaGlyma.19G260900.GydF4y2Ba)和GmLHY2b (GydF4y2Baglyma.03g261800.GydF4y2Ba）（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图。S1）。研究四个功能GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba在大豆基因中，利用4个靶标适配器，包括靶向1/2GydF4y2Bagmlhy2a.GydF4y2Ba和GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba基因，并将3/4作为目标GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba和GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa).靶点1存在于第2、3外显子中GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba和GydF4y2Bagmlhy2a.GydF4y2Ba基因,分别;目标2存在于第5和第6外显子GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba和GydF4y2Bagmlhy2a.GydF4y2Ba基因,分别;靶3存在于第一个外显子中GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba和GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba；目标4存在于第五外显子GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba和GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba在大豆（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。CRISPR向量编码CAS9并由CAMV35S启动子驱动和由此驱动的四个GRNA驱动GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba分别为U3b、U3d、U6-1和U6-29启动子。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab、 c）。GydF4y2Ba

为了验证CRISPR/Cas9构建物是否能够在转基因大豆植株中正确编辑这些基因，我们首先在转基因大豆毛状根中使用CRISPR/Cas9构建物进行了测试GydF4y2BaA. rhizogenes.GydF4y2BaK599（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2A)。以高效的方法获得了转基因大豆毛状根GydF4y2Ba发根农杆菌GydF4y2Ba介导的转换(GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．当感染部位产生的毛状根长约2cm时，用于基因型检测。利用PCR技术检测转基因毛状根的基因型GydF4y2BaCas9GydF4y2Bagene-specific引物和GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Bagene-specific引物。我们在6个dna体积标本中检测到移动转移条带GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba利用基因特异性引物。结果表明，共获得5个转基因株系GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba基因产品（GydF4y2BaCas9GydF4y2Bagene-positive)(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图。S2B）。测序分析GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因表明GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba基因阳性品系(R1-R5)在靶区1/3位点产生重叠峰，而靶区2/4位点不变(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2C，附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：表S1）。这些结果表明，转基因编码的CAS9和GRNA能够有效地在靶1/3位点处诱导双链断裂GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba

无转基因纯合四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba在大豆GydF4y2Ba

接下来我们进行了稳定的大豆转化，获得了19个独立的TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba转基因线与节为GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba基因产品（GydF4y2BaCas9GydF4y2Bagene-positive)(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S3A)。测序分析表明，TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba-7系为杂合子四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba这可能会有一个2-bp的缺失GydF4y2BaGmLHY2b/2a/1b-GydF4y2Batarget1/3和中的1-bp缺失GydF4y2BaGmLHY2a -GydF4y2Batarget3(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S3B-E；附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S2)。为了将这些突变体应用于作物育种，我们寻找了纯合子的四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba没有转基因的线并筛选tGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba植物来源于TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba转基因线。幸运的是，我们获得了八吨GydF4y2Ba_1GydF4y2Ba来源于T的植物GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba–7缺少GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba基因(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa，b），只有一行（tGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba-15)为无转基因纯合四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba氟;附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S2)。测序分析表明，突变体为GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba有一个2-bp的缺失GydF4y2BaGMLHY2B / 2A / 1BGydF4y2Ba-target1/3和1-bp缺失GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba-target3(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac -GydF4y2Ba2GydF4y2BaF)，导致帧移突变GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bag)。GydF4y2Ba

表达水平GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba在四重突变体和WT中GydF4y2Ba

LHY/CCA1是生物钟的关键组成部分，参与生物活动的时间组织和基因表达的调控[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．以前的研究表明表达水平GydF4y2BaLHY / CCA1GydF4y2Ba早上比夜晚更高了[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．但是，表达模式GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba的四重突变基因GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba尚不清楚。的昼夜节律GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba的四重突变体的基因表达GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba在诱导长日（LD）条件下，通过定量实时PCR（qRT PCR）进行分析GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba那GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba那GydF4y2BaGmLHY2a,GydF4y2Ba和GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba在WT中高度调节，在黎明后在0小时和24小时检测到最高表达（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba模拟)。然而，的表达GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba四重突变体的基因较低GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba而不是wt（图。GydF4y2Ba3模拟GydF4y2Ba）.这些结果表明四个表达GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba在四肢突变体中基因显着降低GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba降低大豆株高和缩短节间GydF4y2Ba

检验的损失函数GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba， T的表型GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-观察到无转基因的第三代四倍体突变体和野生型植株。我们发现，在LD条件下，对于20个DAE，四倍体突变体的株高显著低于野生型植株（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa, b).随后，我们检查了节数和节间长度，因为这些影响株高[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．如图1中所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC和D，节点数量没有变化，而在四重突变体中的髁间长度明显较短。这些结果表明，四重突变体的矮化植物高度是由较短的长度引起的。我们还分析了四重突变体的植物高度，并从20到35 dae的植物高度（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae）。结果表明，四重突变体的高度GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba短于20 ~ 35 DAE。GydF4y2Ba

四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba赤霉素生物合成途径的缺陷GydF4y2Ba

以往的研究表明，GAs是决定植物高度的最重要的植物激素之一[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba].测试是否GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba影响GA的生物合成途径GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba用ga处理突变体和wtGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba和Uni（Uniconazole，Ga生物合成抑制剂）。结果表明外源GAGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba可以恢复GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变对WT，并且UNI治疗可以减少WT的植物高度GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变体苗(无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa，b）。内源性GAGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba从WT和GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测突变体。结果表明，内源性GydF4y2BaGA3GydF4y2Ba在GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba均低于重量（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC）。这些发现表明了GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变体具有低活性胃蛋白水平，并且它是GA生物合成缺陷型突变体。GydF4y2Ba

赤霉素代谢途径相关基因在四重突变体中的表达分析GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba和wt植物GydF4y2Ba

接下来，进行QRT-PCR以测量已知参与Ga生物合成的基因的相对表达，例如Ga-20氧化酶（GydF4y2BaGmGA1GydF4y2Ba那GydF4y2Baglyma.09g149200.GydF4y2Ba；GydF4y2BaGmGA2GydF4y2Ba那GydF4y2BaGlyma.20G153400GydF4y2Ba)，椰油基焦磷酸合酶(GydF4y2BaGMCPS2GydF4y2Ba那GydF4y2Baglyma.19g157000.GydF4y2Ba)、t-kaurene合成酶(GydF4y2BaGmDW1GydF4y2Ba那GydF4y2Baglyma.08g163900.GydF4y2Ba)，和GA反应基因(GydF4y2BaGmGR2GydF4y2Ba那GydF4y2BaGlyma.20G230600GydF4y2Ba；GydF4y2BaGmGR8GydF4y2Ba那GydF4y2Baglyma.11g216500.GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]在野生型和四倍体突变体中GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba．与野生型植物相比，这些基因在四重突变体中的表达显著降低GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baf)。我们的发现表明GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba可能正调控这些GA生物合成和GA响应基因的表达，从而限制大豆的株高。GydF4y2Ba

遗传标记的发展与四重突变等位基因的遗传GydF4y2Ba

遗传标记提供了鉴定分子辅助研究的突变等位基因的关键有效手段，并且可能在后代加速基因分型程序[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]因此，我们开发了三个dCAPs（衍生切割扩增多态性序列）标记来鉴定GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变等位基因（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa） .进行基因分型GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变体，使用PCR扩增使用GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba-特异性和dcap特异性引物对。放大的产物GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmLHY2a,GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba在突变基因组DNA模板上，而在WT基因组DNA模板上，可以通过限制性内切酶MspI进行剪切(图)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab).此外，放大的产品GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba在突变基因组DNA模板上，而在WT基因组DNA模板上，可以通过限制性内切酶RspRSII进行剪切(图)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab).这些结果证实了GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba可用于基因分型GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变体并在分子育种研究中具有进一步的前景。GydF4y2Ba

CRISPR / CAS9系统是最近的一个发展，它已经迅速，广泛用于编辑各种作物的基因组，例如大豆[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．例如，Bao等人获得GydF4y2BaGMSPL9.GydF4y2Ba使用CRISPR / CAS9的基因突变体和稳定的大豆转化，发现突变体GydF4y2BaGMSPL9S.GydF4y2Ba表明主茎和分枝上的节数增加，导致单株总节数增加[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．crispr编辑的两种大豆植株GydF4y2BaGmFAD2-1AGydF4y2Ba和GydF4y2BaGmFAD2-1BGydF4y2Ba基因中油酸含量显著增加80%以上，亚油酸含量下降至1.3-1.7% [GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaLHY.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCCA1GydF4y2Ba是编码两个早晨表达MYB转录因子的重要生物钟基因吗GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．然而，LHY/CCA1家族成员在大豆中的功能尚不清楚。在本研究中，我们设计了4个靶标适配器(靶标1、靶标2、靶标3和靶标4)来编辑4个靶标GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba为了测试这些靶点是否能在转基因大豆植株中正常发挥作用，我们首先在转基因大豆毛状根中使用GydF4y2Ba发根农杆菌GydF4y2Ba应变K599。我们确认目标1和目标3可以执行，而目标2和目标4可能不能正常工作(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S2）。然后我们进行了稳定的大豆转化，获得了19 TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba事件。在之前的CRISPR/Cas9研究中，嵌合突变降低了大豆中突变等位基因的遗传传递[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]．因此，在这项研究中，我们寻求纯合的四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba无转基因系和筛选的TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba植物来源于TGydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba转基因线。幸运的是，我们得到了一个(TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba-15）无转基因纯合的四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba2f.GydF4y2Ba氟;附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S2)。我们的研究结果表明，CRISPR/Cas9系统在大豆育种中具有巨大的潜力。GydF4y2Ba

昼夜节奏在多种生物过程的时序中起着关键作用，在某些模型作物中的压力反应[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．作为昼夜时钟的关键部件，LHY / CCA1 TFS能够启动和设置时钟控制节奏的阶段以产生一定的表型[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．例如，过度表达GydF4y2BaNaLHYGydF4y2Ba与野生型植株相比，下胚轴延长，开花晚GydF4y2Ba尼古利亚娜attenuata.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．观察到相同的表型GydF4y2BaArabidopsis atlhy.GydF4y2Ba-overexpressing线[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．虽然LHY/CCA1家族成员的功能与模式作物的开花和胁迫反应有关，但对大豆LHY/CCA1家族成员的生物学功能知之甚少。为了探讨大豆基因的分子功能，我们检测了大豆基因功能缺失的表型GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba在T.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba无转基因突变体。我们发现植物高度在GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba大豆中的突变体在20到35 DAE时缩短（图。GydF4y2Ba4A-E.GydF4y2Ba）.我们的数据表明时钟基因GydF4y2BaGmLHY4GydF4y2Ba，作为一种MYB-TF，对大豆植株高度具有调节作用。GydF4y2Ba

植株高度通常被认为是各种作物育种的中心产量性状[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]GAs是一大类四环二萜类植物激素，调节植物生长发育中的多种生物过程，如胚胎发生、叶原基、开花和植株高度[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]．近年来，在植物中已经报道了一些与株高相关的GA代谢途径相关基因[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]．例如，GydF4y2BaSD1.GydF4y2Ba编码胃肠杆菌素20-氧化酶基因（GA00X），以及降低的内源GA水平GydF4y2Basd1GydF4y2Ba突变体导致水稻品种IR8矮小[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．然而，缺乏TFS在大豆中植物高度调节的分子机制的研究。在这项研究中，内源性GA3的水平GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba，缩短的节间表型可以通过外源GA3处理得到挽救(图3)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa - c)。此外，我们检测了GA合成基因的表达水平(GydF4y2BaGmDW1GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmGA1GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmGA2GydF4y2Ba,GydF4y2BaGMCPS2GydF4y2Ba)和GA反应相关基因(GydF4y2BaGmGR2GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmGR8GydF4y2Ba）在四重突变体中GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba和wt大豆植物（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baf)。我们发现这些基因在四重突变体中的表达显著降低GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba总之，我们推测GmLHY可能正调控这些GA代谢途径相关基因的表达，从而降低大豆株高。GydF4y2Ba

CRISPR/Cas9系统可用于多种基因编辑，促进作物育种。在本研究中，我们利用CRISPR/ cas9为基础的多基因组编辑成功获得了一个四重突变体GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba此外，我们的结果表明，GmLHY可直接或间接提高GA合成基因和GA反应相关基因的表达水平，从而调节大豆的株高。我们的研究结果为利用基因编辑生成非转基因大豆基因型提供了一个案例研究，并为深入了解潜在的机制提供了依据作物物种中的株高调节网络。GydF4y2Ba

质粒构建GydF4y2Ba

四个核苷酸序列GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因从植物血红素下载（GydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlGydF4y2Ba）.目标序列GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba利用网络工具CRISPR-P (GydF4y2Bahttp://cbi.hzau.edu.cn/crispr/GydF4y2Ba）.Pylcrispr / cas9p35s-b载体是Ma等人的礼物。[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]根据Ma等人报告的方案，将靶序列亚克隆到不同的单指南RNA（sgRNA）表达盒中，并构建到pYLCRISPR/Cas9P35S-B载体中[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]．将阳性质粒导入GydF4y2Ba根癌农杆菌GydF4y2Ba菌株EHA101对大豆进行稳定的转化和转化GydF4y2Ba发根农杆菌GydF4y2Ba用于大豆毛状根转化的菌株K599。GydF4y2Ba

稳定大豆转化GydF4y2Ba

转换过程是根据以前的协议[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]．利用除草剂喷叶法筛选出转基因大豆植株GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba通过擦拭100 mg / l v3，v3，v4和v5）的一代叶子GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}在叶子上表面涂上氨基膦酸铵溶液。利用NuClean植物基因组DNA试剂盒(CWBIO, China)从抗除草剂植物叶片中提取基因组DNA。来确认是否存在GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba基因，PCR分析采用GydF4y2BaCas9GydF4y2Ba基因特异性引物(附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S3)。每个DNA样本进行一次PCR扩增。GydF4y2Ba

发根农杆菌GydF4y2Ba-大豆毛状根的介导转化GydF4y2Ba

转基因大豆毛状根由GydF4y2BaA. rhizogenes.GydF4y2Ba如Kereszt等人所述的介导的转化。[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba和Cheng等[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba经过一些修改。子叶被切成粗糙的三角形，立即放入含有0.8%琼脂培养基的培养皿中，以保持其湿润。切面用20 μL处理GydF4y2BaA. rhizogenes.GydF4y2Ba悬架。培养皿用塑料薄膜密封，置于25°C的培养箱中。大约2周后，转化的毛状根沿愈伤组织脊分布在接种的子叶上。对转基因毛状根进行PCR测序分析。GydF4y2Ba

利用PCR和测序分析鉴定诱导突变GydF4y2Ba

使用核心植物基因组DNA试剂盒（CWBIO，中国）从转基因大豆毛的根和转基因植物中分离DNA。跨越目标的地区GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba使用Kod DNA聚合酶（Toyobo，Japan）在附加文件中使用不同的引物对扩增基因GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S3。T的序列GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba和TGydF4y2Ba_1GydF4y2Ba利用BioEdit对CRISPR/Cas9诱导的突变进行分析。GydF4y2Ba

植物材料、生长条件和引物GydF4y2Ba

大豆品种‘Harosoy’用于大豆毛状根和稳定转化。为了研究转基因植株的株高，TGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在长度为20-35 dae的16小时光/ 8小时暗循环中，在生长室中生长无转基因突变体和WT对照植物在25℃和70％的相对湿度下保持。主干和髁间长度上的节点数在20deae中记录。在突变体中检测到Ga生物合成基因和Ga响应相关基因的表达，并在20dea的叶片中叶。用于载体构建，PCR和QRT-PCR测定的所有靶基因的所有引物都列于额外的文件中GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S3。GydF4y2Ba

存在分析GydF4y2Ba

从WT和T细胞中提取总RNAGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba使用Trizol试剂（Invitrogen，Shanghai，China）突变大豆叶。根据制造商的说明，使用M-MLV逆转录酶试剂盒（Takara，大连，中国）进行cDNA合成。使用QRT-PCR分析来测量转录水平GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因,即GydF4y2BaGmGA1GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmGA2GydF4y2Ba那GydF4y2BaGMCPS2GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmGR2GydF4y2Ba那GydF4y2BaGmGR8GydF4y2Ba,GydF4y2BaGmDW1，GydF4y2Ba在Roche LightCycler480系统（德国Roche）使用实时PCR套件（Roche，德国）。大豆管家基因GydF4y2BaGmTubllinGydF4y2Ba（GydF4y2BaGlyma.05G157300GydF4y2Ba)作为内部参考标准化所有数据。使用2GydF4y2Ba^{−ΔΔCTGydF4y2Ba}方法。每根测定每条生物复制三种生物复制。GydF4y2Ba

分子标记发育GydF4y2Ba

GmLHYGydF4y2Ba通过测序获得Harosoy和突变体基因组的序列。使用引物Premier 5.0设计引物，产物大小为< 200 三个dCAPs标记是根据基因1/3位点的变异开发的GydF4y2BaGmLHYGydF4y2Ba基因。GydF4y2Bagmlhy2a.GydF4y2Ba和GydF4y2Bagmlhy2b.GydF4y2Ba共享一对标记，和GydF4y2BaGmLHY1aGydF4y2Ba和GydF4y2BaGmLHY1bGydF4y2Ba每个共享一对标记。附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba表S3列出了本研究中使用的dCAPs标记。GydF4y2Ba

GA.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba和单处理，以及内源性GA测定GydF4y2Ba

这GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba突变体和WT在25°C LD (16 h光照/8 h黑暗)和75%湿度条件下的生长室中生长。在大约20 DAE时，从突变体或WT幼苗收获1 g(新鲜重量)叶片组织，称重后立即在液氮中冷冻，然后在−80°C下保存。GA的定量分析GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba这些分析由苏州科敏生物技术有限公司（中国苏州）进行。GydF4y2Ba

来评估GydF4y2BaGmlhy1a1b2a2bGydF4y2Ba遗传变异GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， 1.0 mg/L GAGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba对完全张开真叶的幼苗施用两次。同时进行Uni (1.0 mg/L)处理。大豆的生长条件如上所述。每个处理准备3个重复，4 d后通过测量幼苗长度评价激素对茎膨大的影响。GydF4y2Ba

本研究中所开发和分析的数据集和材料可在合理要求下从通讯作者处获得。GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

Br2:GydF4y2Ba

短体细胞GydF4y2Ba

Cas9：GydF4y2Ba

CRISPR-associated系统9GydF4y2Ba

CPS2：GydF4y2Ba

焦氨基焦磷酸合酶GydF4y2Ba

CRISPR：GydF4y2Ba

集群定期间隔的短文重复GydF4y2Ba

DAE:GydF4y2Ba

几天后出现GydF4y2Ba

DCAP：GydF4y2Ba

衍生的裂解扩增多态性序列GydF4y2Ba

DW1:GydF4y2Ba

侏儒突变GydF4y2Ba

情感表达:GydF4y2Ba

黄昏元素GydF4y2Ba

遗传算法:GydF4y2Ba

赤霉酸GydF4y2Ba

GA1/2:GydF4y2Ba

GA-20 oxidase1/2GydF4y2Ba

GA3OX2：GydF4y2Ba

GA3 B-羟化酶GydF4y2Ba

GR2 / 8：GydF4y2Ba

GA-encooctive基因2/8GydF4y2Ba

LC-MS：GydF4y2Ba

液相色谱-质谱法GydF4y2Ba

LD:GydF4y2Ba

漫长的一天GydF4y2Ba

LHY:GydF4y2Ba

晚细长的幼杆子GydF4y2Ba

qRT PCR：GydF4y2Ba

定量实时PCRGydF4y2Ba

TF:GydF4y2Ba

转录因子GydF4y2Ba

TOC1:GydF4y2Ba

CAB表达的时间1GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

我们感谢华南农业大学刘耀光教授提供的载体pYLCRISPR/Cas9P35S。我们感谢LetPub (GydF4y2Bawww.letpub.com.GydF4y2Ba）在编写本手稿期间的语言援助。GydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(no . 31901568, no . 31725021, no . 31771815, no . 31701445, no . 31801384)。国家自然科学基金重点研发计划项目(no . 2017YFE0111000, no . 2016YFD0100400)。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有作用。GydF4y2Ba

作者指出GydF4y2Ba

1. Qun Cheng，Lidong Dong，Tong Su和Tingyu Li源于这项工作。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 广州大学生命科学学院，广州GydF4y2Ba

   程群，董立东，李廷玉，甘卓然，南海洋，陆思佳，方超，孔令平，李海洋，侯志宏，唐杨，林晓亚，赵晓辉，陈立玉，刘宝辉，孔繁江GydF4y2Ba

2. 中国科学院种子设计创新研究院，大豆分子设计育种重点实验室，中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨GydF4y2Ba

   通苏、昆口、刘宝辉和孔繁江GydF4y2Ba

3. 中国科学院大学，中国北京GydF4y2Ba

   通苏昆口GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

FK和BL设计实验并管理项目。QC、LD和TS执行实验。TL修改和修订手稿。ZG、HN、SL、CF、LK、HY、ZH、KK、YT、XL、XZ和LC执行数据分析。FK、QC和LD编写手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba宝会刘GydF4y2Ba或GydF4y2Ba孔繁江GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

道德认可和参与同意GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者没有相互竞争的利益需要申报。GydF4y2Ba

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再版和权限GydF4y2Ba