细胞学和转录组分析揭示了这一点gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba缺陷影响水稻绒毡层或花粉外壁异常相关基因的表达gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

作为世界的主要作物之一，米的无菌（gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba显著影响生产，导致产量下降。我们以前的研究表明gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，编码含有U-box结构域的73蛋白，可能与雄性不育有关。然而，关于花药发育所需的这个基因的信息很少。在目前的研究中，我们剔除了gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba通过使用CRISPR / CAS9系统并研究与水稻品种（Taicheng 65）中的花粉发育和无菌相关的基因缺陷的细胞学和转录组。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

序列分析表明gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba由3个外显子和2个内含子组成，其中CDS编码586个氨基酸，包含一个U-box结构域。的表达模式gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba表明它在减数分裂期间在花药中表达了高度表达。的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba花粉育性较低(19.45%)，显著低于野生型(85.37%)。细胞学观察显示减数分裂时期绒毡层液泡化，双细胞花粉期花粉外壁异常gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba．RNA-SEQ分析检测到2240下调和571个上调基因gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba与减数分裂时期的WT相比。在2240个下调基因中，已知的7个基因与绒毡层细胞死亡或花粉外壁发育有关，包括gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba（gydF4y2Ba细胞色素P450羟化酶703A3gydF4y2Ba)，gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba（gydF4y2Ba细胞色素p450羟化酶704b2gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba（gydF4y2Ba有缺陷的花粉墙gydF4y2Ba)，gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba（gydF4y2Ba对于顽固性绒毡Cell1gydF4y2Ba)，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba（gydF4y2Ba未开发Tapetum1gydF4y2Ba)，gydF4y2BaOSAP37.gydF4y2Ba（gydF4y2Ba天冬氨酸的protease37gydF4y2Ba） 和gydF4y2BaOsABCG15gydF4y2Ba（gydF4y2BaATP捆扎盒G15gydF4y2Ba），通过定量实时聚合酶链反应（QRT-PCR）验证。这些结果建议gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba可能在Tapetal或花粉外来发育中​​发挥重要作用，并导致花粉部分无菌性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的结果显示gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2BaU-box在水稻雄性生殖发育中起着重要的作用，这为水稻雄性生殖发育中U-box的分子机制提供了有价值的信息。gydF4y2Ba

米 （gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2BaL.）是全球人口中最重要的农作物之一，并提供超过一半的全球人口。提高粮食安全必需水稻粮食的生产率。然而，低种子环境是水稻产量的主要障碍;此外，雄性生殖发展与种子环境中的成功相关。gydF4y2Ba

众所周知，雄性生殖发育是涉及为性繁殖的单倍体花粉产生的关键生物过程;和撒母制定是男性生殖发展的主要活动[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．花药包括四叶结构，并且每个叶片包括微孢子囊肿，表皮，内皮，中间层和形态发生后的绦虫。Tapetum是花药的最内部细胞层，在微孔发育期间提供安全的周围，必要的营养和酶[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．在减数分裂后，Tapetum开始堕落，这被认为是编程细胞死亡（PCD）的过程。Tapetum降解促进花粉壁的形成并释放吉麦孢子。正常的绦虫降解对于在雄性生殖发育中生产可行的花粉粒，并且异常的绦虫降解通常会导致花粉无菌[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．在先前的研究中，在大米中发现了控制绦虫发育的一些基因[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．MYB转录因子(GAMYB)被认为是花粉发育的重要因素gydF4y2BagamybgydF4y2Ba突变体表现出外壁和乌氏体发育异常[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．李等人[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]报道gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba编码一种控制绒毡层退化、花粉壁形成和流产小孢子的phd手指蛋白。gydF4y2Ba

泛素-蛋白酶体系统参与翻译后修饰，是植物生长发育的关键调控机制[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．泛素 - 蛋白酶体系涉及三种必需酶，包括泛素活化酶（E1），泛素 - 缀合酶（E2）和泛素连接酶（E3）[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．E3连接酶在调控泛素-蛋白酶体系统中起重要作用，并对泛素化反应具有特异性。E3连接酶修饰大量的蛋白质或蛋白质复合物，其中大多数含有RING、HECT、F-box和U-box结构域[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．含有约70个氨基酸的U形盒是高度保守的结构域和E3连接酶活性相关的蛋白质结构域;首先显示参与酵母中的多泛素链组件[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．稻米和水稻中一些预测的植物U字箱（PUB）家庭蛋白质gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaU-box、U-box+ARM/HEAT、U-box+GKL-box、Kinase+U-box、U-box only、U-box+WD40、TPR +U-box、TPR + Kinase+U-box、MIF4G +U-box，其中U-box+ARM/HEAT是最大的一类[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．酒吧蛋白质参与了高等植物中的各种细胞过程，包括非生物应激反应[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，植物激素调节[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，开花时间[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba细胞分裂和伸长，植物细胞死亡和防御反应[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]．此外,gydF4y2BaAtpub4gydF4y2Ba绒毡层细胞不完全退化，花粉粒外壁结构异常。这些结果表明，PUB家族蛋白在植物雄性育性中也起着重要作用。gydF4y2Ba

OsPUB73gydF4y2Ba在水稻中编码U-box蛋白并具有E3连接酶活性[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．我们以前的研究表明gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba与转录组分析相应的二倍体稻杂交物相比，在花粉无菌基因座的多等等相互作用的自身传递稻米杂交水稻混合中受到了下调的，这提出了这一点gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba可能与水稻的雄性不育有关[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．研究其分子机理gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba,我们开发了gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba通过使用CRISPR / CAS9技术。细胞学观察用于研究生育能力gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和wt，我们主要旨在评估角色gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba用于男性生殖发展。此外，进行了对花药的转录组分析以鉴定含量（差异表达基因）之间gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba在减数分裂期间wt。我们的研究提供了PUB在调节男性生殖发展方面的作用。gydF4y2Ba

序列分析及表达模式gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba

的顺序gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba通过重新测序，与Nipponbare相比，没有显示Taichung-65的任何变化，并与来自水稻基因组注释项目数据库的全长序列一致（gydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/gydF4y2Ba）.的gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba包含三个外显子和两个内含子（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).的CDS序列gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba是1758 BP（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S1)，编码586个氨基酸的泛素连接酶活性相关蛋白，其中包含一个U-box结构域(图S1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。曾等人。［gydF4y2Ba27gydF4y2Ba发现了在米中编码含U字幕结构域的蛋白质的77和63个基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因组分别。的gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba属于V类（仅限U字箱）。探讨稻米和水稻Ⅴ类的系统发育关系gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，12个基因（米饭中包含7级，5级gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba）用于序列比较和系统发育分析。gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsPUB26gydF4y2Ba发现为同源对(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)，所有基因均检测到U-box结构域(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S2）。gydF4y2Ba

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和qRT-PCR分析方法，研究其时空分布特征gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba在台中- 65植物。的gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba主要在减数分裂时期的花药中表达gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba在成熟的花药中几乎检测不到。此外，微量gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba在根，茎和叶中也检测到表达（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：图S3）。高水平gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2BaMeiosis阶段的表达是与其在调节男性生殖发育方面的作用一致。gydF4y2Ba

的制作gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba使用CRISPR/Cas9系统gydF4y2Ba

评估功能gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba， CRISPR/Cas9系统用于创建gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba突变体。CRISPR / CAS9重组载体，包括在第一个外显子中的三个引导RNA靶标gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，用于改造台中65号工厂。共18吨gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba获得转基因植物，通过测序PCR扩增分析靶位部位gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba转基因植物的基因组DNA在转基因植株中有6个纯合突变株、2个双等位突变株、7个杂合突变株和3个非突变株(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：表S1）。的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba-1和gydF4y2Baospub73-2gydF4y2Ba用于随后的实验（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和TgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba植物的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba-1和gydF4y2Baospub73-2gydF4y2Ba已被用于表型和遗传分析。gydF4y2Ba

突变的gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba引起花粉半不育gydF4y2Ba

的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba显示正常的植物类型和正常的营养发育(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S4）。但是，穗的圆锥gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba出现了许多未填充的谷物（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa）和种子设置gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba-1和gydF4y2Baospub73-2gydF4y2Ba分别仅为19.63和37.02％，显着低于WT（85.37％）（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba这些结果暗示花粉或胚囊发育中存在潜在的缺陷。为了验证我们的假设，我们研究了成熟胚囊(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae-g）和花粉生育率（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab-d)突变体与野生型之间gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba近90％（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baj）。然而，许多成熟的花粉粒中止了gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba，花粉育性gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba-1和gydF4y2Baospub73-2gydF4y2Ba分别为16.85和22.05%，显著低于WT的花粉育性(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一世）。这些现象表明wt和wt之间的胚囊囊肥无差异gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba但是gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba男性semi-sterility显示。这些结果表明gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba可能参与花粉发育。gydF4y2Ba

染色体行为分析及特性发展gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和WTgydF4y2Ba

揭示…的影响gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，我们比较了染色体行为gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba使用DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色的花粉母细胞减少病。基于以前的减数分裂阶段的分类[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，减数分裂阶段可分为9个发育阶段，包括前期I(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和e)，中期I(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab和f)，后期I(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac和g），telophase i（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad和h)，中期II(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bai和m)，后期II(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baj和n），telophase II（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bak和o)和四分体(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bal和p)gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba我们的观察和wt（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

上述结果表明染色体行为gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba是正常的，这促使我们进一步研究gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba花粉组织。进行半薄截面分析以研究花粉发育过程gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和wt。在患前阶段，没有明显的形态学差异gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和在花药中，表皮，内皮癣，中层，绦虫和微血液血液中的两者都是正常的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和野生型花药(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa、d)。减数分裂时期，花粉母细胞正常减数分裂，形成四分体，绒毡层液泡化gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB和e）。在四阶段，花粉母细胞形成了四胞胎，中间层细胞变得非常薄和退化。但在gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba花药，虽然形成四面体，但绦虫似乎是真空的（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在单小孢子时期，绒毡层变得更密集，染色更深(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bag-h和j-k）。在成熟的花粉阶段，WT花粉晶粒含有淀粉和Tapetum完全退化。然而,gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba微微孢子已经退化，而Tapetum细胞变得更加真实并且没有退化（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba此外，透射电镜(TEM)分析显示绒毡层在WT中冷凝(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa和b），但Tapetum真空gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad和e)。该结果与半薄切片结果一致。双细胞花粉期花粉外壁异常(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba这些结果表明gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba水稻绒毡层或花粉外壁表现异常。gydF4y2Ba

纯合子gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba对植物进行转录组分析gydF4y2Ba

为了研究由此控制的基因监管网络gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，我们分析了从纯合的花药（MeIosis阶段）产生的转录组数据gydF4y2Baospub73-1gydF4y2Ba结果表明，突变体花药在减数分裂阶段出现液泡化现象。为每种材料建立了三个生物重复。总的来说，在WT和中检测到大约1900万个干净的readsgydF4y2Baospub73gydF4y2Ba花药在减数分裂。与Nipponbare参考基因组进行比对，得到92.91 ~ 93.61%的参考基因组注释转录本gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和WT大米，分别(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.三种生物复制中的相关系数高于0.98（附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S2），主成分分析（PCA）显示复制样本集聚在一起（附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba：图S5）。相关系数和PCA表明，表达模式在生物复制之间具有高相似性。gydF4y2Ba

与WT花药相比，共有2811次（共）gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba，其中2240个基因下调，571个基因上调gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S3)。基因本体论(GO)分析表明，85和4 GO分别在下调和上调的deg中显著富集。在生物过程类中，有41个GO项在下调的deg中显著富集，如生物合成过程调控、转录调控、碳水化合物代谢过程、蛋白质氨基酸磷酸化和蛋白质修饰过程;氧化还原的GO项在上调的DEGs中明显富集。在分子功能分类中，下调的DEGs富集氧化还原酶活性、蛋白激酶活性和激酶活性等40个氧化石墨烯类物质，上调的DEGs富集氧化还原酶活性相关的氧化石墨烯类物质。在细胞成分类别中，共鉴定出4个和2个氧化石墨烯项分别在下调和上调的deg中显著富集(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba：表S4）。gydF4y2Ba

Kegg（基因和基因组的京都百科全书）分析表明，在下调的次数中鉴定了109个途径。前20名最富集的途径是植物病原体相互作用，苯丙醇丙醇化生物合成，内质网的蛋白质加工，植物激素信号转导，淀粉和蔗糖代谢，遍在蛋白介导的蛋白水解，在下调的℃下过氧酶体（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一种）。总共52例途径在上调的次数中鉴定出来。前20位最富集的途径主要集中在光合生物中的光合作用，碳固定，植物激素信号转导，乙醛酸和二羧酸酯代谢，内吞作用，苯丙醇化生物合成和DNA复制（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab). GO和KEGG分析结果显示，下调的DEGs参与转录、蛋白修饰和信号转导的数量更多。gydF4y2Ba

此外，我们还发现了7个与绒毡层和花粉发育相关的基因，这些基因在绒毡层和花粉发育中表达下调gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba， 包含gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba，gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOSAP37.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsABCG15gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S3）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba利用qRT-PCR技术检测了不同花粉期花药中基因的表达情况。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.结果表明，这些基因在下调gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba与野生型相比，减数分裂时期的花药(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bah），并且基因表达类似于我们的RNA-SEQ数据。在单个微孔阶段，表达水平gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba，gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOSAP37.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsABCG15gydF4y2BaWT和gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba然而,gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba上调gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba．在双细胞花粉阶段，gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba法gydF4y2Ba呈现高表达gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba和表达水平gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba和gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba被抑制在gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba对如此多的重要花药发育基因具有如此广泛的影响，可以认为它是调控水稻花药发育的保守基因调控网络的重要组成部分。gydF4y2Ba

相对比gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba监管角色gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGAMYBgydF4y2Ba和gydF4y2BaTDR.gydF4y2Ba（gydF4y2BaTapetum退化延迟gydF4y2Ba）在花药开发中gydF4y2Ba

为了澄清gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba， 2811 DEGs在gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba比较了gydF4y2Baptc1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，gydF4y2Baudt1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，gydF4y2Bagamyb-2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba] 和gydF4y2Ba热带病研究和培训特别规划gydF4y2Ba植物 [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]， 18.27% (449/2458) deg在变化gydF4y2Baptc1gydF4y2Ba突变体，9.88% (121/1255)DEGs发生变化gydF4y2Baudt1gydF4y2Ba植物，36.78％（320/870）跌幅变化gydF4y2Bagamyb-2gydF4y2Ba植物和14.72％（34/231）在变化中gydF4y2Ba热带病研究和培训特别规划gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.5个基因在所有5个突变体中表现出表达变化(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba：表S5;额外的文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba：图S6），包括3-氧代苯基 - 还原酶（gydF4y2Baloc_os12g13930.gydF4y2Ba），LTP（脂质转移蛋白）家族蛋白质（LTPL2，gydF4y2BaLOC_Os07g46210gydF4y2Ba)、水通道蛋白(gydF4y2BaLOC_Os01g02190gydF4y2Ba)及雄性不育蛋白(gydF4y2Baloc_os03g07140.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba)在所有5个突变体中均表达下调，果胶酯酶(gydF4y2BaLOC_Os07g41650gydF4y2Ba)表达下调gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba，gydF4y2Baudt1gydF4y2Ba，gydF4y2Bagamyb-2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba热带病研究和培训特别规划gydF4y2Ba但在植物中表达上调gydF4y2Baptc1gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S5)。这些基因参与脂质代谢和运输、细胞壁，并在绒毡层和花粉发育中发挥重要作用。gydF4y2Ba

OsPUB73gydF4y2Ba可能在雄性生殖发展中发挥重要作用gydF4y2Ba

许多先前的研究表明，酒吧在植物中具有E3泛素连接酶活性，这对泛素化改性具有显着影响，并且揭示了酒吧在植物细胞死亡，防御反应，免疫反应和开花时间中发挥中央作用[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．此外，在水稻中发现了总共77个U-Box蛋白基因[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba的gydF4y2BaSPL11.gydF4y2Ba（gydF4y2BaOSPUB11.gydF4y2Ba)是第一个在水稻中被研究的PUB基因，该基因具有E3连接酶活性，参与细胞死亡和防御途径[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．随后，科学家们报告说gydF4y2BaOSPB15.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，gydF4y2BaOsPUB44gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaOsPUB75gydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．然而，分子机制和功能PUB基因仍然很大程度上是未知的。在这项研究中，我们确定了一个pub基因，gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，这包括三个外显子和两个内含子。的gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba体外具有E3连接酶活性[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．我们成功地发展了一个纯合子gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba通过CRISPR / CAS9系统。的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba显示正常胚囊生育能力。然而,gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba显示男性semi-sterility。gydF4y2Ba

减数分裂染色体行为和花药墙发展是相关植物男性生殖发展的重要部分[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．绒毡层为小孢子发育提供养分和稳定的环境，绒毡层的及时降解对花粉粒的形成至关重要[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．还发现酒吧基因在Tapetum发育中具有重要功能，从而影响雄性生殖发育。Wang等人。［gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]报道了一个PUB基因(gydF4y2BaATPUB4.gydF4y2Ba）参与花粉发育gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．的gydF4y2BaAtpub4gydF4y2Ba四分体期后绒毡层异常膨大，末绒毡层不完全变性，缺失gydF4y2BaATPUB4.gydF4y2Ba这些结果表明，这会导致完全的男性不育gydF4y2BaATPUB4.gydF4y2Ba可能是雄性不育中的关键因素。我们观察到染色体行为没有差异gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba而绒毡层在花粉成熟期未发生退化，并产生败育花粉gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba．这些观察表明，这是一场惨败gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba可能导致水稻半不育。gydF4y2Ba

OsPUB73gydF4y2Ba可能会影响与水稻中的Tapetum或花粉外来发育相关的基因的监管网络gydF4y2Ba

众所周知，植物雄性生殖发育是一个复杂的生物学过程，大量的基因参与了这个过程[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．最近，已发现RNA测序（RNA-SEQ）是用于研究基因表达和研究基因调节表达网络的有用工具[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．RNA-SEQ分析显示79.69％的DEG在下调gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba这表明基因下调可能在雄性生殖中起重要作用。在下调的基因中，大量的DEGs富集在糖代谢过程、脂代谢过程和蛋白质修饰过程中，这些过程与花药发育或花粉壁生成有关。gydF4y2Ba

此外，我们还发现了7个下调基因gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba，与绒毡层发育有关，包括gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba，gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOSAP37.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsABCG15gydF4y2Ba．gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba编码螺旋环螺旋蛋白，这是水稻中塔皮特降解所必需的。在里面gydF4y2Baudt1gydF4y2Ba突变体，绒毡层在减数分裂阶段变成液泡状，花药室中没有花粉[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba和gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba在水稻中是细胞色素P450s家族基因，在花药中特异性检测到脂肪酸的脂肪酸的羟基化。损失gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba和gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba基因引起了缺陷的花粉外来和男性生殖发展，以及gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba直接由gydF4y2BaTDR.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba法gydF4y2Ba是一种脂肪酰基载体蛋白还原酶，是花药角质层发育和花粉孢子素生物合成所必需的gydF4y2Ba法gydF4y2Ba突变体表现出花药表面和花粉壁的异常和脂质乌氏体的减少[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2BaOSAP37.gydF4y2Ba是一种直接调节的天冬氨酸蛋白酶gydF4y2Ba吃gydF4y2Ba（gydF4y2Ba永恒的Tapetum 1.gydF4y2Ba）并在水稻中引起异常脚注[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba，是一种phd手指蛋白，控制着水稻花药发育过程中绒毡层PCD的缺失gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba导致花粉壁结构改变，雄性不育[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．gydF4y2BaOsABCG15gydF4y2Ba编码ATP结合盒传输蛋白，通过将脂质从Tapetem出口到花粉局部给花粉局部发挥重要作用[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．上述基因对于Tapetum或花粉发育至关重要。这些绦虫相关基因表达模式的突然改变可能导致绦虫异常并导致雄性半无菌gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

四种转录因子在水稻绒毡层的形成和退化中起重要作用，包括gydF4y2BaGAMYBgydF4y2Ba，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTDR.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba．gydF4y2BaGAMYBgydF4y2Ba是一种myb家族转录因素，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba和gydF4y2BaTDR.gydF4y2Ba编码bHLH家族转录因子gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba是一种博士指转录因子。4个突变体绒毡层延迟退化，花粉外壁缺陷[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．的gydF4y2BagamybgydF4y2Ba，gydF4y2Baudt1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba热带病研究和培训特别规划gydF4y2Ba和gydF4y2Baptc1gydF4y2Ba突变体在花粉发育过程中表现出相同的表型，包括绒毡层延迟退化和小孢子败育。在gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba，我们还观察到Tapetum延迟降解的现象。此外，我们发现表达没有变化gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba在里面gydF4y2BagamybgydF4y2Ba，gydF4y2Baudt1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba热带病研究和培训特别规划gydF4y2Ba和gydF4y2Baptc1gydF4y2Ba植物。此外，我们还比较了中国的监管网络gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，gydF4y2BaGAMYBgydF4y2Ba，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTDR.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，并观察到五个关键基因是由gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba，gydF4y2BaGAMYBgydF4y2Ba，gydF4y2BaUDT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTDR.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPTC1gydF4y2Ba， 包含gydF4y2Ba法gydF4y2Ba，LTP前体（gydF4y2BaLOC_Os07g46210gydF4y2Ba)、水通道蛋白(gydF4y2BaLOC_Os01g02190gydF4y2Ba)及果胶酯酶(gydF4y2BaLOC_Os07g41650gydF4y2Ba）.有趣的是，这五个基因在这五个突变体中几乎是下调的，除了gydF4y2BaLOC_Os07g41650gydF4y2Ba被上调gydF4y2Baptc1gydF4y2Ba．这五种基因调节代谢和转运参与Tapetum或花粉壁发育的代谢物。例如，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba是一种推定的脂肪酸还原酶，并在花粉墙发展中起重要作用[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba法gydF4y2Ba在所有五个突变体中受到了下调。如报道所示，LTP与在花药中的微孔到微孔的Tapetum运输脂质组分有关，对水稻花粉壁形成至关重要[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．gydF4y2BaLOC_Os07g46210gydF4y2Ba属于大米的LTP家族，在所有五个突变体中都在下调。这些结果表明，这五种基因在所有五个突变体中发挥基本作用，可能是Tapetum发育中的重要因素。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们获得了gydF4y2Baospub73gydF4y2Baa的纯合突变体gydF4y2Ba粳稻gydF4y2BaCRISPR / CAS9系统稻米品种（Taichung65）。的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba显示出正常的营养发育和成熟的胚胎生育能力，但表现出花粉晶粒的半不育。细胞学观察表明gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba在减数分裂期期间，花粉率在双细胞花粉阶段表现出异常现象的Trapetum。此外，一些重要的Tapetum相关基因在下调gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba我们推测这些基因之间的关系不是简单的线性调控基因网络，而是在雄性生殖发育中存在一个复杂的基因调控网络。本研究为PUB在水稻雄性生殖发育中的作用提供了新的认识。gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba品种Taichung-65用作WT。在自然条件下，Taichung-65植物种植在华南农业大学（SCAU）的实验农场。gydF4y2Ba

水稻突变体的开发与鉴定gydF4y2Ba

OsPUB73gydF4y2Ba使用如先前报道的CRISPR / CAS9系统产生突变体[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．三个目标位置序列gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba克隆到单个引导RNA (sgRNA)中，整合的gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2Ba被纳入CRISPR / CAS9载体Plycrispr / Cas9pubi-h。然后，将载体转移到Taicheng-65中。使用CTAB方法从幼叶中提取转基因系和WT的基因组DNA [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]．CRISPR靶位点周围的基因组区域gydF4y2BaOsPUB73gydF4y2BaPCR扩增片段，Sanger测序筛选突变体。TgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba纯合突变体植物已被用于表型和遗传分析。本研究使用的引物序列列于附加文件中gydF4y2Ba12gydF4y2Ba：表S6。gydF4y2Ba

观察染色体行为gydF4y2Ba

从中收集了穗子gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba在其旗叶垫和第二次到最后叶垫之间，并在碳酸溶液（乙醇：乙酸= 3：1）中固定在24小时内。然后将样品在40％乙醇中在4℃下在20分钟后用70％乙醇洗涤两次。将花药从小花中解剖，并在玻璃载玻片上置于1mg / L DAPI的一小滴。5-10分钟后，用滑动盖覆盖玻璃载玻片，并在荧光显微镜（Leica DMRXA）下观察。gydF4y2Ba

描述的gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba表型gydF4y2Ba

整个山脉eosin B共聚焦激光扫描显微镜（We-Clsm）用于探讨胚胎囊生育能力gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba根据Chen等人的话。［gydF4y2Ba55gydF4y2Ba稍作修改。收集成熟小穗，在FAA(50%乙醇:乙酸:甲醇= 89:6:5)中固定。将子房从花序上取下，再水合，伊红B染色，脱水后放入混合溶液(乙醇和水杨酸甲酯= 1:1)。最后，将卵巢置于纯水杨酸甲酯中，用激光扫描共聚焦显微镜(Leica SPE)检查。花粉的育性gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba根据Chen等人观察到WT。［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．在半薄试验中，花药gydF4y2Baospub73gydF4y2Ba收集不同花粉发育阶段的WT对照植株，室温下在FAA中固定48 h。通过乙醇系列脱水后，根据制造商的协议(贺利氏古莎)，将组织嵌入徕卡7022 Histeresin Embedding Kit (7022LR)中。切片机(Leica RM2235)切割2 ~ 3 μm厚度的切片，60℃干燥24小时。切片用0.5%甲苯胺蓝(m/v)染色。切片在显微镜下观察并拍照(Motic BA200)。在透射电镜检测中，收集花药固定，过程参照Li等[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测gydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用Trizol Reagent（Invitrogen）的冷冻样品分离总RNA。根据制造商的说明，使用具有GDNA橡皮擦（Takara）（Takara）（Takara）（Takara）（代码No.RR047a，Takara）的素剧性试剂盒合成第一链cDNA。通过使用Tb Green Premix ExTaq II（代码No.RR820A，Takara）对罗氏-PCR反应进行QRT-PCR反应，并且根据Chen等人进行QRT-PCR反应过程。［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．所有qRT-PCR反应均在三个生物重复中进行。qRT-PCR引物见附加文件gydF4y2Ba12gydF4y2Ba：表S6。gydF4y2Ba

RNA-seq实验及数据分析gydF4y2Ba

TgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在−80°C的3个生物重复中收集减数分裂期的转基因株系(纯合突变体)和WT对照植株进行RNA分离。按照TRIzol Reagent (Life technologies, California, USA)的说明书进行总RNA提取。RNA-seq过程是根据前面描述的方法进行的[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．使用DESEQ包来检测样品之间的基因表达差异。用FDR（假发现率）判定DEGS≤0.01，LOG2（折叠变化）≥1的绝对值（折叠）≥1，然后使用DEGS进行随后的分析。gydF4y2Ba

RNA-SEQ数据可从NCBI获得，下载号码PRJNA578476。gydF4y2Ba

支持这里描述的结论的所有数据都是在表格，数字和附加文件中提供的。gydF4y2Ba

DAPI：gydF4y2Ba

4,6-二氨基-2-苯基吲哚gydF4y2Ba

可见：gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

FDR：gydF4y2Ba

假发现率gydF4y2Ba

走：gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

Kegg：gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书gydF4y2Ba

LTP:gydF4y2Ba

脂质转移蛋白gydF4y2Ba

主成分分析:gydF4y2Ba

主要成分分析gydF4y2Ba

纤毛运动:gydF4y2Ba

编程细胞死亡gydF4y2Ba

酒吧:gydF4y2Ba

植物U-boxgydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

RT-PCR：gydF4y2Ba

逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

TEM：gydF4y2Ba

透射电子显微镜法gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

作者感谢冠军张教授捐赠Taichung 65.我们还感谢舒红YU女士和其他实验室成员提供帮助。gydF4y2Ba

这项工作得到了广州科技重点计划的支持，刘刘（201707020015），NSFC为XD Liu（31571625），广东省关键领域研发计划（2018B020202012）和广东省重点实验室开幕基础植物分子育种（GPKLPMB201803）。资助者在研究和收集，分析和解释的设计中没有作用，以及编写手稿。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 华南农业大学亚热带农业生物资源保护和利用国家重点实验室，广州510642gydF4y2Ba

   陈林，邓瑞莲，刘国强，吴金文，刘向东gydF4y2Ba

2. 华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室，广州510642gydF4y2Ba

   林辰，瑞利安邓，郭强刘，景金，金文武＆襄东刘gydF4y2Ba

3. 华南农业大学广东省岭南现代农业重点实验室，广东广州510642gydF4y2Ba

   林辰，瑞利安邓，郭强刘，景金，金文武＆襄东刘gydF4y2Ba

4. 2 .广东省农业科学院蔬菜研究所，广东广州510640gydF4y2Ba

   林辰gydF4y2Ba

5. 广东蔬菜新技术研究重点实验室，广州510640gydF4y2Ba

   林辰gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XDL和LC构思和设计了实验。LC和XDL撰写了这篇论文。LC、RLD、GQL、JJ、JWW进行实验并分析数据。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba湘东刘gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba