野生与栽培大豆种子含油量及组成的数量性状位点分析

背景

大豆油是食用油的主要来源，野生大豆的驯化使其油脂含量和成分发生了显著变化。人们已经做了大量的工作来确定与大豆油性状有关的遗传位点。本研究的目的是鉴定与大豆籽油有关的数量性状位点，并比较野生大豆和栽培大豆的脂肪酸组成。

结果

利用特异位点扩增片段测序(slf -seq)方法，从野生大豆ZYD00463 (甘氨酸大豆)和栽培大豆WDD01514 (大豆)进行基因分型。最后，构建了包含20个连锁群(LGs) 11,398个单核苷酸多态性(SNP)标记的高密度遗传连锁图谱。采用基于模型的复合区间映射(CIM)方法，在多个环境中鉴定出24个稳定的种子含油量和成分qtl。在这些qtl中，23个与先前报道的qtl重叠或相邻。一个QTL,qPA10_1(5.94-9.98 Mb)。10是棕榈酸的新位点。在稳定的qtl区间，检测到一些与脂质代谢相关的有趣基因。

结论

从野生大豆ZYD00463与栽培大豆WDD01514杂交中分离到181个ril，并利用SLAF-seq方法构建了该基因的高密度遗传图谱。共鉴定出24个稳定的种子油含量和成分qtl，其中包括qPA10_1在Chr. 10上，一个新的棕榈酸位点。在QTL区域还检测到一些有趣的基因。我们的研究将为科学家们了解野生大豆和栽培大豆脂质代谢的遗传变异提供有用的信息。

大豆(大豆(L. Merr.)是最重要的蛋白质和油料作物之一[1]，其产量占2018年世界油籽产量的近60% [2]。大豆油主要由五种脂肪酸组成，分别是棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)，它们的平均含量分别约为10%、4%、18%、55%和13% [3.，4]。豆油的质量取决于脂肪酸的组成，它影响豆油的营养价值、风味和稳定性。不饱和脂肪酸在免疫系统调节、血液凝固、神经传递、胆固醇代谢以及脑和视网膜膜磷脂结构中发挥重要作用[5]。然而，不饱和脂肪酸容易被氧化，导致油的味道变差，降低油的保质期[6，7]。因此，目前培育的大豆含有较多的单不饱和脂肪酸(油酸)和较少的多不饱和脂肪酸(亚油酸和亚麻酸)，这增加了氧化稳定性，对人体健康也更好[4，8]。

大豆油的含量和组成受多个数量性状位点(qtl)/基因控制，也受环境因素影响[j]。9，10]。迄今为止，与大豆种子油和脂肪酸相关的qtl已被广泛研究[11，12，13，14，15，16，17，18，19]。自从第一次研究试图发现大豆中的油脂qtl以来[10]，在SoyBase数据库的所有20条染色体(Chr.)中鉴定出超过322个油质qtl和228个脂肪酸qtl [20.]。在这些QTL中，有一些是稳定的，在不同的双亲本群体和环境中检测到，包括Chr上1.64 ~ 2.09 Mb和33.35 ~ 35.95 Mb的QTL区域。种子含油量为20 [14，21，22，23，24，25]， QTL区为44.58 ~ 48.58 Mb。14代表种子亚麻酸[11，13，24，26]。然而，由于与理想QTL等位基因的连锁不平衡不足以及性状的遗传复杂性，这些QTL的选择精度较低，尚未有效地应用于大豆种子油的标记辅助选择(MAS)中。27，28]。

随着大豆cv基因组测序的完成。威廉姆斯82 [29]和新一代测序技术的快速发展，单核苷酸多态性(SNP)标记已被用于构建高密度连锁图谱来鉴定QTL区间[25，30.]。Cao et al.(2017)基于包含2062个SNP标记的高密度遗传图谱，鉴定出一个QTL，qOil-5，对种子油进行了定位，定位到Chr. 05，物理距离为2.5 Mb [30.]。使用Illumina Infinium BeadChip测序平台，Patil等人(2018)在Chr. 02上报告了稳定的油含量qtl。qOil_02)，第08段(qOil_08)，第15章(qOil_15)及第20 (qOil_20)，使用3343个多态snp(3个K-SNP) [25]。特异性位点扩增片段测序(SLAF-seq)技术已被用于构建高密度遗传图谱，是大豆大规模从头发现SNP和基因分型的有效方法[31，32]。Li et al.(2017)使用3541个SLAF标记检测到5种脂肪酸的26个稳定qtl，平均距离为0.72 cM [31]。Zhang等人(2018)创建了包含8597个SNP位点的高密度遗传图谱，平均距离为0.57 cM，其中两个qtl，qOil10-1和qOil10-2，以计算含油量[32]。此外，通过SNP基因分型的全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)发现了一些与大豆油含量和组成相关的基因[30.，33，34，35，36，37，38]。这些基因为大豆种子油的改良提供了有用的信息。

在大豆中，与脂质生物合成相关的关键功能基因已被研究，其中包括脂肪酸去饱和酶基因FAD2-1A（Glyma.10 g278000)，FAD2-1B（Glyma.20 g111000)，FAD3A（Glyma.14 g194300)，FAD3B（Glyma.02 g227200)，FAD3C（Glyma.18 g062000)，FAD7（Glyma.18 g202600和Glyma.07 g151300) [39，40，41]、3-酮酰基acp合成酶II基因(内二世，Glyma.17 g047000和Glyma.13 g112700) [42，43]和二甘油酯酰基转移酶基因DGAT（Glyma.17 g053300) [44]。然而，过表达单个基因不能显著增加脂肪酸的生物合成通量[45]。脂质代谢似乎需要多个相关基因的调控。一些重要的转录因子也被发现通过直接结合脂质生物合成基因的启动子参与脂质积累的调节。例如，过度表达GmNFYA，GmDof4，GmDof11，GmbZIP123,和GmMYB73显著增加转基因植物种子脂质积累[46，47，48，49]。研究这些因素有助于加深对大豆脂质代谢机制的认识。

栽培大豆种子的含油量约为18-22%，而野生大豆种子的含油量约为8-10% [25]。为了鉴定控制大豆种子含油量和组成的基因，需要对栽培大豆和野生大豆的含油量进行QTL分析。本研究以野生大豆ZYD00463(2)的种间杂交获得的181个重组自交系(RILs)为材料，利用slf -seq技术构建了大规模SNP标记，构建了连锁群，并绘制了控制种子油脂和成分的qtl图谱。甘氨酸大豆)和栽培大豆WDD01514 (大豆）.本研究结果可以帮助科学家了解野生大豆和栽培大豆在驯化过程中籽油的遗传变异，并通过分子育种进一步提高籽油的数量和质量。

表型变异

2015 - 2016年在湖北武汉和河南许昌对亲本和子代的种子油含量和5种优势脂肪酸组成进行了测定。表格1结果表明，WDD01514的平均含油量为23.76%，约为ZYD00463(11.89%)的2倍。籽油成分方面，WDD01514的油酸含量(20.57%)高于ZYD00463，亚麻酸含量(7.60%)低于ZYD00463，分别为11.39%和16.60%。181个品种的含油量和组成差异较大，含油量为11.36 ~ 13.11%，油酸含量为17.07 ~ 22.68%，亚麻酸含量为11.05 ~ 14.41%。

使用Shapiro-Wilk (w)统计表明，油分、棕榈酸、硬脂酸(2015/X除外)、亚麻酸与P-values > 0.05。然而，油酸和亚油酸并非正态分布(P< 0.05)1;额外的文件1）.油酸向ZYD00463倾斜，而亚油酸向WDD01514倾斜1）.此外，在棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的后代中观察到海侵分离1;额外的文件1)，表明亲本之间发生了全面的等位基因重组。

广义遗传力(h²)在组合环境下，油脂和脂肪酸的变异范围为80.2% ~ 92.0%，这表明遗传变异占观察到的表型变异的主要比例(表2)1）.方差分析显示FG × E互作值在各性状(P< 0.001)。然而,F-值小于基因型(表2)2）.

在所有四种环境中，油含量与油酸之间呈正相关(P< 0.01)，而油分与棕榈酸、油分与亚麻酸、棕榈酸与油酸、油酸与亚油酸、油酸与亚麻酸、油酸与亚麻酸均呈负相关(P< 0.01)(附加文件2）.这表明控制这些性状的重要遗传因素是紧密相连的。

利用slf -seq构建SNP标记遗传图谱

采用SLAF-seq方法开发双亲之间的SNP标记。最终，分布在20个连锁组(LGs)上的11,398个SNP标记被用于构建遗传连锁图谱(附加文件)3.、附加文件4）.这些SNP标记覆盖大豆基因组2913.78 cM，标记之间的平均距离为0.26 cM。20个LGs的遗传距离为126.23 cM ~ 226.60 cM (Chr. 03)，平均标记间隔为0.15 ~ 0.60 cM。最大的LG (Chr 01)含有891个SNP标记，最小的LG (Chr 13)含有248个SNP标记(附加文件)5）.

油含量qtl

本研究共定位了22个与种子含油量有关的qtl(附加文件)6）.其中，在多个环境中鉴定出7个LOD > 3.6的稳定qtl(图2)。1;表格3.)，并被映射到第02页(qOC2_1)， 08 (qOC8_1和qOC8_2)， 15 (qOC15_1和qOC15_2)，及20 (qOC20_1和qOC20_2)(附加文件7）.QTL的qOC2_1在Chr. 02上平均解释了6.7%的含油量表型变异;qOC8_1和qOC8_2在Chr 08上，平均分别解释了8.9%和6.6%的表型变异;qOC15_1和qOC15_2Chr 15对表型变异的平均贡献率分别为12.9%和11.0%;和qOC20_1和qOC20_2对Chr. 20的平均解释率分别为12.2和19.3%。所有qtl均表现出负加性效应，表明来自野生大豆亲本ZYD00463的等位基因对含油量有负作用。与已报道的QTL区域相比，有6个QTL，包括qOC8_1，qOC8_2，qOC15_1，qOC15_2，qOC20_1,qOC20_2，与之前的qtl重叠(图2)。2;额外的文件8）.QTL的qOC2_1,该QTL位于Chr. 02上5.08-6.27 Mb区间内，与定位的QTL相邻，位于6.86-9.67 Mb区间内(图2)。2;额外的文件8）.

在这些稳定的QTL区域中鉴定出6个参与脂质代谢的酶基因(附加文件)9)，其中包括两个丙酮酸激酶基因(GmPK，Glyma.02 g071000和Glyma.02 g071100的基因区域内qOC2_13-酮酰基acp还原酶基因(GmFabG，Glyma.08 g102100内)qOC8_1，两个3-酮酰基辅酶a合成酶基因(GmKCS，Glyma.15 g042500,Glyma.15 g046300)， 3-羟基酰基acp脱氢酶基因(GmFabZ，Glyma.15 g052500内)qOC15-1．此外，还发现了两个可能参与脂质代谢的转录因子基因qOC8_2(附加文件10)，包括同源箱亮氨酸拉链基因(GmZIP，Glyma.08 g124400)和核因子Y亚基a基因(GmNF-YA，Glyma.08 g124200）.

油成分的qtl

共定位了66个与种子油成分相关的qtl(附加文件)6）.在这些qtl中，17个LOD > 3.6的稳定qtl在多个环境中被鉴定出来(图2)。1;表格3.）.这些qtl被定位到Chr. 05、10、11、13、14、15和167）.对于棕榈酸，有4个稳定的qtl，包括qPA10_1第10页，qPA13_1第13页，qPA15_1在第15章，和qPA16_1在Chr 16上，平均贡献率分别为12.9%、8.4、9.7和8.3%。所有棕榈酸的qtl，除了qPA15_1和qPA16_1,结果表明，野生大豆亲本ZYD00463等位基因对棕榈酸具有负加性效应。对于硬脂酸，Chr. 14上有3个稳定的qtl，分别为:qSA14_1，qSA14_2,qSA14_3，平均分别占表型方差的18.6%、16.0%和17.0%。3个qtl均表现负加性效应。对于油酸，有两个稳定的qtl，包括qOA11_1第11页和第11页qOA15_1在Chr. 15，分别解释了12.3%和19.1%的表型变异。这两个qtl的加性效应为负。对于亚油酸，有4个稳定的qtl，包括qLA5_1和qLA5_25月5日qLA11_1和qLA11_2在Chr 11上，被鉴定和解释的平均表型方差分别为9.9、9.6、10.4和10.0%。除了qLA11_1和qLA11_2，qLA5_1和qLA5_2呈负加性效应。对于亚麻酸，有4个稳定的qtl，分别为qLNA5_15月5日，qLNA14_1月14日，qLNA15_1在第15章，和qLNA15_2在Chr 15上，平均解释了12.5%、10.0%、12.9%和16.1%的表型变异。4个qtl的加性效应均为正，说明这些等位基因对野生大豆亲本ZYD00463的加性效应为正。在17个稳定的脂肪酸组成qtl中，qPA10_1(位于5.94-9.98 Mb范围内)与报道的qtl和数量性状核苷酸(QTNs)没有重叠或不在附近(图2)。2;附加文件8和11）.这表明这是一个新的棕榈酸位点。

我们鉴定出21个酶编码基因可能参与稳定QTL区域的脂质代谢(附加文件)9）.这些基因包括两个丙酮酸激酶基因(GmPK，Glyma.10 g065000和Glyma.13 g149800)、两个二酰基甘油酰基转移酶基因(GmDGAT，Glyma.13 g106100和Glyma.13 g118300)、三个磷脂酰甘油酰基转移酶基因(GmPDAT，Glyma.13 g108100，Glyma.16 g005800,Glyma.11 g190400)、两个3-酮酰基acp合酶I基因(GmFabB，Glyma.13 g128000和Glyma.05 g218600)， 3-酮酰基acp合成酶II基因(GmFabF，Glyma.13 g112700)，两个3-酮酰基辅酶a合成酶基因(GmKCS，Glyma.15 g042500和Glyma.15 g046300)， 3-羟基酰基acp脱氢酶基因(GmFabZ，Glyma.15 g052500)、两个酰基载体蛋白基因(GmACP，Glyma.16 g011300和Glyma.05 g201300)，丙二酰辅酶a:ACP丙二酰转移酶基因(GmFabD，Glyma.11 g164500)，一种omega-3脂肪酸去饱和酶3基因(GmFAD3，Glyma.11 g174100)，乙酰辅酶a羧化酶基因(GmACCase，Glyma.05 g221100)，一个酰基辅酶a合成酶基因(通用汽车金融服务公司(gmac)，Glyma.11 g194500)，丙酮酸脱氢酶基因(GmPDH，Glyma.14 g186900)和溶血磷脂酸酰基转移酶基因(GmLPAAT，Glyma.15 g034100）.此外，还鉴定了9个参与脂质代谢的转录因子基因(附加文件10)，包括一个螺旋环螺旋基因(GmHLH，Glyma.05 g200900)，一个WRKY蛋白基因(GmWRKY，Glyma.05 g203900)，一个C3H蛋白基因(GmC3H，Glyma.05 g224400)，两个同源箱亮氨酸拉链基因(GmZIP，Glyma.10 g071700和Glyma.11 g145800)，一个B3结构域蛋白基因(GmB3，Glyma.10 g076100)、两个MYB蛋白基因(GmMYB，Glyma.13 g109100和Glyma.16 g007200)，以及一个DBB蛋白基因(GmDBB，Glyma.15 g029500）.

不同性状的qtl在Chr上也存在共定位。11和15(附加文件7）.的经济价值qOA11_1和qLA11_1在Chr。11在11.0-25.6 Mb的物理间隔内。的经济价值qOC15_1，qPA15_1，qOA15_1,qLNA15_2在Chr。在2.80-5.63 Mb的物理间隔内有15个。

在本研究中，我们鉴定了24个稳定的种子油和成分qtl。通过将他们绘制的区域与先前报道的大豆参考基因组进行比较(图2)。2;附加文件8和11，我们发现了这一点qPA10_1与之前报道的qtl没有重叠或相邻。此外，它不含与GWAS获得的棕榈酸相关的qtn。由于构建了包含11,398个SNP标记的高密度遗传图谱，QTL区域的间隔与之前报道的相比显著缩短。例如，对于含油量，物理距离qOC8_1，qOC8_2，qOC15_2,qOC20_2分别为7.52-9.44 Mb、9.44-10.8 Mb、4.15-5.63 Mb和32.5-33.8 Mb。相比之下，为5.58 ~ 10.28 MbqOC8_1［16]， 5.58-10.3 MbqOC8_2［16]， 3.23-4.07 MbqOC15_2［17]， 27.0-34.3 MbqOC20_2［54]。对于硬脂酸，物理距离为qSA14_1和qSA14_3在我们的研究中分别为32.2-37.5 Mb和42.2-43.4 Mb。相比之下，间隔为16.3-45.9 Mb [56]。对于亚油酸，物理距离为qLA5_1和qLA5_2分别为37.5-39.9 Mb和38.5-40.7 Mb，而间隔为37.6-42.2 Mb [57]。

与之前报道的qtl (http://www.soybase.org)(附加文件8和11)， 24个qtl中有23个与先前报道的qtl接近或重叠(图2)。2）.例如，QTLqOC2_1Chr. 02的含油量约为5.08-6.27 Mb，与已报道的QTL (6.86-9.67 Mb) [50]。此外,qOC8_18月8日，qOC8_28月8日，qOC15_1在第15章，和qOC15_2在Chr 15上，分别位于7.52 ~ 9.44 Mb、9.44 ~ 10.8 Mb、2.80 ~ 5.63 Mb和4.15 ~ 5.63 Mb，与报道的5.52 ~ 12.64 Mb [16，51，52]， 5.52-14.21 Mb [51，52，53]， 3.23-4.07 Mb [17]，及4.52-5.21 Mb [25),分别。对于棕榈酸，qPA13_1(21.8-26.8 Mb)qPA16_1(0.42-1.19 Mb)分别接近于报道的26.41-29.08 Mb和2.67-5.06 Mb [55，56]。对于硬脂酸，qSA14_1，qSA14_2,qSA14_3分别位于32.2 ~ 37.5 Mb、16.3 ~ 40.5 Mb和42.2 ~ 43.4 Mb，与16.30 ~ 45.90 Mb [56]。对于亚麻酸，qLNA5_1(33.8-35.4 Mb)与31.98-34.65 Mb [18]。虽然这些qtl位于相似的区域，但它们的负责基因是否相同还需要进一步的研究。相比之下,qPA10_1在Chr. 10上定位到5.94 ~ 9.98 Mb的区域，远高于已有报道的0.98 ~ 1.87 Mb [24(图。2;额外的文件8)，并没有发现任何经GWAS与棕榈酸有关的qtn [58[附加文件11）.结果表明，该QTL是棕榈酸的新位点。

利用SoyBase数据库的基因注释工具对24个稳定QTL区间的所有基因进行注释[20.]，鉴定出12个参与脂质代谢的重要酶编码基因(另附文件9）.例如,GmACCase（Glyma.05 g221100)编码一种乙酰辅酶a羧化酶，该酶催化乙酰辅酶a生成丙二酰辅酶a，作为脂肪酸从头开始生物合成的直接底物[59]。GmFabD（Glyma.11 g164500)编码一个丙二酰辅酶a:ACP丙二酰转移酶，负责将丙二酰辅酶a的丙二酰基转移到酰基载体蛋白(ACP)。GmACP（Glyma.05 g201300和Glyma.16 g011300)编码了一种酰基载体蛋白，该蛋白在脂肪酸合酶的酶域之间运输不断生长的脂肪酸链[60]。GmFabB（Glyma.05 g218600和Glyma.13 g128000),GmFabF（Glyma.13 g112700)分别编码一个酮酰- acp合成酶I和II，这两个合成酶分别主要用于生产棕榈酰- acp和硬脂酰- acp作为脂肪酸链延伸的凝聚酶。GmFabG（Glyma.08 g102100),GmFabZ（Glyma.15 g052500)编码3-酮酰基- acp还原酶和3-羟基酰基- acp脱氢酶，分别催化3-酮酰基- acp还原和脱水反应[61]。此外,GmFAD3（Glyma.11 g174100)编码了一种omega-3脂肪酸去饱和酶3，该酶催化第三个双键生成亚油酸，从而产生亚麻酸[40，62]。GmDGAT（Glyma.13 g106100和Glyma.13 g118300)编码二酰基甘油酰基转移酶，催化脂肪酸和甘油3-磷酸形成标签[63，64]。这些基因在稳定QTL中的存在表明它们可能参与大豆种子脂质代谢。然而，这些酶编码的基因是否负责相应的qtl需要用转基因方法确认。除了参与脂质代谢的关键酶基因外，一些转录因子基因在调节脂肪酸生物合成中也起着重要作用。我们在24个稳定的QTL区间内鉴定出11个参与脂质代谢的转录因子基因(附加文件)10),包括GmB3，GmC3H，GmDBB，GmHLH，GmMYB，GmNF-YA，GmWRKY,GmZIP．研究了几种参与大豆油脂和脂肪酸生物合成调控的转录因子。例如，过度表达GmNFYA在拟南芥显著增加种子含油量[46]。GmMYB73促进脂质积累转基因拟南芥，可能是通过抑制HD-ZIP的转录因子GLABRA2 [49]。QTL区域转录因子在大豆籽油性状驯化中的作用有待进一步研究。

在新QTL的间隔中qPA10_1研究人员还发现了三个可能参与脂质代谢的候选基因，包括GmPK（Glyma.10 g065000)，GmB3（Glyma.10 g076100),GmZIP（Glyma.10 g071700）.GmPK（Glyma.10 g065000)编码丙酮酸激酶(PK)。在大豆种子发育过程中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活性参与了一个复杂的相互作用，调节糖酵解碳转化为蛋白质和油生物合成前体的代谢流[65]。在拟南芥在种子中，通过破坏丙酮酸激酶β1亚基编码基因来降低可再生丙酮酸激酶活性，导致种子含油量减少60% [66]。GmB3（Glyma.10 g076100)编码一个B3结构域家族的转录因子。在芸苔属植物显著,BnFUSCA3（BnFUS3)突变体，B3结构域转录因子的成员，抑制种子油水平和增加亚油酸水平，可能是由于表达减少ω3 FADESATURASE（FAD3) [67]。在大豆中，B3结构域转录因子GmLEC2a弥补了大豆的缺陷拟南芥atlec2幼苗发育和甘油三酯积累的突变体。的过度表达GmLEC2a在拟南芥与对照种子相比，种子的甘油三酯含量增加了34%，长链脂肪酸组成增加了4% [68]。GmZIP（Glyma.10 g071700)编码同源盒亮氨酸拉链蛋白。Song et al.(2013)报道GmbZIP123（Glyma.06 g010200)提高转基因大豆的脂质含量拟南芥通过促进蔗糖转运基因的表达(SUC1和SUC5)和细胞壁转化酶基因(cwINV1，cwINV3,cwINV6) [48]。在答:芥， bZIP67结合到脂肪酸去饱和酶（FAD3)促进剂FAD3表达，并增加亚麻酸种子含量[69]。

利用slf -seq技术，构建了包含11,398个SNP标记的高密度遗传图谱，并鉴定出24个稳定的qtl，用于测定野生大豆和栽培大豆的籽油含量和脂肪酸组成。在这些QTL中，1个QTLqPA10_1与先前报道的qtl不重叠或不接近，也不包含任何与棕榈酸相关的qtn，表明它是一个新的位点。在QTL区域还发现了一些值得进一步研究的有趣基因。本研究为进一步阐明大豆油脂的生物合成提供了有价值的信息。

植物材料

RIL制图人群包括181名F₇由野生大豆ZYD00463 (甘氨酸大豆)和栽培大豆WDD01514 (大豆）.ZYD00463 (甘氨酸大豆)及WDD01514 (大豆)由中国农业科学院油料作物研究所(中国武汉)提供。2015年和2016年，在湖北武汉(N30°35′，E114°33′)和河南许昌(N34°02′，E113°81′)两个试验站种植181株rir及其亲本。这两个地点具有不同的气候条件，武汉气温较高，降雨较多，而许昌气温较低，降雨较少。采用完全随机区组设计，设置亲代和子代3个重复。每个地块包括2.5 m的行距，行距1.0 m，相邻植物间距0.5 m。对于每种基因型，在R8生育期(完全成熟期)从每个地块的5株植株上收获种子[70]。将大豆种子风干至定重，然后按如下方法评估性状。

油和脂肪酸的测定

种子含油量和脂肪酸组成根据Wei等测定。71稍加修改。简单地说，每系30颗大豆种子被磨成细粉。将每种粉末状样品的20毫克转移到一个10毫升的玻璃管中。样品中加入硫酸-甲醇(5%，2 mL)、丁基羟基甲苯(BHT) (0.2%， 25 μL)、甲苯(300 μL)和内标(IS)(十七酸甲酯，Sigma Aldrich, St. Louis, USA, 2.5 ~ 5 mg/mL, 100 μL)制备脂肪酸甲酯(FAME)，在90-95℃水浴中酯化1.5 h。冷却至室温后，加入氯化钠(0.9%，1ml)和n提取液中加入-己烷(1ml)。所得上清液用于气相色谱分析。

采用毛细管柱(FFAP, 30 m, 0.25 mm id, 0.50-μm膜厚)的气相色谱(Agilent 6890 N, USA)分离酯类。氮气被用作载气，入口压力为25psi。进样口和检测器(FID)的温度分别保持在250℃和260℃，色谱柱的温度程序为:210℃(1 min)，以10℃/min (22 min)的速度增加到230℃。用于统计分析的计算机软件为STATISTICA 6.0版本(Statsoft Inc.， Oklahoma, USA)。使用脂肪酸甲酯的真实标准，根据其保留时间确定峰。用相对峰面积定量测定脂肪酸的含量。种子含油量计算公式如下:

一个_t和一个_年代分别为根据停留时间确定的总峰面积和内标峰面积;和m_年代和m_我是内标和干籽的重量。每行样品测定三次。

统计分析

所有表型数据使用SAS 9.3 (SAS Institute Inc.， Cary, NC, USA)的PROC mix程序进行分析。各性状间的Pearson相关系数采用SAS 9.3中的PROC CORR函数计算。

在单一环境下的遗传力估计如下:

不同环境的遗传力计算如下:

在哪里\({\updelta}_{\mathrm{g}}^2 \)为ril间每样性状的基因型方差分量，\({\updelta}_{\mathrm{e}}^2 \)为误差方差，r为性状的重复次数，n为环境的个数[72，73]。对不同环境进行方差分析，以确定基因型、环境及其相互作用的重要性。方差的误差分量(\({\updelta}_{\mathrm{e}}^2 \))，基因型×环境相互作用(\({\updelta}_{\mathrm{gy}}^2 \))，以及基因型(\({\updelta}_{\mathrm{g}}^2 \))采用SAS 9.3 (SAS Institute Inc.)中的一般线性模型程序(PROC GLM)进行分析。所有参数均由方差分析的期望均方估计。

基因图谱构建

采用SLAF-seq方法开发双亲之间的SNP标记[74]。SNP标记利用JoinMap 4.0版软件的Kosambi作图功能构建高密度遗传连锁图谱[75]。根据LOD评分为3.0对SNP标记进行分组，然后根据输入算法进行排序以估计重组频率。将连锁位点之间的重组频率转换为距离(cM) [76]。通过将每个SNP标记的序列与Williams 82的基因组序列比对，分析LGs与大豆参考基因组的共线性[77]。

QTL定位与候选基因预测

使用WinQTL制图师2.5版中引入的复合区间映射(CIM)来检测可加性qtl [78]。对于每个性状，通过1000次重复的排列试验估计LOD > 3.6的显著QTL的鉴定阈值P< 0.05。将辅助因素考虑在内，并在测试间隔周围选择10 cM的窗口大小进行CIM分析。利用MapChart 2.2版本绘制了qtl在遗传连锁图谱上的分布[79]。检测到的qtl用代表性状缩写的一个或多个字母与染色体数目组合表示[80]。将在武汉和许昌两种环境中连续2年重复检测到的qtl定义为稳定qtl。其他组先前报告的qtl被定义为报告的qtl。根据大豆参考基因组(Wm82.a2.v1.1)的注释，从SoyBase数据库中获得稳定QTL区间内的预测基因。使用默认设置的GO网站对预测基因进行基因本体(GO)富集分析[81]。

支持本文结论的所有数据都包含在本文及其附加文件中。

方差分析:

方差分析

二叔丁基对甲酚:

丁羟甲苯

CIM:

复合区间映射

名声:

脂肪酸甲酯

GC:

气相色谱法

走:

基因本体论

GWAS:

全基因组关联研究

是:

内部标准

拉:

亚油酸

格林:

连锁群

放大器:

亚麻酸

LOD:

概率对数

MAS:

分子标记辅助选择

门店:

新一代测序

办公自动化:

油酸

度:

含油量

PA:

棕榈酸

QTL:

数量性状位点

本考察团:

数量性状核苷酸

瑞来斯:

重组自交系

山:

硬脂酸

SLAF-seq:

特异位点扩增片段测序

SNP:

单核苷酸多态性

我们非常感谢吴丹博士编辑了这篇手稿草稿的英文文本。我们也感谢LetPub (www.letpub.com)，感谢其在编写本手稿期间提供的语言帮助。

国家重点研发计划项目(No. 2016YFD0100504)、国家自然科学基金项目(No. 31522042和31371654)、国家转基因项目(No. 2016ZX08004003)、湖北省自然科学基金项目(No. 2016CFA049)、中国农业科学院项目(No. 2016CFA049)资助。Y2017JC14)，河南农业大学。资助机构的作用是提供财政支助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

从属关系

1. 中国农业科学院油料作物研究所农业农村部油料作物生物学与遗传改良重点实验室，湖北武汉430062

   姚艳杰，尤清波，周新安，焦永清

2. 中国农业科学院研究生院，北京，100081

   实证么

3. 华中农业大学植物科学与技术学院农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070

   姚艳杰，李霞

4. 许昌农业科学研究所大豆研究室，许昌461000

   段国展，任建军，赵俊清

5. 河南农业大学农学院/河南省粮食作物协同创新中心，河南郑州450002

   褚珊珊，焦永清

贡献

y.y.和Y.J.设计了这项研究并撰写了这篇文章。秦永远、郭广德、纪荣、苏正成、纪中、肖立、尚哲进行了数据分析和实验。Y.J.协调了这项研究。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到夏李或新安周或永庆娇．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者没有竞争的经济利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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