根系性状影响苹果早期火炬病易感性(家棠)

背景

虽然众所周知，抗性砧木有助于管理由欧文氏菌amylovora,砧木在提供系统性防御中的作用大肠amylovora目前还不清楚。本研究验证了根系活力高的砧木对苹果火枯病感染具有较高的耐受性的假设。多个苹果接穗基因型嫁接到单一砧木基因型和非嫁接的' M。7’ rootstocks of varying root vigor are used to assess phenotypic and molecular relationships between root traits of rootstocks and fire blight susceptibility of apple scion cultivars.

结果

观察到不同的根系性状表现出显著的(p< 0.05)与火疫病易感性呈负相关。事实上，根表面积在一定程度上决定了‘M’的火病易感性的不同水平。7的小苗。此外，不同分子途径的基因表达模式的对比变化伴随着观察到的根驱动的火炬病易感性水平的差异。研究发现，一个由防御、碳水化合物代谢、蛋白激酶活性、氧化还原和应激反应途径基因组成的单一共表达基因网络调节了苹果根系依赖的火烈病易感性。特别是WRKY75和udp -糖转移酶被挑出来作为中心基因，值得进一步详细分析。

结论

低根质量可能会在资源限制条件下激活碳水化合物代谢途径，这些途径与植物免疫系统基因相互作用，从而引起不同水平的火炬病易感性。

根在植物功能及其与生物和物理环境的相互作用中起着至关重要的作用。植物根通过器官间信号传递调节植物对抗病原体感染的系统防御，其作用越来越被人们所认识[1，2，3.，4］．根可以触发生理和遗传反应，从而激活分子途径，在感染时识别和抵抗病原体[2，3.，4，5］．事实上，一些根系特征可以作为土壤传播病原体的物理屏障，阻止它们渗透到活组织中[6，7，8，9］．因此，研究根与病原体之间的相互作用及其与疾病易感性的关系对果树作物特别重要，因为果树作物经常选择特定的砧木来赋予易感接穗品种抗病性[10，11］．

据报道，根系结构(RSA)由各种根系类型的生长、长度、直径、密度、分枝模式和分枝角度决定，并影响从土壤中吸收资源[12，13，14，15］．一般来说，植物的根主要由一个或多个主根组成，这些主根又依次产生若干次根和第三根[15，16］．相比之下，果园苹果砧木的根系主要由不定根组成，通过无性繁殖产生于茎插枝的节点连接处，这对嫁接接穗的初始建立和成功至关重要。因此，不定根的生长和密度可以影响植物在正常和易受胁迫条件下的养分获取能力[17］．养分吸收不仅支持植物的整体生长，还有助于植物在不同胁迫条件下的生存，如伤害、洪水、干旱和营养缺乏[17，18，19］．然而，不定根在增强生物和非生物胁迫耐受性方面的潜在作用尚不清楚。

砧木通过许多不同的方式影响接穗的基因型。它们可以影响接穗活力和结构、物候、早熟、果实质量和产量[20.，21］．此外，砧木赋予不同作物不同的耐盐性、耐旱性和易病条件[21，22，23］．例如，已选择抗性砧木并用于提高嫁接接穗品种的抗病能力[11，24，25，26用于商业苹果园的可持续病害管理。有人提出，砧木可以通过根和芽之间的远距离信号传递，通过改变脱落酸、细胞分裂素、生长素和其他激素的水平来改变接穗的表型[27，28，29，30.］．此外，砧木调控的基因表达差异和可移动的mRNA运动也可能有助于增强宿主对病原体感染的防御[11，25，31］．例如，嫁接的苹果接穗在火枯病感染下，砧木影响茉莉酸和肌醇途径的疾病相关基因表达水平[11］．这些源于砧木的可移动mrna可能充当长途信号[31改变嫁接接穗中疾病相关分子通路的表达。根还产生次生代谢产物，如尼古丁、糠香豆素和醛，以改善植物对病原体的防御机制[4］．相反，叶面细菌侵染改变了根系中苹果酸的分泌，从而吸收有益的土壤细菌，提高植物对病原菌的免疫力[32］．此外，砧木也可能通过调节水和养分的吸收水平来影响接穗的生理机能[22，33]，从而限制病原体的传播和疾病的感染。综上所述，砧木根系性状在调控地上植物生理和接穗病害易感性方面具有重要的功能作用。

火枯病，一种由欧文氏菌amylovora(毛刺)。34造成全球范围内苹果产量的大量损失。火枯病可发生在植物发育的多个阶段，尤其在幼嫩果园的新生长组织中感染的风险较高[35，36］．在商业果园中，苹果种植者主要依靠使用化学处理和修剪受感染的树枝来控制火炬病，但一旦细菌已经侵入生殖和/或营养植物组织，这些预防控制措施仍然效率低下。植物抗性为可持续控制细菌传播提供了替代选择，特别是当细菌渗透到宿主组织时。

使用抗性砧木可直接控制火枯病的感染，但也可限制其向易感接穗的传播[26，36］．例如，从日内瓦、纽约的苹果砧木育种项目中嫁接到G.16、G.30和G.11苹果砧木上的易感接穗品种已表现出高至中等水平的抗火枯病能力[26，37］．这一观察到的由砧木驱动的嫁接接穗的差异火枯病抗性归因于疾病相关蛋白和途径的基因表达变化，包括植物激素、转录和信号转导活动，以及各种细胞和代谢反应[11］．砧木可以潜在地利用几种机制来赋予对接穗的抗性，但砧木定义的接穗抗性或耐火性的确切机制仍然未知。

在本研究中，我们验证了高根质量(g)的苹果砧木能更有效地应对火枯病感染的假设。为了研究这个问题，我们进行了以下两个实验。在一项实验中，将一系列基因型的苹果接穗嫁接到单一的苹果砧木“Malling 7”(“M.7”)上，允许嫁接的树木生长，然后进行人工接种大肠amylovora建立不同遗传背景下根系活力与病害严重程度的关系．在第二个实验中，未嫁接的' M。7’ rootstocks of varying root mass are grown, and then these are challenged with大肠amylovora在单一基因型中特异性检测根系活力对疾病严重程度的影响。在这两个实验中，对形态特征进行了评估，从而评估了砧木根系性状与苹果火病易感性之间的分子相互作用。

砧木根系性状与嫁接接穗的火病易感性相关

M.7砧木45个接穗嫁接数据(附加文件)9:表S1)评价根、梢、叶与火枯病侵染严重程度性状之间的关系。根干质量(g)和每节平均根数(count)在该接穗基因型群体中都有很大的变异。M.7砧木的根干质量从0.67 g (g)到6.84 g(附加文件)不等1:图S1A)，而M.7砧木的平均每个节点根数在2.96到7.56之间1:图S1B)。相应的茎叶性状也显著(p< 0.05)该人群的变异(附加文件1:图S1C-E)。该种群的茎长为8.8 ~ 24.5 cm，叶长为3.0 ~ 6.6 cm，叶绿素SPAD值为28.4 ~ 38.5。茎部性状具有中等的广义遗传力(H²)的值，叶长和叶绿素含量在0.70 ~ 0.62之间。特别值得注意的是，病变长度百分比在1.2至93%之间，并显示显著(p< 0.05)人群变异(附加文件1:图S1F)。H²病变长度百分比值为0.71。

为了具体检查根干质量与火炬病病变百分比长度之间的关系，我们根据病变百分比长度将45个接穗基因型分为三类，对根干质量(g)进行了统计分析(图2)。1)．接穗基因型的聚类导致每个疾病严重程度等级的复制数量增加，以进行更可靠的统计分析。一个重要的(p根干质量(g)在三个疾病严重程度等级之间的差异< 0.05。1)．在去除20个在病变长度百分比中显示高标准偏差的接穗基因型后，得到了类似的结果(附加文件9:表S1)。

两两表型相关表现为根与梢性状正相关，根与火枯病易感性性状负相关10:表S2)。然而，并不是所有的相关性都是显著的。例如，根干质量(g)有显著(p< 0.05)与病变长度百分比负相关(- 0.45)2:图S2)，而每节平均根数与火病易感性性状之间的负相关不显著。同样，根干质量(g)显示显著(p< 0.05)与叶长呈正相关，与茎长无显著正相关10:表S2)。总的来说，这些表型相关性表明，砧木的根干质量可以影响嫁接接穗的叶片生长和火烈病易感性。

利用层次聚类和多变量分析将整个种群根据表型差异进行分组。因此，这个种群被分为六个表现出不同性状变异模式的主要集群，如性状值热图所示(附加文件)3.:图S3)。此外，根病和火疫病性状的主成分分析也突出了该群体中这些基因型簇的表型差异(图2)。2a).例如，根干质量(g)和病变长度百分比(%)在6个鉴定聚类中表现出不同的性状均值分布模式(图1)。2事实上，“C4”和“C6”聚类往往由根质量相对较低(g)和疾病易感性较高的基因型组成。然而，这种观察到的模式在其余的聚类中表现得不太清楚。

有趣的是，9个主成分(PCs)解释了该人群中存在的总变异。PC1对总变异的最大解释为32.6%。虽然所有性状都对PC1变异有贡献，但根和梢性状对PC1变异有正向贡献，而火疫病易感性性状对PC1变异有负向贡献(附加文件)4:图S4)。这一趋势支持了先前检测到的根和火疫病易感性性状之间的负相关。此外，对高阶pc的分析揭示了来自根、梢和疾病易感性性状的不同程度的贡献(附加文件)4:图S4)，所有与根和疾病相关的性状都对PC2变异有正向贡献。总的来说，PCA分析显示该种群存在相当大的变异，这部分是由根系生长和疾病易感性性状之间已确定的相关性所驱动的。

超过根面积阈值的砧木不易受火枯病的影响

为了评估根系对火病易感程度的影响程度，采用代表四种不同根区类别(RACs)的非嫁接M.7砧木进行了第二次独立实验。研究发现，平均根表面积从1720厘米(最低RAC-1)到4455厘米不等²(最高RAC-4)，与其他3个rac的变化约为1.27 ~ 2.59倍(图2)。3.a).此外，以病变长度百分比(%)衡量的火枯病感染表现出显著(p < 0.05)不同rac之间随时间变化的变化(附加文件5:图S5)。RAC-4和RAC-3 2 ~ 8代疾病进展的绝对比率约为41.9 ~ 75.0%;而RAC-1和RAC-2的阳性率较高，分别为84.4 ~ 98.3%。在第8代，病变长度百分比显著(pRAC-1与RAC-3、RAC-4差异均< 0.05)，而在p在RAC-2中，与其他rac相比< 0.05。3.b).总体而言，高根表面积(cm)根类的总感染和疾病进展相对较少²)在实验开始时，反之亦然。此外，根表面积阈值为3644 cm的砧木对火病的易感性最高²，用RAC-3表示(图;3.)．

表型相关性分析显示出很强的相关性(r²= 0.87;p根面积(cm²)，总生长时间为106 d，这表明初始根面积可以作为根发育后期根面积增长的预测因子。同样，其他根系性状也表现出显著的(p< 0.05)正相关(附加文件11:表S3)。例如，根干质量(g)与种植前后根面积(r)呈高度正相关²= 0.82和0.93)。同样，粗根质量和细根质量均显著(p< 0.05)与根面积(cm²)前(r)²分别为0.79和0.62)和种植后(r²= 0.85和0.78)。部分根系性状也表现出显著的(p与火疫病易感性性状呈负相关(< 0.05)。例如，种植前的根面积(厘米²)和细根干质量(g)与火枯病病变长度分别呈−0.70和−0.58的显著负相关(附加文件11:表S3)。相反，病变长度百分比与种植后根面积(cm²)、粗根干质量(g)和总干质量(g)差异不显著。

不同基因组的不同表达模式与根系依赖的火疫病易感性相关

接种细菌后，表型分析发现显著(p < 0.05)不同RACs的7 .砧木叶片的火疫病感染随时间的差异(图;3.；额外的文件5:图S5)。为了鉴定与根调控的火枯病易感性相关的分子变化，研究了不同根面积类别(平均根面积为1720 cm的RAC-1)叶片组织的基因表达模式²与RAC-4相比，平均根面积为4455 cm²对照和细菌接种处理下未嫁接的M.7基因型在第4和第8代(附加文件)12:表S4)。该基因表达分析是按顺序进行的(图。4)．我们首先比较了RAC-1和RAC-4的对照叶片样本，以确定任何解释根表面积差异对叶片响应影响的差异表达基因(DEGs)。接下来，对照和细菌接种的叶片样本随着时间的推移进行分析，以确定叶片组织中的火枯病反应基因。结果，从两种分析中鉴定出一组共同的基因，并认为这些基因与叶片组织中根调控的火枯病易感性反应相关。

随后，观察到该人群中存在高PC1变异(82%)(附加文件)13)，从而表明根面积、火疫病感染和采样时间对基因表达数据集中检测到的可变性有贡献。此外，显著的(p < 0.05)在对照组和细菌接种的RAC-4样品中，deg随时间的推移而增加，而在细菌接种的RAC-1样品中，deg随时间的推移而减少(图2)。4a).有趣的是，在4和8 dpi时，RAC-1和RAC-4之间分别检测到132个和1017个deg1；额外的文件14)．4 dpi时所有132个DEGs在8 dpi时也被识别出来(附加文件6:图S6)，这表明根表面积差异的影响持续存在，事实上，在这一发育阶段，这种影响变得更加严重。此外，1017个DEGs中有454个在细菌感染后转录水平发生显著变化(p < 0.05)。4b;额外的文件15)．这些deg涉及可能与细菌感染相关的基因，其表达水平也依赖于根表面积的差异，如对比RACs中所述，在本文中称为根调控火病反应(RRFBR)基因。

RRFBR基因的归一化表达分析在第4和第8代对比RACs中发现了相反的趋势。例如，约31.7% (n= 144)两次接种细菌后，DEGs在RAC-1中表达水平升高，但在RAC-4中表达水平下降(附加文件)16)．同样，11.4% (n= 53) DEGs在RAC-1中表达水平下降，而在RAC-4中表达水平升高。有趣的是，只有少数基因(n= 9)显示了细菌感染后两种RACs之间表达水平的相似变化模式(附加文件16)．这些结果表明，对于大多数RRFBR基因，RAC-1和RAC-4之间的火炬病易感性差异主要与不同的基因表达模式有关。

来自多种途径的基因之间的相互作用伴随根部依赖的火疫病易感性

通过进一步的基因本体(GO)分析，发现~ 92%的RRFBR基因属于与代谢反应(42%)、催化活性(40%)和氧化还原(10%)过程相关的一般应激反应途径(图。4c;额外的文件17)，而8%的RRFBR基因表示与碳水化合物代谢过程、细胞识别、对生物刺激的反应、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性和外质体相关的功能项(图。4c;额外的文件17)．此外，在这些途径中，DEGs的表达水平有所不同(附加文件7:图S7)。例如，碳水化合物代谢和蛋白激酶途径中的一些DEGs在RAC-1中的表达水平低于RAC-4，而其他DEGs则表现出相反的趋势(附加文件)7:图S7)。有趣的是，所有参与防御反应途径的六种deg在细菌感染后的8代，在RAC-1中表达水平降低，但在RAC-4中表达水平升高(附加文件)7:图S7;额外的文件17)．总的来说，这些发现指向了一般应激反应和碳水化合物代谢途径与防御相关基因的可能相互作用。事实上，这些相互作用可以解释苹果火病易感性的根调控差异。

随后，采用加权共表达分析，通过识别模内连通性最高的中心来识别RRFBR基因之间的共表达模式和假定的相互作用(图2)。5a).研究发现单一共表达模块“C3”占RRFBR基因的77.3%(附加文件)8:图S8)。此外，发现在“C3”模块中，udp -糖基转移酶、甲酸脱氢酶、发病相关4、WRKY dna结合蛋白75、富半胱氨酸RLK、细胞色素P450、漆酶7、葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶蛋白和糖基转移酶家族蛋白作为高度连接的基因一致存在(图3)。5b;额外的文件18)．这表明，来自一般应激反应、碳水化合物代谢和防御途径的核心基因之间的相互作用决定了RAC-1和RAC-4之间观察到的火炬病易感性差异。此外，在“C3”模块中检测到dna结合结构域蛋白作为枢纽，支持来自这些不同途径的共表达基因的转录调控。

早前已有研究报道，砧木和砧木系统结构影响嫁接到这些砧木上的接穗基因型的各种重要性状[20.，21］．正如已证明的，砧木增强了各种作物对盐、干旱和疾病的耐受性[21，22，23]，已开始努力培育抗病砧木，从而提高嫁接接穗品种的抗病能力[11，24，25］．在本研究中，观察到苹果砧木(M.7)的根性状，包括根干质量(g)和平均每节根数(count)，确实是可变的，它们反过来影响嫁接到该砧木上的不同接穗基因型的茎和叶片性状，包括叶片叶绿素含量。更重要的是，这些根系性状还影响不同基因型接穗叶片和嫩枝对控制接种的反应大肠amylovora，以及他们对火枯病的易感性。尽管后者的发现证实了早先的报道[24，26]，详细分析了根质量性状对嫁接接穗基因型侵染后火炬病反应的重要性大肠amylovora．这一发现得到了显著的(p < 0.05)根系质量与接穗火病易感性呈负相关。

未嫁接的' M。7’ rootstocks on fire blight susceptibility of above-ground leaf tissues, it is observed that increased root surface area contributed to decreased fire blight susceptibility in these above-ground leaf tissues, and the reverse is found to be true as well. These observed root-dependent differences in levels of fire blight disease susceptibility may be attributed to presence of multiple defense mechanisms [11，25，38，39，40]与植物营养状况相关的途径相互作用。事实上，与植物代谢、细胞周期、氧化还原和应激反应相关的多种分子途径的参与表明，苹果的火炬病感染存在系统性调控[11，38］．此外，砧木基因型可以通过砧木调控的基因表达模式显著地促进接穗对火枯病易感性的耐受性[11］．

值得注意的是，不同的火枯病反应和根系特征显示出显著的(p在本研究中进行的两个实验中，差异< 0.05)。所观察到的病变长度百分比(%)的变化部分归因于嫁接接穗品种的遗传背景不同，计算出的病变长度百分比(%)的中等广义遗传力支持这一点。嫁接接穗对‘M’的根系性状也有影响。7’ rootstock, but the short time frame (~ 3 months since grafting and 8 days post inoculation) of each experiment in this study makes it harder to notice such effects. However, the effect of scion genotypes cannot be fully excluded and could vary depending on the scion genotypes used. Nonetheless, the significant differences in root traits remains apparent in three different disease severity classes of mixed genetic backgrounds, which supports the observed relationships between root and disease severity traits. It has been reported that variations in root traits of rootstocks might contribute to phenotypic plasticity due to their exposure to different nutrient regimes, soil, and environmental conditions during their earlier growth in the clonal rootstock [15，41，42］．不同基因型之间，不同性状的表型可塑性各不相同[43，44，45，46］．因此，鉴定根系表型可塑性基因将有助于培育具有更统一根系性状的砧木。反过来，这将有助于增强抵抗大肠amylovora侵染，尤指果园中嫁接的年轻苹果树。

在本研究中，在对比RACs之间检测各种不同的DEGs，包括几种疾病相关和发病蛋白，指出了中央免疫系统在赋予根依赖的火枯病易感性/抗性反应中的关键作用。早期的研究已经报道了一些与疾病相关的CC-NBS-LRR蛋白对苹果的火枯病具有主要的抗性[39，40］．这些结果表明，核心防御途径与系统水平代谢和胁迫响应途径之间的基因相互作用可能调控苹果根系依赖的火炬病易感性/抗性反应。此外，这些途径可能与糖和碳水化合物代谢途径协同作用，在本研究中研究的对照RACs中已显示出过高的代表性。因此，低根质量可能会改变植物的下沉活性，从而改变碳水化合物代谢基因的表达模式。此外，碳水化合物代谢的变化可以通过代谢和应激反应基因相互连接的信号网络改变植物的防御反应。例如，限制地下根的生长可以改变地上叶组织的发育和碳水化合物代谢[47，48，49］．此外，源叶中代谢物水平的改变可以决定对病原体感染的防御反应[50，51，52］．事实上，在苹果中检测到由碳水化合物代谢和疾病相关蛋白组成的单一共表达模块“C3”，进一步支持了这种模型的可行性。此外，相互作用的WRKY和乙烯响应的dna结合转录因子的存在表明这些途径的转录共同调控。因此，低根质量可能导致植物的资源限制条件，从而通过碳水化合物代谢途径促进发病机制和疾病相关蛋白的基因表达变化。正是这些在中央植物免疫系统中表达的变化最终决定了苹果的火炬病易感性水平。这些结果可能进一步证明，植物在感应到接种接穗的疾病感染后，启动对火炬病的系统反应，并将信号传递给砧木，这反过来又通过多种机制促进了疾病的耐受力/抗性。然而，砧木可以通过多种途径影响嫁接接穗的病害严重程度。例如，本研究提出的由砧木调控的基因表达、根茎间的移动RNA信号以及营养-病原体相互作用可能是导致嫁接接穗上砧木效应的一些因素[4，11，25，31］．

需要指出的是，本研究中进行的共表达分析也突出了那些模块内连通性最高的核心基因。特别是WRKY75转录因子和udp -糖转移酶是该网络中显示最高水平连通性的前两个基因。因此，这两个基因被认为是值得进一步研究的候选基因，以评估它们在各种生物和非生物胁迫条件下的潜在作用。此外，确定那些导致火枯病易感性/抗性水平的根依赖性差异的因素将是有趣的，这需要对少数候选基因进行严格的实验和功能验证，但这超出了本文的范围。

根系直接调节养分和水分的摄取量，进而影响嫁接接穗的生长、生理和代谢[22，33，53］．由于较小的根系会限制养分的可用性或施加局部压力条件，这反过来又会影响疾病易感性水平。例如，据报道，水分亏缺会增加不同植物物种对真菌感染的敏感性[54，55］．这部分归因于宿主R基因和/或病原体效应物表达的改变[54］．本研究在RAC-1和RAC-4之间检测到几个抗病基因和富亮氨酸重复序列的对比表达模式，这表明在低根表面积下植物免疫发生了变化。同样，氮的有效性可以影响植物的疾病严重程度[53，56];然而，营养依赖性疾病易感性水平变化的确切机制仍然未知。因此，应开展进一步的研究，以确定资源限制条件的作用，以及在地上植物组织对火炬病易感性/抗性反应的根依赖反应差异中涉及的因素。

未来的研究还需要对根性状和疾病严重程度之间的关系进行更准确的估计和解释，因为相同基因型的重复之间疾病严重程度的高变异可能会在我们的分析中引入噪声。由于多种因素导致基因型的高度变异，选择相同年龄、相同接种量的同种芽是在一定程度上减少这种变异的一种简单方法。此外，使用增加数量的生物重复也可能有助于降低基因型内的这种变异。另一组丰富的实验将是在本研究的实验时间框架之外扩展类似的分析，因为本研究的结果表明，疾病在低根表面积和高根表面积的植物中以不同的速度发展。

综上所述，根系性状可以影响苹果对火炬病的易感性。需要一个最佳的根面积阈值，以达到对火病的最大耐受;然而，根系性状的高可塑性会阻碍苹果砧木这种最佳根系的维持。因此，应该进行进一步的研究，以确定控制根系大小、分枝和根系表型可塑性的基因或生长条件，因为这一新知识将有助于设计更均匀的根系，以获得最佳的无性系苹果砧木活力。此外，控制胁迫响应途径的核心调控基因有助于增强植物对根系生长受限和疾病感染所施加的非生物和生物胁迫的耐受性。

植物材料和生长条件

一年生苹果“Malling 7”(“M.7”)的砧木，一种中等程度的火枯病易感砧木，从Willamette Nurseries Inc.(坎比，OR)购买，并用于两个不同的实验。“M。7，’ a commercially important apple rootstock, was originally selected from traditional French rootstocks, known as ‘Doucin’, at East Malling Research Station (UK).

为评价砧木根质量对嫁接接穗火病易感性的影响，将45个不同基因型的接穗嫁接到1年生‘M’上。7 ' rootstocks(附加文件1:表S1)。接穗基因型的芽木采集自美国国家苹果收藏，这些苹果在位于纽约日内瓦的USDA-ARS植物遗传资源部门(PGRU)保存了很长时间。这些嫁接的树木在潮湿黑暗的室内保存了三个月，以促进嫁接愈合。然后，将这些嫁接的树木种植在D40H深坑(Stuewe and Sons, Tangent, OR)，直径6.5 cm，深度24.2 cm，含有标准的康奈尔土壤混合物(50 peatmoss:50蛭石，6.2 kg.m)⁻³石灰，1.25 kg.m⁻³过磷酸钙，0.62 kg.m^3.硝酸钙)。这些树木被允许在Cornell AgriTech (Geneva, NY)的温室设施中适应和生长，环境温度为25°C, 50% RH，光照16小时/暗8小时，持续8周。对于每种接穗基因型，在Cornell AgriTech (Geneva, NY)的温室设施中保持三次复制，并以完全随机的块设计进行安排。

为了评估不同根质量(g)对火炬病易感性的影响，21株非嫁接的' M。第二次试验采用7 '砧木。One-year-1-year-old ' M。7’ rootstocks were pruned from the bottom up, using Fiskars hedge shears, to alter the numbers of adventitious root nodes growing along each of the rootstocks. The resulting rootstocks were photo-imaged, and analyzed using ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)，以确定四个具有显著不同根区域的类(rac)。这些非嫁接的' M。7’ rootstocks were then potted in plastic pots (26 cm in diameter and 22.5 cm in depth) using the Cornell Soil mix as described above. For each RAC rootstock treatment, three replications were used, and these trees were maintained in the greenhouse facility at Cornell AgriTech, arranged in a completely randomized block design, under conditions of 25 °C, 50% RH, and 16 h light/8 h dark photoperiod for a period of 106 days.

火枯病的接种与性状评价

用高毒力制备细菌接种物大肠amylovora菌株Ea2002A从康奈尔大学Steve Beer博士的收藏中获得。将冷冻接种物转移到含有King’s B培养基(KB)的培养皿中，在28°C下孵育48 h。细菌细胞在使用1X PBS的悬浮培养中恢复，并调整到10⁹CFU/ml在SmartSpec Plus分光光度计上(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)。

盆栽幼树分别接种细菌(处理)和水(对照);仅在第二次实验中)用于火病评价。如前所述，使用浸有细菌悬浮液的剪刀，将盆栽幼树活跃生长的嫩枝中最年轻的展开叶横切中脉接种[38，57］．在第二次试验中，用去离子水对对照植物的叶片中脉进行等分。

接种后第8天(代)对所有幼树进行火炬病感染及根系性状的评价。在这两个实验中，总梢长、总叶长和叶片坏死长度都用尺子以“厘米”为单位测量。叶片坏死病变长度百分比(%)为叶片坏死病变长度与总叶长之比乘以100。此外，使用SPAD 502 Plus叶绿素仪(Spectrum Technologies, Aurora, IL, USA)测量了对照和感染叶片的叶绿素含量。同时评估所有接种幼树(对照和处理过的)的平均每节根数(计数)和根干质量(g)。每个节点的平均根数是用根总数除以所使用的砧木切割的节点数来计算的。在每个试验结束后的第8天，将每个砧木的根剃除，并在烘箱中干燥，以确定干根质量。

在第二个实验中，在实验开始和结束时以数字方式收集额外的根性状数据。根系来自每一个' M。7’ rootstock was photographed by rotating it 360 degrees to capture the three-dimensional root surface area using a Canon EOS Rebel T5 Digital SLR camera (Cannon USA Inc., Melville, NY, USA). All raw images were first converted into greyscales, and then followed by binary conversion using the software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)．二值图像用于计算总根表面积(cm²)在实验的开始。砧木按根表面积从低到高分为4个不同的RACs²)．在实验结束时，仔细地挖出根系，并用洗涤剂和水清洗。然后将根铺在平面上，用佳能EOS Rebel T5数码单反相机拍摄。使用ImageJ软件处理照片图像，计算实验前和实验后的根表面积(cm²)．在数字化根径分类的基础上，将每棵幼树的根系分为粗根(直径> 1 mm)和细根(直径< 1 mm)，在烘箱中烘干，然后测定细根干质量(g)、粗根干质量(g)和总根干质量(g)。

统计分析

所有采集到的根、梢性状及疫病严重程度数据均用于统计分析。为了测试根干质量(g)和病变长度百分比(%)之间的关系，根据病变长度百分比将基因型分为三类:抗性(0-20%平均PLL)、中等(21-80%平均PLL)和易感(81-100%平均PLL)。在R统计软件中采用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态性检验(http://www.R-project.org/)和对数变换对非正态数据进行归一化处理。采用R统计软件(http://www.R-project.org/)．此外，我们还使用原始非正态数据集进行了Kruskal-Wallis检验，观察差异是否显著。均数比较采用Tukey多重比较检验。广义遗传(H²)估计为V的比值_G/ V_P，其中V_P对应于由遗传成分方差(V_G)．疾病进展的绝对速率计算为第8天和第2天PLL的差值，除以第2天的PLL。

利用平均性状值计算Pearson相关系数，并利用“hclust”函数进行层次聚类，利用R (http://www.R-project.org/)．层次聚类根据个体之间的相似程度来估计个体之间的关系;而主成分分析利用方差分量来确定这种关系。对特征均值进行缩放，进行层次聚类和主成分分析。在分层聚类中，利用缩放特征数据集，利用Ward 's linkage方法生成欧氏距离矩阵，用于估计聚类间距离。通过主成分分析得到主成分(PC)特征值和旋转，估计不同性状对解释每个PC变化的贡献。使用前两个主成分(PC1和PC2)生成PCA双标图，以确定总体基因型变异和根干质量(g)对疾病严重程度的影响。

叶片样本采集，RNA提取，3'RNAseq检测和测序

7 .砧木的叶组织的对比初始根表面积(厘米²)，在第二个实验中用于RNA提取和基因表达分析。如前所述，在第4天和第8天，从对照的两个生物重复和两个对照rac的细菌接种幼树的三个生物重复中收集叶片[38，57］．叶片组织立即浸泡在液氮中，并保存在-80°C，直到用于RNA提取。

使用SpectrumTM植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)按照制造商的方案提取总RNA。叶组织在液氮中研磨成细粉，100 mg叶粉转入含2% β-巯基乙醇的500 μl裂解液中。样品充分混合，56°C放置5分钟，13000 rpm离心1分钟。上清液以13000转/分的速度通过过滤柱1分钟以去除碎屑。将清除后的裂解液与250 μl结合液混合，以13000 rpm的转速在结合柱中离心1 min。RNA结合后，按照制造商的建议，使用500 μl I洗涤液洗涤两次。在不同的洗涤步骤中，柱以最大速度离心1分钟。干燥柱转移到新的2 ml离心管中，每个结合柱中心加入50 μl洗脱缓冲液。样品在洗脱缓冲液中保存1 min，以最大速度离心30 s洗脱RNA，然后重复使用30 μl洗脱缓冲液以提高RNA收率。RNA的含量使用NanoDrop™分光光度计(赛默飞世尔科学公司，Grand Island, NY, USA)测定，RNA样品的质量通过1%漂白琼脂糖凝胶进行评估。

在康奈尔大学(Ithaca, NY, USA)的基因组学实验室，对对照和细菌接种的RNA样本共构建了20个文库并进行了测序。简单地说，使用Lexogen QuantSeq 3 ' mRNA-Seq Library Prep Kit FWD for Illumina从每个样品的总RNA中制备3 ' rnaseq文库(https://www.lexogen.com/quantseq-3mrna-sequencing/)．文库在Molecular Devices Spectra Max M2平板阅读器上定量(使用插层染料QuantiFluor)，并相应地混合以达到最大均匀性。采用数字PCR定量，沿Illumina NextSeq500测序仪单车道测序，得到单端1 × 86 bp序列。使用Illumina bcl2fastq2软件(版本2.17;Illumina, Inc, San Diego, CA, USA)。

测序数据处理与分析

Trimmomatic(0.36版本)[58该软件用于从解复用fastq序列中删除Illumina适配器，以及删除低质量的读取以供进一步分析。然后使用BBMap包中的BBDuk程序删除至少10个碱基长度的Poly-A尾部和poly-G延伸(https://sourceforge.net/projects/bbmap/)，但在修剪后保持至少18个碱基的长度。通常，poly-G延伸是通过测序短片段的末端(G =无信号)获得的。

然后将修剪过的reads与GDDH13 Version 1.1苹果基因组组装(https://iris.angers.inra.fr/gddh13/downloads/GDDH13_1-1_formatted.fasta.bz2)使用STAR对准器(2.5.3a版本)[59］．对于STAR索引步骤，gff3注释文件(https://iris.angers.inra.fr/gddh13/downloads/gene_models_20170612.gff3.bz2)被转换成GTF格式的gffread程序从袖扣(版本2.2.1)[60］．STAR索引步骤(−runmode genomeGenerate)的关键参数包括——genomeChrBinNbits 18和——sjdbOverhang 100。STAR对齐步骤使用了以下关键参数:——outReadsUnmapped Fastx、-outFilterMultimapNmax 10、- outfiltermismatchnovellmax 0.06、-outSAMmode Full、-outSAMattributes Standard、-outFilterIntronMotifs、RemoveNoncanonicalUnannotated。使用SAMtools(1.6版本)将输出SAM文件转换为BAM [61]，并且使用HTSeq-count (version 0.6.1)计算gff3文件中每个基因沿正向链重叠的reads数[62］．使用针对特定基因模型检测至少5个对齐的高质量读取序列的标准来判定基因的表达。

基因表达及富集分析

R包DESeq2 (version 1.20.0) [63]用于从原始读计数中获得规范化计数。然后将这些计数用于计数归一化和方差稳定变换后对500个最易表达的基因进行主成分分析，并进行差异基因表达分析。以根类、时间点和接种处理为显著因素，比较各根类和时间点的对照和接种样品。使用DESeq2中的“对比度”函数获得每个比较的表达式分析输出。对于每个基因，差异表达的统计显著性基于Wald检验，通过拟合负二项式广义线性模型获得非零对数折叠变化(LFC)估计[63］．调整p-多重测试的值遵循Benjamini和Hochberg方法[64］．基于1.5和a的log2Fold变化阈值，基因被视为差异表达p-value小于0.01。所有上调基因都是基于正的log2Fold变化值来确定的，反之亦然。

来自个体比较的差异表达基因集用于使用Fisher精确检验和agriGO v2.0进行基因本体(GO)术语富集分析[65］．将差异表达基因(DEGs)与GDDH13 Version 1.1苹果基因组组装中完整的全注释基因进行比较。估计p-值在agriGO v2.0中使用Hochberg错误发现率(FDR)校正方法进行校正。一个p-value cutoff < 0.05用于确定显著富集的氧化石墨烯项。

基因共表达网络分析

采用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)包对R [66]以获得具有相似表达模式的基因模块。通过从各种差异基因表达分析中去除冗余基因，建立了每个比较中独特的DE基因列表。随后，提取这些独特的DEGs的归一化基因表达值，进行共表达网络分析。利用单步网络生成和模块检测方法在WGCNA中构建共表达基因模块。具体来说，通过连接数据集中的所有表达值，然后检测显示非常相似的基因表达模式的模块，从而生成一个网络。使用无符号拓扑重叠矩阵(TOM)估计模块分配的阈值;然而，网络使用阈值功率为16，分支切割高度为0.25，最小模块大小为30来构建。这些共表达模块随后在Cytoscape v3.7.1中可视化[67]，每个模块内的高连接基因使用cytoHubba插件进行识别[68]在细胞景观。这些模块使用0.2的阈值从WGCNA导出，并使用四种不同的算法(包括MCC、MNC、Degree和EPC)识别出前20个高连接基因，在cytoHubba中实现。最后，将输出进行比较，以选择从所有四种算法中一致检测到的中心基因。

本研究中使用的所有样本的RNA-Seq分析的所有读取序列都保存在国家生物技术信息中心(NCBI)序列读取档案(SRA)数据库中，生物项目标识符PRJNA507638。本文提供了支持本研究结论的数据作为补充资料。

方差分析:

方差分析

BAM:

二进制对齐图

CA:

加州

CC-NBS-LRR:

螺旋状核苷酸结合位点富含亮氨酸重复序列

菌落:

克隆形成单位

度:

差异表达基因

EPC:

边缘渗透组件

罗斯福:

错误发现率

GDDH:

黄金美味双单倍体

走:

基因本体论

IL:

伊利诺斯州

KB:

英皇B中

利物浦:

对数折叠变化

M.7:

虐打7

世纪挑战集团:

最大集团中心度

跨国公司:

最大邻域分量

NCBI:

国家生物技术信息中心

纽约:

纽约

或者:

俄勒冈州

PBS:

磷酸盐

PC:

主成分

主成分分析:

主成分分析

聚合酶链反应:

聚合酶链式反应

PGRU:

植物遗传资源小组

锁相环:

病变长度百分比

RAC:

根区域类

RH:

相对湿度

RRFBR:

根调节火枯萎响应

RSA:

根系体系结构

山姆:

序列比对图

SPAD:

土壤植物分析发展

SRA:

序列读归档

明星:

对引用的拼接文本对齐

汤姆:

拓扑重叠矩阵

英国:

联合王国

我们:

美国

WGCNA:

加权基因共表达网络分析

我们感谢Rebbeca Steiner为测序提取RNA。

这项研究得到了美国农业部国家食品和农业研究所、Hatch项目NYC-625410和美国纽约州日内瓦康奈尔大学纽约州农业实验站(nyaes)管理的联邦能力基金计划以及nyaes主任控制捐赠基金的支持。这项研究与资助者的优先事项保持一致，但资助者在研究的设计和数据的收集、分析和解释或撰写手稿方面没有直接作用。

从属关系

1. 植物病理学和植物微生物生物学科，康奈尔大学，日内瓦，NY, 14456，美国

   Jugpreet Singh, Jack Fabrizio, Elsa Desnoues, Julliany Pereira Silva和Awais Khan

2. 索尔克生物研究所，植物分子和细胞生物学实验室，综合生物学实验室，10010 N Torrey Pines路，拉霍亚，CA, 92037，美国

   沃尔夫冈•布希

贡献

AK设计了这个实验。ED和JF分别进行了第一次和第二次实验。第二个实验的设计和数据采集支持JKS。JS进行数据分析，包括基因表达、通路富集和共表达分析。JS和AK对数据进行解读并撰写论文。世行支持实验的概念化和设计、结果的解释和手稿的审查。所有作者都阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到Awais汗．

伦理批准并同意参与

关于细菌的研究没有伦理准则欧文氏菌amylovora．

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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