梨基因组中多半乳糖醛酸酶基因家族的全基因组分析及参与梨软化的成员鉴定

背景

聚半乳糖醛酸酶(PG)作为一种参与果胶降解的重要水解酶，在果实软化过程中起着重要作用。然而,信息PG梨基因组的基因家族和参与水果软化的特定成员仍然是基本的。

结果

在本研究中，共有61个PG从梨基因组中鉴定出的基因可分为6个亚类，染色体位置、基因结构、基序和基因序列均不同独联体表演元素。大多数PBRPGS.来源于WGD/节段复制区块，纯化选择是其扩展的主要动力。的表达式概况PBRPGS.梨的发育受组织/发育阶段/品种的影响。在‘后穗’梨贮藏过程中，硬度的降低与PG活性的积累有关。完全,28岁PBRPGS.在果实储存期间表达，可以根据不同的表达模式分为五类;最符合趋势的增加。其中,PbrPG6结合硬度、PG活性和PBRPGS.．通过构建沉默载体，观察到更高的坚固性PbrPG6-沉默的水果与控制(空矢量)。在进一步的研究中，我们发现PbrPG6由Postharvest 1-MCP / Ethrel治疗管制，以及几个pberfs.可能在这个过程中起作用。

结论

我们确定了61.PbrPG梨基因组的基因;其中,PbrPG6参与水果软化过程;此外，表达PbrPG6可能是pberf的控制。本研究为未来的作品提供了旨在阐明梨软化的分子机制的基础。

园艺水果的成熟和衰老是一个非常复杂的过程，伴随着颜色、质地和味道的变化[1]．贮藏过程中硬度的降低是最明显的现象之一，它提高了果实对机械损伤的敏感性，从而缩短了果实的货架期[2]．水果软化主要是由于细胞壁结构和组成中的交替，包括纤维素，半纤维素和果胶[3.]．果胶是初生细胞壁的主要成分，在细胞结构完整和细胞粘附中起着至关重要的作用[4]．

属于最大的水解酶家族，多糖尿嘧啶酶（PG），已知半年前，已知参与植物发育的各种过程，如花发育，果实成熟和衰老和器官脱落[5，6，7]．PG在果胶的分解过程中起着重要的作用，根据不同的催化过程可分为三种类型，包括内- pgs、外- pgs和rhamno-PGs [6]．直到最近,PG家族基因已经从各种植物中鉴定出来，例如拟南芥，栽培稻，芸苔属植物拉伯，杨树，黄瓜，西瓜，西红柿，芒果，苹果和桃子[6，7，8]．十一个成员杨树被认为与花的发育有关，而有两个与盐胁迫下的叶片脱落有关[9]．54香格里拉从番茄果实中鉴定的分支A和分支B的成员参与了果实和剥离带的发育，而分支C、D和分支F的成员参与了开花发育[7]．三个PpPGs据说参与了桃子的软化过程[8]．这些结果表明，植物之间存在广泛的功能分化PG基因。

乙烯在更年期果实的成熟衰老过程中起着重要的作用[10]．乙烯受体的突变，Never-ripe（Nr)，抑制番茄果实成熟过程;此外，37%的基因在转基因果实中表达发生改变，导致不同的种子数量、抗坏血酸和类胡萝卜素丰度[11]．乙烯响应因子(ERFs)作为乙烯信号通路中的最终响应基因，通过与多个成熟相关基因的启动子结合，触发乙烯响应，调控果实成熟果胶methylesterase（中外职业)，1-aminocyclopropane-1-carboxylic酸氧化酶（ACO.),PG［10，12，13]．电泳迁移率移位测定（EMSA）证明了特定的结合cperf9.致……的发起人CPPG5.和CpPME1/2在木瓜中，通过GCC-box图案[13]．大多数erf会激活成熟相关基因的转录，而有些则显示出相反的影响[10]．

梨，作为一种呼吸性的更年期水果，因其多汁、美味的味道而受欢迎[14，15]．在水果贮藏过程中，与风味因子组成变化相关的是硬度的降低[14，16，17，18，而PG可能在[19]．不过，我们对梨的认识PG基因家族和参与水果软化的特定成员仍然是基本的。在这项研究中，鉴定了PG对梨基因组中的基因进行了染色体定位、基因结构和基序组成分析独联体表演元素。测定了它们在不同组织及果实发育/贮藏过程中的表达谱。结合硬度、PG活性和硬度之间的系统发育和相关性分析结果PBRPGS.通过构建瞬时沉默载体，对梨果实软化过程中发挥重要作用的转录本成员进行了识别和功能验证。此外，候选erf可能参与了调控密钥的表达PG总结了基因。

鉴定和系统发育分析PBRPGS.

完全61PG从梨基因组鉴定基因，被命名为pbrpg1 - 61基于他们的染色体位置(附加文件2:表S1)。其中，43个基因含有保守的域I，II，III和IV;PbrPG18和52.缺少领域I;14个成员国不拥有第三领域;PbrPG2和3.缺少域IV;PBRPG8.缺少域名II和III(附加文件1:图S1和附加文件2:表S1)。共有80个ESTs被识别PBRPGS.以最大的数量PBRPG7.，46，57.,58.(附加文件2:表S2)。

参照生物分类动力桃子和拟南芥，PBRPGS.可以分为6个子类(子类A到子类F)，分别包括8个(A)、6个(B)、7个(C)、20个(D)、12个(E)和8个(F)成员。1一个)。子类G由三个组成PG基因拟南芥，不包括任何来自梨和桃子的成员(图。1a)。此外,PbrPG48，55.，31，56.，23，20.，21，22，24和PBRPG9.，34，28，52.D亚纲中有两个特殊的亚群，没有来自其他种的成员。1一个)。

长度、分子量、等电点(π）PBRPGs的消光系数，不稳定性指数，脂族指数，脂族指数和宏观平均值（肉汁）的范围在234-753氨基酸的范围内，24.74-82.23kDa，4.61-9.70,10,345-88,975,23.39-61.89,28.53-97.47，分别为0.366-0.109（附加文件2:表S1)。不稳定性指数用于确定蛋白质在试管中是否稳定(≤40，可能稳定;> 40，可能不稳定)[15]．因此，预测大多数PBRPGS是稳定的（附加文件2:表S1)。大多数PBRPG的肉汁值低于零，表明它们是亲水的（附加文件2:表S1)。SignalP 4.1分析显示PbrPG1-3、5-7、12-16、18、20-27、29、33-40、42、43、45、47、49-51、53-58含有信号肽(附加文件)2:表S1)。

基因和蛋白质特征PBRPGS.

如图1所示。1B，内含子的数量PBRPGS.范围:1 (0)~ 11 (10);A、B和F亚类的成员通常比其他亚类拥有更多的外显子/内含子;此外，同一亚类的外显子/内含子结构相对保守。平均内含子/外显子数PBRPGS.比整个基因组高/大;和GC3的平均百分比PBRPGS.低于整个基因组中的平均水平（附加文件2:表S3)。

一百零五年独联体的启动子中确定了作用元素PbrPGs,可分为八个类别(附加文件2表S4)，包括保守启动子基序(n = 2), light responsive elements (n= 26)，植物激素反应元件(n= 12)，防御/非生物应激反应要素(n= 5)，组织/细胞器特定成分(n = 7), pathogen/elicitor/wound responsive elements (n= 1)、杂项元素(n= 10)和未知函数的元素(n= 42) (15]．他们的分发PBRPGS.是不同的(附加文件2:表S4)。对相近同源基因上游区域的比较分析显示，复制基因的启动子存在差异(附加文件)1:图S2)。

在PBRPGS中发现八个图案，具有不同的分布（附加文件2(表S5): 96.7%的成员中包含motif 1和3，而一些motif只存在于特定的亚类中(例如，亚类E不包含motif 2、4和8)。

染色体定位、基因复制及Ka/Ks分析

大多数PBRPGS.分布在16条染色体上，分布不均匀(图。2a). 26个基因来自WGD/节段复制;分别有22名和12名成员被分配到离散复制区和串联复制区;另一方面，只有1.64%的数据来源于近端复制(附加文件2:表S6)。所有的visual studio。-基于与PGDD相似的方法，对整个梨基因组进行所有局部BLASTP，以识别同位块。在含有PBRPGS.．取PbrPG1＆PbrPG35，在含有这些基因的区域中观察到高度保守的共同(图。2b）。

如附加文件所示2表S7, 7对重复基因的Ks值相似(0.159-0.237)，提示它们可能来源于最近的WGD/节段重复(30-45 MYA);11对基因的Ks值较小(0-0.141)，提示它们可能来自最近的WGD/节段复制;PbrPG5＆PbrPG42（ks〜2.000）可能来自γ三倍（〜140 mya）[20.]．此外，15个旁向基因对的Ka / ks比例小于1，暗示纯化选择是主要驱动力PBRPGS.［15]．

表达概况PBRPGS.在梨的不同组织和果实发育过程中

的表达式概况PBRPGS.在“雅利”梨的不同组织中是截然不同的，在耻辱和花瓣中最低的总丰度最高。34,24,26,25,32和23基因分别以耻辱，芽，卵巢，叶，花瓣和15个Dafb果实表达;和丰富的PbrPG61果实、花瓣、叶片和子房中mrna含量最高PbrPG4和PbrPG35在茎部和柱头中表达量最高。3.一个)。

21PBRPGS.在‘后穗’果实发育过程中转录，具有多种表达模式:PbrPG6，35和42mrna在果实成熟过程中呈增加趋势PbrPG37和38减少;的表达PbrPG4，33和46在增加之前在早期阶段进行了下调，而观察到相反的现象PbrPG2，13，17，37，47，49，55.和61.；另一方面，其他成员的记录丰度波动(图。3.b) (21]．而且，表达概况PBRPGS.在水果发育过程中依赖品种（附加文件1:图S3) [21]．

的识别PBRPGS.参与梨的软化

在‘后穗’梨贮藏期间，贮藏期为3个月^＊果皮硬度下降，这与乙烯的释放速率和呼吸速率的变化有关，从第0 d到第18 d，乙烯的释放速率和呼吸速率均呈先增加后降低的趋势1:图S4和表1）.对于PG活性，它在整个储存过程中累积，增量为52％（图。4一个)。

61个中有28个PBRPGS.在“Housui”梨的采后储存期间表达;并且可以在每个阶段检测14个成员的转录物（图。4b).根据不同的表达模式，可分为5组:第1组基因的mRNA丰度，包括PbrPG6，10，14， 26，31，3539，43和47岁的在整个储存过程中表现出增加的趋势;的表达PbrPG3，4，17和30.第二组下调;第三组成员的转录，如PbrPG2，46，49和51.，在递增之前在早期阶段受到抑制;基因的表达模式（PbrPG1，33，37，48，52.现年53岁的54.）IV群与III组相反;另一方面，在储存期间V族V组中其他成员的表达。RT-QPCR分析验证了关于表达式模式的转录组数据的准确性PBRPGS.（图。4b和附加文件1:图S5a)。

相关分析PBRPGS.对mrna、PG活性和硬度进行检测，总结出与PG活性和硬度相关系数高的基因(> 70%)，包括PbrPG4，6，17，26，46和61.（图。4c)。其中,PbrPG4，6，17，46和61.是集群的PpPG15, 21和22（图。1A)，它们被认为参与了桃果的软化过程[8];与此同时,PbrPG6和26演示了类似的模式PpPG15, 21和22在存储(无花果。4b和(8])。这些结果表明PbrPG6可能在水果软化过程中发挥关键作用。

为了验证其功能，然后我们构建了梨果瞬态转化的沉默矢量。如图1所示。5，观察到具有较低水平的转基因果皮的皮质更高的坚定性PbrPG6mrna和PG活性，与对照组相比。

候选人pberfs.调节PbrPG6

如图1所示。4C，观察到阳性相关性PbrPG6mrna和乙烯的进化。此外，还有相反的影响PbrPG6在1-MCP和Ethrel治疗梨果的含量后观察到表达，PG活性和皮质固体：1-MCP熏蒸抑制PbrPG6mrna和PG活性，与对照组相比，导致更高的皮质硬度;另一方面，PbrPG6乙烯利处理后的果实表达和PG活性升高，皮层硬度低于对照(图2)。6）.在2017年在单位进行的先前研究中观察到类似的结果（附加文件1:图S6)。此外，果实的表达上调PBRACO1，可增强乙烯的演化[15，表现出较高的丰度PbrPG6MRNA以及较低的坚定（附加文件1：图S7）。此外，PbrPG6在翻译起始网站上的2000 BP中包含GCC-Box（https://www.dna.affrc.go.jp/place/）（附加文件2:表S8) [22］．这些结果表明PbrPG6可能受乙烯调控，PbrERF可能参与了这一过程。

根据之前的报告小块土地梨基因组中的家族基因[23以及转录组分析，155个样本中有100个pberfs.均表达于‘后穗’梨贮藏期间，且表达模式多样(图2)。7a). RT-qPCR分析验证了转录组数据对表达模式的准确性pberfs.(附加文件1:图S5b)。相关分析发现，33个成员的相关系数较高(> 70%)PbrPG6。其中,Pbr1ERF5/6，Pbr3ERF21，PBR4ERF24，PBR5ERF28，PBR12ERF100.，PBR13ERF110，Pbr15ERF126/129/136,Pbr17ERF148与呈态度相关PbrPG6；另一方面，观察到负面关系PbrPG6和其他pberfs.（Pbr1ERF1/2，Pbr3ERF15/19/20，PBR4ERF26，Pbr5ERF38/39，Pbr6ERF40/45/48/51.，PBR8ERF67.，Pbr9ERF74/76.，Pbr10ERF80/84.，Pbr11ERF86/90.，PBR13ERF106/107,PBR15ERF138)(图。7b）。

此外，30个成员用乙烯示出了高相关系数（> 70％）（图。7b)。其中,Pbr2ERF13，Pbr3ERF17，PBR5ERF28，Pbr7ERF61，Pbr9ERF72/73.，Pbr10ERF78/85.，Pbr11ERF87，PBR12ERF95- - - - - -97.，PBR13ERF110，PBR14ERF119.，Pbr15ERF133- - - - - -136，Pbr16ERF144/146,Pbr17ERF148与乙烯呈正相关．另一方面，在乙烯和其他之间观察到负性关系pberfs.,包括PBR1ERF8，PBR5ERF30/31，Pbr6ERF51，Pbr10ERF77，Pbr13ERF105/107，Pbr15ERF124/125．

梨以中国为主要产地，分布六大洲，以其独特的风味品质深受消费者喜爱[14，16]．在‘后穗’梨贮藏期间，贮藏期为3个月^＊Pericarp的值，减肥和衰减率累积，而皮质固件减少（表1）.鸭梨和黄花梨在贮藏过程中也出现了类似现象[14，19]．

果实软化，主要是由于细胞壁结构和组成的变化[3.，可以提高梨果对机械损伤的敏感性，从而缩短梨果的货架期[2]．细胞壁由复杂的多糖组成，包括果胶、纤维素和半纤维素[3.]．许多酶，包括PG、果胶酯酶(PE)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、纤维素酶和木葡聚糖内转糖基酶(XET)，被认为参与了这些成分的代谢[7，24]．

果胶是初生细胞壁和中层板层的一种结构多糖，在细胞间粘附中起重要作用[7]．PG是其降解的关键酶，通过α-(1→4)糖苷键的裂解[7，25]．直到最近,PG家族基因已经从许多植物中鉴定出来[6，8，9，26]．除果实软化外，PG还在植物的许多发育过程中发挥作用，如花的发育或脱落带的发育[7]．黄花梨贮藏期间，硬度与PG活性呈相反趋势[19]．在果实贮藏过程中也观察到类似的现象。4a和附加文件2:表S1)。然而，我们的知识就PG梨基因组中的基因家族及其在果实软化中的作用尚不成熟。

总计61PBRPGS.从染色体分布不均匀的梨基因组中鉴定，可分为6组(A-F)。1一个)。在其他植物中观察到类似的结果[6，7，8]．与之前关于桃中PbrPGs的报告一致，大多数PbrPGs包含4个保守结构域[8:结构域I和II可能构成催化位点;结构域III参与催化反应;另一方面，结构域IV很可能是底物中羧酸基团与离子相互作用的候选区域[27]．

基因的结构和基序的组成独联体-作用因素明显不同PBRPGS./ PbrPGs;同一类群的成员具有相似的基因结构和成分(图)。1b).在梨的其他基因家族中也观察到类似的结果[15，20.]．与Wu等人的结果一致[28),最PBRPGS.被分配到WGD/节段复制中，纯化选择是它们进化的主要驱动力(附加文件2:表S7)。通过WGD产生的多倍体通常与基因组重排有关，基因的进化被认为是由多种因素驱动的，包括结构复杂性、保守域和进化速率[15]．在我们的研究中，PbrPGs具有四个高度保守的域(附加文件1：图S1），并展示了较低的KA / KS比率（附加文件2表S7)，表明近年来它们的功能相对稳定，可以作为选择剂量平衡的良好靶点[20.]．此外，梨中的表达谱是组织/发育阶段/品种特异性（图。3.& S3)，这与报告相似香格里拉家庭基因[6]．

28PBRPGS.根据其表达模式可分为5组(图5)。4b).同样，45分中的16分PpPG从桃子基因组中鉴定的基因在成熟过程中转录，具有不同的表达曲线[8];其中,PpPG15, 21和22可能在水果软化中发挥关键作用[8]．结合相关性和系统发育分析的结果，PbrPG6可能在梨果实的软化过程中起关键作用。1一个&4c)的沉默PbrPG6与对照相比，PG的表达抑制了PG的活性，并保持了果实的硬度。5）.之前，Quesada等人[29发现了草莓的反义FaPG1基因抑制了成熟果实的软化过程，这可能是由于减少了果胶的溶解和增加了果胶共价结合在细胞壁上的量。下调也观察到类似的现象PG1在' Royal Gala '中的表达apple [30.]．这些结果暗示了更高的坚固性PbrPG6 -与对照相比，沉默的果实可能是由于更多的果胶以共价结合在细胞壁上。

梨是一种更年期水果，其特征是在成熟开始时呼吸速率增加，这与乙烯的积累有关(Trinchero et al.， 2004)。与此相一致的是，果实贮藏第18 d乙烯的演化和呼吸速率均达到最高水平1:图S4)。乙烯在果实成熟期品质变化中起着关键作用[31]．乙烯受体的突变，Never-ripe（NR），抑制果实的成熟过程和质量形成[11]．在本研究中PbrPG6MRNA和梨储存过程中的乙烯演化相似（图。4B＆附加文件1：图S4a）;同时，1-MCP和Ethrel治疗的影响PbrPG6mrna、PG活性和皮层硬度相反(图。6）.这些结果表明PbrPG6可能是乙烯的控制。

作为乙烯信号通路中的最终反应基因，ERF可以与几种基因的启动子结合，例如ACO.，PME，和PG，调节乙烯形成和质量交替[12，13];同时，ERF对成熟的影响是多元化的[10]．基于生物信息分析，ERF可以与[12的启动子中观察到PbrPG6(附加文件2表S8)，提示PbrERF可能调控PbrPG6。在'Housui'梨储存期间，100pberfs.，表达模式多样(图。7一个);其中33个成员与之相关系数较高(> 70%)PbrPG6（图。7b)．

六十一年PBRPGS.通过对梨基因组的染色体定位、基因结构、基序和结构特征的分析，将其划分为6个类群(A-F)独联体表演元素。大部分基因来源于WGD/节段复制，以纯化选择为主要驱动力。它们在梨中的表达表现为组织/发育阶段/品种特异性。在‘后穗’梨贮藏过程中，与品质(如颜色、失重、腐烂率、硬度)的变化以及PG活性的积累相关PbrPG基因被转录，根据表达模式的不同可分为五类。其中,PbrPG6在生物信息分析和实验验证结合的果实软化中发挥了重要作用。进一步的研究发现，其表达可能由乙烯调节;和几个pberfs.可能参与了这个过程。

梨色素蛋白的序列再审与注释

桃树和拟南芥基因组从蔷薇科基因组数据库(GDR) (http://www.rosaceae.org/)[32)和拟南芥资讯资源(TAIR) (http://www.arabidopsis.org/)[33](附加文件2:表S9)。这些序列用作查询，对梨基因组数据库执行BLASTP (http://peargenome.njau.edu.cn/)[28]．随后，从PFAM数据库访问的PG域（PF00295）的种子对齐文件（http://pfam.sanger.ac.uk/）使用HMMER3在HMM搜索之前在嗯搜索之前构建HMM文件。20.]．然后将所有候选人提交给PFAM或SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）database to verify the presence of conserved domains, and the candidates lacking more than two highly conserved PG domains (domains I (‘SPNTDGI’), II (‘GDDC’), III (‘CGPGHGISIGSLG’), and IV (‘RIK’)) were eliminated [8]．

对梨EST文库进行本地BLASTN分析，找出最大同源性> 95%、长度> 200 bp、e值< 10的候选基因⁻²⁰［20.]．

利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)[15]．信号肽和每个成员的亚细胞定位通过SignalP 4.1 (http:/)进行分析www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)[34]和CELLO v2.5服务器(http://cello.life.nctu.edu.tw/)[35),分别。

系统发育，基因结构，基序和独联体表演元素分析

系统由Mega 7.0.26软件构建，使用邻近（NJ）方法，具有1000重复的引导分析和泊松模型[36]．基因的结构PBRPGS.通过基因结构显示服务器2.0 (GSDS 2.0)程序将开放阅读框(ORFs)与相应的基因组序列进行比对(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[15]．使用MEME套件5.0.5进行图案分析[37];识别的主题使用智能数据库注释[38]．独联体-利用PlantCARE数据库识别了翻译起始位点5 '调控区1.5 kb中的作用调控元件[15];并且通过GATA程序测量每个副偶胆基因对的上游序列之间的分歧[39]，窗口尺寸设置为七个，下截止分数为12位。

染色体位置，同步和KA / KS分析

所有染色体的位置PBRPGS.根据基因组注释数据确定，然后用Circos软件绘制[40]．

类似于PGDD的方法(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)来分析同线关系[41];和重复的PBRPGS.然后将其分为全基因组复制(WGD)/节段型、串联型、单例型、近端型和分散型。利用MCScanX下游分析工具注释同位基因对的Ka和Ks置换率;KaKs Calculator 2.0采用Nei-Gojobori (NG)法测定Ka和Ks [42]．

植物材料

均匀无瑕疵的梨果(p . pyrifolia简历。从南京农业大学的园艺实验园中种植的“Housui”）被选中，随机分为几组，用塑料袋包装，然后储存在25°C。每6 d采样一次，直到衰减率超过20%。对于采样，在分析之前，每次复制的5个果实的皮质快速移除。

颜色、失重、腐烂率、硬度、乙烯生成及呼吸速率测定

颜色(果皮及果皮下第一层皮层组织)、体重减轻和腐烂率根据Wang等人的方法测定[16]．采用美能达CR-400色度仪(日本大阪柯尼卡美能达感应公司)进行颜色分析。

通过Brookfield纹理分析仪（CT3，Middleboro，MA，美国）来测量皮层的坚定性，使用2毫米不锈钢柱探头，装载0.5毫米⁻¹与10 mm距离相关联。

用YGA2100 CO测定呼吸速率₂(中国北京阳光益时达科技有限公司)乙烯的逸出是由装有火焰离子化检测器(FID)的气相色谱仪(Agilent Technologies 7890A)测定的[43]．

转录组测序和qRT-PCR分析

用TRizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取总RNA，然后用RNase-free DNase处理(Qiagen, Valencia, CA)。RNA-seq和生物信息分析由Biomarker Technologies(北京，中国)进行。利用Illumina HiSeqTM 4000测序平台进行文库构建;梨基因组数据库[28用作参考基因组;FPKM用于计算基因表达[44]．根据之前的报告，野生动物p . pyrifolia是共同的祖先吗p . pyrifolia和p . bretschneideri［45]．

的引物PBRPGS.使用Premier 6.0设计（附加文件2:表S10)。用TRizol reagent (Invitrogen公司，美国)分离总RNA，然后用RNase-free DNase处理(Qiagen公司，美国)。使用TRANSGEN一步gDNA去除和cDNA合成SuperMix (TRANSGEN，中国)，约2 μg总RNA用于第一链cDNA合成。qRT-PCR方法参照Wang等[15]．Pyrus.以微管蛋白为内对照，用2计算相对表达量^−△△Ct方法(46]．

PG活性测定

按照生产厂家(PG-1- g，苏州科敏生物科技有限公司，中国)的说明书，从梨皮中提取粗PG并分析其活性。采用蛋白检测试剂盒(SSNP-1-W，苏州科明生物技术有限公司，中国)测定粗酶提取物中的蛋白浓度。结果以mg半乳糖醛酸h表示⁻¹ mg⁻¹蛋白质。

短暂的沉默PbrPG6梨果实中的表达

约400 bp片段在c端PbrPG6在插入PTRV2载体之前被扩增[47]．将构建的载体和能够辅助pTRV2载体在细胞内运动的pTRV1进行转化农菌株GV3101分别;然后在注射到皮层组织之前组合在1：1的比例中[48]．将未构建的pTRV2载体与pTRV1共注射作为对照。注射后的果实在25℃下保存5 d后取样。每个处理3个重复，每个重复5个果实。

梨果实的瞬时转化

梨果实的瞬时转化是跟随Hao等人进行的[12)的方法。PBRACO1ORF被扩大（附加文件2:表S10)，插入到修改后的pCAMBIA 1300载体中，然后转化为农菌株GV3101。温育后，离心悬浮液，重悬浮用渗透缓冲液，然后在25℃下储存之前缓慢注入梨皮质。用空载体渗透的梨果用作对照。每个载体有三个水果有三种复制。

统计分析

除梨果实贮藏期间转录组分析(一个重复)外，所提供的数据均为至少3个生物重复的平均值。使用SAS版本9.3 (SAS Institute, Gary, NC)进行数据分析，采用方差分析(PROC ANOVA)和多重比较校正。平均分离采用0.05水平的邓肯多重范围检验。采用Spearman相关分析评估各属性之间的相关性，并将其可视化为热图。

可获得的支持数据

支持本研究结果的转录组清洁原始读取数据已提交至NCBI序列读取档案(SRA)，编号为Accession SUB6578158, Bioproject: PRJNA590622。本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本发表的文章及其补充信息文件中。

不适用。

1-MCP:

1-Methylcyclopropene

华:

酸氧化酶

DAFB:

盛开后的日子

EMSA:

电泳迁移率变速测定

小块土地:

乙烯反应的因素

est序列:

表达序列标签

支撑材:

火焰离子化检测器

FPKM:

每公斤百万零件

GDR：

蔷薇科基因组数据库

汤:

亲水性的大平均值

GSDS：

基因结构显示服务器

嗯:

隐马尔可夫模型

MEME:

多重EM motif elicitation

mya：

百万年前

吴:

Nei-Gojobori

NJ:

Neighbor-joining

Nr:

Never-ripe

子:

开放阅读框

pe：

果胶酯酶

答:

polygalacturonase.

PGDD:

植物基因组复制数据库

PI:

等电点

PME：

果胶methylesterase

TAIR:

拟南芥信息资源

WGD：

全基因组重复

XET:

Xyloglucan endo-transglycosylase

β加:

β牛乳糖

我们感谢顾超、王国明和郭志华帮助构建沉默向量。

国家自然科学基金资助项目(no . 31701868, no . 31830081);中国博士后科学基金资助项目(no . 2018 T110508, no . 2017 M620213);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(no . KJQN201813)。资助机构只提供研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的编写方面的资金支持。

作者笔记

1. 张苏玲、马敏、张虎平等对这一工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，梨工程技术研究中心，江苏南京210095

   苏明张，Min Ma，Huping Zhang，Shaoling Zhang，Ming Zian，Zhen Zhang，Jinbu Fan，Zhiqiang Liu＆limin Wang

2. 美国农业部，农业研究所，美国园艺研究实验室，2001 S. Rock Road, Fort Pierce, FL, 34945, USA

   威奇罗

贡献

LW & ShZ设计了实验;LW、SuZ、MM撰写手稿;MM、SuZ、ZZ、ZL、JF、MQ进行了实验;SuZ、MM和WL对数据进行了分析。HZ进行了补充实验，对数据进行了分析，并对修订稿的语言进行了改进。所有作者阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到利宾王．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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再版和权限