全长转录组测序显示出低温耐受机制gydF4y2BaMedicago falcatagydF4y2Ba根gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

低温是限制作物生长、发育和生产的主要环境因素之一。gydF4y2BaMedicago falcatagydF4y2Ba是一种重要的豆科草本植物，广泛分布于世界各地。gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba与紫花苜蓿有关，但较紫花苜蓿更耐低温。了解耐低温机理gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba对紫花苜蓿的遗传改良具有重要意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在这项研究中，我们探讨了低温处理的根部的转录组变化gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba将SMRT测序和NGS技术相结合。共获得115153个非冗余序列，预测AS事件8849个，SSRs 73,149个，lncrna 4189个。从SMRT测序中共注释了111587个基因，鉴定出11369个DEGs，涉及植物激素信号转导、内质网蛋白加工、碳代谢、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、胞吞作用等途径。我们将1538个TF基因分为45个TF基因家族，其中最丰富的TF家族是WRKY家族，其次是ERF、MYB、bHLH和NAC家族。共有134个基因在所有5个温度点共表达差异，其中101个基因表达上调，33个基因表达下调。发现PB40804、PB75011、PB110405和PB108808在耐受性中起关键作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温。WGCNA透露，Mebrown模块与低温应力显着相关gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba．电解质泄漏与大多数遗传模块相关，并验证了电解质泄漏可以用作生理测定中的直接应力标记，以表明来自低温胁迫的细胞膜损坏。QRT-PCR结果和RNA-SEQ分析之间的一致性证实了RNA-SEQ数据的有效性以及基于转录组的低温胁迫的调节机制分析。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究产生的全长转录本提供了一个完整的特性的转录组gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba并且可能对采矿新的低温应激相关基因进行特异性gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba这些新发现将有助于理解植物的耐低温机制gydF4y2Bam . falcata。gydF4y2Ba

低温是限制植物生长发育和地理分布的主要环境因素之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．低温应力，由冷却应力（<10°C）和冷冻应力（<0°C）组成，可以在一定程度上降低作物生产率[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]低温对植物的影响取决于发育阶段和暴露时间。在低温胁迫下，幼龄组织和器官的损伤比老组织和器官更严重，繁殖期比营养期对低温更敏感[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．低温暴露导致植物的生理和分子变化，导致代谢紊乱:这些变化包括抑制光合活性;水吸收的减少;通过增加活性氧(ROS)的积累而增加氧化应激;细胞内pH值和渗透压升高;以及叶绿体、线粒体和其他细胞器的功能异常[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．此外，低温暂时抑制蔗糖合成，膜的重排改变蛋白质的稳定性和迁移率和氧化还原稳态的迁移，这减少了酶活性，并改变了代谢稳态和基因转录[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

植物已经发展了许多机制和途径，使它们能够最大限度地减少低温的负面影响，并成功地生长和繁殖[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．低温胁迫诱导的渗透性，包括脯氨酸，可溶性糖和冷致应激蛋白（脱氢和Lea蛋白）可以改善细胞的渗透势，保护生物膜的稳定性，缓解氧化损伤局限，甚至采取行动作为调节应激相关基因表达的信号[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].过表达gydF4y2BaSlNAM1gydF4y2Ba该基因编码典型的NAC基因，通过改善渗透性和降低HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和超氧阴离子自由基(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^．-)，有助于减轻低温胁迫后细胞膜的氧化损伤[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．低温诱导钙的产生gydF4y2Ba^{2＋gydF4y2Ba}，可以通过相应的受体，其中脂质CA中的感测gydF4y2Ba^{2＋gydF4y2Ba}信道可以是初级低温信号的受体，并且可以然后激活钙反应的蛋白激酶（CPKs，CIPKs，和CRLK1）和MAPK级联反应，其反过来调节的冷响应（COR）基因的表达[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].过表达gydF4y2BaCOLD1gydF4y2Ba（jap）显著提高了耐寒性；gydF4y2BaCOLD1gydF4y2Ba与G蛋白α亚单位相互作用以激活CagydF4y2Ba^{2＋gydF4y2Ba}感知低温和加速g蛋白GTPase活性的通道[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．低温胁迫可迅速诱导多种转录因子(TFs)的表达，包括CBF ap2结构域蛋白，然后激活大量下游蛋白的表达gydF4y2Ba天哪gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．表达gydF4y2BaCBFgydF4y2Ba该基因由上游TFs控制，如bHLH TFgydF4y2BaICE1.gydF4y2Ba．gydF4y2BaICE1.gydF4y2Ba分别由SUMO E3连接酶SIZ1和泛素E3连接酶HOS1介导的泛素化和多聚泛素化以及随后的蛋白酶体降解[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

由Pacbio Biosciences RSII开发的单分子长读（SMRT）测序代表了第三代排序平台。由于其长读取，该平台广泛用于基因组测序，并通过产生全长或长序列，它已经消除了与测序相关的许多限制[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。下一代测序（NGS）技术（RNA测序[RNA seq]）可以提供编码或非编码RNA的表达谱，并可以生成基因表达的数字数据，从而能够对包括水稻在内的大多数主要作物物种进行快速、经济高效的基因组学和转录组学研究[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)、小麦(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，还有葡萄[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]NGS和SMRT测序相结合的方法经常被用于在转录水平上产生综合信息，从而能够识别与非生物胁迫抗性相关的关键功能和调控基因[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．响应于低温胁迫的基因表达的变化揭示的转录组分析，包括转录因子，蛋白激酶，小的非编码RNA和酶代谢途径，其调节从低温下游基因，靶基因，和受保护的细胞中的表达损害 [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

Medicago falcatagydF4y2BaL.是一种在经济和生态上具有重要意义的豆科草本植物，从地中海北部地区延伸到俄罗斯北部，与紫花苜蓿关系密切，但表现出比紫花苜蓿更好的耐低温性[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba].了解植物耐低温的机理gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba对于遗传改良苜蓿，这是最重要的牧草豆科牧草，因为它的高生物生产力的，最佳的营养分布和足够的持久性[重要gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．虽然低温耐受性gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba是从形态学层面到生理、生化和分子生物学层面的热门研究课题[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba的低温耐受性研究很少gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba在转录组水平。在本文中，我们将SMRT和NGS相结合来生成的表达谱gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温胁迫下的根。总共获得115,153个非冗余序列gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba共鉴定出11369个差异表达基因（DEG），其中134个基因在所有五个温度点上都有差异共表达。这些发现提供了基因转录的总体特征，并有助于理解植物的耐低温机制gydF4y2Bam . falcata。gydF4y2Ba

生理反应gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温胁迫下gydF4y2Ba

测定了电解质渗漏量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性以及超氧阴离子自由基(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^．-），可溶性蛋白质，降低的谷胱甘肽（GSH），脯氨酸和可溶性糖含量以研究生理变化gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba暴露于低温应激2小时的根（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.下的低温应力，电解质泄漏随着温度的降低（图逐渐增加。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。在-15℃下观察到最大的电解质泄漏，比对照条件下的4.18倍。MDA含量逐渐降低，在-10℃（相对于对照的℃）达到峰值，在-15℃下略微降低（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab). SOD活性无明显差异，低温处理后SOD活性升高，4℃至−15℃时SOD活性降低(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC）。在不同温度下，猫和豆荚活动的变化完全不同。猫活动首先增加，而首先降低豆荚活动（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad e)。O的含量gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^．-在低温处理后显著增加，在−10°C时达到峰值(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).可溶性蛋白含量在低温处理后先降低，4℃后升高，0℃后显著降低(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG）。The GSH content increased significantly after low-temperature treatment and peaked at − 5 °C (Fig.1gydF4y2Bah)。在低温环境下，脯氨酸含量略有下降(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai)，最大可溶性糖含量在−10℃下测定(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj）。gydF4y2Ba

m . falcatagydF4y2Ba转录组高通量测序gydF4y2Ba

鉴定和鉴定gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba根低温胁迫下，we measured the roots under room temperature (CK), 4 °C, 0 °C, − 5 °C, − 10 °C and − 15 °C for 2 h by combining the PacBio SMRT and NGS technologies for whole-transcriptome profiling. In total, 125.48 Gb of clean data were obtained by RNA-seq, yielding 418,495,643 reads (with a GC content of 42.61% and a QC 30 of 87.55%) (Additional file1gydF4y2Ba：表S1）。在三个尺寸范围内的三个文库中使用总共八个SMRT细胞，1-2 kB，2-3 kB和3-6 kB，产生19.27 GB的清洁数据。得到总共1,202,336个聚合酶读取，并且随后过滤并除去含有小于0.75的序列精度小于50bp的片段的聚合酶读数。然后通过从接头，接头序列和碎片长度小于50bp的片段（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.从原始序列中共提取插入序列(roi) 552,818个，其中270,750个为全长非嵌合reads (flnc)， 223,319个为非全长reads (Table)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).通过SMRT分析软件的RS_IsoSeq模块对全长序列进行聚类。共获得131118个一致的异构体；通过非全长序列比对获得99490个高质量异构体，通过RNA-seq数据获得并校正31628个低质量异构体。高质量异构体中存在任何冗余通过CD-HIT软件消除每个样本的校正低质量转录序列，获得115153个非冗余序列。基于每个样本的非冗余序列，我们通过IsoSeq_AS_de_novo脚本（附加文件）预测总共8849个选择性剪接（AS）事件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2);73,149个简单序列重复(SSRs)通过MIcroSAtellite识别工具(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S3）;和4189个长非编码RNA（lncRNAs）与编码潜在计算器（CPC），编码非编码指数（CNCI），编码潜能评估工具（CPAT）和蛋白质家族（PFAM）的数据库信息（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S1）。gydF4y2Ba

低温应力下转录物的注释和表达gydF4y2Ba

为了获得最全面的注释信息，将SMRT的所有全长转录本与NCBI non冗余protein (Nr)、SwissProt、Gene Ontology (GO)、Clusters of Orthologous Groups (COG)、Eukaryotic Ortholog Groups (KOG)、Pfam、NCBI non冗余protein (Nr)、SwissProt、Gene Ontology (GO)、和京都基因和基因组的百科全书KEGG数据库信息通过爆炸软件(版本2.2.26),并从SMRT共有111587个基因注释,其中的7155个基因的长度是> = 300 bp和< 1000个基点和104432个基因的长度是> = 1000个基点(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:表S4)。在这些注释序列中，Nr数据库中有显著匹配的序列有111,384条，Pfam数据库中有显著匹配的序列有89,117条，SwissProt数据库中有82,433条，GO数据库中有有效匹配的序列有3385条。根据不同种间序列的同源性，共发现97,831条(87.87%)序列gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba，3463（3.11％）序列有秘密命中gydF4y2Ba中投arietinumgydF4y2Ba,紧随其后的是gydF4y2Bam .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba（1662,1.49％），gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba(1011 0.91%),gydF4y2Ba辣椒gydF4y2Ba(528 0.47%),gydF4y2BaFusarium oxysporumgydF4y2Ba(388 0.35%),gydF4y2Ba甘氨酸大豆gydF4y2Ba(369 0.33%),gydF4y2Ba菜豆gydF4y2Ba（349,0.31％），gydF4y2Bavitis ViniferagydF4y2Ba（266,0.24％），和gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba（181,0.16％）。仅5283（4.75％）注释序列与其他植物物种的序列相似（附加档案gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：图S2）。gydF4y2Ba

为了评估基因在低温胁迫下的表达水平，我们将所有的干净数据映射回组装好的转录组，并通过RNA-seq期望最大化(RSEM)软件从映射结果中获得每个基因的读计数(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S5)。然后将每个基因的映射读计数转换为每百万映射读的转录本每千碱基的预期片段数(FPKM)(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S6）。FPKM值可以消除转录本长度和序列差异对计算表达的影响。FPKM值的箱线图表明基因表达水平在不同的实验环境中分布不均匀（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa） 皮尔逊相关系数随后用于评估每个生物样本的相关性，rgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba值接近1，表明两个重复样本之间有很强的相关性(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).排除异常样本后，对所有序列进行进一步的DEG分析。gydF4y2Ba

低温应力对DEGs响应的分析gydF4y2Ba

通过比较基因在低温胁迫下的表达水平，共鉴定出11369个在任意一对温度点之间表达上调或下调(fold change≥2 and false discovery rate (FDR) < 0.01)的DEGsgydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S7)。通过对低温胁迫下各基因的聚类分析，确定低温胁迫下各基因的聚类模式。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).将所有表达水平相同或相似的deg聚类，确定一组基因在低温胁迫(4℃)早期快速表达，其他基因在冷冻(−10℃)下表达。通过K-means共表达聚类分析，将鉴定出的11,369个DEGs分为6个亚群(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。The expression level of genes in subcluster 1 (1271 genes) began to increase after the temperatures decreased to − 5 °C and reached a maximum at − 10 °C; the expression levels then decreased rapidly. KEGG analysis of the genes in subcluster 1 revealed that most were involved in starch and sucrose metabolism, plant-pathogen interactions, and galactose metabolism. The expression of genes in subcluster 2 (2226 genes) increased significantly after low-temperature treatment, after which the level first decreased slowly and then rapidly at each temperature point below 4 °C. Genes in this subcluster functioned mostly in the circadian rhythm, plant-pathogen interactions, and plant hormone signal transduction. The expression of the genes in both subcluster 3 (1460 genes) and subcluster 4 (2695 genes) was upregulated after low-temperature treatment and downregulated after 4 °C treatment. The difference was that the decrease in the expression of genes in subcluster 3 fluctuated, while that in subcluster 4 was continuous. Genes involved in starch and sucrose metabolism, protein processing in endoplasmic reticulum, fatty acid degradation, and tyrosine metabolism were enriched in subcluster 3, and genes in subcluster 4 were enriched in plant-pathogen interactions, starch and sucrose metabolism and plant hormone signal transduction. The expression of genes in subcluster 5 (1613 genes) was weakly downregulated after low-temperature treatment, strongly upregulated from 4 °C to 0 °C, and then upregulated again under − 15 °C treatment. The genes in this subcluster functioned mostly in plant-pathogen interactions, phenylalanine metabolism, and the plant hormone signal transduction pathway. The expression of genes in subcluster 6 (2104 genes) was downregulated at all times, and most of these genes functioned in phenylpropanoid biosynthesis, circadian rhythm, and ubiquitin-mediated proteolysis.

假定转录因子的识别gydF4y2Ba

转录因子在细胞功能和发育中发挥重要作用，通过与自身及其他蛋白的相互作用直接调控基因表达，参与植物逆境调控，包括低温相关过程。在本研究中，1538个TF基因在不同温度点之间的差异表达，根据PlantTFDB (gydF4y2Bahttp://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/gydF4y2Ba)(额外的文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba:表S8)。TF家族中最丰富的是WRKY(186个基因)家族，其次是ERF(165个基因)、MYB(143个基因)、bHLH(131个基因)和NAC(111个基因)家族。对TF基因表达的聚类分析表明，在低温下，部分TF基因的表达广泛上调gydF4y2Ba11gydF4y2Ba例如:bZIP、AP2/ERF、MYB、C2H2、WRKY和tf。gydF4y2Ba

低温处理样品与对照样品共表达基因比较gydF4y2Ba

在低温胁迫下，每个温度点与对照环境进行比较，共识别出8683 DEGs。有趣的是，上调的deg(5876个基因)远远多于下调的deg(2807个基因)，134个基因在所有5个温度点上差异共表达(附加文件)gydF4y2Ba12gydF4y2Ba：表S9）。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba第一，在所有五项比较中，有101个基因上调，33个基因下调。这134个共表达基因被划分为生物过程、细胞成分和分子功能GO类别(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab）。在生物处理的类别，“代谢过程”，“细胞过程”，“单生物体过程”和“生物调节”是最富集的条款。在蜂窝部件类别，“细胞”，“细胞成分”和“细胞器”是最富集的，并且在分子功能类别，“结合”是最富集的术语，其次是“催化活性”。134个共表达的基因的COG功能分类显示，大多数的基因是在“仅一般功能预测”富集的“转录”，“复制，重组和修复”，“信号转导机制”和“碳水化合物转运和代谢”（图．gydF4y2Ba4gydF4y2Bac). KEGG富集显示，多数共表达基因富集于“昼夜节律-植物”、“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”、“精氨酸和脯氨酸代谢”、“苯丙氨酸生物合成”、“半乳糖代谢”、“植物-病原体相互作用”和“氨基酸生物合成”途径(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

低温胁迫下DEGs的加权基因共表达网络分析（WGCNA）gydF4y2Ba

进行WGCNA以更好地理解这些复杂信令网络中的哪个基因是最连接的集线器。根据其表达水平对模块中的基因数量进行聚类，并且将这些具有高聚类度的基因分配给相同的型号。通过比较低温处理的样品和对照样品来鉴定的8683℃是基于拓扑重叠聚集的，然后从动态树切割获得基因模块。最后，在合并表达模式相似的模块之后鉴定了12个基因模块（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).品红色模块包含的基因最多(1092个)，紫色模块包含的基因最少(70个)(附加文件gydF4y2Ba13gydF4y2Ba：表S10）。灰色模块不是一个真正的模块，而是一个对剩余基因进行分类的地方，这些基因与任何一个显著的有色模块都没有很好的相关性。计算了每个基因到每个模块的基于模块特征基因的连接性（kME）值，发现449个基因在多个模块中起到枢纽作用。gydF4y2Ba

所有12个遗传模块，模块特征值gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05用于识别与样品和生理指标高度相关的模块(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).对照样品与MEblue模块高度相关。4℃处理下的样品与MEmagenta模块高度相关，0℃处理下的样品与MElightcyan模块高度相关。−5℃处理下的样品与melightyyellow模块高度相关，−10℃处理下的样品与MEbrown模块高度相关，−15℃处理下的样品与MEgray60模块高度相关。研究发现MEbrown模块与生理指标显著相关，可能在植物的低温耐受性中起关键作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba．该COG分类结果表明，MEbrown模块基因涉及23个主要类别，包括“只是一般功能预测”，“信号转导机制”，“转录”和“复制，重组和修复”（附加文件gydF4y2Ba14gydF4y2Ba：图S4A）。的GO分析结果表明，MEbrown模块基因涉及主要在13个生物过程，包括“蛋白磷酸化”，“转录调控，DNA为模板的”和“氧化 - 还原处理”。这些基因被分发到八个细胞组分的术语，包括“膜的整体组成部分”，“胞间连丝”，“叶绿体基质”和“核”，并用14个分子功能，其中包括ATP结合，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性相关和阳离子结合（附加文件gydF4y2Ba14gydF4y2Ba:图S4B)。KEGG富集分析显示，MEbrown模块中的大部分基因在“淀粉和蔗糖代谢”、“植物-病原菌互作”、“昼夜节律-植物”、“内质网蛋白加工”、“半乳糖代谢”和“植物激素信号转导”等方面富集(补充文件)gydF4y2Ba14gydF4y2Ba：图S4C）。gydF4y2Ba

通过qRT-PCR分析确认RNA-seq测序数据gydF4y2Ba

被选择用于qRT-PCR的测定法与低温胁迫相关联的DEGS确认SMRT测序数据。二十基因从所有五个温度点共表达134度的视角随机选择的。我们发现，通过测序数据计算的倍数变化表达不完全一致通过定量RT-PCR分析检测出其表达的价值观，但表达谱的所有20个基因基本一致（附加文件gydF4y2Ba15gydF4y2Ba：图S5）。这些分析证实了从SMRT测序数据产生的基因表达值的可靠性。gydF4y2Ba

结合NGS和SMRT测序的方法已经越来越受到研究工厂对不利环境条件的影响，以在转录组水平提供高质量和越来越完整的组件[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．SMRT测序可以生成全长或长序列，高错误率可以通过短而高精度的NGS读取来克服[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．在本研究中，我们结合SMRT和RNA-seq方法来分析根的转录组组装gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba研究了植物在低温胁迫下的主要功能和调控基因。我们最终获得了115153个非冗余序列，平均ROI足够长，能够代表全长转录本(TablegydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.我们还预计共有8849个AS事件，73149个SSR和4189个lncRNAs。gydF4y2Ba

生理指标变化gydF4y2Ba

我们的研究结果表明内的生理变化的复杂性gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba植物对低温胁迫的反应。在低温胁迫下，根的细胞膜、抗氧化剂和渗透物质的变化相对更广泛。在低温处理的小麦和野生番茄中，MDA、脯氨酸和可溶性糖的含量增加，电解质渗漏也有所增加[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．在低温治疗,gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba积累了较高的蔗糖和脯氨酸，并表现出较高的蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖合酶活性[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．本研究发现，在低温处理的根系中，丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量增加，电解质渗漏增加gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba说明渗透剂在植物低温脱水过程中可能起到保护细胞膜、增强膜稳定性和平衡渗透压的作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba；此外，电解质泄漏可以作为直接的应力标记来反映低温应力对细胞膜的损伤(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)低温胁迫可诱导细胞凋亡因子的活性，已证实低温胁迫对细胞的损伤作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温与细胞内的蛋白质有关[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．酶促抗氧化系统是一种保护机制，用于消除或减少ROS，提高植物耐受低温胁迫的能力[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．因此，CAT、POD和GSH的变化可能在低温诱导的活性氧解毒中起关键作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba根。gydF4y2Ba

根系中的基因表达gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba对低温胁迫的反应gydF4y2Ba

在本研究中，共鉴定出11369个DEGs在所有温度点都对低温胁迫有响应，其中68.8%的DEGs在低温胁迫下诱导表达，31.2%的DEGs在低温胁迫下受到抑制表达。所有的deg被分成6个子簇(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab），之后进行Kegg途径富集分析。在有机体系统类别中，最富集的途径是“植物 - 病原体相互作用”，表明根系中的植物免疫应答gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温胁迫下的植物[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]在环境信息处理中，大多数DEG参与植物激素信号转导途径。我们的研究结果表明，植物激素在植物对外部和内部线索的反应中起着关键作用，从而调节生长和发育[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．在遗传信息加工范畴中，最丰富的途径是“内质网蛋白加工”。低温胁迫下，适应冷的紫花苜蓿膜蛋白合成速率和膜蛋白数量增加[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．我们的数据显示，通过伴侣相互作用和内质网中多聚体蛋白的形成，促进和监测适当的折叠。在代谢范畴中，大多数DEGs参与了“碳代谢”，其次是“糖酵解/糖异生”和“淀粉和蔗糖代谢”，表明碳和能量供应对植物的适应非常重要gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温。在细胞过程类别中，大多数在内吞作用中起作用。内吞作用根据不良环境条件调节膜蛋白，脂质和细胞外分子的进入细胞，并在缓解ROS中发挥关键作用[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

低温胁迫下转录因子的编码基因gydF4y2Ba

转录因子在细胞功能和发育中发挥重要作用，通过与自身和蛋白质的相互作用直接调控基因表达，参与植物逆境调控过程，包括低温相关过程。许多使植物具有低温耐受性的TFs，包括bHLH、bZIP、MYB、C2H2、ERF、NAC和WRKY类型，已经通过转录组方法确定[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]．在本研究中，1538个TF基因在不同温度点之间的差异表达，被分为45个TF基因家族。TF家族中最丰富的是WRKY家族，其次是ERF、MYB、bHLH和NAC家族，与这些TF家族相关的基因表达的动态变化可能揭示了它们的重要功能gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温宽容。我们的研究结果与之前关于转录因子参与植物对低温胁迫反应的报道一致[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]和建议WRKY家族，成员中发挥关键作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温宽容。gydF4y2Ba

基因的鉴定负责响应于低温gydF4y2Ba

植物已经发展了许多机制和途径，使它们能够最大限度地减少低温的负面影响。对胁迫响应基因的全面分析有助于了解植物对低温胁迫的响应。本文通过每个温度点与对照环境比较，共鉴定出8683个deg，其中有134个基因在5个温度点共表达差异，其中101个表达上调，33个表达下调(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.然而，只有7个基因通过富集分析成功地注释，并且在所有三个类别中富集了两个基因（PB40804和PB75011）。在低温胁迫下，将两种基因的表达上调。PB40804的产品用作苯丙氨酸氨酶，其作为直接控制钙霉素和钙霉素-7-O-Beta-D-葡糖苷的积累的智能开关gydF4y2Ba黄芪gydF4y2Ba低温处理期间的植物[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba]PB75011蛋白是一种脱羧酶，参与细胞壁/膜/包膜的生物发生。鸟氨酸脱羧酶和精氨酸脱羧酶控制植物中多胺的合成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba对低温胁迫强调精氨酸脱羧酶基因表达的转录调控[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．在COG注释的基础上，我们确定了18个富集的基因，其中包括上调其表达的15个，其中表达下调其表达。根据COG分析，PB40804也被称为“氨基酸输送和代谢”。氨基酸转运蛋白的丰度与植物生长和发育的多种基本作用相关，低温应激可以降低氨基酸浓度并改变其组合物[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．“昼夜节律 - 植物”是根据KEGG结果最丰富的途径，我们发现PB110405，在生物过程类别中最GO术语相关的基因，这一途径富集。PB110405用在生物过程类别9个GO术语注释，包括“转录调控，DNA为模板的”，“昼夜节律钟的温度补偿”，“响应于过氧化氢”，“淀粉代谢过程”和“响应于冷”。用“昼夜节律植物”途径的关联表明的内部温度gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba基本上受低温的影响。PB108808的表达，一种UB相关的LHY TF基因的推定正轨gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba是一种由低温诱导的基因，表明昼夜节律和人体对低温的反应之间存在相互作用gydF4y2Bam . falcata。gydF4y2Ba下一个途径是“精氨酸和脯氨酸代谢”;精氨酸和脯氨酸代谢是氨基酸生物合成的中心途径之一[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．脯氨酸积累是缓解植物非生物胁迫的一种众所周知的手段[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]结合低温胁迫下脯氨酸含量的变化，我们的结果表明，渗透调节物质、保护蛋白分子gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba，在对低温应激的响应中起重要作用，并且芳族化合物的组成可能在低温胁迫下变化。gydF4y2Ba

对应于低温胁迫遗传模块的识别gydF4y2Ba

WGCNA是一种系统的生物学方法，可以应用于具有多种来源的生物过程研究[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．它已被证明，WGCNA可以是一个高效的数据挖掘方法，具体地用于筛选相关性状的基因和用于进行模块化分类，以确定具有高生物学意义的共表达模块[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba]．本文通过对比低温处理样本和对照样本，鉴定出8683个DEGs，并将表达模式相似的模块合并到一起后，将其聚类成12个基因模块(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.发现Mebrown模块与低温应力显着相关gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba．迈尔德模块的富集分析显示，在该模块中可以获得具有生物学意义的调节途径。例如，富含GO注释术语“冷响应途径”，“对应力”和“细胞内信号转导”进行了富集。COG分类揭示了兆纽模块富集在许多与一般功能预测相关的DEG中，并且信号转导机制，并且KEGG途径富集分析显示淀粉和蔗糖代谢中涉及许多参数。我们还发现电解质泄漏与更多的遗传模块相关，而不是其他生理指标，其从生理测定中证实了电解质泄漏的结果可以用作来自低温胁迫的细胞膜损伤的直接应力标记。gydF4y2Ba

总之，通过结合SMRT和NGS技术，我们探索了低温处理的根的转录组变化gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba植物。共获得115153个非冗余序列，预测AS事件8849个，SSRs 73,149个，lncrna 4189个。从SMRT测序中共注释了111587个基因，鉴定出11369个参与植物激素信号转导、内质网蛋白加工、碳代谢、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、内吞作用等途径的DEGs。我们将1538个TF基因分为45个TF基因家族，其中最丰富的TF家族是WRKY家族，其次是ERF、MYB、bHLH和NAC家族。共有134个基因在所有5个温度点上差异共表达，其中101个基因表达上调，33个基因表达下调。发现PB40804、PB75011、PB110405和PB108808在耐受性中起关键作用gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba低温。WGCNA结果表明，Mebrown模块与低温应力显着相关gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba．此外，电解质泄漏与大多数遗传模块相关，证实了电解质泄漏可作为生理试验中低温胁迫对细胞膜损伤的直接胁迫标志物。这些发现提供了一个完整的基因转录特征，并有助于理解耐低温的机制gydF4y2Bam . falcata。gydF4y2Ba

植物栽培和低温处理gydF4y2Ba

的种子gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Bal .简历。呼伦贝尔是经中国内蒙古呼伦贝尔草原站许可，在呼伦贝尔草原上采集的。中国内蒙古呼伦贝尔草原站对样品进行了正式鉴定，并提供了标本保存的细节。是国家草品种审定委员会批准的栽培品种(Accession number: 269)。种子的采集需要得到中国内蒙古呼伦贝尔草原站的许可。实验研究gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba符合中国和国际规范。的种子gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba用5%次氯酸钠溶液消毒5 min，然后用蒸馏水洗涤。然后种子在25°C的黑暗环境下在培养皿中湿滤纸上发芽。将5日龄幼苗移栽于温室内平均温度为25℃、20℃、日间相对湿度为55℃、夜间相对湿度为70%的蛭石:珍珠岩:泥炭(1:1:1)混合填充的塑料盆中。所有幼苗都用1/2强度的霍格兰浇水[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]每两天用一次。移栽90天后，将均匀的幼苗移入生长室进行低温处理。处理温度分别为4℃、0℃、−5℃、−10℃和−15℃;以正常环境温度作为对照。对于低于0°C的温度(冻害)，gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba幼苗驯化2周 4天 °C，然后暴露在低温应力下。冷应力诱导计划涉及减少1 每1°C h从4开始 °C，在每个研究温度下进行低温应力处理2小时 h[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]．采收根系后，立即用液氮冷冻，并在−80°C下保存以供实验室分析。gydF4y2Ba

低温处理的生理分析gydF4y2Bam . falcatagydF4y2Ba根gydF4y2Ba

通过电解质渗漏评估根细胞膜损伤[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba]．根据改性的硫酰碱酸（TBA）方法测量MDA含量[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]用硝基蓝四氮唑（NBT）法测定SOD活性[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba]．CAT的活性根据Maehly与机遇[的方法测量gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba[根据Zaharieva等人的方法测量豆荚的活性。[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba]．O.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^．-确定内容物如elstner描述的[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba]，可溶性蛋白含量按Bradford法测定[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba]，还原谷胱甘肽的含量经荧光测定估算[gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]，用茚三酮法测定脯氨酸含量[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba]，可溶性糖含量按Dreywood方法测定[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

上述所有试验重复4次，有4个生物学重复。数据显示为平均值±SDs，采用方差分析确定显著差异。在显著性水平(α = 0.05)下，通过邓肯检验确定均数的最低显著差异(lsd)。gydF4y2Ba

RNA分离、文库制备及测序gydF4y2Ba

根据制造商的协议，通过TRIzol试剂（美国Invitrogen）分离每个样品的总RNA，并通过DNase I（日本TaKaRa）消化去除基因组DNA。然后使用Nanodrop ND-1000分光光度计（美国Nanodrop）测量纯度、浓度和核酸吸收峰使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦，美国）测量RNA完整性，并通过电泳检测基因组DNA污染。gydF4y2Ba

制备库后的样品通过了质量检验。For Illumina cDNA library preparation, 20 μg of total RNA from each pool was enriched with oligo (dT) magnetic beads and randomly interrupted by the addition of fragmentation buffer. First-strand cDNA was then synthesized with random hexamers, with mRNA used as a template. Second-strand cDNA was synthesized after the addition of buffer, dNTPs, RNase H and DNA polymerase I. The cDNA was subsequently purified with AMPure XP beads. The purified double-stranded cDNA was subjected to end repair, the addition of a poly-A tail and ligation with sequencing linkers, and the fragment size was selected via AMPure XP beads. Finally, the cDNA library was prepared by PCR-based enrichment.

关于PacBio Iso-Seq文库的制备，使用SMARTer™PCR cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)合成cDNA。利用BluePippin生成不同大小的cDNA文库。将筛选出的cDNA经PCR扩增，修复末端，连接到SMRT哑铃型连接器上，并进行核酸外切酶切。最后，通过BluePippin的二次筛选完成了文库的准备。共8个SMRT细胞用于3个大小范围的文库:1 - 2kb、2 - 3kb和3 - 6kb。gydF4y2Ba

通过Qubit 2.0对文库进行准确定量，并通过安捷伦2100仪器确定文库大小后，通过PacBio RS II(8个SMRT细胞)和Illumina HiSeq 2500生物标志物研究所(Biomarker Institute, Biomarker, China)对文库进行测序。将1 - 2kb、2 - 3kb和3 - 6kb的文库分别与3,3,2个SMRT细胞进行测序。gydF4y2Ba

质量过滤和转录组组装gydF4y2Ba

Raw reads通过豆腐流水线处理成错误校正的roi，全通> = 0，序列精度大于0.75 (gydF4y2Bahttps://github.com/PacificBiosciences/cDNA_primer/wiki/Understanding-PacBio-transcriptome-data#readexplainedgydF4y2Ba）.通过去除包含连接器和低质量读数的读取获得的高质量清洁数据（包括N个去除率大于10％的那些，并且读取质量值Q≤10的基部数量超过50％阅读）。然后通过在ROI中寻找多尾信号和5'和3'cDNA引物来确定FLNC转录物。用于纠错（ICE）的迭代聚类用于获得共有同种型，使用SMRT分析（2.3.0版）抛光冰的全长共识序列。为进一步分析产生了大于99％的校正精度的全长转录物。通过CD-HIT（Identity> 0.99）从ISO-SEQ™高质量全长转录物中删除冗余读数。得到的转录序列直接用于随后的事件，SSR和LNCRNA分析。第二代数据用于量化和差异地分析新CD。gydF4y2Ba

识别作为事件，SSR，LNCRNA和CDSSgydF4y2Ba

国际标准化组织™ 数据用于执行all vs all BLAST，满足所有标准的BLAST路线被视为候选as事件的产物。as差距大于100 英国石油公司和至少100名 3′/5′端以外的bp，用MISA鉴定转录组内的ssr(gydF4y2Bahttp://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/gydF4y2Ba）.选取长度大于200 nt、两个以上外显子的转录本作为lncRNA候选基因，通过具有区分蛋白编码基因和非编码基因能力的CPC/CNCI/CPAT/Pfam进行进一步筛选。TransDecoder (gydF4y2Bahttps://github.com/transdecoder/transdecoder/releases.gydF4y2Ba)用于鉴定转录序列内的CDS区域。gydF4y2Ba

基因功能注释gydF4y2Ba

为了获得最全面的注释信息，将SMRT测序中发现的所有全长转录本通过BLAST软件(version 2.2.26)与NCBI Nr、SwissProt、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库进行比对[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba]．GO富集分析采用GOseq R包，基于Wallenius非中心超几何分布[gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba].KOBAS软件随后用于测试KEGG路径中DEGs的统计富集[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

基因表达水平的量化gydF4y2Ba

通过RSEM对每个样本的基因表达水平进行鉴定[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]．干净的数据被映射回组装好的转录组，并从映射结果中获得每个基因的读计数。使用Bowtie2软件将Illumina测序的clean数据与SMRT测序数据进行比较。考虑到测序深度和基因长度对片段的影响，通过FPKM值估计基因表达水平的量化。gydF4y2Ba

DEGs的识别gydF4y2Ba

通过DESeq R软件包（版本1.10.1）进行差异表达分析，以确定低温处理样品和在不同温度点采集的对照样品之间的DEG[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]．DESEQ通过基于负二项式分布的模型进行统计分析来确定数字基因表达数据中的差异表达。为了检测到DEG，使用折叠变化≥2和FDR <0.01作为筛选标准。折叠变化表示两个样本（组）之间的表达比率。通过纠正FDR来获得gydF4y2BapgydF4y2Ba不同意义的价值。因为转录组测序表达分析的差异是大量独立统计假设试验的转录表达值，所以假阳性是一个问题;因此，在分析DEGS的过程中，公认的Benjamini-Hochberg校正方法的假设检测与原始重大gydF4y2BapgydF4y2Ba校正，并且随后的值，则FDR被用作筛选DEGS关键指标。gydF4y2Ba

假定转录因子的识别gydF4y2Ba

爆炸用于搜索所有对抗植物TF数据库的参数（工厂TFDB版本4.0，gydF4y2Bahttp://planttfdb.cbi.pku.edu.cngydF4y2Ba)来识别假定的TFs。根据对比结果对TF信息进行标注。gydF4y2Ba

与WGCNA的共表达网络分析gydF4y2Ba

CoExpression Networks通过来自所有DEG的r中的WGCNA包构建[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]．模块由自动网络构建功能块获得，模块采用默认设置。计算每个模块的特征基因值，并用于测试与各生理指标的相关性。整体连接和模块内连接(功能软连接)、kME(用于模块成员)和kMEgydF4y2BapgydF4y2Ba为deg计算值。gydF4y2Ba

QRT-PCR验证RNA-SEQ数据gydF4y2Ba

将上述分离的RNA样本作为模板，用HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR (gDNA eraser)试剂盒(Vazyme, China)进行反转录。本研究使用的引物采用Primer 5和RefSeq设计，列于附加文件中gydF4y2Ba16gydF4y2Ba：表S11。表达gydF4y2Babeta-actingydF4y2Ba基因作为内部控制。根据制造商的协议，使用ChamQ™Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，中国)在LightCycler 480 II58设备(罗氏，瑞士)上进行qRT-PCR。根据2gydF4y2Ba^{-ΔΔctgydF4y2Ba}方法(gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

所有相关的补充数据在本手稿中作为附加文件提供。本研究生成的PacBio SMRT reads和Illumina NGS reads分别提交到NCBI Sequence Read Archive，登录号分别为BioProject PRJNA 549099和520970。地址如下:gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为:gydF4y2Ba

可变剪接gydF4y2Ba

猫：gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

CD：gydF4y2Ba

编码DNA序列gydF4y2Ba

CNCI:gydF4y2Ba

编码-非编码索引gydF4y2Ba

齿轮:gydF4y2Ba

局部群体的簇gydF4y2Ba

冷1：gydF4y2Ba

Chilling-tolerance散度1gydF4y2Ba

林后:gydF4y2Ba

冷响应gydF4y2Ba

注册会计师：gydF4y2Ba

编码潜能评估工具gydF4y2Ba

CPC：gydF4y2Ba

编码潜在计算器gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

FDR：gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

FLNC:gydF4y2Ba

全身nonchimeric读gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每百万碱基对的转录序列每千碱基测序gydF4y2Ba

走：gydF4y2Ba

基因本体gydF4y2Ba

谷胱甘肽:gydF4y2Ba

还原型谷胱甘肽gydF4y2Ba

ICE1:gydF4y2Ba

CBF表达1的诱导剂1gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书gydF4y2Ba

角：gydF4y2Ba

真核直接同源组gydF4y2Ba

李:gydF4y2Ba

胚胎发生晚期丰富的蛋白质gydF4y2Ba

lncRNA:gydF4y2Ba

长非编码RNAgydF4y2Ba

LSD：gydF4y2Ba

最小显著性差异gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

门店:gydF4y2Ba

新一代测序gydF4y2Ba

NR：gydF4y2Ba

NCBI nonredundant蛋白质gydF4y2Ba

OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^．-：gydF4y2Ba

超氧化物阴离子自由基gydF4y2Ba

PFAM：gydF4y2Ba

蛋白家族gydF4y2Ba

荚：gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

定量RT-PCR：gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链式反应gydF4y2Ba

RNA-SEQ：gydF4y2Ba

RNA测序gydF4y2Ba

投资回报:gydF4y2Ba

读取插入物gydF4y2Ba

活性氧：gydF4y2Ba

活性氧物种gydF4y2Ba

RSEM:gydF4y2Ba

期望最大化RNA测序gydF4y2Ba

SMRT：gydF4y2Ba

单分子实时gydF4y2Ba

草皮：gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

SPS：gydF4y2Ba

蔗糖磷酸合成酶gydF4y2Ba

苏维埃社会主义共和国:gydF4y2Ba

简单序列重复gydF4y2Ba

TF：gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

WGCNA:gydF4y2Ba

加权基因共表达网络分析gydF4y2Ba

我们感谢生物标志物公司（中国北京）进行SMRT测序和RNA-seq以及原始数据分析。gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2016YFC0500607);国家自然科学基金项目(no . 31502007);东北农业大学青年人才工程项目(no . 16QC23);黑龙江省自然科学基金项目(QC2015019)。每个资助机构都是根据一项研究提案批准这些资金的。这些机构对实验设计，数据分析和解释，或手稿的写作没有影响。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Guowen Cui和Hua Chai在这项工作中同样贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 东北农业大学动物科技学院草地科学系，哈尔滨150030gydF4y2Ba

   国文崔华柴，杭阴，阳梅，李国富胡＆潘璋gydF4y2Ba

2. 黑龙江农业科学院畜牧业与兽医分公司，齐齐哈尔，161005gydF4y2Ba

   华柴gydF4y2Ba

3. Hulunbuir Grassland Station，Hulunbuir，021008gydF4y2Ba

   郭明英，易鲁格勒图gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

GC、HC和PZ设计了本研究。PZ和HC撰写了这篇论文，其中包括所有合著者的贡献和讨论。HC、HY、MY、GH、MG和RY进行了研究。所有作者都已阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba锅里张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba