油棕杂交种形态及产量相关性状的全基因组关联研究(GWAS)油松树与几内亚松树)人口

背景

属Elaeis具有两种经济重要性的油棕农用工业:Elaeis鉴定(O)，原产于美洲，以及Elaeis guineensis(G)原产于非洲。这项工作为我们所知的第一个对OxG油棕种群的关联图谱研究提供了依据，该种群具有抗病虫害、高油质和可接受的果串产量。

结果

利用基因分型测序(GBS)技术，对378个OxG杂交群体的10个农艺性状进行了全基因组关联分析(GWAS)，共鉴定出3776个单核苷酸多态性(snp)。12个基因组区域(snp)位于候选基因附近，涉及多种功能类别，如组织生长，细胞运输和生理过程。

结论

我们提供了新的见解，在基因组区域映射到候选基因参与植物结构和产量。这些潜在的候选基因需要被确认，以便将来进行有针对性的功能分析。相关性状的标记为油棕育种中标记辅助选择的发展提供了宝贵的资源。

与其他产油作物相比，油棕是一种重要的作物，具有更高的油质量和更大的产量潜力[1]。哥伦比亚是全球第四大油棕生产国，2018年产量为180万吨，产量为3.8吨/公顷，高于全球平均产量[2]。在槟榔科，非洲油棕(Elaeis guineensis)，原产于西非，是世界上大多数植物油的主要来源[3.]。然而，另一种被称为美洲油棕(Elaeis鉴定)，原产于中美洲和南美洲的热带地区，以其高产而闻名[3.]。这两种棕榈树都是多年生单子叶植物，寿命约为25年[4]，这导致繁殖过程缓慢。Corporación columbiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia)建立了一个育种计划，重点是开发OxG种间杂交(e .鉴定x大肠guineensis）.OxG的特点是树干生长缓慢[5]，对芽腐病的耐受性[6，7，8，9]和红环病[10与亲本物种相比。此外，这些OxG群体继承了单性果实发育e .鉴定，因此可以生产无籽水果[11]。

饱和遗传连锁图谱是鉴定与主要基因相关的基因组区域和控制农艺性状的数量性状位点(qtl)所必需的。在过去的20年里，油棕的多个基因图谱已经建立起来。第一个这样的图谱是使用限制性片段长度多态性(RFLPs)和扩增片段长度多态性(aflp)生成的[12，13]。随后使用简单序列重复(SSRs)和单核苷酸多态性(SNP)标记构建密集的遗传图谱，这些标记也用于QTL鉴定。利用这种方法，Jeennor和Volkaert [14]利用69个群体的定位群体，鉴定出一个与束重相关的QTL，并生成了包含89个ssr和101个snp的遗传图谱。此外，Billotte等人。[15]使用了一个多亲本连锁图谱，该图谱由251个ssr组成，并报告了与一些性状相关的qtl。类似的方法已经能够利用SSR、AFLP和RFLP标记鉴定出与21个产油组分相关的164个qtl [16]。

近年来，下一代测序技术的进步降低了DNA测序成本，目前已获得数千个snp [17，18]。特别是，测序基因分型(GBS)是一种快速、低成本、可靠的利用snp筛选育种群体的方法[19]。Pootakham等。[20.用F绘制了一张油棕地图₂从GBS中提取了1085个snp，并鉴定出了与果实高度和果串质量相关的qtl。类似地，全基因组关联分析(GWAS)使用来自GBS的大量snp(4031个)，跨越不同的群体e . guineensis鉴定出与树干高度增加有关的新qtl [21]。

与QTL连锁映射相比，GWAS被认为是一种更可靠的方法[22]。与双亲本定位群体有限的遗传变异相比，在GWAS分析中广泛使用遗传背景增加了检测与感兴趣性状相关的QTL区域的可能性[23]。然而，GWAS的局限性，如群体结构的影响，可能导致候选标记与特定表型性状之间的虚假关联[24]。为了消除这种关联，混合线性模型结合了结构数据(Q)和相对亲属效应(K)，从而减少了假阳性关联[25]。

鉴于棕榈油在许多加工食品以及工业和医疗应用中的使用，这种作物的经济重要性经历了快速增长，棕榈油现在是世界上交易量第二大的植物油，仅次于大豆。26，27]。由于从反式脂肪转向更健康的替代品，对这种作物的需求正在增加。28]，因为它的残留物可以加工成生物燃料[27]。由于这些原因，鉴定特定基因组区域的基因参与形态性状，如高度和叶面积，以及这些性状与生产力之间的关系，对这种作物变得越来越重要。

虽然以前的研究已经确定了控制油棕形态和产量相关性状的qtl，但这些qtl是在种内群体中检测到的。我们的研究是第一个通过关联分析在种间OxG群体中绘制分子标记的报告。我们的研究目的是:(i)对一个OxG油棕种群进行基因分型;(ii)使用GWAS来识别与形态和产量相关性状相关的位点或候选基因，以便将来在育种计划中使用。

表型数据分析

378个OxG杂交种群体表型数据的均值、标准差和极差值见表1。第一主成分(PC1)解释了45.6%的总表型变异，其中叶面积(LA)、叶面积(FA)、叶干重(LDW)和干高(HT)等形态相关性状对该成分贡献很大。同时，第二主成分(PC2)解释了19.9%的方差，主要与产量相关性状相关(图2)。1a - b)。大部分形态性状(r= 0.1 ~ 0.8)，而产量与大部分形态性状(r≤0.3)。1b)。值得注意的是，高温与FA、LA、LDW和树干直径(TD)相关(r≥0.6)，而产量与束数(BN)高度相关(r= 0.91);与束重(BW)的相关性较弱(r= 0.57)。

采用层次聚类分析对378个OxG杂交种的表型相似性进行评价(图2)。2;额外的文件1:表1)。我们发现两个集群之间的表型差异与形态相关性状的可变性一致。总体而言，II组所有形态学相关性状的平均值最高(附加文件)3.:图S1)，例如，与组I (HT = 238±28 cm)相比，组II的OxG个体明显更高(HT = 269±21 cm) (p≤0.0001)。而产量相关性状组间差异不显著。

SNP打电话

从7个Illumina HiSeq通道共生成1,058,182,456个原始Illumina测序读数，涉及471个棕榈树(62e .鉴定(O)，31大肠guineensis(G)，378 (OxG))。基因分型检测到131825个snp，覆盖16条油棕染色体。过滤后，保留3776个snp，平均每条染色体236个snp(附加文件)2表2)。

聚类和关联分析

整个种群(471棕榈)的邻域加入(NJ)分析(图2)。3.A)显示了两个主要的组包含e .鉴定和e . guineensis在OxG人群中有三组，结果如下:一组与大肠guineensis，另一个更类似于e .鉴定最大的群体与两个亲本物种都表现出中等程度的相似性。OxG群体的3个组表现为两个高度杂合的二倍体(Aa × Aa)杂交的典型分布，基因型分离比为1:2:1。

对OxG群体(378个杂交种)的PCA分析表明，前3个分量约占总变异的15.47%，可以将群体划分为3个类群，从而支持了根据我们群体的分离性在NJ树上观察到的结果(图2)。3.b)。

我们对378个OxG杂交种和3776个snp进行了7个形态性状和3个产量相关性状的关联分析(表1)1）.12个snp与测量的性状最显著相关，基于p错误发现率(FDR)校正前油棕基因组不同基因组区域的值(表1)2）.根据表型相关结果，观察到轴长(RL)和单叶(LXL)的共同snp，以及HT和LA，产量和BN之间的共同snp。Q-Q图(图1)4)显著支持SNP与这些性状(p≤0.005)，说明GWAS模型的群体分层得到了充分控制。

油棕基因组序列的可用性[29]使特定的qtl与物理图谱上的基因组区域相关联，并探索潜在的候选基因及其可能的功能。在第3、13和15号染色体上，我们发现了10个显著的snp，这些snp位于FDR校正前与形态学相关性状相关的基因所在的基因组区域。4和表2）.对于产量相关性状，我们观察到5号和10号染色体上两个候选基因的两个snp，在进行FDR校正后，这些snp不显著(图2)。4、表2）.我们评估了与性状相关的snp是否存在于标记较多的染色体中，以评估我们的结果是否可能来自基因分型中的偏差。本研究中发现的相关snp(染色体3、5、10、13和15)并不位于GBS方法鉴定的snp数量较高的染色体上(附加文件)2表2)。

在与评估性状相关的基因组区域中出现的染色体的snp之间的成对连锁不平衡(LD)在附加文件中说明4:图S2。所有染色体的LD块都很小，考虑到物种的异交性质，这是意料之中的。

改善油棕的油质和提高每公顷产量是油品加工业关注的主要问题。Corporación columbiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia)是一家非营利性政府研究机构，致力于为农民提供解决方案，将从包括油棕在内的育种项目中开发的品种纳入其中。其策略侧重于开发在抗病、果数、果重、叶长和树干直径等性状上具有杂种优势的种间OxG [30.]。据我们所知，这项研究是首次对OxG人群进行GWAS分析。

表型数据

产量相关性状的相关分析结果表明，相对于体重，粗氮化硼有可能成为OxG群体更好的产量选择标准。在本研究中，产量与叶片相关性状(FA、LA、LDW、LXL、RL)无显著相关;然而，之前的一项研究e .鉴定与OxG杂交发现BN可以高于叶片数量，但只有在油棕产生多个花序的时候[31]。其他油棕种质研究表明，BN和BW的增加也与中果皮和仁油产量的增加有关[32]。考虑到油棕育种在这方面的重要性，未来的研究应针对提高油棕产量进行。

关联分析

在目前的研究中，我们使用GBS(一种为农作物开发的技术)生成了测序数据[19]。GBS依靠限制性内切酶产生分布在整个基因组中的位置的减少表示，以降低其复杂性，并使用间隔SNP标记快速对样本进行基因分型[33]，这可能与负责重要性状的候选基因有关。因此，GBS因其高通量和低成本的基因分型技术，适用于各种不同生物的群体研究、种质鉴定、遗传改良和性状定位，在作物研究和植物育种中得到广泛应用[34]。

通过关联图谱，鉴定出了与10个形态和产量相关性状相关的12个基因组区域(snp)2）.然而，只有5个与LDW、TD、RL和LXL相关的区域仍然显著(p≤0.05)。重要的是，发现的与该性状有统计学显著关联的snp不一定是因果DNA变异，也就是说，具有直接影响的变异。这种关联仅表明SNP位点与GWAS鉴定的SNP在LD中存在因果变异。

热图分析中的小LD块可能表明因果区域位于最显著snp附近。因此，本研究中鉴定的SNP作为一个标志，定义了基因组中的一个区间，必须进行后续研究以确定因果变异。

因此，我们描述了五个最重要的区域，以及位于这些区域内的基因，这些基因可能是参与本研究评估的表型性状表达的潜在候选基因。在形态性状上，LDW与3号染色体有显著关联，解释了10%的表型变异。该区域最重要的SNP位于机械敏感(MS)离子通道蛋白10样(MSL10)基因。已经提出，MS离子通道在植物中发挥着广泛的作用，从促进触觉和重力的感知到调节细胞内细胞器的渗透稳态[35]。此外，机械感觉基因对于正常细胞和组织的生长和发育以及对一系列生物和非生物胁迫的适当反应至关重要[36]。在第15号染色体上发现了第二个与TD相关的重要区域，该区域包含一个参与核酸结合的基因，该基因具有c2h2型锌指结构域。有研究认为，C2H2-ZF基因家族参与了杨树等物种木材的形成、枝层和形成层的发育，并在逆境和植物激素反应中发挥作用[37]。

对于RL和LXL性状，在染色体2、4、10和16上报道了qtl [32]。在我们的研究中，三个snp与13号染色体上三个不同的RL候选基因相关。SNP S13_20,856,724最接近AGC3并编码不同的G蛋白。据报道，这些基因参与了广泛的发育和生理过程，因此有可能促进水稻等作物的产量提高[38]。第二个显著关联是发现SNP S13_23,674,227，位于细胞外核糖核酸酶基因(核糖核酸酶基因)。的核糖核酸酶植物的基因已被研究多年，在植物防御中起着至关重要的作用[39]和发育，因为它们有能力改变RNA水平，从而影响蛋白质合成[40]。最后，SNP S13_25,522,088也与RL和LXL显著相关，但需要进一步研究以确定其在调节这些性状中的作用，如果有的话。

在FDR校正后，7个snp不再显著，可能是由于使用的样本量减少。QTL和关联研究受到相对较小的定位群体规模的限制，导致统计能力较低，从而导致小效甚至中等效的QTL在统计上不显著，难以检测。这些统计上力量不足的人口也可能遭受严重的效应大小估计膨胀(所谓的比维斯效应)[41]。因此，需要增加种群规模和标记密度，以使估计不受Beavis效应的影响，并获得更高的统计功率[41，42，43];然而，对于后代数量有限的多年生种群(世代时间较长)来说，增加体型需要相当大的投资。

对于油棕来说，由于树干的高度，在棕榈达到一定年龄后，收获果实束是一项艰巨的任务。因此，减少HT和TD的基因型在油棕种植者中更受青睐。同样，更大的叶面积(取决于RL和LDW)与更大的光合作用有关，这可能涉及更高的生产力。然而，最重要的是，增加水果的数量和重量意味着每棵棕榈树的生产率更高，从而为农民带来更高的收入。因此，利用与这些性状相关的qtl或基因(如我们在本研究中发现的那些性状)可以有助于植物育种策略的发展，例如标记辅助选择，有助于在早期阶段(即温室条件下)选择有前途的材料，从而缩短育种周期。由于我们在关联研究中发现的相关性还不能被称为因果关系，因此需要进一步的工作来关注我们研究中发现的一组潜在候选基因的生物学功能。

我们的研究首次报道了基于GWAS的OxG油棕种群的5个与形态和产量相关性状相关的重要基因组区域。功能注释可能与相应性状相关的基因位于这些区域内，因此，这些基因可能代表qtl的候选基因。我们的研究结果将为油棕标记辅助育种的发展奠定基础，并将为未来的功能研究奠定坚实的基础，以确定高产的驱动因素。

植物材料

共有471种不同的油棕(62种)e .鉴定(O)登记入册，31大肠guineensis(G)登记入册，和378个OxG杂交种)来自Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia)的El Mira和La Libertad研究中心[44]，被纳入本研究。通过8个不同的杂交点(8个不同的杂交点)获得了OxG种群e .鉴定作为雌性祖先的加入与一个杂交大肠guineensis作为男性祖先加入);然而，这些过境点的父母目前已经去世。十字架的细节和个体的起源在附加文件中给出1表S1。该植物材料属于Agrosavia维护的哥伦比亚国家种质资源收藏。所有样本均按照国家规定采集。

表现型

在哥伦比亚图马科的El Mira Agrosavia研究中心，收集了378个OxG杂交种的表型数据，这些杂交种种植在植株之间10 m的五边形或三角形系统中。植物采用完全随机区组设计随机分布，共4个区组。

共有10个特征(表1)1)分布在两个类别(形态和产量相关)之间，评估如下:i)形态类别(7个性状);树干直径(TD，树干中部周长)，树干高度(HT，最低绿叶与果实之间的距离)，轴长(RL，在完全展开的叶子上测量)，叶干重(LDW，每片叶子的平均干重乘以产生的叶子数)，叶面积(FA，每片叶子的平均面积乘以每手掌的叶子数)，叶面积(LA，每片叶子的平均面积)和每叶小叶(LXL，最大小叶的长度)。ii)与产量相关的类别(三个性状):束重(BW，收获期间果实的重量)，束数(BN，收获期间每棕榈果实的数量)和每棕榈产量(产量，每年每棕榈果实的公斤数)。每个特征都根据Corley等人提出的方法进行测量。[45]和Breure [46]。

表型数据的统计分析

性状间的相关系数采用Pearson相关系数(r),p≤0.05。为了评估所研究性状之间的关系，进行了主成分分析(PCA)。最后，采用Ward’s方法进行层次聚类分析，分析杂种之间的关系。聚类间性状差异采用at以及与p≤0.0001。所有统计分析均使用R v3.42软件进行[47]。

基因分型

使用dnasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)从471棵棕榈树的叶片组织中提取基因组DNA。DNA质量用后在2%琼脂糖凝胶上电泳。用甲基化敏感限制性内切酶构建GBS文库PstI(CTGCAG)。测序采用基因组多样性研究所(Cornell University, Ithaca, NY, United States)的Illumina HiSeq 2000平台(Illumina Inc.， United States)进行100 bp单端reads测序。

SNP发现和数据处理

使用来自Tassel v4.5.9软件的标准流水线对Illumina读取进行解复用[48]。然后，读取被映射到油棕的参考基因组大肠guineensis［49使用Bowtie2 [50雇用…非常敏感的选择。选取次要等位基因频率(minor allele frequency, MAF) < 5%，最小位点覆盖(minimum locus coverage, mnLCov) 0.9，最小位点覆盖(minimum site coverage, mnScov) 0.7，最小分类单元覆盖(minimum taxon coverage, mnTCov) 0.5进行SNP召唤。最后，使用VCFtools v0.1.13软件对snp进行筛选[51]去除95%的缺失数据，并保留双等位基因snp。

聚类和标记性状关联分析

采用Tassel v4.3.5的邻居加入算法对所有471棵油棕进行聚类分析[48]并使用Figtree v1.4.0进行可视化[52]。378个OxG杂交种的种群结构通过使用SNPrelate的PCA进行了评估。53的程序。使用GAPIT (Genome Association and Prediction Integrated Tool)软件中的混合线性模型计算分子标记与表型数据之间的关联[54]。为了避免群体结构可能造成的偏差，我们在混合线性模型中纳入了PCA的前五个主成分和来自GAPIT的亲缘关系(亲属关系)矩阵。使用观测到的−log绘制分位数-分位数(Q-Q)图₁₀p-value和期望的−log₁₀p-值是为了研究GWAS模型的适宜性。错误发现率(FDR) [55用来纠正错误的联想。

利用自定义脚本，通过对R进行配对绘制，生成了连杆不平衡(LD)的热图²根据同一染色体上标记之间的物理距离(碱基对)的值。

潜在候选基因鉴定

SNP标记的物理位置来自国际马来西亚油棕基因组计划的Genomsawit网站(http://gbrowse.mpob.gov.my/fgb2/gbrowse/Eg5_1/）.利用已发表的基因组信息建立候选基因区域下的基因注释大肠guineensis［49]。在数据库中查询与性状相关的重要SNP标记的推测生物学功能的SNP侧翼序列，如HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)及NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，以及欧洲分子生物学实验室(http://www.ebi.ac.uk/)和欧洲核苷酸档案(http://www.ebi.ac.uk/ena）.

本研究中使用和分析的数据集可应通讯作者的合理要求向其提供。

妊娠:

扩增片段长度多态性

BN:

群号码

BW:

一些重量

费尔南多-阿隆索:

叶面积

罗斯福:

错误发现率

GBS:

Genotyping-By-Sequencing

GWAS:

全基因组关联研究

HT:

树干高度

拉:

叶面积

LD:

连锁不平衡

LDW:

叶片干重

LXL:

每叶单张

主成分分析:

主成分分析

QTL:

数量性状位点

RFLP:

限制性片段长度多态性

RL:

脊柱的长度

SD:

标准偏差

SNP:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

道明:

树干直径

作者要感谢William Tolosa在样本收集过程中的支持，Jhon Berdugo在数据分析过程中的支持，Marco Antonio Lopez为LD热图分析提供了脚本，Roxana Yockteng在邻居加入分析的阐述过程中提供了支持。作者感谢Joanna Kelley在修改手稿最终版本时提供的帮助。获得油棕作物符合Agrosavia与哥伦比亚农村农业部(MADR)签署的无商业利益遗传资源科学研究协议第74号。

本文的出版由TV-17资助，并得到哥伦比亚农业和农村发展部(MADR)的支持。资助实体在研究设计、数据收集、分析、解释、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

从属关系

1. tibaitat研究中心，Corporación columbiana de Investigación Agropecuaria, Agrosavia，波哥大，哥伦比亚

   Jaime A. Osorio-Guarín, Gina A. Garzón-Martínez, Paola Delgadillo-Duran, Felix E. Enciso-Rodríguez和Luz Stella Barrero

2. Palmira研究中心，Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, Agrosavia, Palmira，哥伦比亚

   西尔维奥·巴斯蒂达斯和雷迪·p·莫雷诺

3. 华盛顿州立大学生物科学学院，美国华盛顿州普尔曼

   奥马尔·e·科内霍

贡献

LSB、FEER和SBP对项目及其组成部分进行了概念化和构思。SBP、PDD、GAGM、FEER、JAOG和LPM收集杂种和性状数据。JAOG和GAGM在OEC的监督下进行了基因型和表型分析。JAOG和GAGM撰写原稿，LSB、OEC和FEER对原稿进行了修改和编辑。所有作者都参与了手稿的起草和审查，并阅读和批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到奥马尔·e·科内霍或Luz Stella Barrero。

伦理批准并同意参与

对植物材料的研究，包括其收集，符合机构和国家的指导方针。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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