利用特定长度扩增片段(SLAF)测序和QTL定位构建了高密度的芝麻种子相关性状遗传图谱(胡麻属indicuml .)

背景

芝麻(胡麻属indicumL。2n= 2x= 26)是含油量高、粒型小的重要油料作物。为了揭示种子相关性状的遗传位点，我们构建了一个高密度单核苷酸多态性(SNP)连锁图谱₂利用特异长度扩增片段(SLAF)技术，确定了芝麻种子相关性状的数量性状位点(qtl)_3.后代。

结果

该遗传图谱由2159个SNP标记组成，分布在13个连锁群(LGs)上，全长2128.51 cM，相邻标记间平均距离为0.99 cM。QTL定位发现19个具有表型效应的主效QTL (R²)超过10%，即种皮颜色qtl 8个，种子大小qtl 9个，千粒重(TSW) qtl 2个。特别是LG04和LG11，由于位置接近或相同，种皮颜色性状和种子大小性状的QTL区域是重合的。共筛选和分析了155个种皮色候选基因、22个种子大小性状候选基因和54个TSW性状候选基因。

结论

本文首次利用F - 1基因对芝麻种子相关性状进行QTL定位₂人口。研究结果揭示了芝麻种子相关性状特异性标记的定位，为进一步研究芝麻种子品质性状提供了依据。

芝麻(胡麻属indicumL.)，二倍体种(2n= 2x= 26)，是国内最古老、最重要的油料作物之一，基因组大小较小，仅为354mb [1，2]。芝麻富含不饱和脂肪酸和天然抗氧化剂(如芝麻素和芝麻醇)，是营养丰富的来源[3.，4]。目前，芝麻已在亚洲、非洲和南美洲的许多热带和亚热带国家得到广泛种植，2011年至2016年全球平均年产量为582万吨(粮农组织数据)，收获面积为981万公顷。芝麻抗旱能力强，适应各种土壤类型和栽培方式。然而，由于其种子体积小，其生产面临着与许多作物类似的挑战，如发芽率低，生长缓慢，幼苗对环境条件的耐受性低，最终影响作物产量[5，6，7，8]。因此，增加种子大小和提高种子品质都是芝麻生产的重要方面。

在作物中，种子大小是一个复杂的数量性状，通常用三个指标来描述:种子长度、种子宽度和种子厚度[9，10，11]。迄今为止，水稻中已经报道了许多与种子大小性状相关的数量性状位点(qtl)或基因[12]，玉米[13]和小麦[5]。在番茄,fw2.2基因是影响果实重量的重要位点，是心皮细胞分裂的负调控因子[j]。14，15]。其他与种子有关的数量性状包括种子重量和种皮颜色。芝麻的千粒重(TSW)由1.82克至4.74克不等[16]。近年来，利用全基因组关联研究(genome wide association study, GWAS)检测到5个与油籽产量显著相关的候选基因[17]。成熟的芝麻最常见的颜色是黑色和纯白，不太常见的色调有灰色、棕色、金色、黄色、浅白色等。芝麻品种种皮性状与种子生化特性、抗氧化能力甚至抗病能力有关，被认为是种内进化的标志胡麻属［18，19，20.，21，22]。到目前为止，使用F - qtl检测到4个种皮颜色qtl₂人口(23]。根据GWAS方法共确定了32个种皮颜色位点附近的候选基因[24]。然而，据我们所知，芝麻中与种子大小性状相关的QTL和基因的定位尚未见报道，控制种皮颜色和种子重量的基因也尚未在该物种中被鉴定。发现与种子大小、种皮颜色和种子重量有关的QTL和基因是发展芝麻分子育种技术的必要条件。

新一代测序技术(NGS)的发展使快速构建高密度或超密集单核苷酸多态性(SNP)遗传图谱成为可能，从而在许多作物中进行基于图谱的基因鉴定[25，26，27，28]。对于芝麻，已经构建了6个高密度分子遗传图谱，用于芝麻基因组组装和基于图谱的基因克隆[23，24，29，30.，31，32，33]。特别是利用全基因组重测序方法构建超密集SNP遗传图谱，促进了芝麻基因克隆和基因组学研究[32，34]。基于连锁作图法和候选变异体筛选，Sidt1控制花序的确定性和Sicl1控制叶片卷曲和蒴果不裂，克隆成功[32，34]。

为了阐明芝麻种子相关性状的遗传机制，我们对一种芝麻种子的种子大小、TSW和种皮颜色性状进行了遗传表征_3.人口。利用特定长度扩增片段测序(SLAF-seq)方法构建高密度遗传图谱，确定了芝麻籽粒大小、籽粒重和种皮颜色性状相关的显性QTL，并对QTL区间内的候选芝麻基因进行了分析。研究结果为进一步分析芝麻种子相关性状的遗传调控奠定了基础。

大豆种子相关性状的表型分析_3.两种环境下的后代

在芝麻中，种子的外观质量涉及种子大小，种子重量和种皮颜色。为了揭示上述种子相关性状的遗传基础，本研究以高邮8号(母本，白色种子)和干直6号(父本，黑色种子)两个芝麻品种为材料构建了杂交群体。对种子大小、总重、种皮颜色等17个性状的表型变异进行了分析_3.在两个不同的环境中长大的一代和两个父母进行了调查(图2)。1和2;表格1）.

对籽粒大小相关的7个指标进行分析，从变异系数来看，SA、SL、SP、SD和SW的值波动明显(简历)，在122个后代系中进行了两次田间试验。在F的低水比中观察到正海侵偏析_3.人口。方差分析表明，在两种环境下，SL、SW、SP、SD和SA性状的偏度和峰度绝对值均< 1，在HN(2014)中，LWR和SC性状的偏度和峰度绝对值均< 11）.除SP、SD和SA外，结果与频率分布结果基本一致。利用方差分析和频率分布分析，SL、SW、LWR和SC的近正态曲线分布表明遗传控制模式为多基因模式，而SP、SA和SD在频率分布分析中呈双峰分布，表明主要效应基因的参与(图2)。1;表格1）.

为了揭示上述种子相关性状之间的关系，我们对F_3.在两个田间试验中的种群(附加文件)1:表1)。籽粒大小与(PSL、SW、SP、SA之间的差异均≤0.01)。SD值与SL、SP、SA呈显著正相关，SC值与SL、SP、SA、SD呈显著负相关(P≤0.01)。但部分指标的相关性受到环境的影响。其中，LWR与SP、SD、SA呈显著正相关(P≤0.01)，而SW与SC呈显著负相关(P≤0.01)。

同时，HN站TSW偏度和峰度绝对值均< 1(2014)(表1)1）.近正态频率曲线分布表明该性状受多基因控制(图2)。1）.TSW值也随负海侵偏析的出现而显著变化_3.两个田间试验的种群数(HN, 1.18-3.19 g);YY, 1.17-2.77 g)，但两亲本的值相近(表2)1）.此外，籽粒重与7个种子大小性状的相关关系也受环境的影响。除LWR外，各种子大小性状均呈极显著正相关(P< 0.01)与HN位置的TSW呈负相关，而SL、SW、SP、SD和SA呈负相关(P≤0.05)。LWR与TSW仅在HN处理中存在显著负相关(P≤0.01)1:表1)。

在种皮性状上，高邮8号和干枝6号亲本的L*、a*和b*值与F_3.个体差异显著(表1)1）.F中的L*值_3.人口分布在18.49 ~ 62.19之间;HN站点a*和b*值分别为0.08 ~ 10.46和- 0.20 ~ 27.24。在P≤0.01水平上，种皮颜色空间的全试验相关系数均为极显著正相关2表2)。在F区_3.在种群中，种皮颜色空间以典型的定量方式呈现，并呈双峰分布(图2)。2）.结果表明，白、黑、黄三色在F_3.人口。

SLAF-seq数据分析及SLAF标记物鉴定

为了在高密度SNP遗传图谱中定位与种子相关性状相关的基因或标记位点，我们对122f的基因进行了测序₂采用高通量测序方法，对亲本高邮8号(白色种子)和干直6号(黑色种子)进行测序。结果，共获得26.31 Gb基因组数据，Q30比值高的测序数据占82.98%(附加文件)3.表S3)。甘植6号和高邮8号的覆盖率分别为35.97倍和37.60倍。Illumina数据对F₂个体为1.97 ~ 9.29倍，平均为5.17倍。

基于芝麻参考基因组序列(http://ocri-genomics.org/Sinbase_v2.0)，甘植6号(父本)和高邮8号(母本)的SLAF特异性标记分别为123,679和133,354个。对于122 F₂每个样本的SLAF标记数在50,181 ~ 113,301之间，平均为95,887个(附加文件)3.表S3)。在检测到的141313个优质slaf中，9134个在父母双方之间存在多态性，多态性比为6.46%(表6)2）.其中8159个多态性标记可划分为8种分离模式。

在构建遗传图谱之前，筛选两亲本中不同基因型的纯合标记。根据F₂群体中，最终选择6682个标记构建SNP遗传图谱。在6682个标记中，2650个标记在亲本和子代的序列深度分别大于10倍和2倍。所有2650个标记包含70%以上的SLAF标签完整性。

高密度遗传图谱构建与结构分析

最后，2650个标记中的2159个被映射到13个LGs上。3.;表格3.）.地图上所有标记物的平均完整性较高，达93.15%。SLAF分子遗传图谱中，13个LGs的总长度为2128.51 cM3.）.最大的LG是LG11 (195.42 cM)，锚定175个标记;最小的LG是LG07 (103.01 cM)，锚定108个标记。LG平均长度为166.00 cM，平均标记密度为0.99 cM/个SLAF标记。Gap≤5所反映的标记间连锁度范围为95.40 ~ 100.00%，平均为97.86%。这张地图上最大的缺口位于LG11，长度为15.00 cM。

SLAF遗传图谱共有3种类型的标记，即“SNP_only”标记2142个(99.21%)，“InDel_only”(插入-删除)标记8个(0.37%)，“SNP&InDel”标记9个(0.42%)3.）.在2142个优势标记中，739个(34.5%)标记具有两个以上SNP位点，其余1403个(65.5%)标记具有单个SNP位点。在2159个标记中共检测到3129个SNP位点(表2)3.和4）.R (A/G)(32.85%)和Y (C/T)(30.43%)是主要的转换型，其次是M (A/C)、K (G/T)、S (C/G)和W (A/T) 4种转换型。以上4种翻转类型所占比例为8.44% ~ 10.13%，占所有snp的36.72%。

高密度遗传图谱上SNP标记的分离畸变

统计结果显示，遗传图谱上共有343个标记表现出分离扭曲的显著性(P< 0.05)5）.这些SNP标记均为“SNP_only”型，除最小的LG07外，大部分分布在LGs的末端。最大的LG (LG11)和最小的LG (LG07)上标记的偏析失真频率分别为53.14%和100.00%。另外，在9个LG11上检测到11个sdr，其中LG11的sdr数量最多(表1)5）.

两种环境下种子相关性状的QTL定位

根据上述表型数据和LGs，我们采用复合区间作图方法确定了种子大小、种子重和种皮颜色性状的qtl(表3)6）.共有31个种子相关qtl (R²≥5%)位于8个连锁群中，单个性状检测到1 ~ 3个qtl(表5)6）.其中，种皮性状的14个qtl位于LG04、LG09和LG12。在5个LGs中定位了14个与种子大小性状相关的qtl。对于TSW，在LG04、LG09和LG12中发现了3个qtl。在31个qtl中，有19个主要效应qtl被R检测到²≥10%，10个qtl (R²≥10%)，QTL区域相似(表2)6）.

在5个lgg的8个区域共检测到14个种子大小性状的qtl，在一个环境下的贡献率为6.43 ~ 15.12%，其中LG01和LG11的qtl占比超过64%。14个qtl中有9个单独解释了10%以上的种子大小表型变异，LOD > 3(表2)6)，而甘植6号除qsc1和qsc2．其他qtl的多效性效应也与它们接近或相同的位置有关，特别是对于贡献率较高的qtl。在4个种子大小性状LGs的4个区域中发现了并置的QTL区域，且包含一个以上的主位点。尤其在165.41 cM处，LG11含有4个带R的qtl²> 10%;所有负加性效应的基因座均来自父本。与此同时,qsp11分布在LG11的164.51 cM处，表型解释率为13.97%。

在种皮颜色性状方面，我们检测到14个qtl(表2)6）.这14个qtl全部锚定在3个LGs的7个区域;其中有8个qtl具有较高的解释值，解释值≥10.0%。14个位点的正加性效应由高邮8号等位基因贡献，解释了表型变异的5.58 ~ 33.25%。在LG04上发现了3个位点，而在78.19 cM、79.58 cM和80.89 cM处至少有2个(或更多)种皮颜色相关指标qtl。两个法,qscca * 9和qsccZ9，紧靠LG09。因此，这些位点可能对芝麻的外壳颜色有多重影响(表1)6）.

此外，qtlqtsw4和qtsw9，分别占表型解释的15.09和6.90%，在HN区检测到LOD > 3的TSW。这两个基因座对父本等位基因具有负加性效应。相比之下,qtsw12来自母本，正加性效应为14.17%，解释了YY田间条件下19.56%的表型变异(表6）.

候选基因注释

为了确定与上述三组种子性状相关的候选基因，我们筛选了稳定qtl (R²≥5%)(表7）.在置信区间内共有469个基因。除种皮颜色空间和种子大小性状两个置信区间不存在候选基因外，其余qtl的置信区间均存在候选基因。469个已知蛋白基因中有439个功能标注，其中种皮颜色空间157个，种子大小性状116个，TSW性状166个。对于种皮性状，分别用GO、KEGG和COG标记了108个、28个和44个基因。同时，种子大小性状116个候选基因中有97个、32个和48个在GO、KEGG和COG中有注释，166个候选基因中有123个、34个和66个在TSW中有注释。在主要qtl的置信区间(R²≥10%)，231个(52.62%)具有功能注释的预测基因被筛选为芝麻种子相关性状的候选基因(表2)6和7）.

在种子大小性状的间隔上，有22个候选基因(5.01%)存在于带R的侧翼序列中²≥10%(表6和7）.根据GO注释信息中每个基因的功能，细胞组分类(6个分支)、分子功能类(4个分支)和生物过程类(13个分支)涉及的基因分别有41个、20个和56个，其中一些基因具有多种功能，可以分为两种或两种以上的功能类别。其中，细胞组分类涉及的基因大部分来自细胞(12个基因)、细胞部分(12个基因)和细胞器(9个基因)三类，分子功能类涉及的基因大部分涉及催化活性(10个基因)和结合(6个基因)，生物过程类涉及代谢过程(14个基因)和细胞过程(12个基因)三类。在KEGG分析中，在核糖体(ko03010)和植物激素信号转导(ko04075)两条途径中鉴定出4个基因，每条途径有2个基因。在COG分析中，共将22个基因分为7类，其中5个基因仅具有一般预测功能，3个基因具有转录功能;复制、重组和修复;信号转导(signal transduction)各有4个基因(18.18%)。

对于TSW, 54个(12.30%)候选基因进行了功能注释(表2)6和7）.GO分析结果显示，在细胞组分类的7个分支中检测到79个基因，在分子功能类的10个分支中检测到46个基因，在生物过程类的14个分支中检测到101个基因。在细胞成分类别中，细胞部分、细胞和细胞器涉及的基因数量最多，分别为20个、19个和17个基因。在分子功能类别中，分别有21个基因和16个基因被标注为催化活性和结合。在生物过程类别中，25个基因被注释到代谢过程，22个基因被注释到细胞过程。在KEGG分析中，在8条通路中鉴定出9个基因。在植物激素信号转导(ko04075)通路中发现2个基因，在其他7个通路中发现1个基因。在COG分析中，8个基因仅具有一般预测功能。其余21个基因中，5个与信号转导机制有关，4个与转录复制机制和重组修复机制均有关。同时，有3个基因与翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白有关，2个基因与脂质转运和代谢有关。 No more than one gene was found in other functions in COG classification.

在种皮颜色性状相关区间，共发现候选基因155个(35.31%)6和7）.在氧化石墨烯分析中，107个基因被分为33个分支，其中细胞组分类基因296个(10个分支)，分子功能类基因101个(7个分支)，生物过程类基因309个(16个分支);有些基因具有多种功能，可以分为两种或两种以上的功能类别。在细胞成分类别中，细胞部分和细胞涉及的基因数量较多，分别为74个基因和72个基因。在分子功能类别中，大多数基因参与催化活性(45个基因)和结合(42个基因)，而参与生物过程类别的大多数基因被注释到代谢过程(69个基因)和细胞过程(58个基因)。在KEGG分析中，在21条通路中鉴定了30个基因。KEGG富集分析显示，显著富集的途径为二萜类生物合成途径(ko00904)，涉及5个基因(16.67%)。将54个基因分为16类进行COG分类和预测分析。除一般预测功能外，基因数量最多的4个类别是转录(6个基因，11.11%)、能量产生和转化(5个基因，9.26%)、复制、重组和修复(4个基因，7.41%)、翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣(4个基因，7.41%)。COG分类中其他功能的基因不超过3个。

基因分析

种子大小、总重和种皮颜色是重要的种子外观特征。选择参考性状差异显著的两个完全纯合亲本进行种内杂交，构建了2159个位点的芝麻新遗传图谱，探索了种子相关性状的遗传基础，并鉴定了重要的qtl。为了提高数量性状遗传分析的精度，我们在两个环境中采用大的实验组对所有性状进行分离分析。分析了两种环境中表型性状的频率分布，发现不同地方的平均值相似。

籽粒大小与(P2个田间试验的相关系数分析显示，SL、SW、SP、SD和SA之间的相关系数均≤0.01)。SC值与SL、SP、SD、SA、LWR呈极显著负相关(P≤0.01)。种子大小是水稻产量构成的一个重要因素。种子大小的主要指标有SL、SW、种子厚度(ST)和LWR，其中SL是水稻种子大小的最佳指标[j]。10，35]。因此，未来对种子大小性状的研究应包括SL和SC的遗传模型。种子重是与SL、SW和ST密切相关的典型数量性状[5，12，13]，我们分析了7个重要种子大小性状与TSW的相关性。结果表明:5个种子大小性状(SL、SW、SP、SD、SA)和TSW与2014年HN条件下的产量呈显著正相关(P≤0.01)，与2015年YY (P≤0.05)。TSW、SL、SW、LWR和SC的近正态曲线分布表明遗传控制存在多基因模式。本研究首次揭示了芝麻种子大小性状是一种复杂的数量性状，受多基因控制，对环境变化敏感。因此，有必要对种子表型相关性状进行反复检测，以获得可靠的QTL定位，并对基因的遗传效应、遗传力和基因组功能进行进一步研究，以阐明控制种子相关性状的分子机制。水稻是生物学研究的模式作物，其种子大小影响产量和商品品质[9，10，11，12]。本研究开启了芝麻籽粒大小的研究，对提高芝麻的产量和外观品质具有重要意义。

种皮颜色是芝麻重要的农艺性状，与蛋白质和油脂代谢生化、抗氧化活性和抗病水平密切相关[j]。18，19，20.，21，22]。Zhang等。[23]等文献报道，芝麻种子颜色是一个复杂的数量性状，主要受两个主基因和多基因的遗传因素控制，具有加性-显性-上位性效应。在遗传分析中，Wang等。[24发表了黑色占主导地位的白色为芝麻的外衣颜色。F₁白芝麻和黑芝麻杂交的种子颜色都是黑色的，因此黑色的种子颜色是通过延迟遗传或预定遗传来表达的。Wang等人的研究结果[24表明L*、a*和b*的芝麻种皮颜色指标以黑色、白色和黄色为主。在F区_3.高优8号(白色种皮)和干枝6号(黑色种皮)的种间杂交群体中，大部分种色空间存在正、负海侵隔离。种皮颜色表现出典型的数量特征，与种皮颜色相关的9个指标的表型变异呈显著相关，表明遗传因素在该性状中发挥了重要作用。种子颜色空间如L、a、b、L*、a*、b*等呈双峰分布，表明主要效应基因的参与，这与前人的研究结果一致[23，24]。调控种皮性状的基因数量在不同作物中存在差异，控制种皮性状的基因范围为1 ~ 3个[36，37，38，39，40，41，42]。种子颜色性状相对稳定，不受环境因素影响[43，44，45]。在我们的芝麻基因组计划(www.sesamum.org) [2]，对基因克隆、进一步的基因组组织和功能的研究对于研究种皮颜色与重要生化过程之间的相关性至关重要[18，19，20.，21，22]。

遗传连锁图

QTL定位，借助高分辨率的遗传连锁图，通常用于定位与特定性状相关的候选基因[26，46]。芝麻是一种自花授粉的作物，所有的芝麻都是来自唯一栽培的芝麻品种美国indicum［47，48，49，50]。因此，芝麻的遗传基础较窄，具有多态性的通用分子标记较少，如简单序列重复和snp [23，33，47，51]。基因分型技术是一种在短时间内产生足够多态标记以构建高密度遗传图谱的高通量技术。先前已经使用SALF-seq和限制性内切位点相关DNA测序(RAD-seq)技术基于减少表示基因组测序构建了芝麻的四个SNP图谱[24，29，31，33]。

snp已成为许多进化和生态选择的理想标记类型，因为它们是基因组中最丰富和最频繁的遗传变异形式[52]。在这项研究中，我们使用slf -seq方法构建了一个高密度的芝麻遗传连锁图谱，该方法是最近发展起来的，首次实现了芝麻SNP和InDel标记的快速质量鉴定。SLAF是通过对序列特异性限制性内切片段长度的对端测序来测量的，而RAD序列是通过限制性内切酶作用后随机中断的基因组DNA来测量的。因此，SLAF比RAD具有更好的重复性，可以生成大量的序列信息，处理全基因组密度分布。同时，该技术在较高的基因分型准确性和相对较低的测序成本之间取得了平衡。在这项研究中，我们发现了2000多个snp;整个基因组中snp的发生率为6.46%，高于Zhang等报道的5.12%。[33]。大多数snp属于R (A/G)型(32.85%)和Y (C/T)型(30.43%)，这与之前在芝麻中发表的观察结果一致[31，33]和其他物种，甚至包括人类[53]。该新图谱具有比其他利用类似技术的芝麻遗传图谱更优越的特征，例如:(1)更大的F₂采用122个个体的隔离种群;(2) 2159个标记相对饱和，其中“SNP_only”型标记2142个;(3) 13个LGs与芝麻核型中的13条染色体匹配(2n = 26)，可用于精细基因组组装;(4)估算的芝麻基因组长度为2128.51 cM，显著长于已有的1216 cM和1474 cM图谱，平均标记距离为0.99 cM。因此，本研究获得的芝麻种质资源图谱具有较好的优势，将为芝麻种质资源QTL/基因定位、比较基因组学研究、图谱克隆等领域的发展做出贡献。由于该遗传图谱的构建和整合主要基于两个芝麻品种产生的SNP, SNP侧翼序列为80 bp，因此作为研究界的通用工具，该图谱的实用性存在局限性。由于连锁不平衡(LD)的衰减距离(150 kb)和基因组大小(流式细胞术计算为369 Mb) [23]，一个理想的饱和遗传图谱应该基于2500个以上的snp，均匀分布在芝麻的13个LGs上。2016年，Zhang等。[32采用基因组重测序策略构建了芝麻的超密集SNP遗传图谱，其中平均标记密度约为每0.98 cM 1 bin或每0.1 cM 1 SNP。

在许多研究中，分离畸变已被报道为一种普遍现象，如果使用得当，可以有利于QTL分析[54，55，56]。首先，利用孟德尔标记构建核心遗传图谱。然后，将分离失真标记单独插入到现有的地图中，并采用与Wang等人类似的方法对标记之间的重组分数进行迭代处理。[qh]57]。结果，343个(15.89%)分离扭曲的标记被映射到最终的图谱中，分布在13个LGs中10个的末端附近，而79个(10.91%)[23]， 205 (16.63%) [33]， 115 (9.35%) [31在其他基因图谱上也发现了标记。在我们的地图中，有9个地表上发现了11个特别提款权，而在11个地表上发现了18个特别提款权[33]及四份特别提款权在四份立法会上[31]在其他SLAF地图中发现。

种子相关性状的QTL鉴定

本研究通过对芝麻17个重要种子性状(9个种子色空间、7个种子大小性状和TSW)的QTL分析，鉴定出31个相关区域。LOD > 3的表型变异贡献率超过10%的qtl有19个，其中8个为种皮色qtl, 9个为种子大小qtl, 2个为TSW qtl。

在种皮颜色qtl中，qsccY9，qsccZ9，qsccb * 4,qscca * 9发挥了主要作用，分别解释了33.25%、32.88%、23.10%和20.02%的表型变异qscca * 4，qscca4-1，qscca4-2,qsccb4被认为是多基因，因为它们的贡献相对较低。在本研究中，大部分种皮颜色空间均存在显著的相关，说明这类性状的控制因素可能是密切相关或多效性遗传因子。在LG04 (78.19 cM、79.58 cM、80.89 cM)上检测到3个多效性基因座，分别含有10个、49个和2个候选基因。特别是,qscca * 4和qscca4-2分布在79.58 cM处，分别解释了19.09和19.79%的表型变异，LOD > 10，与经典遗传分析结果一致。其他主要的多效种皮颜色位点位于LG09。的基因qsccZ9 qscca * 9日,qsccY9位置很近，显示出R²值大于20%。遗传力、标记密度和样本量决定了两个qtl之间的独立性[58]。当QTL遗传力为10%时，标记密度为15 cM，样本量为300 F₂或F_3.在种群中，两个qtl相邻的概率为80%。qscca * 9，qsccZ9,qsccY9本研究在LG09中检测到的QTL距离非常接近，QTL距离约为10 cM，遗传力大于20%，标记密度为1.11 cM。因此，我们估计这些QTL可能是LG09区域一个更大QTL的三个部分。我们将继续研究基因的遗传效应和遗传力，以进一步证实这一假设。Wang等人也报道了芝麻种皮颜色基因座对表型的高贡献率[j]。24]， Zhang等。[23]。Wang等。[24]检测到9个与种皮颜色相关的qtl，贡献率为3-46%，分别位于LG04、LG08和LG11的4个位点上。qscl - 4.1在4号染色体199.9 kb的区域上发现了L*、a*和b*颜色空间值的多效性位点，该位点分布在bin标记SLG4_bin63 (50.4 cM)和SLG4_bin64 (50.9 cM)之间，包含32个候选基因。Zhang等。[23]检测到4个芝麻种皮颜色qtl，贡献率在9.6 ~ 39.9%之间，但这些位点主要被应用片段长度多态性标记定位在独立的遗传图谱上。因此，我们无法确定它们与本文所述基因座的关系。

最后，检测到9个与种子大小有关的qtl和2个与TSW有关的qtl。这是在芝麻中首次报道的与种子大小相关的qtl，它们的遗传控制主要由带R的主qtl组成²≥10%。此外，一些种子大小相关性状之间的显著相关性可能表明控制这些性状的遗传因子密切相关或多效性。几个qtl的共定位证明了这一点。SC与LWR呈显著负相关qsc2高邮8号(母本，白色)等位基因的加性效应为正ql / w2甘植6号(父本，黑色)等位基因在LG02上具有负加性效应。与此同时,qsl11，qsd11，qsa11,qsw11甘植6号(父本，黑色)等位基因在0.82 cm区域配置在LG11上，贡献率为12.39 ~ 15.12%，与SL、SD、SA和SW呈显著正相关。然而，由于未检测到的QTL的影响或多效性或连锁以外的原因，QTL共定位并不等同于性状之间的相关性。人们已经做出了许多努力来准确剖析连锁qtl以解释这些存在的矛盾，或者筛选具有优秀等位变异的种质以促进育种。

种子性状是影响芝麻产量和品质的关键因素之一。本研究获得了与种皮颜色、种子大小和种子重量有关的重要qtl，为芝麻种子相关性状的标记辅助选择奠定了初步基础。高优8号(母本，白色)种皮颜色相关qtl均表现出正加性效应，而甘植6号(父本，黑色)种皮颜色相关qtl则表现出负加性效应。这些结果将提高种子相关性状的选育潜力，并为产量、种子含油量或蛋白质含量等一系列重要农业性状的研究提供一个有效的体系。

候选基因功能分析

在R的置信区间内共有231个候选基因²≥10%(表6和7）.种皮颜色性状在COG分析中有16个功能类别。在转录和能量的产生和转化过程中，候选基因的数量较多。在KEGG分析中，基因数量最多的前两个途径是二萜类生物合成和氧化磷酸化，分别包含5个基因和2个基因。Chang等。[59]发现芝麻皮醇提物具有抗氧化成分，可能是酚类物质和萜类物质。氧化磷酸化是一个重要的能量转换过程，驱动ATP合成。我们预测了49和74个候选基因的置信区间为qscca * 4和qsccY9其中一些可能在种皮颜色的调节中起作用。为qscca * 4，标注的基因主要有谷氨酸脱氢酶(SIN_1016757)、E3泛素蛋白连接酶(SIN_1012044和SIN_1012049)、多酚氧化酶(SIN_1016759)、ATP结合蛋白(SIN_1016750)、转录延伸因子A蛋白(SIN_1012051)、五肽重复序列蛋白(SIN_1012034)等。根据以前的研究，SIN_1016759和SIN_1012034(附加文件)4:表S4)可能与种皮颜色的形成有关[17，60，61]。种子颜色的变化与多种色素有关，包括黄酮醇、原花青素(类胡萝卜素含量的浓缩单宁)，以及潜在的其他酚类化合物，如木质素和黑色素[62]。多酚氧化酶(PPO)在原花青素、木质素和黑色素生物合成的氧化步骤中出现，导致种皮颜色较深[63，64]。许多编码类黄酮生物合成酶的基因已被克隆拟南芥［65]，葡萄[66]和大豆[67]。Wei等。[17报道了基因编码PPO(SIN_1016759)来调节芝麻种皮的黑色。通过生物信息学筛选，发现了五肽重复序列(PPR)家族拟南芥蛋白质(68]，并且在这些细菌中检测到超过450个编码PPR蛋白的基因拟南芥水稻基因组[69]。大多数PPR蛋白被预测以线粒体为目标[70，71]或叶绿体[72，73，74，75]。PPR蛋白也可能控制植物的昼夜节律[76]。编码PPR蛋白的基因可能与南瓜果皮颜色性状有关(Cucurbita moschata杜赫)(77]。为网站qsccY9其中，SIN_1022635编码一种铵转运蛋白，SIN_1022704编码一种脂氧合酶(LOX)， SIN_1022679和SIN_1022680编码蛋白质COBRA(附加文件)4:表S4)。这些基因可能对种皮颜色有贡献[78，79，80]。LOX是一种非血红素、含铁双加氧酶家族，它催化含有顺式、顺式-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的氢过氧化物，这种氢过氧化物被认为是苦味和草味的前体[81，82，83，84]。1928年，Bohn和Haas发现，在小麦粉面团中加入少量大豆粉会降低小麦的正常黄色[85]。随后，人们发现lox参与了这种颜色的丧失[86]。从那时起，许多食品科学家和大豆育种家开始对大豆种子LOXs的漂白活性感兴趣β-胡萝卜素或用于大豆种子中LOX同工酶的检测β胡萝卜素(84，87]。近年来，对COBRA蛋白的研究主要集中在一些模式植物上。COBRA蛋白与植物根、茎、叶组织细胞壁的生物合成密切相关，其功能已被探索。COBRA是植物特异性糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定蛋白家族的一员，在控制细胞壁纤维素含量和细胞扩增方向方面发挥重要作用[j]。88，89，90，91]。

种子大小和总重在COG分析中分别有7个和9个功能类别。在复制、重组和修复、信号转导机制和转录方面，候选基因的数量最多。在KEGG分析中，植物激素信号转导途径包含两个决定种子大小和TSW的基因，核糖体途径包含两个决定种子大小的基因。植物激素信号通路在植物防御反应中不是单独作用的，它们之间存在着串扰，是抵抗不同类型病原体入侵的有效策略[j]。92]。此外，核糖体还参与蛋白质的合成和一些植物激素的调控，如生长素和赤霉素。这些基因可能有助于抗病性和植物生长，并最终与种子相关的性状，特别是TSW。我们检查了解释率较高的芝麻种子大小多效位点，在置信区间内找到了11个候选基因qsa11．这些基因的注释揭示了它们在调节种子大小方面的潜在功能。例如，SIN_1003683被预测编码有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)， SIN_1003684编码50S核糖体蛋白，SIN_1003687被鉴定含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)(附加文件)4:表S4)。STK是MAPK信号转导通路的重要组成部分。根据细胞环境的不同，MAPK/细胞外信号调节激酶级联调节转录、翻译和细胞骨架重排，然后介导多种生物功能，如细胞生长、粘附、存活和分化[93]。核糖体蛋白是核糖体的主要组成部分，在细胞内蛋白质的生物合成中起着重要作用。核糖体已被发现参与细胞外功能，如DNA修复、细胞发育和调控以及细胞分化[94]。为网站qsw5， SIN_1013822, SIN_1013833和SIN_1013848可能与种子大小密切相关(附加文件4:表S4)。在哺乳动物细胞中，线粒体转录终止因子(mterf)家族调节线粒体基因表达。近年来，核基因组编码的线粒体调控因子已被发现。MTERF2是一种与线粒体DNA结合的线粒体基质蛋白。过表达MTERF2可抑制细胞增殖[95]，但到目前为止，其机制还没有得到很好的定义。MTERF3是MTERF家族中最保守的成员，对哺乳动物线粒体DNA转录具有负调控作用[96]。DEAD-box解旋酶在DNA和RNA的复制、修复、重组、转录、翻译、核糖体生物发生和剪接等代谢过程中起着至关重要的作用，调节和控制着植物的生长发育[97，98]。生长素反应因子(ARFs)可能在脱落或许多生长素介导的过程中发挥重要作用，因为ARFs是在生长素反应基因启动子中结合生长素反应元件的转录因子[99，One hundred.]。

最后，我们检查了芝麻TSW的多效位点，在的置信区间内检测到117个候选基因qtsw9．SIN_1022989, SIN_1023052和SIN_1022987可能与TSW(附加文件)有关4:表S4)。三螺旋转录因子家族是一个在调节植物生长发育中起重要作用的小家族[101]并可能广泛参与植物对生物和非生物胁迫的反应[102，103]。目前，对三螺旋蛋白基因的研究主要集中在拟南芥［104]，烟草[105]和大米[106]。随着功能基因组学的发展，许多影响种子重量(大小)的基因已被成功克隆用于重要作物(水稻)和模式植物(拟南芥)，通过突变分析、图谱克隆、基因表达分析和功能验证。这些基因调节许多生化和遗传代谢途径，包括碳水化合物代谢[35]，泛素蛋白酶体[107，108]、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶[109)等。直到现在，Ranocha等人。[110报道说墙很薄。（WAT1液泡(液泡)是一种未知的植体定位的生长素转运体，这意味着液泡在调节植物细胞内生长素平衡中起着至关重要的作用。此外，外源生长素的应用可以挽救次生细胞壁增厚的减少wat1突变体，这意味着生长素可能在植物的次生生长中发挥重要作用。进一步的研究可能会证实它们的功能。该QTL定位结果可以进一步分析，以确定距离LOD值最高的标记最近的基因，并确认这些基因在芝麻种子相关性状中的功能。

综上所述，本研究首次提供了带有F基因的种子相关性状的QTL定位₂人口为芝麻。我们利用SLAF-seq测序共检测到3129个snp标记，并与InDel标记结合构建了高密度遗传图谱，InDel标记包含与芝麻染色体数量相同的连锁组数。对17个重要的种子相关性状进行了QTL分析，其中19个主效QTL解释了10%以上的表型变异，LOD > 3;其中，与种皮颜色空间相关的qtl 8个，与种子大小性状相关的qtl 9个，与总重相关的qtl 2个。其中，检测到10个QTL具有相似的QTL区域，部分解释了这些种子相关性状之间的相关性。qsc2(由母本贡献)和ql / w2(由父亲贡献)，qscca4-1和qsccb4(由母本贡献)和qscca4-2和qscca * 4(由母本贡献)被搭配在一起。四法,qsl11，qsd11，qsa11和qsw11，由父本贡献，位于LG11附近。在稳定qtl置信区间内共鉴定出469个候选基因²≥5%)，包括231个带R的主要qtl候选基因²值≥10%。为芝麻种子相关性状的下游遗传分析，如基因图谱克隆、标记辅助选择和基因组序列组装奠定了基础。

植物材料与栽培

以高邮8号(母本，白色种子)和干植6号(父本，黑色种子)两个芝麻品种为材料，构建杂交群体。两亲本在总重和种子长上也存在差异，高邮8号的总重较大，种子长较短。该品种来源于河南省农业科学院河南芝麻研究中心芝麻种质库。

共122°F₂从采收的黄芪种子中随机选择种子₁2013年在河南省鸳鸯试验站(34°16′n, 112°42′e)进行培养。122f的嫩叶₂收集个体和双亲，液氮冷冻，- 80°C保存，用于提取DNA。

随后，F_3.于2014-2015年生长季在海南省三亚试验站(18°15′n, 109°30′e)和河南省远阳试验站(34°16′n, 112°42′e)进行群体培养，进行种子收获和种子相关性状研究。三亚实验站位于中国最南端，属于热带海洋性季风气候，而沅阳实验站位于黄河冲积平原，属于大陆性暖温带季风气候。每行随机种植，每行长5.0 m，间隔0.4 m。每行保留16个植株，其他植株在开花期移走。成熟期，每系每行中间5个植株的种子收获并集中。

种子相关性状调查及数据分析

采用种子大小、总重、种皮颜色等17个指标反映芝麻种子相关性状。使用SC-G种子分析仪(Vision Detection Co. Ltd, Hangzhou, P.R. China)测量种子大小和种子重量。7个种子大小性状，即种子长(SL, mm)、宽度(SW, mm)、长宽比(LWR， %)、周长(SP, mm)、直径(SD, mm)、面积(SA, mm)²记录圆度(SC)和TSW (g)。采用ColorFlex EZ (HunterLab, Reston, VA, USA)软件研究种皮颜色性状，记录9个颜色空间(L*、a*、b*、L、a、b、X、Y和Z)的值。上述数据的频率分布、标准误差和相关系数分别使用Excel 2007和SPSS软件进行计算。

SLAF文库构建及高通量测序

在SLAF测序之前，改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[111]提取122f的基因组DNA₂个体和双亲。用1%琼脂糖凝胶和ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)用λ DNA阶梯标准液电泳检测提取DNA的质量。

SLAF测序文库按照程序构建[112稍加修改。两种酶,有三世和Hpy166II (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)用于消化基因组DNA, T4 DNA连接酶(New England Biolabs, USA)， ATP (New England Biolabs, USA)和双标记测序接头(page -纯化;随后加入Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，在37°C孵育得到的片段。这些稀释的限制性结扎DNA样品与dNTP, Q5®高保真DNA聚合酶和引物(page纯化;Life Technologies, USA)，然后进行聚合酶链反应(PCR)。混合后的产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)分离和纯化大小为264 ~ 364 bp的DNA片段(包括索引和接头)。对端测序(2 × 80 bp)在Illumina HiSeq 2500平台(Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)上进行，按照北京生物标志物技术公司(http://www.biomarker.com.cn）.

序列数据分组和基因分型

按照Sun等人的描述进行SNP鉴定和基因分型。[112]。质量分数低于20的读数被过滤掉。根据双工条形码序列将原始读数解复用到每个个体。将序列的条形码(0-3 bp)和末端位置(104-125 bp)进行裁剪后，使用SOAP软件将相同样品的干净序列映射到参考芝麻基因组序列上[113]。所有识别到相同位置且同源性超过95%的序列被认为是一个SLAF位点[114]。在每个SLAF中使用次要等位基因频率评估来定义等位基因。具有2个、3个和4个等位基因标签的slaf被鉴定为多态性和潜在标记。具有4个以上等位基因的SLAF位点作为重复SLAF被丢弃。根据基因型分析了多态slaf的标记码₂种群与分离类型(aa × bb)。

采用贝叶斯方法进一步确保基因分型质量[112]。首先根据等位基因覆盖率和SNP数计算后验条件概率。利用概率转化的基因型评分筛选优质标记进行遗传作图。筛选标准设置如下:过滤掉SNPs超过3个的slf;后代的平均序列深度大于2倍，亲本的平均序列深度大于10倍;对缺失数据大于30%的标记进行过滤。采用卡方检验检验偏析变形。

联动图构建

考虑到NGS数据的基因分型错误和缺失，采用HighMap策略对SLAFs标记进行排序、创建连锁组(LGs)和纠正基因分型错误[115]。详细最小生成树(MST)映射算法也用于对SLAFs标记进行排序[116]。采用SMOOTH算法按标记顺序对基因分型错误进行校正[117]。所有LGs的结构按以下步骤建立:根据有序标记之间的关系，根据其在参考基因组上的位置确定主标记顺序。通过SMOOTH算法校正基因分型错误或缺失。然后，应用MST图对序列进行排序，并使用SMOOTH对新的有序基因型进行4个或更多周期的校正。随机标注13个LGs的数量。每个LG的地图距离以厘米(cM)为单位，使用Kosambi的映射函数[118]。所有有明显分离扭曲的标记(P< 0.05)作为辅助标记最初被排除在图谱之外。将相邻位点超过3个且偏析扭曲显著(P < 0.05)的区域定义为偏析扭曲区(SDR) [119]。

QTL定位分析

采用rQTL包检测与各目标性状相关的qtl。采用复合区间映射法，步行速度为1 cM [120]。每个QTL区间的显著性采用似然比统计检验(似然率[LOD]评分)。LOD评分的显著性阈值(α = 0.01, 0.05或0.1)由1000个排列独立确定。基于排列，LOD评分为2.0作为声明特定基因组区域中存在QTL的最低值。QTL效应是根据Stuber等人描述的方法确定的。121]。

种子相关性状候选基因的鉴定

我们筛选了候选QTL区间(R²≥10%)，根据芝麻参考基因组物理序列(http://ocri-genomics.org/Sinbase_v2.0）.我们根据基因本体(GO)分析，根据Kolmogorov-Smirnov值最小的前10项对所有候选基因进行分类，并使用京都基因与基因组百科全书(KEGG)程序，通过前10项最小的路径识别相关通路p值(122]。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。

论坛:

生长素反应因子

cM:

厘摩

齿轮:

同源基团的簇

CTAB:

Cetyltrimethylammonium溴化

走:

基因本体论

谷歌价格指数:

Glycosylphosphatidylinositol

GWAS:

全基因组关联研究

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

格林:

连锁群

LOD:

几率的可能性

液态氧:

脂氧合酶

轻水反应堆:

Length-to-width比率

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

MST:

最小生成树

MTERFs:

线粒体转录终止因子

门店:

新一代测序

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

QTL:

数量性状位点

RAD-seq:

限制性位点相关DNA测序

山:

种子区域

SC:

种子循环

SD:

种子直径

特别提款权:

偏析变形区

SL:

种子长度

SLAF-seq:

特定长度扩增片段测序

SNP:

单核苷酸多态性

SP:

种子周长

圣:

种子厚度

STK:

丝氨酸/ threonine-protein激酶

西南:

种子宽度

天水围:

1000 -种子重量

本工作由河南省特种油料作物基因组学重点实验室和河南省油料作物改良重点实验室完成，作者在此感谢支持。

基金资助:中国农业科学研究体系专项基金(cas -14)、河南省科技重点项目(151100111200)、河南省农业科学院杰出青年科技基金(2013YQ27)。作者声明，没有任何资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写论文中发挥任何作用。

从属关系

1. 河南省农业科学院河南省芝麻研究中心，河南郑州450002

   杜华，张海洋，魏立斌，李春，段英辉，王慧丽

贡献

DH指导主要实验，进行数据分析，并撰写论文。WL、LC和DY进行了田间试验，并参与了数据分析。WH进行了材料调查和现场实验。ZH构思和设计实验，指导稿件的准备和修改。所有作者都阅读、编辑并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到海阳张．

伦理批准并同意参与

我们声明这些实验符合伦理标准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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