硫转移酶(套装与sot文件棉花基因家族(Gossypium)以及它与纤维发育的关系

背景

Sulfotransferases (套装与sot文件) (EC 2.8.2.-)在硫酸盐偶联反应中起着至关重要的作用，参与植物的生长、活力、抗逆性和病原体感染。套装与sot文件在拟南芥中进行了研究，并分为8组。然而，系统的分析和功能信息说棉花的家族基因很少被报道。

结果

根据BLASTP和HMMER结果，我们分离了46、46、76和77株说基因组中的基因g . arboreum，g . raimondii就，g .取得和g .分子,分别。245年共170人套装与sot文件根据与?的同源关系进一步分为四组拟南芥，串联复制主要促成了说基因家族g .分子．的表达谱GhSOT结果表明，大部分基因在茎、叶和纤维发育初期均有高水平表达。定位分析表明GhSOT67在细胞质中表达，位于茎和叶组织中。此外，的表达GhSOT67介导基因沉默后，茎毛和叶毛的长度缩短农杆菌属，与空白对照和阴性对照比较。

结论

我们的研究结果表明说这些基因可能与棉花纤维发育有关，为进一步研究棉花纤维发育提供了有价值的信息说基因在Gossypium．

硫是植物生命中最基本的元素之一。它在高等植物中的同化和重要代谢硫化合物的减少是植物生长、活力和抗逆性的关键因素[j]。1]。硫在蛋白质的结构、调控和催化中起着重要作用。根据前人的研究，硫酸化是根瘤菌结瘤因子在细菌中向植物发出信号所必需的[2]。在哺乳动物中，硫酸化有助于许多具有生物活性的内源性化合物的体内平衡和调节[3.]。在植物中，硫酸盐偶联反应在植物生长发育和逆境适应中起着重要作用[4]。硫酸盐在用于生化转化之前，必须经过两个随后的活化步骤来形成腺苷-5 ' -磷酸硫酸酯(APS)和3 ' -磷酸腺苷-5 ' -磷酸硫酸酯(PAPS) [5]。

Sulfotransferases (套装与sot文件) (EC 2.8.2.-)催化硫酸盐基团从PAPS转移到不同底物的羟基[6]。第一个工厂说基因是从Flaveria物种(菊科)，这与黄酮醇的磺化反应有关[7]。随后，从植物中分离到编码硫转移酶的cDNA拟南芥并推导出302氨基酸多肽与植物黄酮醇磺酸转移酶高度相关[8]。套装与sot文件广泛存在于高等植物、动物和真细菌中[1，9]。根据之前的研究，说蛋白质参与多种生理和生物过程的调控，如生长、发育、对土地的适应、气孔关闭、耐旱性和病原体感染[qh]1，3.，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18]。套装与sot文件的Flaveria利用分子生物学和生物化学手段对物种进行了很好的表征，并作为植物的一般模式套装与sot文件［7]。这些套装与sot文件接受不同黄酮醇作为硫酸盐受体，可能参与胁迫适应或极性生长素运输。当拟南芥幼苗用激素或与压力相关的化合物处理，说水杨酸和茉莉酸甲酯显著诱导蛋白表达。此外，积累套装与sot文件在成熟植物的叶片或细胞悬浮液中也观察到细菌病原体感染[8]。其他几份报告也透露了这一点套装与sot文件可直接催化硫代葡萄糖酸盐、油菜素内酯、茉莉酸盐、黄酮类化合物和水杨酸，并直接或间接参与防御信号、发育和应激反应[1，10，12，16，19]。

棉(Gossypium)是一种主要的工业作物，在世界上提供重要的天然纤维和食用油。本属有45种二倍体和5种四倍体。其中,陆地棉L.已在世界范围内种植，目前占世界纤维产量的绝大部分(> 90%)。20.，21，22]。棉纤维是一种独特的细长细胞，这有助于研究细胞分化。棉纤维是单细胞毛状体，经历了起始、伸长、次生细胞壁合成和成熟四个主要发育阶段[23]。棉纤维在伸长率和次生细胞壁合成方面的发展决定了纤维的长度和强度特性[24]。此外，纤维发育是一个复杂的过程，涉及多种途径，包括各种次级代谢、激素、信号转导和转录调控组分[25，26]。例如，一种黄酮类化合物柚皮素已被证实与纤维发育呈负相关[26，27]。生长素和油菜素内酯促进了纤维的起始和伸长;赤霉素酸和乙烯在纤维伸长阶段起积极作用[25，26，27，28，29]。另一方面，细胞分裂素、脱落酸起相反的作用[11]。茉莉酸参与多种发育过程。不同浓度的茉莉酸起着不同的作用，高浓度的茉莉酸抑制纤维的起始[30.，31]。同样，茉莉酸盐通过抑制赤霉素信号在一定程度上抑制了棉花的发育[32]。茉莉酸的过度积累抑制棉绒和绒毛纤维的形成，减少纤维长度，导致棉籽无纤维表型[j]。33]。

考虑到套装与sot文件直接催化油菜素内酯、茉莉酸酯、黄酮类和水杨酸等与生长、棉纤维发育和胁迫适应有关的物质，有必要了解它们的相关信息说基因家族Gossypium为了更好地了解硫化反应与生理过程的关系。然而，据我们所知，并没有系统的研究说家庭Gossypium．在本研究中，我们确定了46、46、76和77说基因g . arboreum，g . raimondii就，g .取得,g .分子然后研究了染色体位置、系统进化关系、基因结构、保守基序、组织和亚细胞定位以及表达模式等特征。我们的研究提供了一个全面的分析Gossypium说基因家族和结果可能有助于理解的作用说在植物发育中。

鉴定、鉴定及染色体分布说四种棉花的基因

根据BLASTP和HMMER 3.1的结果，共有245个说从4个棉花品种中鉴定出46个基因g . arboreum， 46个基因g . raimondii就， 76个基因g .取得77个基因g .分子．蛋白序列分析表明说基因蛋白编码60 ~ 672种氨基酸，平均分子量(Mw)为32.48 kDa，等电点(pI)为6.58。亚细胞定位分析显示245例中有70.6%说基因定位于细胞质中，这可能与它们作为转移酶的功能一致。的说在附加文件中列出了基因名称、位点id和其他特征1表S1。

245说4种棉花的基因在染色体上分布不均匀(图2)。1）.Chr09的g . raimondii就包含的数量最多说基因(11)。的Chr03/ Chr08g . arboreum， Chr04/ Chr05/ Chr10的g . raimondii就， A03/ A08/ D02/ D08的g .取得及A03/ A08/ D02/ D08g .分子不包含说基因。此外，分布说基因在g .取得和g .分子有一些相似之处。因此，我们进一步分析了二者的共线性说这四个基因组的基因。

的共线性和重复分析说基因

我们找出了这4个棉花基因组中的所有同源基因，分析了它们的共线性关系说基因(图。2和附加文件1表2)。在所有77人中说基因的g .分子39岁的GhSOTs有基因组间同源基因吗g .植物园， 37个同源基因g . raimondii就49个同源基因g .取得,分别。共鉴定出32对共同同源说四种棉花的基因。

以前的研究Gossypium表明基因家族总是通过串联、全基因组和片段复制来扩展[34，35]。在g .分子，共发现20对串联重复基因对(32个基因)分布在12条染色体上(图2)。3和附加文件1表S3)。另外，16个基因对重复被归类为WGD/节段重复。其余基因复制机制被检测为近端或分散。因此，串联复制可能主要有助于扩大说进化过程中的基因家族g .分子．为了理解的共线性说基因家族g .分子和两个二倍体棉花祖先，我们也鉴定了这些连锁基因对(图2)。3.B).共线基因对共56对g .分子和g .植物园，其中29个属于in的At亚群g .分子．共线基因对48对g .分子和g . raimondii就， 22个基因为Dt亚群g .分子．

的系统发育分析说基因

从由所有成员构建的系统发育树说基因(图。4)， 245人中的170人说基因分布在4个亚科，其余75个基因被划分为2个支系。第七亚科和第六亚科是最大的两个亚科，分别有78和75个成员。亚家族V是最小的，只有5个基因。的说4种棉花的基因亲缘关系较近拟南芥．此外，在分支的末端，有许多枝上有三个基因聚集在一起。一般来说，在这三个基因中，两个基因来自四倍体的At亚群，一个来自g .植物园;或者两个基因来自四倍体Dt亚群，一个基因来自g . raimondii就．这与四倍体来自两个二倍体的事实是一致的[36]。然而，在四倍体形成后，两个四倍体之间的关系比它们的祖先之间的关系更密切。

的结构特征和保守基序分析GhSOT基因

基因结构说根据基因注释文件对基因进行分析，如图3所示。5．结果表明，外显子数量在1 ~ 6个之间，平均为1.5个。绝大多数基因含有少于3个外显子，大多数只含有一个外显子。通常，同一进化分支的基因结构相似，在内含子/外显子数量和内含子/外显子长度方面具有保守的基因结构模式。

的20个保守基序GhSOT通过MEME程序鉴定基因(图2)。5和附加文件1(表S4)，宽度从11到50个氨基酸不等。不同基因中保守基序的数目在2 ~ 14个之间，但在系统发育树的同一分支中，保守基序的数目和类型是相似的。Motif 4出现在66个基因中，几乎为所有基因所共有GhSOT其次是Motif 5,3,10,7,1(出现在60多个基因中)。在同一进化枝上的四个基因的基因结构和保守基序，GH_D03G0217，GH_A02G1840，GH_D10G1036和GH_A10G0926与其他基因不同，这可能导致进化速度和功能的变化。

RNA-Seq表达谱GhSOT基因

首先,21GhSOT在10个不同阶段表达水平低于1的基因被淘汰。其余56个的原始数据GhSOT基因归一化为log2^FPKM表达的热图如图所示。6．大多数基因表现出在不同阶段特异性表达的特征。16个基因在10个组织中组成性表达，其中以GH_A04G0111和GH_D04G1212在所有阶段都大于1。大部分的GhSOT基因在茎、叶和纤维发育初期(胚珠- 3,0,3 dpa)表现出高水平表达。这表明说基因可能与棉花纤维发育有关。如先前研究所述[37]，与纤维质量相关的基因座大量聚集在D11染色体上。在这项研究中，有两个说位于D11染色体上的基因，其中一个在几个组织中特异性表达。因此，我们进一步进行了实验来了解的特点和功能GhSOT67（GH_D11G2586）.

组织和亚细胞定位分析GhSOT67

目的探讨…的组织定位GhSOT67构建了pGhSOT67::GUS重组载体，并将其转化为拟南芥由根癌土壤杆菌细胞(GV3101)。筛选多个阳性转化子，浸泡在GUS染色液中，最典型的阳性转化子如图所示。7a和b.结果表明，在转化植株的茎和叶中发现了蓝色的染色，这与基因的转录组表达一致GhSOT67(无花果。7c).这种表达模式在拟南芥［8]。

根据在线工具CELLO，GhSOT67被预测定位于细胞质(附加文件1:表1)。为了验证这一点，完整的cdGhSOT67与pBinRFP载体连接。对照空载体pBinRFP遍布细胞，包括细胞核、膜和细胞质(图2)。7d).相比之下，GhSOT67::RFP融合蛋白主要定位于细胞质中，证实了之前的预测结果。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)GhSOT67在棉花

为了探究两者之间的关系GhSOT67本研究对棉花品种J02进行了基因和纤维发育的VIGS试验。空载体pYL156作为阴性对照。重组载体pYL156:CLA1可以诱导叶片白化表型，因此可以作为基因沉默成功的阳性对照。

诱导17天后，阳性对照植株出现白化表型(图2)。8a)证明VIGS是成功的。的表达式GhSOT67基因沉默后，首先通过PCR与Histon3．随后，qRT-PCR结果显示，大多数的基因表达水平GhSOT67沉默植物减少了80%以上(图2)。8b).如图所示。8C、治疗1个月后，茎毛数在增加GhSOT67与空白对照和阴性对照相比，沉默植株数量明显减少。与此同时，茎和叶毛的长度GhSOT67沉默植株明显短于对照植株(图2)。8c、d)。茎、叶毛和棉籽纤维均起源于单细胞层，两者的纤维分化发育机制可能相似[38，39，40]。因此，结果表明GhSOT67可能与纤维发育过程有关。

近年来，核基因组序列g . arboreum，g . raimondii就，g .分子，g .取得和g .分子已陆续出版[41，42，43，44]，进一步加深了对棉花基因组学和遗传学的认识，为探索提供了可能说基因家族成员及其系统发育关系。在这里，我们一共确定了245个说从四个棉花品种的基因中，根据蛋白质的序列进行鉴定。的数量GhSOT和GbSOT基因多于说这可能是由于大约150万年前，两种四倍体棉花发生了多倍体化事件(Mya) [36]。

基因复制被认为是进化的主要驱动力，导致功能分化和多样化[45]。基因复制主要包括串联复制、全基因组复制和片段复制三种形式。在这项研究中，我们发现串联复制可能主要有助于扩大GhSOT基因家族，以及其他几种复制方法存在。在先前报告的基础上拟南芥，套装与sot文件被分成8组[1，9]。系统发育分析表明245说棉属植物基因聚类套装与sot文件从拟南芥分成4支，除了75支套装与sot文件从Gossypium．三个基因在进化分支末端的收敛与先前的研究一致，即两个二倍体是四倍体的祖先[36]。基因间外显子和保守基序数量的差异表明外显子的增加和减少可能导致基因功能的多样性说与进化密切相关的基因说基因家族。

到目前为止，只有几个拟南芥套装与sot文件都有功能特征。At5g07000来自VI族的化合物被证明可以催化12-羟基茉莉酸酯的硫酸化，从而导致植物中茉莉酸的失活[16]。为另一个拟南芥说，At3g45070从II组中，已经发现与黄酮醇特异性结合[1]。为GhSOT我们特别关注那些可能在植物生长或纤维发育中起关键作用的基因成员。结合的转录组表达GhSOT先前报道的纤维质量相关位点的基因[37]，GhSOT67选择它是为了进一步了解它的特点和功能。对于定位分析，GhSOT67估计在细胞质中表达，并定位于茎和叶组织。这些特征可能与它作为催化剂的功能有关[8]。转录组表达表明GhSOT67特异表达于多个组织和纤维发育初期(胚珠- 3,0,3 dpa)。此外,GhSOT67经VIGS处理的沉默植株茎毛和叶毛长度均短于对照植株。根据系统发育聚类结果，GhSOT67属于第六组，它可能有类似的功能At5g07000可以催化茉莉酸的失活。所以我们推测GhSOT67被沉默后，茉莉酸不能在植株内硫酸酸化积累，茎叶毛长度缩短。综合来看，这些结果表明GhSOT67可能与棉纤维发育有关。然而，详细的相关性套装与sot文件茉莉酸和纤维的发育还有待进一步验证。

在这项研究中，全面分析包括染色体定位，共线性和重复，基因结构和表达模式说基因家族Gossypium是第一次执行。综上所述，我们共分离了245例说基因组中的基因g . arboreum，g . raimondii就，g .取得和g .,并进一步分类说根据基因的同源关系将其分为四组拟南芥．串联复制主要促成了扩展说基因家族g .分子．的表达谱GhSOTs在不同的组织和发育阶段暗示GhSOTs可能与纤维发育有关。此外，VIGS基因沉默可显著诱导GhSOT67缩短了茎叶毛的长度。综上所述，这些发现表明说基因可能与棉花纤维发育有关。

数据库检索和序列检索

两种二倍体棉花的基因组档案及蛋白质序列分析[j]。41，46) (g . arboreumlg . raimondii就)和两种四倍体棉花[44) (g .分子lg .取得L.)从棉花功能基因组数据库(CottonFGD)下载(https://cottonfgd.org/) [47]。蛋白质序列拟南芥(L.)从拟南芥资讯资源(TAIR) (https://www.arabidopsis.org/）.根据翻译产物的序列相似度，对翻译产物进行分类拟南芥整个基因组包含21个基因说蛋白(AtSOT) [1和所有21拟南芥说用TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases) [48]。

采用两种方法进行检索说四种棉花的基因。首先,21拟南芥说使用BLAST算法(BLASTP)对4个默认参数(e值<1e-5)的棉花蛋白序列文件进行查询。候选人说每个棉花品种的基因分别命名，如GhSOT从g .分子和GbSOT从g . barbadens．其次，从Pfam (http://pfam.xfam.org/)，作为查询序列搜索候选对象说利用Hmmer 3.0 (http://hmmer.org/)，使用默认参数。的说保留e值小于15的蛋白序列。然后，我们将上面得到的所有命中数合并，并丢弃重复序列。所有非冗余蛋白序列使用NCBI保守结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)在自动模式下(阈值= 0.01，最大命中数=500)。

最后，候选人说进一步人工确认基因以消除伪序列，并根据在线工具CELLO v2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/) [49]。候选物质的分子量(Mw)和等电点(pI)说通过在线ExPASy服务器(http://web.expasy.org/compute_pi/) [50]。

染色体作图和系统发育分析

染色体位置和基因结构信息说从4个棉花基因注释文件中获得基因说利用MapChart软件(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart/）.

的全长氨基酸序列说来自双方的基因拟南芥和Gossypium保存为fasta格式文件，并使用默认设置的ClustalW程序执行多个序列对齐。随后，我们在MEGA X中构建了邻居连接(NJ)树，参数设置为:1000个bootstrap重复，Jones-Taylor-Thornton (JTT)替代模型，部分间隙删除模式，截断值为80%。

内含子/外显子分布和保守基序分析

基因结构说基因结构显示服务器2.0 (GSDS)http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) [51]。的保守域基元套装与sot文件多模序激发(Multiple Em for Motif Elicitation, MEME) (http://meme-suite.org/tools/meme) [52]根据以下参数:位点分布设置为每个序列出现0或1次，motif的宽度范围为6 ~ 50,motif的最大数量为20。的所有特征结果说通过Tbtools将基因可视化并整合到图形中。

基因表达分析

外显子每千碱基每百万片段映射的片段数(FPKM)值是通过转录组数据获得的g .分子简历。TM-1 [53]。考虑- 3 dpa胚珠、0 dpa胚珠、3 dpa胚珠以及5、10、20和25 dpa胚珠3个不同组织和7个不同纤维发育阶段的表达值，并进一步分析FPKM值至少大于1的基因。的表达式说估计Gene以log2的形式归一化^FPKM并显示在热图中。

植物材料

棉花品种J02由中国农业科学院安阳棉花研究所种质资源库(CRI of CAAS，中国河南安阳)提供，仅供科研使用。J02播种于蛭石:腐殖质= 1:1的混合土壤中，在28°C和25°C的培养箱中分别进行16 h /8 h(光/暗)光周期培养，直至子叶完全展开。

拟南芥生态型哥伦比亚(Col-0)和烟草(烟草benthamiana)也由中国科学院CRI提供，并通过以下方式作为受体材料生长。用滴管将种子生长在琼脂固化的Murashige和Skoog (MS)培养基上，低温48 h后，将培养皿置于培养箱中，分别在24°C和22°C下进行16 h / 8 h(光/暗)光周期。当子叶展开后，移栽到无菌混合土(蛭石:腐殖质= 1:1)中。

目的基因载体的构建及其接种处理

以便进行组织定位GhSOT67将该基因上游1500 bp启动子序列扩增至pBI121载体的两个限制性内切位点(HindIII和BamHI)。的根癌土壤杆菌将含有构建载体的细胞(GV3101)转化为拟南芥植物按花浸法[54]。野生型和转基因植株在上述条件下生长。在含有50 μg/mL卡那霉素的半强度MS培养基上筛选阳性转化子，并通过PCR和β-葡萄糖醛酸酶(GUS)染色进行鉴定。

的光盘GhSOT67无初始密码子插入pBinRFP载体的SalIrestriction位点[55]来构建翻译RFP融合结构。将重组质粒转化为根癌土壤杆菌菌株LBA4404，按方案接种于烟草顶部的第二或第三片叶片上[56]。将pBinRFP(单独RFP)载体转化到与对照同时种植、条件相同的烟叶中。最后，将染病烟叶用锡纸包裹，置于黑暗环境中24-48 h，在CCD相机光学显微镜下观察(Leica Microsystems，德国)[57]。

在病毒诱导的基因沉默(VIGS)实验中，选择了一个特定的300 bp序列GhSOT67在两端扩增出两个限制性位点(SpeI和AscI)。首先将PCR扩增产物克隆到pMD19 T载体中。所得构建物与pYL156分别用SpeI和AscI酶切，并通过连接缓冲液i连接形成pYL156:GhSOT67。质粒转化为根癌土壤杆菌LBA4404用于感染棉花。将pYL192农杆菌培养悬浮液与其他农杆菌培养悬浮液均匀混合，作为辅助载体。将阴性对照pYL156、阳性对照pYL156: cl1和阳性对照pYL156:GhSOT的农杆菌培养悬液分别注入棉花品种J02完全展开的子叶中，在真叶尚未长出之前。10株J02留作野生型(空白对照)，10株分别注射pYL156和pYL156:CLA1, 45株注射pYL156:GhSOT67。实验程序和操作方法参照文献[。]58]。

收集、RNA分离和qRT-PCR分析

浸润约2周后，当真叶出现白化表型时，立即将J02叶片放入液氮中，- 80℃保存，用于RNA分离分析。总RNA通过RNA提取试剂盒(TIANGEN, Beijing, China)提取。第一链cDNA的合成使用PrimeScript™RT reagent Kit和gDNA Eraser (TaKaRa, Japan)。采用7500 Fast real-time PCR系统(Applied Biosystems, Inc.， California USA)和SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Japan)进行实时荧光定量PCR分析。的Histon3基因作为内源对照，使基因表达正常化。的相对表达量GhSOT67利用2^——ΔΔC_T方法(59]。

所有用于扩增或构建载体的基因特异性引物在附加文件中列出1表S5。

支持本研究结论的数据集包含在本文(及其附加文件)中。作者很乐意根据要求分享任何原始数据。

APS:

腺苷的-phosphosulfate

BLASTP:

蛋白质BLAST算法

cd:

编码序列

装备:

染色体

CottonFGD:

棉花功能基因组数据库

分区:

花后天数

FPKM:

每千个碱基的片段每一百万个片段映射的外显子

德牧:

基因结构显示服务器

格斯:

β葡萄糖醛酸酶

JTT:

Jones-Taylor-Thornton

m:

数百万个碱基对

MEME:

多em主题引出

女士:

Murashige和Skoog

兆瓦:

分子量

米娅:

百万年前

NJ:

neighbor-joining

PAPS:

3 -phosphoadenosine-5 -phosphosulfate

pI:

等电点

存在:

实时定量PCR

RNA-seq:

RNA序列

套装与sot文件:

Sulfotransferases;

TAIR:

的拟南芥信息资源

中收取:

病毒诱导的基因沉默

WGD:

全基因组复制

感谢实验室所有同事提供的有益讨论和技术支持。我们非常感谢编辑和审稿人对手稿的批判性评价，并对其改进提供建设性的意见。

山东省自然科学基金项目(ZR2017MC057)、国家重点研发计划项目(2018YFD0100303)、现代农业产业技术体系项目(SDAIT-03-03/05)、国家自然科学基金创新群体项目(批准号:31621005)资助。所有资助机构都支持本研究的设计、数据收集、分析、解释和稿件撰写。

从属关系

1. 山东农业大学作物生物学国家重点实验室/农学院，泰安271018

   王丽媛，刘锡燕，刘宝深，宋贤良

2. 中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室，安阳455000

   王丽媛，刘希燕，王晓阳，潘兆娥，耿晓丽，陈宝军，杜雄明

贡献

XS和XD构思和设计了研究;LW进行主要实验和生物信息学分析，撰写和修改稿件;XW和XL协助进行VIGS和qPCR实验;ZP收集和培养所有植物材料，提供实验所需的关键试剂;XG和BL协助进行VIGS和qPCR数据分析;XS和BC监督研究，获得资金和修改稿件;所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

作者的信息

不适用。

相应的作者

对应到Xiongming杜或Xianliang歌．

伦理批准并同意参与

我们研究中使用的植物材料的收集符合机构和国家的指导方针。根据当地法律进行了实地研究。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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