病原体Moniliophthora孢促进可可基因型的差异蛋白质组学调节与对女巫病的对比抗性

背景

可可丛枝病(WBD)Theobroma可可)，由…引起的Moniliophthora孢是巴西可可生产最重要的限制因素。因此，开发具有持久抗性的可可基因型是控制该疾病的关键挑战。蛋白质组学方法通常用于研究寄主与病原体之间的相互作用，从而帮助传统的植物育种项目开发抗性基因型。本研究比较了两种标准可可基因型对白斑病抗性和易感性的蛋白质组学变化m .孢接种后72 h和45 d感染;分别为可可x的生物营养和坏死性营养的早期阶段m .孢交互。

结果

共鉴定出554个蛋白，其中易感品种卡通果246个，耐药品种TSH1188 308个。所鉴定的蛋白质主要参与代谢、能量、防御和氧化应激。抗性基因型表现出更多的表达蛋白，与应激和防御相关的变异更大，而易感基因型表现出更多的抑制蛋白。在这些蛋白中，发病相关蛋白(PRs)、氧化应激调节相关蛋白和胰蛋白酶抑制剂最为突出。预测了相互作用网络，并观察到复杂的蛋白质-蛋白质相互作用。一些蛋白质显示出大量的相互作用，这表明这些蛋白质可能在这些生物功能之间起着交叉对话的作用。

结论

我们提出了第一个研究报告耐药和易感基因型的蛋白质组学改变t .可可xm .孢pathosystem。本研究发现的重要改变蛋白与抗性的关键生物学功能有关，如氧化应激，特别是抗性基因型TSH1188，显示出强大的解毒机制。防御蛋白和应激蛋白的正向调控在该基因型中更为明显。几丁质酶、胰蛋白酶抑制剂和PR - 5等对植物真菌病原体具有重要作用的蛋白也被鉴定出来，它们可能是很好的抗性标记。最后，胁迫与防御、光合作用、氧化应激和碳水化合物代谢等重要生物功能受到不同程度的影响m .孢每种基因型的感染。

可可树(可可可可)，其种子是制作巧克力的原料，原产于南美洲的亚马逊和奥里诺科河雨林，生长在热带气候地区，如哥伦比亚、墨西哥、秘鲁、加勒比岛屿以及非洲国家[1]。可可树的女巫扫帚病(WBD)是由Moniliophthora孢艾梅·菲利普斯-莫拉(2005)[2]，是可可最重要的病害之一，在有利的环境条件下，可造成可可年产量高达90%的损失[3.]。

Moniliopthora孢是一种半营养性担子菌，开始感染时为生物营养性病原体，但后来转变为坏死性生活方式[4]。生物营养菌丝体是单核的，没有夹紧连接，细胞间生长依赖于外胞体中的营养物质生存。受感染植物的细胞在感染后15-25岁开始肥大，茎尖(绿帚状)肿胀[5]。真菌以这种方式生长约30天。在感染后约40-45天的生物营养阶段之后，发生向坏死性生长的转变。坏死性真菌菌丝呈双核，夹接，在细胞内生长，引起被感染植物细胞凋亡和坏死，引起宿主组织死亡。随着疾病的进展，在感染后60天和90天完全形成绿色和“干扫帚”;分别为(5，6]。在死组织上，干雨交替诱导担子瘤的产生[7，8]，其中，担子孢子(唯一的感染性繁殖体)形成并通过风传播到植物侵染区;引起茎、花垫和豆荚症状的分生组织[9]。

研究t .可可xm .孢病理系统主要与测序和基因表达有关，如m .孢基因组(10]、基因组测序和效应组分析Moniliophthora来自不同寄主的sp . [11]，m .孢其生命周期不同阶段cDNA序列分析[12]。此外，cDNA文库t .可可xm .孢pathosystem [13]，以及生物营养相互作用期间的转录组分析t .可可xm .孢［14]。对于t .可可，已建立了一个表达序列标签(est)资料库[15]和两种可可基因型Matina (https://www.cacaogenomedb.org/)及克里奥罗[16]，都是公开的。以上研究揭示了在t .可可作为回应m .孢可能是宿主基因防御更快激活的结果，在真菌生命阶段的反应中，以不同的时间和功能模式阻止病原体的发展。不相容互作表明，在感染的早期阶段，即感染后48和/或72小时，当茎尖没有宏观症状时，防御相关基因的表达强烈。以及在早期(感染后45天)可可x的坏死阶段m .孢交互。

尽管它们很重要，但在后基因组背景下，这些研究本身并不足以完全理解m .孢和t .可可互动(17]。蛋白质组学方法在研究基因表达的最终产物(蛋白质)方面具有优势，有助于理解真正被翻译的内容及其积累谱。

蛋白质的积累可受到转录后和翻译改变的影响，这与其编码基因表达水平的低对应关系有关[18]。蛋白质组学研究被广泛应用于证明植物蛋白质组在感染期间的改变，因此可以识别宿主对病原体攻击的重要蛋白表达[19，20.，21]。蛋白质组学研究成功地在其他病理系统中进行，如番茄x尖孢镰刀菌在木质部中发现了几种与抗病相关的蛋白质[22]，以及…的蛋白质组学特征拟南芥x链格孢属brassicicola，这表明答:芥在生长培养基中添加病原体源性激发子引起的细胞培养防御反应23]。

二维电泳(2D-PAGE)随后的质谱分析已经在涉及的研究中使用m .孢，如体外担子孢子萌发的蛋白质组学分析[24]、担子孢子的蛋白质网络[25]和评价m .孢对可可幼苗不同毒力的分离株[26]。同样，可可蛋白质组学研究，如蛋白质提取方案优化[27]、体细胞和合子胚胎发生评价[28]、种子发育和果实成熟[29]和不同基因型可可叶平面蛋白的鉴定[30.]也被执行。然而，我们的理解t .可可xm .孢蛋白质组水平上的相互作用仍然非常有限。因此，本研究的目的是增加对两种可可基因型在疾病发展早期，接种后72小时和45天对白斑病抗性的蛋白质组学改变的了解m .孢。我们发现了500多个蛋白质，涉及重要的生物功能，如代谢、能量、防御和氧化应激，在两种基因型之间表现出表达模式的差异。抗性基因型与胁迫防御、氧化应激相关蛋白表达多样性高、解毒机制强有关，而这些蛋白在易感基因型中大多被抑制。我们还发现了几丁质酶、胰蛋白酶抑制剂和pr5等对植物真菌病原体具有重要作用的蛋白质。这些蛋白质可能是有用的抗性标记。据我们所知，这是第一次报道抗病和易感可可基因型在可可生物营养和坏死营养早期的蛋白质组学反应m .孢相互作用，使用2D-PAGE和液相色谱-质谱(LC-MS/MS)方法。

感染Theobroma可可带有病原体的幼苗m .孢

为了更好地理解蛋白质组学的改变t .可可在感染期间，与抗性基因型相比，抗性基因型(TSH1188)和易感基因型(Catongo)的3 ~ 4周大的幼苗都接种了稻瘟病菌的担子孢子悬浮液m .孢并评估感染后的症状和死亡情况。在接种后72 h, THS1188和Catongo的接种和未接种(模拟接种)实验中收集茎尖，这是与生物营养菌丝体建立相关的第一次代谢反应开始发生，而在接种后45 d，真菌菌丝体开始从生物营养阶段向腐生样阶段转变。

的茎尖t .可可抗性基因型(TSH1188)和易感基因型(Catongo)的植株在感染后72 h和45 dm .孢通过2D-PAGE和液相色谱-质谱法进行蛋白质提取和蛋白质组学评价。利用这些时间线，我们将研究重点放在可可x的生物营养和坏死阶段的早期代谢反应上m .孢交互。

接种后的感染症状m .孢每周观察一次。接种后15 d，茎尖变色、膨大，节间伸长。在60DAI时，82.45%的易感植株形成全绿扫帚，而抗性基因型植株形成全绿扫帚的比例为41%，但其大小直径较小。在45DAI时，两种基因型都注意到叶尖灼烧(图2)。1a).实验结束时，经过95天的症状观察，易感基因型Catongo的发病株占90%左右(死亡株占55.4%，有症状株占35%)，无症状株占9%，而抗性基因型TSH1188的发病株占48%(死亡株占7%，有症状株占41%)，无症状株占52%。对照植株未表现出任何症状。总蛋白平均产量3538.84 μg。1B)，从3824到7683 μg不等。μl - 1;两种基因型在72HAI时产量最高。

蛋白质谱分析响应m .孢感染

两种可可基因型TSH1188不同时期WBD的二维凝胶电泳分析(图2)。2)和Catongo(图2)。3.)，具有不同的表型反应m .孢感染，允许表征蛋白质动力学参与疾病的发展。在每个阶段都观察到差异代谢和特定的差异蛋白表达，以及发育过程中常见的差异代谢。将感染的基因型与各自的对照进行比较。两种基因型(TSH1188和Catongo)和两种采集次数(72 HAI和45 DAI)处理在接种和未接种组织上的凝胶重复都得到了很好的解决，在蛋白产量、再现性和分辨率方面没有显著差异(附加文件)1）.在两种基因型中，72 HAI时未接种处理检测到更多斑点;这一特点在Catongo地区更为明显(图2)。4a).在45 DAI时，仅在接种的TSH1188基因型中观察到这种模式的反转，与其他处理相比，该基因型显示出更多的检测斑点(图2)。4a).此外，根据斑点强度值对重复进行分层聚类，24个重复中有23个分组符合预期，表明重复之间斑点的相似性很高(图2)。4b).这一结果似乎支持了TSH1188和Catongo基因型对照和接种处理的高分辨率参考图谱。基于强度值的折叠变化差异(p≤0.05)，通过主成分分析观察到差异表达点(附加文件2)，接种处理和未接种处理显著区分开，并区分了基因型处理。此外，这些差异和折叠变异是显著的，表明2DE蛋白斑点被认为是在对感染的反应中受到调节的m .孢。在所有分析时间内，两种基因型和处理中检测到的斑点的完整数量显示在维恩图中(附加文件)3.）.

差异表达蛋白鉴定

蛋白鉴定前，使用Image Master 2D Platinum软件对凝胶三份副本的图像进行硅片匹配，选择有显著变化(p≤0.05)的斑点。将显著改变的斑点分为排他斑点[只在接种处理中出现的斑点(上调蛋白)或只在未接种处理中出现的斑点(下调蛋白)]和共同斑点[两种处理中都出现的显著改变蛋白，但表达水平不同:fold change (FC)≥1.5]。通过LC-MS/MS方法，通过分析ProteinLynx Global软件生成的光谱获得的蛋白质的身份，并与NCBI数据库和Theobroma可可并让我们鉴定出总共554个蛋白质点。在72HAI时，在Catongo和TSH1188中分别鉴定出48个和61个蛋白，在45DAI时，在Catongo和TSH1188中分别鉴定出198个和247个蛋白。无论处理方式如何，TSH1188中观察到更多的蛋白质，其中大多数在病原体感染后特异性调节。然而，在Catongo中，在未接种的处理中观察到更多的蛋白质，这表明在该基因型中，这些蛋白质在病原体攻击过程中整体下调。处理之间的专属蛋白和共同蛋白的总发生率在维恩图中说明(图2)。5）.完整鉴定的蛋白质列表和进一步的信息可以在附加文件中找到4和5。

功能分类

利用Blast2Go工具根据蛋白质的生物学功能将其分为8个功能类别。在接种条件下，两种基因型在两种时间内的大多数不受调控的蛋白与能量和代谢有关。在72HAI和45DAI中，与Catongo相比，接种TSH1188后，观察到大量的防御和应激相关蛋白发生了改变(图2)。6）.有趣的是，TSH1188在所有功能群中都比Catongo表现出更多的蛋白质积累。亚细胞定位也被确定为两种基因型(附加文件6）.

确定蛋白质

TSH1188基因型在72HAI表现出重要的氧化应激蛋白如甘油醛-3-磷酸脱氢酶C2亚型1(位点1123)和亚型2(位点1122)上调，过氧化物酶(位点1006、1005)下调(表1）.在Catongo中没有遇到这些蛋白质群。然而，在45DAI时，在Catongo(622、813、1544、1531)和TSH1188(1141、1132、1129、1401、177:FC + 3.58、1224、1222、1068)中发现了几种过氧化物酶的上调，包括抗坏血酸过氧化物酶(96:FC + 1.6和1104)，它在活性氧(ROS)的降解和程序性细胞死亡中起重要作用。6)(表1和表2）.在72HAI时，我们还观察到，与Catongo相比，TSH1188显示出更多与碳水化合物代谢相关的上调蛋白，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(位点1123,1122)，糖基水解酶(位点1106)和推测的β木糖苷酶α L阿拉伯糖苷酶2(位点1120)。在45DAI时，TSH1188中参与糖异生和淀粉生物合成的磷酸甘油酸激酶1(位点1039)等功能组蛋白明显上调1）.此外，尽管Catongo基因型在72HAI时显示了该功能组蛋白的积累，但在45DAI时改变最多的蛋白是苹果酸脱氢酶(斑点1649)、烯醇化酶(斑点1685)、核糖激酶(斑点1641)和醛缩酶(斑点1794、1648)，这表明代谢障碍。在72HAI基因型中，光合作用蛋白也被上调，如TSH1188中的核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶激活酶1异构体1(位点1100,1114)和Catongo中的叶绿体氧进化增强子蛋白1(位点967)。相反，在45DAI时，两种基因型中光合作用相关蛋白的下调幅度更大(图2)。7、表1和2)，例如TSH1188中的光收集天线系统(斑点64:FC−2，斑点73:FC−1.76，斑点94:FC−2.29)，以及Catongo中的光系统I和II相关蛋白(斑点1626,1595)。在72HAI时，防御和应激蛋白在TSH1188中被上调，而在45DAI时，反应更为明显。然而，Catongo基因型在45DAI时表现出整体的下调模式(表1)2和其他文件3.和5）.在72HAI的TSH1188中，除其他外，观察到几丁质酶A(位点1102)，电压依赖性阴离子通道2(位点381:FC + 1.79)-与代谢物交换相关的重要蛋白H₂O₂(过氧化氢)积累和脱落酸信号传导[31，32];下调伴侣蛋白(斑点1033)和一种发病机制相关蛋白PR-2 β-1,3-内切葡聚糖酶，后者可对抗生物感染(斑点1065)。结果表明，在第45代，PR-2的2个同工型被下调(位点1489、1431)，2个同工型被上调(位点1170、1178)，2个PR-4几丁质酶被上调(位点1065、1097)，PR-5几丁质酶被上调(位点1072)，数个渗透素型PR-5被上调(位点1073、1060、1061)，1个PR-10.5被上调(位点1036)。胰蛋白酶抑制剂在72HAI位点的TSH1188中下调(斑点974)，我们也在45 DAI的四个亚型(斑点39:FC−2，斑点40:FC−3.5，斑点42:FC -2.8, 1482)中观察到类似的模式，尽管与72HAI和Catongo相比，这两次的比例都较低，这又显示了对胰蛋白酶抑制剂和其他抑制剂的高抑制，如HSP70(斑点224:FC−11)在72HAI位点。此外，另外三种胰蛋白酶抑制剂(位点1051、1071和1364)在45DAI时在TSH1188中出现调控，而Catongo在此时在与应激和防御相关的蛋白质中呈现整体下调，尽管一些蛋白质如电压依赖性阴离子通道2(位点1578)被上调。其他应激反应蛋白在45DAI时在TSH1188中上调，如miraculin-like(位点1056,1057,1058,1124)，它在生物应激条件下限制细胞损伤[33]， hsp70异构体(斑点224:FC + 7.31284, 1321, 1040)，渗透蛋白(斑点1060,1061,1073)，禁止蛋白(斑点1146)，以及对真菌分子表达的水解酶(斑点1042,1037)。有趣的是，TSH1188中含有锚蛋白重复结构域的蛋白2(位点266:FC−3.3)在45DAI下调，而Catongo中上调(位点1538)。

蛋白质相互作用

为了研究差异表达蛋白之间的相互作用，研究了386个同源蛋白答:芥从这里鉴定的554个总蛋白质中，我们用来建立PPI网络，包括直接(物理)和间接(功能)关联[34]。预测了8个相互作用网络，在两个评估时期分别分析每种基因型的上调和下调蛋白(图2)。7和附加文件7）.在两种基因型中，主要在45DAI处观察到一种复杂的蛋白-蛋白关联，其中大多数蛋白通过观察到的节点数量表现出直接或间接的相互作用。氧化应激、光合作用、蛋白质代谢、应激防御和碳水化合物代谢等过程被过度代表，与我们之前的结果一致。在PPIs中发现的一些蛋白质显示出大量的相互作用，包括不同生物功能的连接(图2)。7）.因此，这些蛋白质可能是当前研究中病理系统中一般蛋白质组学改变的关键参与者。其中一些在TSH1188 45DAI (40S核糖体蛋白S3-3中上调的蛋白中观察到，标识符:AT5G35530;延伸因子EF-2(标识符:LOS1，低表达渗透反应基因2,LOS2);TSH1188在45DAI(光系统II亚基P-1)下调蛋白，标识符:PSBP-1;rubisco激活酶，标识符:RCA;伴侣蛋白htpG家族蛋白，标识符:CR88;ATP合成酶亚基;TSH1888在72HAI (60S)核糖体蛋白L11-2的下调蛋白，标识符:AT5G45775;40s核糖体蛋白SA，标识符:P40); Up regulated proteins of TSH1188 at 72HAI (elongation factor 1-alpha, identifier: A1; voltage dependent anion channel 1, Identifier: VDAC1); Down regulated proteins of Catongo at 45DAI (chaperonin-60alpha; identifier: CPN60A; mitochondrial HSO70 2, identifier: MTHSC70–2; low expression of osmotically responsive genes 2, identifier: LOS2; malate dehydrogenase 1, identifier: mMDH1); Up regulated proteins of Catongo at 45DAI (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, identifier: GAPC2; 60S ribosomal protein L12–3, identifier: AT5G60670; citrate synthase 4, identifier: ATCS; rubisco activase, Identifier: RCA). Proteins nodes generated and their correspondents STRING IDs, as well as further information about Biological process (GO) Molecular function and KEGG Pathways, are provided at Additional file8。

在TSH1188中观察到的蛋白质组改变与Catongo不同，可能与抗性有关

在生物胁迫下，植物可能会分配能量来防御病原体，从而损害其他正常功能。35]，通常在48HAI早期观测到。H的积累₂O₂在感染茎尖的前72小时内[36]和可可幼苗叶片中蛋白质提取物的高过氧化物酶活性[37]在本病理系统中观察到。这些改变需要宿主生物的生理成本，这反映在当时观察到的蛋白质组改变上，因为观察到两种基因型在72HAI时都显示出较少的检测斑点和蛋白质鉴定(附加文件)3.，图A) [38，39]。在草莓接种的2D-PAGE凝胶中也观察到类似的模式炭疽菌fragariaepathosystem [19]。

考虑到TSH1188在这两次都比Catongo显示出更多的斑点，并且代谢从72HAI时的抑制代谢转变为45DAI时的诱导代谢(附加文件)3.(图A和图B)，可以推断这些反应可能与该基因型的抗病相关。此外，与在Catongo中观察到的整体抑制因子模式相比，这似乎与代谢框架的上调有关，Catongo在两次中都显示出更多的抑制蛋白。这些结果不同于da Hora Junior及其合作者(2012)[40]。这些作者发现，在这一病理系统中，更多的差异表达基因在Catongo在可可挑战的茎尖转录组学研究m .孢。然而，这些发现不能恰当地与本研究的结果进行比较，因为作者使用了与我们不同的收集时间:早期阶段(24、48和72小时)的样本池和30和60天的样本。然而，蛋白质组学和转录组学的研究往往具有较弱的相关性。这种差异主要可以通过蛋白质可以经历的翻译后修饰来解释，这些修饰直接影响蛋白质的结构、位置、降解、代谢、功能以及它们的稳定性。这些修饰也可能影响蛋白质丰度，这表明蛋白质的积累部分取决于mrna的积累和降解[18，41，42]。这些发现突出了基因型之间蛋白质组反应的差异，并表明了Catongo的总体抑制代谢模式。

在感染期间，不同基因型对氧化应激蛋白产生的控制不同:TSH1188显示出强大的解毒机制

氧化氧(ROS)如超氧O2⁻过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(OH)，已知对植物有毒，因此它们被抗氧化酶去除。然而，它们参与重要的信号通路，如发育、生长、细胞死亡，主要是对生物和非生物胁迫的反应，直接对抗病原体[43]。此外，它们可能在随后的防御反应中作为信号分子发挥作用[44]。此外，ROS对宿主和病原体都是有毒的，因此，在应激反应中，ROS的产生和去除之间的平衡很重要[43]。TSH1188在72HAI上上调应激氧化蛋白，其中GAPDH同工型上调。编码该蛋白的基因被预测与该病理系统有关，然而，在计算机上没有得到证实[13]。该蛋白除了参与糖酵解途径外，还有其他重要功能[45]。它的半胱氨酸残基可以被氧化[46和ROS信号转导一样，在非生物胁迫中观察到答:芥［47]。过氧化氢在可可组织感染后形成m .孢与Catongo相比，TSH1188的前72HAI显著增加，而后者又没有变化[40]。验证了TSH1188对过氧化物酶3和过氧化物酶4在72HAI位点的抑制作用。这一事实可能与活性氧积累的需要有关，活性氧在可可组织中类似于感染早期的超敏反应(hypersensitive response, HR)，因此可以改善抵抗反应和疾病控制[40]。

在45DAI时，TSH1188对氧化应激蛋白的调节量是Catongo的两倍，尤其是与ROS解毒相关的蛋白(图2)。6、表1和附加文件4）.这种模式的变化可能与真菌从生物营养阶段向腐生样阶段的转变有关，该阶段已经在45DAI开始，因为在菌丝中已经观察到钳形连接(腐生菌丝的特征)m .孢在这个病理系统的45DAI [5]。因此，建议这个时间点可以被认为是一个过渡阶段。这种菌丝具有显著的细胞内侵袭性生长，导致组织死亡。所产生的应激可能影响氧化应激蛋白的上调爆发。H的增加₂O₂在Catongo也观察到45DAI的水平[6]及TSH1188 [36]，但H₂O₂易感基因型可能与促进病原菌生命周期有关[36]。此外，我们的结果表明，两种基因型都表达过氧化物酶。在TSH1188中观察到氧化应激蛋白数量和多样性的持续增加，这表明在抗性基因型中，这种反应可能与更有效的解毒机制有关。一旦该基因型中的ROS爆发必须得到精细控制，以限制病原体感染并通过解毒蛋白的表达将宿主损伤降至最低，则需要这种效率。

两种基因型在感染过程中都需要碳水化合物代谢和光合作用蛋白的调节来提供能量

在植物侵染期间，寄主可能会降低光合速率以调动能量进行防御反应[48]。这种“代谢成本”已在几种病理系统中观察到[19，49]。维持反应所需的能量，导致更多的同化物的帮助，主要以碳水化合物的形式，然而这是一把双刃剑，因为病原体可能使用这些化合物来自我营养，增加其需求[49]。在我们的病理系统中观察到的与碳水化合物代谢相关的蛋白质的上调可能表明呼吸所需的增加。这种模式是一种常见的反应，已经在草莓x中观察到炭疽菌fragariaepathosystem [19]、接种甘蔗花叶病毒的玉米[50]和非生物胁迫[51]。

在我们的病理系统中，可溶性糖的水平在相互作用的第一天增加[52]，而且，淀粉储存水平在疾病早期下降，在前15天，Catongo的淀粉储存水平高于TSH1188，尽管在45DAI时，TSH1188的淀粉储存水平高于Catongo [5]。这些发现证实了我们的结果，因为我们发现在45DAI时TSH1188中与碳水化合物代谢相关的蛋白质上调较多，这可能与通过淀粉代谢更有效地生产己糖过程有关，以满足这一阶段的能量需求[52]。尽管如此，这些分子也可能被真菌利用，并可能在菌丝体从生物营养向腐生转变的过程中发挥重要作用[53]。

两种基因型在72HAI时均表现出与光合作用相关的蛋白质积累增加。光合作用激活可以通过为随后的防御反应提供碳骨架和能量而使细胞受益[54]。在蛋白质组学分析中也观察到相同的模式松果体monticola挑战与柱锈菌属ribicola在兼容和不兼容的相互作用中[55]。然而，这种表达模式在45DAI时发生了变化，两种基因型都表现出光合作用相关蛋白的下调(图2)。6）.这可能与植物与病原体相互作用过程中可以调节光合作用相关基因的己糖积累有关[49]。此外，这种模式已经在其他病理系统中观察到[19]。此外，我们在工作中观察到的糖代谢蛋白的向上积累，以及Sena等(2014)在45DAI观察到的糖积累[5加强了这种可能性。

在TSH1188基因型中，防御蛋白和应激蛋白的正调控在感染的早期和晚期反应中更为强烈

真菌基质细胞壁主要由几丁质组成，虽然宿主不产生这种分子，但通过进化，它们产生了能够在防御反应中降解真菌细胞壁的酶(如几丁质酶)[56]。在TSH1188和Catongo中，这些蛋白在两个时间点都被检测到上调，仅在45DAI处，证明了这些蛋白在植物病原体相互作用中的重要性。表达几丁质酶的转基因植物对真菌和其他病原体的抗性增强，一旦几丁质片段成为重要的病原体相关分子模式(PAMP)，被宿主识别导致防御信号通路的激活[j]。57]。然而，最近Fiorin和他的同事(2018)[58，观察到m .孢进化出一种酶失活的几丁质酶(MpChi)，它与几丁质免疫原性片段结合，从而阻止几丁质引发的免疫，证明病原体免疫抑制宿主反应的策略。此外，PAMP在生物营养发育过程中也有表达，最近的研究表明，来自植物的PAMP - Cerato-plataninm .孢可能以高亲和力的方式结合几丁质，导致真菌释放的几丁质片段引发植物免疫系统[59，60]。此外，通过PAMPs的离子通道被识别[61]，在TSH1188中两次上调，而在Catongo中仅在45DAI上调，这表明在耐药基因型中，这种识别机制被激活得更早。这一信息强调了植物与病原体相互作用过程中复杂的分子关系。

TSH1188的抗性反应也通过几个pr的表达来突出，主要是在45DAI，显示了四个家族的代表。PRs是植物中基础表达的异质蛋白群，主要在病原菌感染期间被诱导表达[62，63]。Gesteira及其同事(2007)[13]发现PR4蛋白在我们的病理系统中TSH1188的cDNA文库中更有代表性。此外，在我们的研究中还观察到，PR5在TSH1188中独家表达，TSH1188是一种重要的蛋白，在许多真菌物种中具有抗真菌活性，如抑制孢子萌发和菌丝生长[64，65，66]，并增强对植物病原体的抗性，例如转基因香蕉x尖孢镰刀菌转基因马铃薯xMacrophomina phaseolina和5种［67，68]。此外，本研究数据表明，Ankyrin重复结构域蛋白2在基因型之间具有相反的表达谱。该蛋白与pr编码基因的调控和PCD(程序性细胞死亡)的正向调控有关[69，70]，这可以促进相位的变化m .孢(从生物营养到腐生)通过向真菌菌丝体释放营养[32]。此外，胰蛋白酶抑制剂是一种天然的植物抗食草性防御蛋白，与生物和非生物抗性有关[71，72]，在两种基因型中均发现同种异构体，但在cDNA文库中仅在TSH1188中发现[13]。此外，仅在该基因型中发现其在45DAI处上调。众所周知，m .孢在生物营养期释放有助于致病性的溶解蛋白和蛋白酶[73]。

丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛分布于真菌、植物、细菌和人类等生物体内。此外，它还与植物抗性有关[74]。在可可中，这些丝氨酸蛋白酶抑制剂的积累在不同的组织和基因型中对几种胁迫的反应是不同的。在耐药相互作用的RT文库中有高度的代表性t .可可和m .孢［13]。这些抑制剂在可可种子的蛋白质组学谱中显示出高丰度[75]，发育中的合子胚胎[28]和可可根遭受洪水侵袭[76]，可可叶对重金属胁迫的反应也不同[77]。基因组中最丰富的蛋白酶m .孢是一种真菌金属蛋白酶，类似于细菌热溶酶[10]。然而，虽然这种丝氨酸蛋白酶抑制剂变异不是对真菌的特异性反应m .孢，我们认为这是可可基因型植物对胁迫的重要防御反应，在这种情况下可能起到保护可可细胞免受真菌水解酶侵害的作用。

PPI分析揭示了一个涉及重要生物学功能的全球蛋白质网络m .孢感染

M孢是可可树最重要的病原体之一，了解感染过程中蛋白质组学机制的生物学过程是必要的。因此，一个详细的蛋白质-蛋白质相互作用网络是非常必要的。对于非模型工厂来说，构建预测PPI网络具有挑战性，[78，79尤其是在高通量蛋白质组学数据方面。为了进一步研究不同可可基因型对赤霉病的抗性和易感性m .孢我们利用基于同源性的预测来鉴定病理系统中鉴定的差异表达蛋白中的PPI。需要强调的是，一些在2D-PAGE电泳中被鉴定为同种异构体的蛋白质，在鉴定过程中被鉴定为相同的蛋白质，这减少了PPI网络中由于输入的重复性而鉴定的总数。

蛋白质不是孤立的实体;更确切地说，它们是一个复杂机制的组成部分，其功能连接对一般代谢起决定性作用。的影响m .孢感染对TSH1188和Catongo代谢的影响如图所示。7，表明不同的蛋白质组分与其伴侣在不同的生物功能中相互作用，如应激与防御、氧化应激、蛋白质代谢、光合作用和碳水化合物代谢。当然，这些簇不是分离的物体，它们形成了一个全球性的蛋白质网络m .孢这可以帮助我们更好地理解这些延迟机制是如何联系在一起的，从而能够预测新的功能相互作用。这是非常重要的，一旦可用的信息，PPI在非模式植物是稀缺的。在其他病理系统中也构建了类似的图谱，如大豆和大豆镰刀菌素virguliforme［80]并且可能有助于发现对感染有反应的特定蛋白质[81]。一旦我们注意到一种或多种蛋白质可能是这些生物功能之间的交叉对话者，我们的研究就增加了一层复杂性。这种连通性表明存在与功能调控相关的重要PPI，并且它们在两个基因型之间是不同的m .孢感染。此外，其中一些蛋白质之间的相关性之一是共表达。众所周知，共表达基因通常在功能上是相关的，即“联想罪恶感”[82]，并可能以类似的途径起作用。这可能导致一组受调节的蛋白质对特定的扰动作出反应。因此，从PPI分析中获得的信息，可能有助于发现新的潜在疾病相关蛋白和调控模型，旨在制定新的假设，以阐明我们的病理系统的分子基础和改进防御策略。

这些结果提示了耐药和易感性在病理系统中的分子机制。虽然这些预测的相互作用网络仍需要在后续的研究中得到验证和进一步分析，但已知PPI在同源物种之间广泛保守[83，84]，加强了本文提出的结果。

这是第一次将2D-PAGE与LC - MS/MS相结合用于研究t .可可不同的基因型m .孢感染。在这里，有可能在易感和耐药模型中跟踪由早期和晚期生物营养期相互作用引起的蛋白质组学变化，确定了500多种参与重要生物功能的蛋白质。研究还发现，这些功能在不同基因型之间发生了明显的变化，可能与THS1188的耐药性有关，与Catongo相比，THS1188对感染的反应呈现出更多数量和种类的蛋白质。该研究强调了可能与抗性关键功能相关的重要蛋白质，如氧化应激蛋白，特别是TSH1188中显示出强大的解毒机制。此外，基于鉴定出的几丁质酶、胰蛋白酶抑制剂和PR - 5等对真菌具有重要作用的蛋白质，该基因型在对感染的早期和晚期反应中，防御和应激蛋白的正调控更为强劲。这些蛋白可能是很好的抗性标记。最后，在蛋白质组学水平上，胁迫与防御、光合作用、氧化应激和碳水化合物代谢等生物重要功能受到了不同程度的影响m .孢在每个基因型中。

基于这些发现，这里提出了一个模型，显示感染期间在两种基因型中观察到的主要变化(图2)。8）.在抗性和敏感性反应的分子背景的一个有前途的和信息框架t .可可基因型在M孢提供了感染，突出了进一步调查的新的潜在目标。

植物材料

本研究使用的植物材料是根据其田间子代试验显示的抗性(TSH1188)和敏感性(Catongo)来选择的[85]。所有基因型的开放授粉豆荚培育的幼苗，均来自巴西巴伊亚州伊尔海姆斯市(伊尔海姆斯，巴西巴伊亚州)的可可研究中心(CEPLAC)总部的可可种质库(CGB)。http://www.ceplac.gov.br/）.它们以2:1的比例种植在商业盆栽混合料(Plantmax®，Eucatex, s o Paulo, SP, Brazil)和富含粘土的土壤中，在自然光和90%相对湿度下在温室的无菌基质中生长，直到接种日。国际可可种质数据库(ICGD) (http://www.icgd.rdg.ac.uk/)提供有关TSH 1188(本地名称:TSH 1188;登录号:28 ' 5)和Catongo(当地名称:SIC 802;登记号:24)。

接种剂和接种程序

用接种量为Mp4145的担子孢子悬浮液接种植株的茎尖，来自巴西巴伊亚州伊尔海姆斯的CEPLAC/CEPEC，加入号4145 (CEPLAC/ CEPEC植物病理学)m .孢系列CEGEN N°109/2013/SECEXCGEN)。接种物按照Mares及其同事(2016)的描述制备[25]。3 ~ 4周龄可可苗(苗)滴接种[5]，每次接种约550株幼苗。简单地说，在接种前，将幼苗的叶片切至其长度的2/3，以诱导根尖生长。每株幼苗接种20 μl担子孢子悬浮液，浓度为200.000孢子mL，浓度为0.3%的水琼脂⁻¹。接种在潮湿室中进行，在黑暗(23±2℃)温度下接种48 h;> 97%(相对湿度)。接种后移入温室，每天3次灌水20 min，直至试验结束。接种质量通过接种前和接种后24 h孢子萌发率(萌发率≥80%)进行评价。每个基因型的对照苗用相同的溶液模拟接种，不接种。

实验设计

每株幼苗的扫帚型、茎肿和死亡评价较弱。在每个时间点收集THS1188和Catongo接种和未接种(模拟接种)实验的茎尖(约40个);接种后72 h (72HAI)和45 d (45DAI)。所有收集的茎尖立即用液氮冷冻，然后冻干，提取蛋白质并进行蛋白质组学评价。将各基因型的接种实验与其匹配对照和未接种对照进行比较。剩余植株用于病害评价。

蛋白质提取与用量

根据Pirovani及其同事(2008)制定的方案，将茎尖进行化学和物理方法的蛋白质提取，以优化蛋白质产量[27经过修改。将茎尖浸渍后，用丙酮加三氯乙酸溶液连续洗涤，然后进行超声处理。还采用了苯酚/SDS缓冲液在变性条件下联合提取蛋白质的工艺。详细的过程可以在附加文件中找到9。根据制造商的说明，使用商业2D定量试剂盒(GE生命科学®)估计总提取物的蛋白质浓度。根据牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线估计样品浓度。蛋白质样品和曲线一式三份，在Versamax (Molecular Devices)分光光度计480 nm处读取。

1D和2D凝胶电泳

在垂直电泳系统(Omniphor)中，将20 μg的蛋白质提交到SDS-PAGE凝胶(8 × 10 cm，丙烯酰胺12.5%)中，对茎尖的蛋白质谱质量进行评价。

在二维分析中，500 μg的蛋白质应用于固定pH梯度(IPG)凝胶条，长度为13 cm, pH范围为3-10 NL (Amersham Biosciences, Immobiline™dry strip)。等电聚焦在Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare)系统中进行，由Ettan IPGphor 3软件控制。电聚焦条件:20℃下复水化时间- 12 h;运行:1小时500Vh, 1:04小时1000Vh, 2:30小时8000Vh, 40分钟8000Vh。用平衡缓冲液(尿素6 mol L)还原条带⁻¹， Tris-HCl pH 8.8 75 mmol L⁻¹，甘油30%，SDS 2%，溴酚蓝0.002%)，DTT 10 mg mL⁻¹15min，用碘乙酰胺25mg mL平衡缓冲液烷基化⁻¹15分钟。最后，用运行缓冲液(Tris 0.25 mol L)平衡条带⁻¹甘氨酸1.92 mol L⁻¹， SDS 1%， pH 8.5)浸泡15分钟。在聚丙烯酰胺凝胶12.5%(三次)中进行第二次电泳，在HOEFER SE 600 Ruby (GE Healthcare)垂直电泳系统中进行电泳，参数为:15cmA/凝胶15分钟，40 mA/凝胶30分钟，50 mA/凝胶3小时，或直到样品完全通过凝胶迁移。用胶体Comassie Brilliant Blue (CBB) G-250固定并着色后，用蒸馏水对凝胶进行脱色。使用ImageScanner III (GE Healthcare)进行数字化处理，对图像进行分析，并使用Image Master 2D Platinum软件(GE Healthcare)通过在硅片上匹配凝胶副本进行斑点检测。

统计分析

对接种与未接种处理进行统计学分析(ANOVA)，以确定差异(排他性和共性)表达斑点(p≤0.05和≥1.5倍变化)。采用多变量分析来评估基因型在感染反应中的全球变化。通过数字化结果获得斑点强度值，并使用NIA找到重复的分层聚类阵列分析工具（http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/)软件。此外，进行主成分分析(PCA)以确定处理之间的表型和基因型差异。

在凝胶消化，质谱和蛋白质鉴定

按照Silva及其同事(2013)的描述，人工从凝胶中切除选定的蛋白质斑点，分别进行漂白、洗涤、脱水，然后进行蛋白质消化。[86多肽在nanoAcquity UPLC(超高效液相色谱)(WATERS)中用反相色谱法分离，在液相色谱中电离并片段化Micromass Q-TOFmicro(WATERS)光谱仪，由Mares及其同事描述(2016)[25]。光谱分析ProteinLynx全球服务器V 2.3 e (水域)软件，并采用MASCOT MS/MS与NCBI数据库进行对比离子搜索（www.matrixscience.com)工具，以下搜索条件:酶:胰蛋白酶;允许最多1遗漏乳沟;固定修饰:氨基甲酰(C);变量修饰:氧化(M);肽耐受性:30ppm;MS/MS公差:0.3 Da和0.1对碎片离子。将NCBI中未识别的光谱与NCBI中未识别的光谱进行比较Theobroma可可数据库(http://cocoagendb.cirad.fr/gbrowse)通过ProteinLynx使用相同的标准。在这项工作中，我们认为在未接种处理中发现的蛋白质是下调的，假设其积累速率在检测限度下降低，以及在接种处理中发现的蛋白质被认为是上调的。

功能注释

利用MASCOT生成的访问号在NCBI数据库中获得鉴定蛋白的FASTA序列。鉴定出的蛋白质序列ProteinLynX在平台中可用。利用BLAST2GO (http://www.blast2go.com/)软件。

蛋白质-蛋白质相互作用

在PPI分析之前，同源蛋白之间t .可可和答:芥利用BlastP 2.5.0软件对相互作用过程中两次鉴定到的两种基因型的差异表达蛋白进行局部比对。87- value 1E-3 -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -num_threads 8。最好的命中命中答:芥被认为是同源的。PPI分析预测使用相互作用基因/蛋白质的检索(STRING) 10.0版本[37) (www.string-db.org）.在软件中，所有的分析都进行了对比答:芥数据库。通过邻域法、实验法、共表达法、基因融合法、数据库法、共现法等不同的预测方法获得PPI信息。用中等置信截止值(0.400)将关联可视化答:芥作为标准的有机体。

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。种子来自可可研究中心/可可种植计划执行委员会(cepec /CEPLAC)的可可种质资源库(ilhsamus, Bahia, Brazil;http://www.ceplac.gov.br/）.国际可可种质数据库(ICGD) (http://www.icgd.rdg.ac.uk/)提供有关TSH 1188(本地名称:TSH 1188;登录号:28 ' 5)和Catongo(当地名称:SIC 802;登记号:24)。接种物为Mp4145，来自巴西巴伊亚州伊尔海姆斯的CEPLAC/CEPEC，加入号4145 (CEPLAC/ CEPEC植物病理学)m .孢系列CEGEN N°109/2013/SECEXCGEN)。

2 d页面:

二维电泳

戴45:

接种后45天

72年海:

接种后72 h

H₂O₂：

过氧化氢

质/女士:

液相色谱-质谱法

PAMP时:

病原体相关分子模式

纤毛运动:

细胞程序性死亡

PPI:

蛋白质相互作用

公关:

Pathogenesis-related蛋白质

ROS:

氧化氧

UPLC:

超高效液相色谱法

我们要感谢CEPEC/CEPLAC植物病理学实验室工作人员对担子孢子收集和接种程序的支持。作者感谢Louise Araújo Sousa (Ceplac)和Rangeline Azevedo (UESC/Ceplac)在植物接种实验中的技术帮助。Edson Mario (UESC)帮助获得同源蛋白。同时，感谢CBG/UESC蛋白质组学实验室的工作人员支持2DE-PAGE的制作。作者感谢dr。Roberto Sena Gomes和Raul Valle对手稿的批判性阅读。

这项工作得到了国家环境保护协会Científico e Tecnológico (CNPq/Brazil)第311759/2014-9号和巴西巴伊亚州健康与发展基金会(FAPESB/Brazil) (PRONEM PNE 005/2011)的资助。ECS获得了FAPESB的硕士学位发展资助。FM, KPG和CPP获得了CNPq的生产力补助金。资助机构没有参与研究的设计和数据的收集、分析和解释，也没有参与论文的撰写。

从属关系

1. 圣克鲁兹州立大学生物科学系(DCB)，生物技术与遗传学中心(CBG)，巴西巴伊亚州伊尔海默斯，45652-900，罗多维亚伊尔海默斯-伊塔布纳16公里

   埃弗顿克鲁兹多斯桑托斯，卡洛斯普里米尼奥皮罗瓦尼，法比安内米切利和卡琳娜佩雷斯格拉马乔

2. 干细胞实验室，骨髓移植中心(CEMO)，国家癌症研究所(INCA)，里约热内卢，RJ，巴西

   埃弗顿克鲁兹多斯桑托斯和斯蒂芬妮克里斯蒂安科雷亚

3. CIRAD, UMR AGAP, F-34398，法国蒙彼利埃

   Fabienne Micheli

4. 可可研究中心(CEPEC)分子植物病理学实验室，CEPLAC, Km 22 Rod。伊尔海姆-伊塔布纳，伊尔海姆，巴伊亚州，45600-970，巴西

   卡琳娜·佩雷斯·格拉马乔

贡献

ECS、KPG和CPP负责实验的构思和设计、数据分析和论文撰写;ECS负责所有实验的执行;SCC参与了PPI的构建、分析，并帮助建立了建议的模型;KPG, CPP和FM在工作的所有步骤中提供实验室基础设施和智力合作。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到卡琳娜·佩雷斯·格拉马乔。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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