一种myb相关转录因子来自羊草，gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba，促进干旱胁迫下种子萌发和根系生长gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

干旱是制约植物生长和生产的最严重因素之一。羊草能够很好地适应各种不利条件，包括干旱。然而，在发芽过程中，羊草幼苗对这些不利条件很敏感。因此，幼苗的适应性对于植物的生存非常重要，尤其是对于栖息于草原或人工草地建设的植物。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们发现了一个羊草myb相关的转录因子，gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba这在干旱胁迫下上调，并在复水后恢复到基础水平。的表达gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba主要由渗透胁迫诱导，并局限于细胞核。此外，我们还证明了这一点gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba干旱和ABA处理对种子萌发和根系生长均有促进作用。此外，我们证实了LcMYB2可以调节gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba通过结合其启动子在羊草中表达，并激活渗透胁迫标记基因的表达gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba通过直接结合它们的启动子在转基因拟南芥。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

基于这些结果，我们提出gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba通过增加渗透保护剂的积累和促进根系生长，提高植物的抗旱能力。因此,gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在植物对干旱胁迫的反应中起着关键作用，是通过基因操作创造抗旱作物的重要候选者，尤其是在种子萌发过程中。gydF4y2Ba

种子萌发和幼苗建立是植物生命周期中最关键的阶段[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba此外，大多数植物的发芽和幼苗形成阶段对干旱等应激条件最为敏感。干旱一直被认为是限制植物生长和生产力的最重要因素，尤其是在干旱和半干旱地区。因此，对干旱胁迫下种子萌发和幼苗建立的研究不仅是评价和培育物种生态适应性的需要，也是制定有效的干旱半干旱草地恢复和应用策略的需要。gydF4y2Ba

干旱通常具有复杂的分支，通过破坏土壤-根-植物-大气连续体的水势梯度，对细胞施加高渗透和离子胁迫[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．植物，尤其是那些不断生长在恶劣环境中的植物，已经进化出许多应对非生物胁迫的策略。一般情况下，植物要么采用逆境耐受策略，要么采用逆境回避策略。例如，建立更深的根系，这有助于根系在干旱条件下从更深的地下吸收水分，是一种躲避策略[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．控制气孔孔径以减少蒸腾作用和渗透保护剂(如脯氨酸或可溶性糖)的积累通常被认为是一种抗逆性策略[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

干旱引起的主要信号是渗透胁迫，渗透胁迫信号与盐胁迫信号重叠，增加植物激素脱落酸(ABA)的积累[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．内源ABA通过信号级联在调节气孔孔径和诱导渗透剂生物合成方面发挥着重要作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．ABA增加，它结合可溶性ABA受体(PYR/PYL/RCAR)，它们一起结合并抑制植物蛋白磷酸酶(PP2Cs) [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．未激活的pp2c从SnRK2激酶中释放，激活它们，使它们磷酸化并激活ABA响应途径中的下游转录因子和效应因子[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

多种转录因子，如碱性亮氨酸拉链(bZIP);NAM、ATAF和CUC转录因子(NAC);APETUAP2/乙烯反应元件结合蛋白(AP2/ERF)和MYB dna结合结构域蛋白(MYB)参与干旱胁迫响应[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．据报道，MYB转录因子在多种功能中发挥作用，包括代谢、细胞命运和特性、发育过程以及在植物生命周期中对生物和非生物胁迫的响应[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．MYB转录因子家族的成员根据相邻重复次数分为四类(1、2、3或4)[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．据报道gydF4y2BaAtMYB60gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtMYB61gydF4y2Ba以相反的方式调节气孔运动和植物的耐旱性[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2BaMYB96gydF4y2Ba参与侧根发育，通过整合ABA和生长素信号调节干旱反应[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．此外，过度表达gydF4y2BaAtMYB44gydF4y2Ba，gydF4y2BaStMYB1R-1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTaMYB33gydF4y2Ba或gydF4y2BaTaPIMP1gydF4y2Ba通过不同机制提高转基因植物的抗旱性[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．一个重要的发现，一个366 bp的插入包括三个gydF4y2BaMYBgydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba元素gydF4y2Ba表明myb型转录因子在干旱响应中具有重要作用[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．羊草广泛分布于欧亚大陆，对干旱、寒冷、盐碱等环境有很好的适应能力[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．为了探索禾本科植物抗非生物胁迫的机制，在过去的几年里已经进行了一些转录组分析[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，转录组分析发现的几个基因实际上增强了转基因植物的非生物胁迫耐受性[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．虽然MYB转录因子在干旱响应中起着关键作用，但目前还没有关于MYB蛋白在禾草抗旱性中的作用的报道。在之前的一项研究中，我们揭示了15个MYB和MYB相关的转录因子参与干旱胁迫响应[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．一个文本(contg41859)，名为gydF4y2Ba羊草gydF4y2BaMYB dna结合结构域蛋白2 (gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba)主要是由干旱引起的，并被选作进一步分析。转录水平gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba甘露醇、盐、ABA和冷处理对番茄红素含量有增强作用。35S-LcMYB2-GFP亚细胞定位和GAL4-BD-LcMYB2 β-半乳糖苷酶活性分布结果表明，LcMYB2定位于细胞核并激活lacZ的转录。使用抗lcmyb抗体进行染色质免疫沉淀(CHIP)分析表明，LcMYB2可以结合到启动子gydF4y2Ba羊草gydF4y2Ba脱水反应元件结合蛋白2(gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba脱水反应元件结合蛋白2A(gydF4y2BaAtDREB2A)gydF4y2Ba，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba△gydF4y2Ba1-Pyrroline-5-carboxylate synthetas (gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaLate-embryogenesis-abundant蛋白(gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba)．OverexpressinggydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba渗透和ABA处理促进种子萌发和根系生长，300 mmol/L甘露醇处理进一步提高可溶性糖和脯氨酸含量。此外，转基因幼苗在自然干旱胁迫下的表现优于野生型。综合来看，这些结果表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba通过规避和耐受两种策略在禾草对干旱的响应中起着重要作用。本研究为了解禾本科牧草抗旱性的内在特征提供了重要信息，并为利用基因工程技术提高禾本科牧草抗旱性提供了一个重要的候选基因。gydF4y2Ba

LcMYB2gydF4y2Ba表达模式分析gydF4y2Ba

通过对干旱胁迫下禾草的454个高通量测序和表达谱分析，我们发现15个MYB及MYB相关转录因子响应植物组织水分变化[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．Contig41859在干旱胁迫下表达上调，命名为gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba，是一个myb相关的转录因子，功能未知，引起了我们的注意(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba: S1)。gydF4y2Ba

LcMYB2gydF4y2Ba300 mM甘露醇在处理后8小时高度诱导(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，而对盐和冷胁迫的反应相对较慢(24 h，图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bab, c)。然而，ABA处理会迅速上调(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).甘露醇处理下的mRNA积累量最高，高于盐、冷和ABA处理，说明甘露醇处理下的mRNA积累量最高gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba主要作用于对渗透胁迫的反应。此外，表达水平gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在不同器官的正常生长条件下也能检测到。结果表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在根中转录水平最高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).基于这些综合结果，我们预测gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba主要负责根系的渗透胁迫反应，对干旱胁迫下的植物有益。gydF4y2Ba

菌株的分离和序列分析gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba

假定的长篇gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba基于454份高通量数据(SRA065691;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba: S2)。的长度gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba开放阅读框(ORF)，区域为1092 bp，编码363个氨基酸(GenBank: KY316376)。该蛋白的分子质量约为38.4 kDa，其理论等电点(pI)为8.3 (DNAMAN 7.0预测)。的多序列比对gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba通过同源性分析表明，这些序列之间存在一个保守区域(氨基酸101-171;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).序列相似性和系统发育分析表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba与BAK02871 (gydF4y2Ba大麦芽gydF4y2Ba), CDM81700 (gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba)及EMT01615 (gydF4y2Ba山羊草属tauschiigydF4y2Ba)，由高节点支持值(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, c).然而，这些的功能gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba迄今为止，同源性尚未被报道。的分析gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba具有重要的生物学功能gydF4y2Ba羊草gydF4y2Ba以及近亲物种gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba山羊草属tauschiigydF4y2Ba同源染色体。gydF4y2Ba

亚细胞定位及转录活性测定gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba

确定其亚细胞定位gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba的ORFgydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba(不含TGA终止密码子)在CaMV 35S启动子控制下与GFP报告基因融合(图3)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).用浸花法分别将重组CaMV35S::LcMYB2-GFP和CaMV35S::GFP转化为拟南芥。共聚焦显微镜显示，GFP蛋白定位于整个细胞，而LcMYB2-GFP融合蛋白仅存在于细胞核(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)，提示LcMYB2是一个核定位蛋白。gydF4y2Ba

转录激活gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba采用酵母单杂交分析系统进行测试。的gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在P调控下，将ORF插入GAL-BD的3’端gydF4y2Ba_{ADH1gydF4y2Ba}形成BD-gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba融合基因(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).含有BD- lcmyb2或BD- wrky15的酵母菌株AH109(阳性对照)在SD/−His-Trp培养基上正常生长，而含有BD的酵母菌株AH109(阴性对照)则不能生长。在Whatman滤纸上的β-半乳糖苷酶活性测定中，含有BD-LcMYB2或bd - wrky15酵母生长的区域出现了蓝色信号(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad).因此，我们建议gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在细胞核中起转录激活作用。gydF4y2Ba

转基因植物在渗透胁迫、ABA处理和自然干旱处理下的表现gydF4y2Ba

首先，我们探讨了生物功能gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在种子萌发阶段，通过渗透或ABA处理。在正常条件下(Murashige-Skoog培养基，MS)，转基因种子与野生型种子的发芽率、子叶绿化率和根长均无显著差异(图3)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA、d、g、c、f、i;无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA, d, g, h, i;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba: S5)。300 mmol/L甘露醇处理下，两种种子的萌发率(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB、c)，子叶绿化率和根长有极显著差异(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaE, f, h, i;额外的文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba: S5)。在0.25 μmol/L ABA处理下，萌发率(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)，子叶绿化率(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)和根长(p < 0.001)在转基因与野生型种子间存在显著差异，在0.5 μmol/L ABA处理下也得到类似的结果(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bab, c, e, f, g, h, i).综合起来，这些数据表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba能促进渗透胁迫下种子萌发和根系生长，可能通过ABA信号通路。此外，转基因植株在自然干旱胁迫条件下保持绿叶的时间更长，复水后的刷新率高于野生型(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

研究转基因与野生型的生理反应gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba在渗透胁迫下，用300 mmol/L甘露醇灌溉4周龄幼苗。2 d后测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、可溶性糖和脯氨酸含量。结果表明，两种转基因株系均过表达gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2BaSOD (p < 0.01)、可溶性糖(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05/0.01)和脯氨酸(p < 0.001)比野生型在300 mmol/L甘露醇处理下，MDA含量较低(图3)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa, b, c, d)。转基因株系中脯氨酸和可溶性糖的大量积累可能为干旱胁迫下的细胞提供额外的保护。MDA含量越低，SOD含量越高，转基因植株细胞损伤越小。这些结果共同表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba促进渗透压抗性。基因表达水平gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba300 mmol/L甘露醇处理后第9h，采用实时荧光定量PCR (Quantitative Real Time PCR, qPCR)检测。转基因植株中这些基因的表达量均高于野生型植株，对照组(CK)和处理组(M9;无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

芯片分析gydF4y2Ba

MYB蛋白可以识别A/TAACCA和C/TAACG/TG两个基序[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．因此，我们分析了gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba利用预测转录起始位点(TSSs)上游1500 ~ 2000 bp的序列，在假定的启动子区域发现了几个可能的motif(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba: S3)。我们通过CHIP实验进一步证实了我们的预测，以LICHIP、L2CHIP或LcCHIP蛋白释放的dna为模板，在qPCR和通用PCR反应中检测到信号。这些结果表明，LcMYB2(或与其相互作用蛋白)调控gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

MYB和MYB相关转录因子在植物中是一个大家族，参与许多生物学过程，如次生代谢和对环境因子的响应[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．对这些基因功能的分离和鉴定提供了一种在转录水平了解植物特异性事件的方法。AtMYB2是myb相关蛋白，可被干旱和ABA诱导;而BcMYB1会迅速强烈地受到干旱的诱导，而外源ABA只会轻微地诱导，这表明MYB蛋白会通过ABA依赖和ABA不依赖的途径来响应环境变化[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba外源甘露醇处理后8小时和外源ABA处理后1小时，其诱导量达到最大。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, d). However, the extent ofgydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba甘露醇的诱导作用大于ABA，表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba主要作用于aba独立的通路。gydF4y2Ba

当面临干旱胁迫时，植物通常会采取回避或抵抗的策略来缓解胁迫的负面影响。深根是回避策略之一。例如，在浅根水稻品种中引入deep roots 1 (DRO1)基因，可以促进根系向下生长，得到的转基因株系在干旱条件下产量更高[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．我们的研究结果表明gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba甘露醇诱导，在渗透胁迫和ABA处理下，促进萌发期和幼苗生长过程中的根系伸长(图3)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．因此,gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba具有增强植物根系生长，避免干旱胁迫的潜力。gydF4y2Ba

渗透调节通常被认为是植物抵抗干旱或盐胁迫的主要机制之一。脯氨酸、可溶性糖和LEA蛋白等相容渗透性物质经常被作为评价植物对非生物胁迫耐受性的重要生理标准。脯氨酸的生物合成是由P5CS1/2和P5CR催化的，它被认为在渗透胁迫下保护亚细胞结构和大分子[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．矮牵牛overexpressinggydF4y2BaAtP5CSgydF4y2Ba或gydF4y2BaOsP5CSgydF4y2Ba积累较多的脯氨酸，似乎具有抗旱性[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．此外，可溶性糖，尤其是蔗糖或海藻糖，与脱水耐受性的获得相关，被认为在干燥环境中稳定膜结构[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．首先在棉花中发现的LEA蛋白，被证明在许多物种的干旱胁迫下上调，并作为兼容的溶质，在严重脱水条件下维持细胞结构[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．过表达部分LEA蛋白编码基因可增强转基因植物的耐旱性[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．在这里，我们发现gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba通过渗透胁迫诱导羊草(300mm甘露醇);而且gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaoverexpressinggydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba可溶性糖和游离脯氨酸积累较多，表达量较高gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba比野生型gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba甘露醇处理的幼苗(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在羊草中，干旱胁迫显著诱导了多个LEA蛋白编码基因和2个p5cs编码基因的表达。在这里，我们证明了LcMYB2可以结合到启动子区域gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa, b, e, f).因此我们建议gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba通过提高渗透保护剂的含量对羊草的作用。gydF4y2Ba

DREB蛋白已被广泛研究，并已被证明可以提高转基因植物的耐旱性。gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtDREB2BgydF4y2Ba在根和茎中是否受到脱水胁迫的强烈诱导gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba具有显著的抗旱能力[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．此外,gydF4y2BaOsDREB2BgydF4y2Ba是由各种压力和过度表达引起的吗gydF4y2BaOsDREB2BgydF4y2Ba在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba或者大米增加表达gydF4y2BaDREB2AgydF4y2Ba目的基因和提高转基因植物抗旱性[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．已有研究提出DREB蛋白如DREB1和DREB2通过aba独立途径与DRE/CTR元件结合，调控低温和干旱响应基因[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在羊草中，最高转录水平为gydF4y2BaLcDREB2agydF4y2Ba20% PEG6000处理后12小时发生[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),而gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba300mm甘露醇处理8 h时，转录本积累量达到最高点(图3)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).表达谱序列分析显示两个contig62249 (gydF4y2BaLcDREB2CgydF4y2Ba/gydF4y2BaLcDREB2BgydF4y2Ba/gydF4y2BaLcDREB2AgydF4y2Ba)和contig41859 (gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba)被干旱胁迫上调，复水后恢复到基础水平;但在干旱胁迫下，contig41859的折叠变化大于contig62249gydF4y2Ba1gydF4y2Ba: S1)。这些结果表明LcMYB2可能是一种转录调控因子gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba．因此，我们克隆了gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba(预测转录起始位点上游~ 1500bp，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba: S2)，并使用CHIP分析LcMYB2蛋白与该启动子区域的结合。通用PCR和qPCR富集CHIP DNA发现LcMYB2可以结合两者的启动子区域gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac, d, g, h)。因此，我们提出LcMYB2通过激活来提高抗旱性gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba在sheepgrass。我们还发现gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba能绑定到羊草的推广人吗gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba和拟南芥gydF4y2BaAtDREB2AgydF4y2Ba可能它们的启动子中都含有MYB结合元件，这表明植物对胁迫的反应机制是保守的。另外，与干旱胁迫下羊草转录组数据差异表达基因DEGs进行pearson相关性分析[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba为了对LcMYB2在干旱胁迫下的作用机制有新的认识，pearson相关分析结果显示，干旱胁迫下禾草中LcMYB2的表达水平与LcLEA、LcDREB2c、LcMYB39、过氧化物酶56等典型胁迫响应基因的表达完全正相关(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2BaS6)，为LcMYB2在干旱胁迫下的功能分析提供了依据。羊草中LcMYB2与LcLEA、LcDREB2c、LcMYB39表达水平的pearson相关分析结果与LcMYB2与AtLEA14、AtP5CS1、AtDREB2A、LcDREB2相应启动子元件结合的CHIP-PCR结果相互关联。本研究整合了RNA-seq进一步分析、CHIP-PCR和通用PCR结果，为了解LcMYB2在干旱胁迫下的功能提供了依据。gydF4y2Ba

随着羊草产业的发展(人工栽培、天然草地改良、人工草地建立)，缺水地区羊草种子萌发和育苗建立阶段的抗旱性是繁殖的关键，是获得经济效益和生态效益的必要条件。因此,gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba是通过基因工程提高植物抗旱性的重要候选。gydF4y2Ba

总之，我们表明，一个干旱和渗透诱导转录因子LcMYB2，通过结合启动子的元素，提高植物的干旱和渗透耐受性gydF4y2BaAtDREB2gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtLEA14gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtP5CS1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLcDREB2gydF4y2Ba调控干旱应答基因的转录以增加渗透保护剂的积累(图1)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．这些可能是羊草耐受干旱环境的原因之一。单子叶植物和双子叶植物的逆境响应基因的顺式元件在进化过程中是保守的，它们都可以被相同的反式因子结合。gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

试验选用中国科学院北京植物研究所国家认证品种中科1号羊草。羊草幼苗在含有营养土壤(丹麦Pindstrup Bubstrate，丹麦)和蛭石(2:1,v/v)的塑料花盆中生长，在27/23°C的温室中，16 h光照/8 h黑暗，培养8周后进行处理。采用100 μmol/L培养液进行ABA处理，300 mmol/L甘露醇进行渗透胁迫，400 mmol/L NaCl进行盐胁迫。将幼苗移入4°C的生长室进行冷胁迫。幼苗在胁迫处理后0、1、3、8、12或24 h采样，立即用液氮冷冻，并保存在−80°C，用于RNA分离。采用不同的人至少进行三次非生物胁迫实验，以检测目的基因的表达模式。同时采集2岁羊草幼苗的茎、叶、根、芽、穗和根状茎进行组织特异性分析。gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba（gydF4y2Ba答:芥;gydF4y2Ba用10% NaClO表面消毒10 min后，用无菌水冲洗5次。无菌种子置于pH 5.8的MS固体培养基上萌发。gydF4y2Ba

RNA的分离及表达谱分析gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba

按照说明书使用Trizol试剂(TaKaRa，中国大连)提取总RNA。使用PrimeScript™RT试剂Kit (TaKaRa，大连，中国)按照制造商的说明书合成第一链cDNA。根据SYBR PremixExTaq™协议(TaKaRa，中国，大连)，在LightCycler480实时PCR系统(Roche, Rotkreuz，瑞士)上进行三份qRT-PCR，程序如下:95°C 5 s, 68°C 30 s, 45个循环。组织的表达gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba采用半定量PCR检测。本研究中使用的所有引物都列在附加文件中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba: S4。gydF4y2Ba

扩增和序列分析gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba

第1链cDNA扩增的5 '和3 '端gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba使用SMARTer™RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA)按照说明书合成。根据454高通量测序结果设计基因特异性引物(GSP-5'RACE)，并使用通用引物(UPM)对其5 '端进行扩增gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba．的假定的全长序列gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba利用根据5’-RACE和454测序结果组装的序列设计的基因特异性引物(LcMYB2-F/R)进行扩增。在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索了gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba使用BLASTX程序。选取的氨基酸序列在DNAMAN软件(7.0版)中进行多序列比对。MEGA软件6.0版本基于JTT矩阵模型，采用最大似然法推断同源物之间的系统发育关系[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

LcMYB2的亚细胞定位及转录活性测定gydF4y2Ba

的子gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba与pCAMBIA1302结合形成gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba绿色荧光蛋白融合蛋白。将重组质粒导入gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaEHA105采用冻融法，进一步转化为gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba使用花浸法[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．在含50 μg/L潮霉素(Roche)的固体MS上筛选阳性苗木，用PCR方法鉴定。将转基因植株的T3种子在MS上萌发，在激光共聚焦扫描显微镜(徕卡TCS SP5)下观察根部的GFP荧光。评估gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba将该ORF插入pBridge载体GAL-BD下游，获得pBD-LcMYB2。将重组载体导入酵母菌株AH109中，在SD(−Trp)培养基上筛选阳性转化子，PCR验证。β-半乳糖苷酶活性测定按照酵母规程手册(Clontech)。gydF4y2Ba

拟南芥转化gydF4y2Ba

揭示其生物学功能gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba，在CaMV 35S启动子控制下，将ORF融合到载体p3301-121(由载体pCAMBIA3301和pBI121修饰而成，由Shen实验室捐赠)。重组结构被转化为gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaEHA105使用花浸法。在添加20 μg/L谷膦酸铵的MS培养基上筛选转基因拟南芥阳性种子，用提取的DNA进行PCR验证。用T3种子在不同处理下进行萌发试验。gydF4y2Ba

转基因幼苗抗旱性分析gydF4y2Ba

揭示…的功能gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在萌发期，转基因和野生型T3种子gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba分别种植在正常MS固体培养基和添加甘露醇(300 m mol/L)或ABA (0.25 μmol/L和0.5 μmol/L)的MS固体培养基上。培养皿置于22°C的生长室中，光/暗周期为16 h / 8 h。对植株拍照，测定其发芽率、子叶绿化率和根长。渗透胁迫和ABA胁迫耐受实验至少重复3次。gydF4y2Ba

测试的作用gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba在干旱条件下，苗期4 d的幼苗移栽到含蛭石和草皮土(2:1,v/v)的花盆中，在22°C的生长室中以16 h / 8 h、光/暗周期、充足水分生长1周，之后开始无水自然干旱胁迫42 d。干旱过程中，每盆每天监测土壤含水量，第42天再次灌水，3天后统计成活率。每个株系(WT, L1, L2)分别有60株幼苗进行干旱胁迫实验。gydF4y2Ba

脂质过氧化及脯氨酸和可溶性糖含量的测定gydF4y2Ba

四周大的转基因和WTgydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba用300 mmol/L甘露醇灌苗。分别于处理后0 h和9 h取叶片进行基因表达分析。2天后，分别收获转基因和野生品系叶片进行生理测量。mda水平由Kramer等人所描述的一种修订方法测定[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．如前所述，使用硝基蓝四氮唑(NBT)还原法测定SOD含量[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．脯氨酸和可溶性糖的含量是根据Shan等人之前描述的方案确定的[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]及Bailey [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba),分别。每次试验进行3次重复，并以标准误差(SE)表示变异。gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀反应化验gydF4y2Ba

用300 mmol/L甘露醇处理4周龄羊草幼苗8 h和24 h，诱导其表达gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba之后，采集样本。六个幼苗的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaoverexpressinggydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba(L1:线路1,L2:线路2)进行测试。所有样品用甲醛固定进行CHIP分析。抗体gydF4y2BaLcMYB2gydF4y2Ba由北京蛋白创新有限公司研制。使用EpiQuik Plant ChIP试剂盒(Epigentek, Brooklyn, NY)进行ChIP分析。CHIP DNA采用通用PCR(40个周期，95°C, 30 S;68°C, 30 S)和qPCR(95°C, 5 S, 45次循环;68°c, 30 s)。采用Ct值比较的方法分析qPCR CHIP效率。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

样本间差异比较采用方差分析(ANOVA)和t检验。* * *表示gydF4y2BapgydF4y2Ba-values < 0.001， **为p-value < 0.01)， *为p-value < 0.05。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

AP2 /小块土地:gydF4y2Ba

APETUAP2 / Ethylene-Responsive-Element结合蛋白gydF4y2Ba

bZIP:gydF4y2Ba

基本亮氨酸拉链gydF4y2Ba

芯片:gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀反应gydF4y2Ba

含有DREB:gydF4y2Ba

脱水反应元件结合蛋白gydF4y2Ba

LcMYB2:gydF4y2Ba

羊草gydF4y2BaMYB dna结合域蛋白2gydF4y2Ba

李:gydF4y2Ba

Late-embryogenesis-abundant蛋白质gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige-Skoog介质gydF4y2Ba

MYB:gydF4y2Ba

MYB dna结合域蛋白2gydF4y2Ba

南京:gydF4y2Ba

NAM, ATAF和CUC转录因子gydF4y2Ba

NCBI:gydF4y2Ba

国家生物技术信息中心gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框;gydF4y2Ba

P5CS1:gydF4y2Ba

△gydF4y2Ba1-Pyrroline-5-carboxylate synthetasgydF4y2Ba

PP2Cs:gydF4y2Ba

植物蛋白磷酸酶gydF4y2Ba

qPCR:gydF4y2Ba

实时荧光定量PCRgydF4y2Ba

RACE-PCR:gydF4y2Ba

cDNA ends的快速扩增gydF4y2Ba

感谢董小兵博士在资料收集和管理方面的贡献。gydF4y2Ba

国家基础研究计划项目(“973”计划，2014CB138704)、中国科学院科技服务网络计划项目(STS, kfj - ewsts -119)、中国科学院库伦旗科技扶贫项目、内蒙古自治区科技重大专项资助。资助人没有参与研究的设计和数据的收集、分析、解读，也没有参与手稿的撰写，只是提供资金支持。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 赵平仓、侯盛林和郭秀芳对这项工作都有同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国科学院植物研究所植物资源重点实验室，北京gydF4y2Ba

   赵平仓，侯胜林，郭秀芳，贾俊廷，杨伟光，刘珠江，陈双燕，李晓霞，戚冬梅，刘功社，程励勤gydF4y2Ba

2. 河北经贸大学管理科学与工程学院，中国石家庄gydF4y2Ba

   Pincang赵gydF4y2Ba

3. 河北省农林科学院谷子作物研究所，河北石家庄gydF4y2Ba

   Shenglin侯gydF4y2Ba

4. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔gydF4y2Ba

   Weiguang杨gydF4y2Ba

5. 广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州gydF4y2Ba

   Junting贾gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

GL和LC构思和设计了实验。SH完成了大部分实验。PZ, XG和LC对数据分析和稿件撰写做出了实质性的贡献。GL对手稿进行了最终审定。实验由JJ、WY、ZL、SC、XL、DQ参与;所有作者阅读并批准最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaGongshe刘gydF4y2Ba或gydF4y2BaLiqin程gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理认可和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》对出版的地图和机构附属关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许不受限制地在任何媒体上使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供创作共用许可的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域转让豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba