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植物防御素基因AtPDF2.1通过调节谷氨酰胺合成酶活性介导氨代谢拟南芥

BMC植物生物学体积19，文章号:557（2019）引用本文

摘要

背景

在植物中，铵代谢对于将吸收的氮转化为氨基酸特别重要。然而，这种转化背后的分子机制在很大程度上仍然未知。

结果

使用野生型拟南芥(Col-0)和AtPDF2.1突变体(pdf2.1-1而且pdf2.1-2)，我们发现富含半胱氨酸的小肽AtPDF2.1，一种植物防御素，参与调节茎部的铵代谢。铵显著诱导AtPDF2.1在茎部和根中，特别是在根木质部维管束中，如组织化学分析所示。亚细胞定位分析显示AtPDF2.1定位于细胞壁。突变体茎部铵浓度高于Col-0处理，但总氮含量、根铵浓度和铵转运体基因表达无显著差异AtAMT2.1．突变体中谷氨酰胺合成酶活性显著降低，谷氨酰胺合成酶家族基因活性显著降低GLN1.3而且GLN1.5与Col-0相比，突变体中显著下调。硝酸还原酶活性与Col-0无明显差异。

结论

总的来说，这些数据表明AtPDF2.1通过调控酶的表达影响铵代谢GLN1.3而且GLN1.5通过一种未知的机制。

背景

植物防御素(Plant defensins, PDFs)是富含半胱氨酸的小肽，通常由n端信号肽、c端可变区和富半胱氨酸结构域组成[1，2］．对萝卜RsAFP1结构和同源性的核磁共振分析显示，该防御素具有一个共同的半胱氨酸稳定的α - β构象，在α螺旋上有四个二硫键，与三个β角反向平行[3.］．植物防御素在动植物中普遍存在，并介导先天的非特异性免疫反应[4］．在植物中发现的防御素大多具有广谱抗菌活性，可抑制淀粉酶和阻断离子通道[2，5］．中已经报道了两个pdf家族拟南芥．第一个家族包含7个高同源性的成员(PDF1.1, PDF1.2a, PDF1.2b, PDF1.2c, PDF1.3, PDF1.4和PDF1.5)，其中5个非常相似(PDF1.1到1.3)。此外，预测的PDF1.2a、b和c的成熟结构相似。第二家族的成员(pdf 2.1至2.6)也非常亲密。pdf2.1、2.3和2.6是串联序列，而pdf2.2和其他基因不在同一分支[2］．以往对不同PDF基因的研究(PDF1.1，1．2，2.1，2.2,2.3)显示出它们的器官特异性表达模式[2，6］．最近的研究证明PDFs也参与了非生物胁迫反应，它们的表达水平受到寒冷、干旱和重金属胁迫的诱导[7，8，9]，而PDF2.3可能与钾离子稳态有关[10］．最新研究表明，pdf介导水稻耐镉性和镉积累答:芥［11，12］．

小肽可作为调控氮(N)反应和胁迫适应的信号分子[13，14］．小c端编码肽(CEPs) [15]，例如，由缺氮的根产生，并转移到芽中，在那里它们与富含亮氨酸重复受体激酶CEP受体1/2 (CEPR1/2)相互作用[13］．根瘤菌诱导的木质部移动CLAVATA3/胚胎周围区域相关(CLE)肽已被证明可以抑制豆科植物的结瘤[16］．虽然目前还不清楚pdf是否与N in相互作用答:芥，我们假设小PDFs也可能作为信号分子调节N代谢。

氮是植物必需的矿质元素，在植物生长发育中起着重要作用。它不仅是核酸、氨基酸和蛋白质的组成部分;它还作为叶绿素的组成部分参与光合作用期间的碳同化，并且在水稻中报道了N和磷之间的相互作用[17］．硝酸盐和铵是植物吸收氮的主要形式。硝酸盐被植物吸收后，一部分直接运输到地上部分或储存在根细胞的液泡中，另一部分转化为铵或整合成氨基酸，代谢或运输到地上部分[18］．

在农业生产中，施N肥一般有显著的增产效果[19，20.］．然而，氮肥利用率低，不仅造成资源浪费和环境污染，还严重威胁人类健康。因此，提高植物氮素利用效率、减少环境污染具有十分重要的意义。从土壤到根系、从根系到茎部和其他植物器官的转运涉及到氮的吸收、同化、转运和再利用等多个过程。氮同化不仅是这些过程中最关键的一步，也是植物生长的重要限制因素之一。因此，提高氮素同化效率是提高植物氮素利用效率的重要方面。

在几种植物中，根部吸收的硝酸盐有一部分在根部被吸收，但大部分被运输到茎部，然后被吸收。硝酸还原酶(Nitrate reductase, NR)在细胞质中首先将硝酸盐还原为亚硝酸盐，前期研究表明NR的活性受14-3-3蛋白、蛋白激酶、蛋白酶和蛋白磷酸酶的调控[21］．这种酶是由NR [NADH]蛋白(NIAs)调节的，而NIA2，而不是NIA1，调节NR活性答:芥［18，22］．亚硝酸盐还原酶将亚硝酸盐还原为铵需要NAD(P)H。此外，通过谷氨酰胺合成酶(GS)/NADH-谷氨酰胺氧谷氨酸转氨酶(NADH- gogat)循环将铵同化为氨基酸也需要ATP和NADH或还原铁还蛋白[18］．近年来的研究表明，nin样蛋白转录因子是硝酸盐诱导的关键调控因子NR基因的表达和nin样蛋白转录因子可能与硝酸盐诱导的其他硝酸盐同化相关基因的表达一致[23，24］．

从硝酸盐中恢复或通过铵转运体(AMTs)作用直接吸收的铵被质体中的亚硝酸盐还原酶和质体和细胞质中的GS进一步还原[25]或通过GS和GOGAT循环同化为氨基酸。参与这些过程的主要GS/GOGAT同工酶是叶绿体中的GS2和铁氧还原蛋白依赖的GOGAT (Fe-GOGAT)，以及细胞质中的GS1和NADH-GOGAT [26，27］．部分GS1同工酶的生理功能答:芥据报道[28，29，30.］．其中GLN1.1和GLN1.4对铵的亲和力较高，GLN1.2和GLN1.3亲和力较低[31］．在低浓度时，铵被GLN1.1、GLN1.2和GLN1.3同化，它们具有功能冗余[32］．在玉米上也有研究指出GLN1.4对释放铵的再同化有作用[33，34］．在答:芥，在转录水平上未检测到GLN1.5 [35]而gln2编码的GS具有叶线粒体和叶绿体的双重靶向性[36］．除了主要的氮同化外，氮再同化还通过光合组织的光呼吸和衰老或种子萌发过程中的蛋白质转化捕获大量的氨[37］．

谷氨酸代谢与谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)活性有关，它催化谷氨酸和2-氧谷氨酸的相互转化。最近的研究答:芥明确表明GDH在缺碳条件下的氨基酸分解中起核心作用，NADH-GDH的主要生理功能是为三羧酸循环提供2-羟戊二酸[38，39］．

氮同化是对氨基酸、铵和硝酸盐等氮代谢物的内部和外部线索的反应。同工酶在转录、翻译和翻译后修饰水平上受到调控[40］．氮素吸收和同化的调控也与根系发育有关。吸收尤其依赖于与根相关的特征，因为植物不仅通过根来调节自身的代谢和基因表达，而且还通过根的结构来优化资源的获取[41，42］．

在不断变化的环境中，更全面地了解氮同化及其调控对提高植物生产力具有重要意义。因此，有必要加强对参考种和其他植物种的基础研究。在本研究中，通过研究氮同化的分子和遗传机制答:芥，我们探讨了的作用AtPDF2.1氨代谢调节。

结果

AtPDF2.1对铵的反应

首先，我们对所有成员进行了诱导实验PDF家族基因来评估他们对高硝酸盐，低硝酸盐和铵的反应。Col-0在培养条件下水培18 d，缺氮3 d，然后用0.2 mM KNO处理3.， 2.25毫米知3.， 10毫米知道3.，或1.125 mM NH4没有3.根系取样前6 h显示PDF2.1而且PDF2.3是由铵引起的，特别是PDF2.1(无花果。1)．为了进一步验证PDF2.1在纯铵生长条件下诱导，采用野生型Col-0在培养条件下水培18 d，缺氮3 d，然后用2.25 mM KNO3.， 1.125 mM(NH4）2所以4，或1.125 mM K2所以46小时后再进行茎部和根部取样。这个实验揭示了AtPDF2.1铵处理对茎部和根部均有显著的诱导作用(图;2)．

图1
图1

的相对表达量分析AtPDF家族基因在根答:芥在不同的处理下。用1/4植物营养液处理18 d, n饥渴处理3 d，再用0.2 mM KNO处理3.， 2.25毫米知3.， 10毫米知道3.，或1.125 mM NH4没有3.6 h后分别收获根系进行RNA分析。一个AtPDF1年代。bAtPDF2年代。Actin2作为实时荧光定量PCR的内对照。显示相同字母的条形图在P经最不显著性差异检验< 0.05

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图2
图2

AtPDF2.1铵能显著诱导相对表达。答:芥用1/4植物营养液处理幼苗18 d，然后进行n -饥饿处理3 d。2.25 mM KNO处理幼苗3.， 1.125 mM (NH4）2所以4， 1.125 mM K2所以4处理6 h后，分别采集根、芽进行RNA分析。一个开枪。b根。Actin2被用作内部控制。显示相同字母的条形图在P <经最不显著性差异检验，为0.05

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AtPDF2.1主要在根维管束和子叶中表达，其蛋白定位于细胞壁

的表达模式AtPDF2.1，我们生成AtPDF2.1启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因植物。PDF2.1经定量PCR分析，在根、苗、叶、茎、角果和花中均有表达(图2)。3.a).我们在叶片、子叶和根维管束中检测到强烈的GUS信号(图。3.罪犯)。横截面GUS分析显示，根中维管木质部薄壁细胞表达较强(图2)。3.e).确定的亚细胞定位AtPDF2.1，我们进行了变换答:芥植物与AtPDF2.1-mRFP使用35S启动子。亚细胞定位分析表明，转化植株细胞壁以荧光信号为主(图2)。4)．这些结果表明，AtPDF2.1定位于细胞壁。

图3
图3

表达模式AtPDF2.1．AtPDF2.1主要表达于茎和根维管束。一个AtPDF2.1在不同器官的相对表达量分析答:芥实时荧光定量PCR。从水培法生长的45 d老植物(叶、茎、角锥和花)或在1/2 MS培养基中生长的7 d老植物(幼苗)中收获组织。Actin2被用作内部控制。数据为均值±标准差，n= 4。b- - - - - -e转基因植物GUS活性的组织化学定位格斯报告基因在亲的控制下AtPDF2.1启动子。b1周龄全装苗根。c，d45 d树龄的植株发芽(c)和叶子(d)．e一周生根横切面。棒材= 4mm in (b)，长2厘米(c)，长1厘米(d)和10 μm in (e）

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图4
图4

35S中红色荧光的共聚焦观察:AtPDF2.1-mRFP转基因答:芥．亚细胞定位合并图。将表面不育种子分别镀于1/2 Murashige和Skoog培养基上垂直生长2周。根表皮细胞在40%蔗糖中诱导质解，然后用共聚焦显微镜成像。箭头指向质壁分离

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AtPDF2.1影响笋中铵的浓度

我们首先筛选和识别AtPDF2.1突变体。虽然表达水平AtPDF2.1在突变体中明显低于野生型，但仍检测到该基因的表达。因此，我们获得了两个功能性敲除突变体，pdf2.1-1而且pdf2.1-2(无花果。5)．移植后，col0，pdf2.1-1,pdf2.1-2将幼苗在正常条件下(1/4植物营养液)培养18 d，取样分析总N含量、NUE、铵态氮浓度和基因表达的差异AMT2.1在被选中的AtPDF2.1突变体和col0。在正常条件下，铵的浓度较高pdf2.1-1而且pdf2.1-2与Col-0处理相比，根系间无显著差异(图2)。6a, b). Col-0处理的嫩枝和根中硝酸盐含量也无显著差异，pdf2.1-1,pdf2.1-2植物(附加文件1:图S1)。蛋白质AMT2.1将铵从根运输到芽[43，44］．在正常情况下，没有差异AtAMT2.1col0的根表达式，pdf2.1-1,pdf2.1-2(无花果。6D)，表明AtPDF2.1不参与铵从根到芽的运输。Col-0的总N含量和NUE，pdf2.1-1,pdf2.1-2植物也没有表现出差异(图;6e, f).这些结果表明AtPDF2.1可能影响嫩枝中铵的代谢。

图5
图5

的识别pdf2.1突变体。一个等位基因转移DNA插入线的示意图pdf2.1-1(SALK_110286)和pdf2.1-2(SALK_206700C)。的white blocks represent 5′-3′ UTR and the line connected the two black blocks represents intron.b通过PCR筛选和测序鉴定纯合子突变体。第一柱为野生型，第二、三柱为筛选纯合子。L和2l代表两个突变体的左边引物，R和2R代表两个突变体的右边引物，B代表插入的序列。c实时荧光定量PCR未检测到完整的AtPDF2.1 mRNApdf2.1突变体植物。Actin2被用作内部控制

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图6
图6

功能中断AtPDF2.1增加茎部铵的积累。一个，bCol-0中铵的浓度，pdf2.1-1,pdf2.1-2在1/4植物营养液中生长21 d (一个)射击和(b)根。c根枝铵浓度比。dAMT2.1基因在Col-0根中的表达pdf2.1-1,pdf2.1-2。eCol-0的总N含量，pdf2.1-1,pdf2.1-2在1/4植物营养液中培养21 d。总氮量从每个重复的6株植物的汇总样本中获得。f氮素利用效率(NUE)， NUE =总干重/总氮含量。Actin2被用作内部控制。数据表示均值±SEs (n= 4)。显示相同字母的条形图在P <经最不显著性差异检验，为0.05

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AtPDF2.1通过调节蛋白的表达来影响GS活性GLN1.3而且GLN1.5在拍摄

虽然AtPDF2.1对全氮含量、根铵浓度和AtAMT2.1，突变体芽中铵离子浓度显著升高答:芥比Col-0芽的含量高。因此，我们假设AtPDF2.1可能参与茎部铵代谢的调节。

在正常条件下，Col-0的嫩枝间NR活性没有差异，pdf2.1-1,pdf2.1-2，而GS活动在嫩芽pdf2.1-1而且pdf2.1-2显著低于Col-0苗。此外，笋中铵的浓度pdf2.1-1而且pdf2.1-2均高于Col-0苗(图;7)．在pdf2.1突变体,GLN1.3而且GLN1.5下调，但没有检测到对其他GLN家族的基因。因此,AtPDF2.1可能通过调节?的表达影响氨同化为谷氨酰胺GLN1.3而且GLN1.5(无花果。8)．

图7
图7

功能中断AtPDF2.1降低茎部GS活性。在1/4植物营养液中培养21 d。一个NR及(b) Col-0植株的GS活性;pdf2.1-1,pdf2.1-2，cNR及(d) Col-0根的GS活性;pdf2.1-1,pdf2.1-2．数据表示均值±SEs (n= 4)。显示相同字母的条形图在P <经最不显著性差异检验，为0.05

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图8
图8

GLN1.3而且GLN1.5在芽中被下调了吗pdf2.1突变体。植物在1/4植物营养液中生长21 d。取嫩枝样本检测(一个）GLN1.1，bGLN1.2，cGLN1.3，dGLN1.4，eGLN1.5,fGLN2．数据表示均值±SEs (n= 4)。Actin2被用作内部控制。显示相同字母的条形图在P <经最不显著性差异检验，为0.05

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AtPDF2.1影响嫩枝铵代谢

来研究铵代谢的哪些步骤会受到影响AtPDF2.1，测定了谷氨酰胺和谷氨酸的浓度，NADH-GOGAT的活性，以及游离氨基酸的浓度。谷氨酰胺浓度pdf2.1-1而且pdf2.1-2突变体的NADH-GOGAT活性也低于Col-0(图2)。9a, b).因此，突变体GS活性的降低可能影响了后续的代谢途径。Col-0对谷氨酸和游离氨基酸浓度无显著差异，pdf2.1-1,pdf2.1-2(无花果。9C, d)，可能是由于功能冗余GLN1.3而且GLN1.1极低的表达GLN1.5的主导作用GLN1.2［32，34］．

图9
图9

铵同化酶活性和铵同化产物浓度在Col-0和pdf2.1突变体。在1/4植物营养液中培养21 d。一个谷氨酰胺(Gln)浓度。b谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)活性。c谷氨酸(Glu)浓度。dCol-0植株中总氨基酸(AA)的浓度;pdf2.1-1,pdf2.1-2．数据表示均值±SEs (n= 4)。显示相同字母的条形图在P <经最不显著性差异检验，为0.05

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总的来说，结果表明AtPDF2.1通过改变蛋白的表达来调节GS的活性GLN1.3而且GLN1.5，导致笋中铵同化的变化。这改变了谷氨酰胺浓度和NADH-GOGAT活性，从而影响了铵的同化。

讨论

pdf是最早在小麦和大麦种子中发现的富含半胱氨酸的小肽[45］．在答:芥，防御素分为PDF1s和PDF2s两个家族。之前的一项研究表明，AtPDF1.1参与植物对生物胁迫的反应[46］．其他研究发现PDF1s可以提高植物和酵母的锌耐受性[9，47，48］．然而，据我们所知，PDFs的分子机制尚未明确。

一些报道发现小肽与N. In有关一个芥在硝酸盐缺乏的情况下，表达CEP3在根部增加了10倍CEP1幼苗表达量增加;在铵限制下，CEP9表达被抑制[15］．近年来的研究表明，CEP家族肽是根系系统性n -需求信号转导的一部分。它们通过受体cepr感知信号，从而介导根中硝酸盐转运蛋白基因的系统性上调[13］．然而，pdf是否在营养吸收、运输或同化中发挥调节作用还没有报道。在本研究中，对野生型Col-0进行了低硝酸盐、高硝酸盐和铵处理，结果表明AtPDF在此条件下对家族基因进行分析。我们发现大多数PDF1S对硝酸盐有反应，而PDF2.1而且PDF2.3是由铵引起的，特别是PDF2.1(无花果。1)．有报道称PDF2.1和PDF2.3具有很高的同源性[2]，我们发现PDF2.1和PDF2.3受到铵的诱导相似，这表明它们可能具有一定的功能冗余，这可以解释为什么野生型和PDF2.1突变体之间的表型差异不明显。近期，我们通过聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9技术获得PDF2.3纯合突变体，并拟对其进行一系列测试pdf2.3单个或pdf2.1/pdf2.3双突变体，并将这些结果与之前的结果结合起来，以深入了解PDF2.1和PDF2.3的功能。在本研究中，PDF2.1在纯铵培养条件下诱导(图;2)．PDFs在木质部、气孔和气孔细胞、薄壁细胞和其他外周区域表达[1，49］．我们的结果也证实了AtPDF2.1是一种细胞壁蛋白答:芥在所有组织中都有表达。然而，因为我们不知道如何AtPDF2.1调节氮和/或铵代谢答:芥，我们检查了Col-0和PDF2.1突变反应AtPDF2.1在正常培养条件下。

首先，我们测定了Col-0中铵的浓度，pdf2.1-1,pdf2.1-2．结果表明，突变体与Col-0处理根系中铵离子浓度无显著差异，但突变体的铵离子浓度显著高于Col-0处理。然而，在表达中未检测到显著差异AtAMT2.1Col-0与突变体之间的差异(图;6)，表示AtPDF2.1不影响铵从根向芽的运输。然而，不同浓度的Col-0对地上部和根部硝酸盐含量无显著影响pdf2.1变种人(附加文件1:图S1)，总N含量和氮素利用率无差异(图1)。6)．因此,AtPDF2.1可能影响嫩枝的铵代谢。位于叶绿体和细胞质中的GS酶负责同化通过硝酸盐还原产生的铵[9，47，48］．

我们测定了嫩枝中与N代谢相关的酶的活性，发现嫩枝中NR活性无显著差异，而GS活性显著降低pdf2.1-1而且pdf2.1-2而不是Col-0。这表明AtPDF2.1可能通过调节GS活性来调节铵的进一步代谢。的pdf2.1突变体对大多数没有影响GLN但对家族基因有调节作用GLN1.3而且GLN1.5．的相对表达式GLN1.5很低。这可能解释了为什么表型不明显。最近的一项研究表明GLN1.1，GLN1.2，GLN1.3,GLN1.4的功能成员是GLN1基因家族答:芥它们在初级氮同化、植物生长、种子萌发和产生以及花粉发育中发挥协同或补充作用[50］．此外，的主要异构体答:芥苗期表达的GLN1.1、GLN1.2和GLN1.3 [43］．另有研究报道GLN1.2在莲藕种子产量、莲座丛生物量和萌发中起着重要作用[28，30.]， GLN1.1和GLN1.3功能的缺失降低了植物的发芽率[50］．这可能就是为什么PDF2.1突变体只部分影响铵代谢的原因。

在本实验中，突变体中谷氨酰胺的浓度高于野生型，可能是由于突变体中NADH-GOGAT活性的降低。然而，谷氨酸转运体1 (GLT1)，调控NADH-GOGAT的基因在野生型和突变体之间没有差异(附加文件)1:图S2)。因此，这种调控可能不会发生在转录水平。GS活性的降低影响了后续代谢过程。然而，谷氨酸和游离氨基酸浓度在Col-0和突变体之间没有显著差异。这可能是由于功能冗余之间GLN1.3而且GLN1.1［50，低表达的GLN1.5,或GLN1.2在…中起主导作用的GLN1.1，GLN1.2,GLN1.3［51］．

总的来说，PDF2.1是一种细胞壁蛋白，通过调节核基因来影响铵代谢GLN1.3．多项研究表明，小肽可以作为蛋白激酶通路的信号分子，间接调控其他基因的表达[13，14，52］．例如，小肽CLE25可以通过受体激酶BAM调节NCED3在叶片中的表达，从而传递缺水信号，影响脱落酸的生物合成和蒸腾作用，调节气孔[14］．也有研究表明，CEP家族肽是根系统中n信号的一部分。它们通过两个LRR标记，即CEPR1和CEPR2感知信号，以调节根中硝酸盐转运蛋白基因的系统性上调[13］．研究表明，根源性CEP诱导叶片中韧皮部特异性多肽CEPD1和CEPD2，并激活NRT2.1的表达，特别是在根吸收硝酸盐的过程中[52］．因此，我们假设PDF2.1也可以通过蛋白激酶或下游转录因子调控GLN1.3和AMT2.1，从而影响铵代谢，但具体过程尚未确定。

基于这些结果，我们认为AtPDF2.1通过调节茎部GS活性来调节铵的代谢，从而影响谷氨酰胺浓度和NADH-GOGAT活性。

结论

我们的研究结果表明，PDF2.1是多种器官的细胞壁蛋白，它通过调控蛋白的表达来影响铵的代谢GLN1.3在植物的嫩枝中。

方法

实验材料和生长条件

的答:芥对照组均为野生型(Col-0)，由上海植物生理生态研究所龚继明提供。的AtPDF2.1基因敲除突变体(pdf2.1-1而且pdf2.1-2)是从拟南芥信息资源(TAIR;http://www.arabidopsis.org/)．Col-0和AtPDF2.1敲除突变体在温室(300 μmol光子m−2年代−1将一对真叶苗移栽到4.5 l的花盆中，在含有1.25 mM KNO的1/4植物营养液中培养21天3.， KH为0.625 mM2阿宝4， 1.25 μM Fe-EDTA, 0.5 mM MgSO4， 0.5 mM Ca(NO3.）2， 0.05 μM NaMoO4， 0.125 μM CuSO40.25 μM ZnSO4， 3.5 μM MnCl2、17.5 μM H3.薄3.．将培养基的pH调至5.8，并在缓冲液中加入MES (2.5 mm)以调节pH可能发生的变化。每4 d更换一次培养基。每个盆地种植48株植物，所有盆地的生长条件相同。

在铵态诱导实验中，设置相对表达量分析AtPDF2.1在不同处理下，用1/4植物营养液处理Col-0幼苗18 d，然后进行N饥饿处理3 d，之后用2.25 mM KNO处理幼苗3.， 1.125 mM (NH4）2所以4，或1.125 mM K2所以46 h，然后分别收获根和芽进行RNA提取和AtPDF2.1表达分析。

在其他实验中，col0，pdf2.1-1,pdf2.1-2用1/4植物营养液处理幼苗21 d后取样分析。

组织化学分析

AtPDF2.1初始密码子上游的1805 bp基因组片段使用引物ProAtPDF2.1进行PCR扩增1:表S1)。然后，亚克隆生成的ProAtPDF2.1启动子，分裂成二进制载体pCAMBIA1300 [53］．的答:芥根据“实验材料和生长条件”部分的报道，在水中培养21 d的幼苗取样。从根中切下半薄片(4 μm)固定在载玻片上，在徕卡- dm6000显微镜下观察。使用GUS组织化学分析试剂盒(Real-Times)进行ProAtPDF2.1启动子驱动的组织化学染色。在Olympus BX51显微镜下观察GUS在根部的染色模式，使用Fujifilm X-A3相机拍摄。

DNA构建并转化为植物

的编码序列AtPDF2.1使用引物AtPDF2.1F和AtPDF2.1R进行PCR扩增(附加文件1:表S1)，然后分析AtPDF2.1的亚细胞位置拟南芥是确定。子克隆生成结构35S::mRFP/1300。由此产生的片段与单个红色荧光蛋白(mRFP)基因的5 '端框在一起，产生35S::AtPDF2.1-mRFP/ pCAMBIA1300结构。通过将35S启动子替换为原生启动子proAtPDF2.1，对这些结构进行了修改，得到proAtPDF2.1::AtPDF2.1-mRFP/pCAMBIA1300构造，这些构造被转换为答:芥使用花浸法[54］．然后用共聚焦显微镜(LSM880;蔡司)。

N浓度的定量

水培法培养21 d后，Col-0和突变体的茎和根均得到培养答:芥植物单独采样，在N液中冷冻，并在- 80°C保存，直到进一步分析。靛酚蓝比色法，在630 nm处[55，56，57和使用(NH4）2所以4，测定铵浓度。在410 nm处测定根和叶中的硝酸盐浓度[57，58，59spectrophotometrically。总氮浓度的测定如Wang等所述[60］．在本研究中，NUE被确定为总生物量/总N积累量[61］．

氮和铵代谢相关酶活性

植物氮代谢与几种关键酶的活性密切相关，如NR和GS [62］．为了测定NR活性，将收获的根和叶立即冷冻在N液中，然后在- 80°C保存，直到进一步分析。样品研磨成细粉(~ 100 mg)，提取，分光光度法分析[57，63，64］．GS活性测定如Wang等报道[65］．使用NADH-GOGAT测量试剂盒(Solarbio生物工程研究所)对NADH-GOGAT的活性进行量化。谷氨酸和谷氨酰胺分别使用谷氨酸测量试剂盒和谷氨酰胺测量试剂盒进行定量(均来自南京建成生物工程研究所)。酶活性以单位时间内每毫克新鲜体重或蛋白质产生/消耗的代谢物摩尔数表示。蛋白浓度采用考马斯亮蓝法测定，采用改良BCA蛋白测定试剂盒，C503051，生工生物科技。

氨基酸定量

根据Del Campo等人的报道，使用高效液相色谱法(HPLC)定量芽中的氨基酸。[66］．冷冻叶片样品(200 mg)用N液粉碎，并在1.5 mL 0.1%苯酚和6 M HCl中均质。匀浆在100°C下水解22 h，然后冷却。使用NDK200-2组织(杭州MIU仪器有限公司)干燥1毫升水解物，并在1 mL 0.1 M HCl中重新溶解。将200 μL再溶水解液与20 μL去亮氨酸内标液、200 μL三乙胺乙腈(pH > 7)、100 μL异硫氰酸乙腈混合，25℃孵育1 h，定量氨基酸。加入400 μL正己烷后，摇匀再孵育10 min。衬底中的溶液通过0.45 μm注射器过滤器。所有HPLC分析均在RIGOL L3000系统(北京RIGOL科技有限公司)上进行。采用RP-HPLC ACE柱(5C18-HL)，粒径为5 μm (250 mm × 4.6 mm)，在100℃下，通过二元梯度进行色谱分离。流动相A为25 mM醋酸缓冲液(pH 6.5)和70 mL乙腈。 Mobile phase B was 80% acetonitrile aqueous solution. The flow rate was 1.0 mL min−1柱温为40℃。

基因分型，RNA提取，定量PCR

为了鉴定突变体，从生长在1/2植物营养液(叶子)中的21 d老植物中提取总DNA，用附加文件中提供的引物作为PCR模板1:表S1。

在铵诱导实验中，分别采集Col-0幼苗的根和芽，用1/4植物营养液处理18 d，处理前进行N饥饿处理3 d，在N液中冷冻，在- 80℃保存至RNA分析。的表达模式分析PDF2.1，从水培法生长的45 d老植物(叶、茎、角果和花)或在1/2植物营养液中生长的7 d老植物(幼苗)中收获组织。按照制造商的说明，用TRIzol (Invitrogen)提取总RNA，用等体积的异丙醇沉淀，用75%乙醇洗涤，并溶解在不含rnase的水中。互补DNA合成使用PrimeScript™RT Kit与gDNA Eraser (Perfect Real Time;TAKARA)遵循制造商的协议。目标基因的相对表达是通过实时定量PCR在应用生物系统StepOne™实时PCR系统和SYBR Premix Ex-Taq (TAKARA)上进行的，根据制造商的说明。将靶基因的相对表达量归一化至内参基因的相对表达量——ΔΔCT方法(67］．分析中使用的引物列在附加文件中1:表S1，表达式数据归一化为Actin2，作为内部标准。

统计分析

在本研究中，所有实验均采用完全随机设计进行。每个处理设4个生物重复和2个技术重复。采用最小显著性差异多极差检验进行多重比较。野生型和突变型之间的差异用Student 's进行评估t-使用统计产品和服务解决方案17.0 (SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行测试。这些差异被认为有统计学意义P< 0.05。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

缩写

AMT:

铵转运蛋白

国民幸福指数:

谷氨酸脱氢酶

GOGAT:

谷氨酰胺转氨酶

g:

谷氨酰胺合成酶

护士:

氮

NR:

硝酸还原酶

自虐:

氮利用效率

PDF格式:

植物defensins

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下载参考

致谢

感谢彭灿(中国科学院亚热带农业研究所核心设施)对共聚焦显微技术的帮助。

资金

国家重点研发计划项目(2017YFD0200100;2017 yfd0200103);国家自然科学基金(31800202);湖南省重点研发计划项目(2018NK1010);中国博士后科学基金(2018 M630900);湖南省外国专家招聘计划;国家油菜生产技术体系;教育部“2011计划”;湖南农业大学双一流建设项目(kxk201801005)、湖南省自然科学基金创新课题组(2019JJ10003)。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与撰写手稿。

作者信息

从属关系

  1. 湖南农业大学资源与环境科学学院，中国南方粮油作物区域协同创新中心，长沙

    姚俊跃，罗劲松，肖燕，张振华

  2. 湖南省农田污染控制与农业资源利用重点实验室，普通高校营养湖南省重点实验室，土壤肥料资源高效利用国家工程实验室，长沙410128

    罗劲松，张振华

作者
  1. Junyue么
    查看作者出版物

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  2. Jin-Song罗
    查看作者出版物

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  3. 严小
    查看作者出版物

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  4. 振华张
    查看作者出版物

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贡献

J-YY、J-SL和Z-HZ设计实验;J-YY完成了大部分实验;YX负责部分实验;J-YY和Z-HZ对数据进行分析;J-YY、Z-HZ撰写稿件。所有作者均同意稿件内容及投稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿

相应的作者

对应到Jin-Song罗或振华张．

道德声明

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

额外的信息

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

补充信息

附加文件1:

图S1。硝酸盐浓度答:芥，图S2。相对表达量AtGLT1在Col-0的芽中pdf2.1-1,A. thaliana . pdf2.1 . 2在1/4植物营养液中培养21 d，表S1。本研究中使用的引物

权利和权限

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姚俊，罗俊。，小，Y。et al。植物防御素基因AtPDF2.1通过调节谷氨酰胺合成酶活性介导氨代谢拟南芥．BMC植物生物学19日,557(2019)。https://doi.org/10.1186/s12870-019-2183-2

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关键字

  • 铵新陈代谢
  • 拟南芥
  • GLN1.3
  • GLN1.5
  • PDF2.1
  • 植物defensins

BMC植物生物学

ISSN: 1471 - 2229

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