miRNAome和转录组的综合分析揭示了水稻幼苗锌缺乏反应

背景

锌(Zn)缺乏是影响水稻产量的最普遍的土壤制约因素之一，但调控锌缺乏反应的分子机制仍然有限。本研究旨在通过整合Illumina高通量小RNA测序和转录组测序，综合分析水稻幼苗缺锌和补锌下的miRNA和mRNA表达谱，了解水稻缺锌反应的分子机制。

结果

所述转录组测序鉴定了被差异在缺锌水稻幼苗的芽和根中表达的基因360和Zn补给后回收其中97。总共68种miRNA被鉴定为下缺锌和/或Zn补给被差异表达。miRNAome所述的集成分析和转录组数据表明，12组差异表达的基因是10 Zn的响应的miRNA如miR171g-5P，miR397b-5P，miR398a-5P和miR528-5p潜在靶基因。被选择用于通过定量RT-PCR验证某些miRNA基因和差异表达的基因，它们的表达均类似于测序结果的。

结论

这些结果提供深入了解在锌缺乏响应miRNA介导的调控途径，并为水稻缺锌宽容的遗传改良提供候选基因。

锌是一种重要的微量营养素，对植物和动物中的许多酶和调节蛋白起催化、调节或结构辅助因子的作用[1]．植物中常见的含锌蛋白包括碳酸酐酶、醇脱氢酶、铜/锌超氧化物歧化酶等酶，以及大量的含锌手指结构域蛋白，它们的功能是转录调控[1，2]．缺锌（-Zn）是在可耕地中一个严重的农业问题全世界由于由因素如高pH，长时间驱，低氧化还原电位，和碳酸氢根的高含量，有机物和磷[引起的Zn的低可用性3.]．土壤和植物缺乏锌也会导致人类营养不良，因为人们摄入的食物中含有低浓度的锌和其他微量营养素[4]．据估计，人口的三分之一，特别是儿童和女性患有Zn缺乏症相关的健康问题[5]．因此，研究植物对锌缺乏的反应和耐受机制，有助于培育锌利用效率、锌浓度和锌缺乏耐受性提高的作物[4，6，7，8]．

大米(奥雅萨苜蓿)是第二大种植的作物，是世界上30亿人的主要主食。然而，缺锌正成为影响水稻产量的最普遍的土壤制约因素之一[9，10.]．已经提出了很多效果来阐明与Zn缺乏症响应和植物耐受相关的生理生化机制[11.，12.，13.]．这些机制包括通过调整根系结构，释放植物细胞和有机酸来增加根吸收的Zn可用性，以及形成丛枝菌根共生的形成[6，14.，15.];扩大树冠根的生长量[16.];转运蛋白如Zrt，IRT相关蛋白质（拉链），金属耐受蛋白和重金属耐受家庭蛋白质中的转运蛋白（Zn摄取和易位）[17.，18，19，20.，21];调节需要锌酶的表达[2，13.]．最近，转录组学分析鉴定了植物中的锌响应基因[22，23，24]．据报道，在Zn缺乏症下，Zn高效水稻品种中调节的四种基因是赋予Zn效率的候选基因[22]．发现大量Zn缺乏响应基因与大豆中的钙，糖和荷尔蒙信号相关[23]．虽然有些已经取得了进展，基础缺锌的反应和耐受性的分子调控机制仍然是有限的。

微RNA（miRNA）是内源性小的非编码RNA，其在尺寸上20至24个核苷酸，并用一个发夹二级结构从单链RNA前体产生的[25]．已知，它们在与目标基因序列互补的基础上，直接靶向mRNA切割、翻译抑制和DNA甲基化。在植物中，mirna主要引导mRNA的切割，在调控生长发育和各种环境胁迫反应中发挥重要作用[26，27，28，29，30.，31，32]．例如，miR156通过靶向SPL转录因子基因参与调控水稻的粒级大小、穗分枝、冠根发育和开花时间[27，33，34];MiR164调节横向根部发育，叶片衰老，籽粒产量和干旱胁迫耐受性[35，36，37]．MiRNA还调节对多种营养剥夺胁迫的植物反应，并参与营养稳态调节[38，39，40]．例如，miR399、miR827和miR778是由磷酸盐缺乏引起的，并通过调节泛素结合E2酶参与调节磷酸盐稳态PHO2，环型泛素E3连接酶国民组蛋白H3赖氨酸9 (H3K9)甲基转移酶Suvh6.分别为(40，41，42，43];miR397、miR398、miR408和miR857通过控制含铜蛋白的表达参与Cu稳态调控[39，44]．通过使用miRNA微阵列，鉴定了八个miRNA家族，响应于Zn缺乏症高粱二色的，以及两个Cu/Zn超氧化物歧化酶基因SbCSD1和SbCSD2分别被miR398和miR528靶向[2]．然而，据我们所知，目前还没有关于mirna是否以及如何调节水稻缺锌反应的报道。在本研究中，我们通过整合水稻幼苗的miRNAome和转录组分析来研究水稻锌缺乏的分子机制。通过对这些不同数据集的综合分析，确定了水稻缺锌情况下可能存在的miRNA-mRNA相互作用。

通过RNA测序对锌缺乏和锌补充反应的转录组分析

在经历Zn缺乏后14天后，芽和根部的Zn浓度显着降低，并且在Zn再补给3天后，Zn缺陷幼苗的射击和根中的Zn浓度明显增加（图。1A，B-D）。在Zn缺乏下，在芽和根生物质中没有观察到显着差异（图。1e).与观察到的表型一致高粱［2]，缺锌显著增加了主根长度(图。1c, f)。这些结果表明，对-Zn和Zn再补给表现出生理适应反应。

然后，我们通过RNA测序分析了水稻幼苗和根系对-Zn和Zn补给响应的整体转录组谱。研究锌胁迫下锌响应基因或miRNAs的恢复情况。通过Illumina的深度测序，剔除低质量reads后，每个文库共获得286 - 5520万条可靠的clean reads，每个文库中的大部分clean reads(86.8-97.3%)可以被定位到水稻参考基因组(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)(额外的文件1：表S2）。Pearson每个样本的三个生物重复的相关性（R值）约为90％，表明复制的高可靠性（附加文件2：图S1）。映射转录物的丰度在FPKM方面进行测定，并且所有这些样品中检测到总共34716的基因位点的（附加文件1:表S3)。

Differential expression analysis (fold change ≥2 and FDR ≤ 0.05) showed that a total of 151, 227, 123, and 205 genes were differentially expressed in Zn-deficient shoots (ZMS/ZPS), Zn-deficient roots (ZMR/ZPR), Zn-resupply shoots (ZRS/ZMS) and Zn-resupply roots (ZRR/ZMR), respectively (Fig.2一个;额外的文件1:表S4-S7)。维恩图分析表明，通过枝条和(或)根系补锌，共恢复了97个锌缺乏应答基因(图2)。2b和c)，表明这些基因的表达水平与生长培养基中Zn的水平存在因果关系。在枝条中89个上调基因和62个下调基因(ZMS/ZPS上调和下调)中，再锌处理后恢复的基因分别为32个(36.0%)和14个(22.6%)(ZRS/ZMS下调和上调)1）.间的117上调和110下调根基因（ZMR / ZPR向上和向下），40（34.2％）和18（16.4％）基因的Zn补给处理（ZRR / ZMR向下和向上）后回收，（表2）.七个基因（Os10g0328600，Os04g0280500，Os04g0561500，OS06G0566201，Os06g0566300，Os08g0207500， 和Os07g0232800)一般通过根和地上补锌来恢复;其中3个编码锌转运体(OsZIP4, OsZIP8和OsZIP10)。氧化石墨烯富集分析(FDR < 0.05)表明，锌离子跨膜转运蛋白(GO:0071577)和锌离子跨膜转运蛋白活性(GO:0005385)显著富集于缺锌上调和zn补充下调的茎和根中。而苏氨酸合成酶活性(GO:0004795)和甲基硫腺苷生物合成l -蛋氨酸过程(GO:0019509)分别显著富集于缺锌下调的茎和根的DEGs中1:表S8)。

水稻对缺锌和补锌反应的miRNA谱分析

测序结果显示，18个文库各获得8.8 ~ 1530万个原始reads，剔除低质量、垃圾和adaptor reads、repeat、Rfam RNA和mRNA序列后，这些文库中38.3 ~ 56.0%的reads为有效reads(附加文件)1:表S9)。大小分布分析显示，6个样本的小rna主要富集在21- 24 nt的序列中，24 nt是最主要的片段(附加文件)1：表S10;额外的文件2：图S2），与之前的研究同时发生[45]．对每个样品的3个生物重复进行Pearson相关分析，发现相关系数在0.80 ~ 0.99之间2：图S3），表示复制的高可靠性。搜索清洁读数被从MiRBase的水稻和其他植物物种的MiRNA进行搜索，并且从所有样品中鉴定了共有498种已知/保守的miRNA。对MiRBase无法映射到miRNA预测的读数。除去不符合植物miRNA标准的小RNA（例如，长度<20或> 24，在样品中没有读取的发夹结构），获得了最终的370个新的miRNA基因（附加文件1:表S11)。

在缺锌(枝条ZMS/ZPS和根系ZMR/ZPR)和补锌(枝条ZRS/ZMS和根系ZRR/ZMR)条件下，共发现68个mirna(包括38个新mirna)差异表达;缺锌情况下差异表达38个mirna，补锌情况下差异表达44个mirna;14种mirna通常对锌缺乏和锌补充有反应(附加文件)1:表S12;无花果。3.；额外的文件2中：图S4和S5）。通过在分别芽和根，锌缺乏这些锌响应miRNA的，12和11分别为上调;图2和12，通过分别在枝条和根，锌缺乏（附加文件下调2:图S4)。然而，这些mirna中没有一个对茎和根的缺锌都有响应，这表明在缺锌的茎和根中有不同的mirna介导的调控网络。在枝条和根系中分别发现17和27个mirna对锌的再供给有响应。有趣的是，有4个和7个锌缺乏反应的mirna分别可以通过在茎和根中补充锌得到恢复(附加文件2:图S4)。例如，osa-miR398a-5p、11 - mir7、11 - mir21和11 - mir38受缺锌诱导，但受补锌抑制;osaas - mir818a -3p、osaas - mir1428a -3p和osaas - mir5532 -5p在根中受锌缺乏性诱导而受锌再供给的抑制(图2)。3.）.两种mirna在缺锌和补锌条件下表达模式相似;miR397b-5p是由根系缺锌和补锌诱导产生的，而11 - mir27分别是由根系缺锌和补锌诱导产生的(图2)。3.)，提示这些mirna在缺锌和再供给下的复杂调控。

鉴定Zn响应MiRNA的潜在靶基因

为了了解这些锌缺乏和/或锌再供给反应mirna的潜在生物学功能，使用在线工具psRNATarget预测mirna靶向基因[46]．共鉴定了这68个锌反应mirna的799个潜在靶基因(附加文件)1:表向)。4种zn应答mirna (miR398, miR408, miR528, miR397)的至少19个靶基因已经通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RLM 5’-RACE)、降解组测序和遗传分析等实验验证(表1)3.）[47，48，49];其中大多数是含Cu的蛋白质，参与Cu稳态，反应性氧物种（ROS）稳态，光合作用和胁迫耐受性[49，50，51，52，53，54，55，56，57，58]．

为了进一步阐明预测的靶基因在缺锌反应中的潜在生物学功能，我们进行了氧化石墨烯富集分析。生物过程组有26项氧化石墨烯，分子功能组有19项氧化石墨烯，细胞组分组有18项氧化石墨烯显著富集(FDR < 0.05)(图2)。4；额外的文件2：图S6和S7）。在富集的分子功能中，最重要的GO术语是氧化还原酶活性（GO：0016682），漆酶活性（GO：0008471），丝氨酸型肽酶活性（GO：0008236），Cu离子结合（GO：0005507）和丝氨酸水解酶活性（GO：0017171）（图。4）.中富集的生物过程中，最富集的GO术语是木质素代谢过程（GO：0009808），苯丙分解代谢过程（GO：0009808），蜂窝氨基酸衍生物分解代谢过程（GO：0042219），次生代谢过程（GO：0019748）和蛋白水解（GO：0006508）（附加文件2:图S6)。在细胞组分组中，质外体(GO:0048046)、染色质(GO:0000785)和光合膜(GO:0034357)的表达量最大2：图S7）。

miRNAome和转录组的整合分析

由于mirna通过靶基因切割负调控靶mrna的表达，mirna的表达模式通常与靶基因的表达模式呈负相关。通过整合转录组和miRNAome数据，我们预测了-Zn和/或Zn再供给下的12个deg被10个响应-Zn和/或Zn再供给的mirna(包括4个已知和6个新mirna)靶向(表)4）.作为与相应的miRNA相比，这表明此类miRNA对它们的潜在靶基因负调控的潜在目标DEGS的一半显示出缺锌或Zn补给不同的响应。由锌补给例如，miR397b-5P上调，而它的潜在靶基因OsLAC11(Os03g0273200)和OsLAC29(Os12g0258700)通过-Zn上调或Zn再供给下调;osa-miR398a-5p在缺锌时表达上调，是其潜在的靶基因OS07G0213800.明显下调;NOV-MIR4由锌补给下调，而其潜在的靶基因Os01g0358700是差异;11 - mir6因缺锌而下调，可能是靶基因Os04g0623901是差异;11 - mir23因缺锌而下调，而11 - mir23是其潜在的靶基因Os01g0923900锌的补充降低了锌的含量。然而，有一半的潜在靶基因表现出与mirna相似的表达模式(表1)4）.这可能是由以下原因造成的:这些基因是mirna的非真实靶基因;潜在靶基因调控复杂;潜在的靶基因是由翻译抑制而不是转录裂解调控的。

通过QRT-PCR确认miraome和转录组结果

为验证小RNA测序结果，随机选取7个zn响应mirna进行qRT-PCR表达验证。初级miRNAs (Primary miRNAs, pri-miRNAs)是由植物中的MIR基因通过聚合酶II转录而成，具有特征性的发夹结构，可用于指示成熟miRNAs的表达水平[59]．在这里，我们根据相应的miRNA基因序列，使用基因特异性引物分析这些miRNA的初级转录本。pri- mirna的表达与成熟mirna的小RNA测序结果基本一致。例如，pri-miR398a在锌缺乏时上调，在锌补充时下调;Zn再供给上调pri-miR408;pri-miR528因缺锌而上调(图。5）.而pri-miR397b和pri- 11 - mir28则受到锌缺乏的抑制，这与成熟miR397b和11 - mir28的表达不一致，说明这些pri- mirna与成熟mirna在锌缺乏下的反应不同。为了确认RNA测序结果，四个锌响应基因(Os05g0472400，OS03G0191900.，Os06g0639800， 和OS06G0131300.通过QRT-PCR随机选择并研究。在Zn缺乏和恢复下这些基因的表达模式类似于RNA-SEQ的结果，除外OS06G0131300.(无花果。5）.显著的表达变化OS06G0131300.qRT-PCR无法观察到缺锌和恢复情况，但通过qRT-PCR观察到枝条缺锌抑制了其表达。的表达水平OS03G0191900.而qRT-PCR检测不到，这与RNA-seq检测到的茎中FPKM值较低是一致的(图2)。5）.这些结果表明，小RNA测序和基因测序在这项研究中得到的数据是可靠的。

我们还通过QRT-PCR分析了Zn响应MiRNA的几种潜在靶基因的表达。miR397b-5p的潜在靶基因显示对Zn缺乏的差异反应;OsLAC7(Os01g0850550)和OsLAC9（Os01g0850800）通过缺锌在根，这是违反miR397b-5P的表达抑制;OsLAC7被Zn缺乏诱导并在射击中抑制zn（图。6一个)。OsCDS2miR398a是miR398a的潜在靶基因，根部缺锌对其表达有抑制作用，这与miR398a的表达相反(图。6b). miR408-3p的潜在靶点对锌缺乏和锌补充也表现出不同的反应，表明它们在锌缺乏反应中的作用不同。OSUCL16.(Os06g0218600)因缺锌而上调，再锌而下调;OsUCL30(Os08g0482700)因根系缺锌而下调;OsORC6(Os07g0628600)在根和地上部均因缺锌而下调(图;6c)。

锌缺乏和锌回收反应中二氢基因的鉴定

在这项研究中，共发现总共569个基因座对Zn缺乏和/或Zn补充的响应;它们的360对Zn缺乏的根和/或芽缺乏症，并且它们的316次响应于根和/或芽中的Zn补充（图。2）.通过与早期研究比较[24据报道，49个次数对Zn缺陷和/或Zn补充（附加文件）响应1:表S14系列)。其中5个常见的deg是假定的锌转运体，3个常见的deg是金属硫蛋白样蛋白，涉及锌稳态[7，60]．此外，发现97只可通过射击和/或根的Zn再补散治疗恢复（表）1和2），表明他们对Zn缺乏的特定反应。这些可富集蜂窝代谢过程，初级代谢过程和生物合成过程（附加文件）2：图S8），表明这些过程受Zn缺陷的影响，可以通过Zn再补给恢复。四只数（Os03g0108300，OS10G0528400.，OS12G0570700.，Os12g0571000)也被报道通过锌补给回收[24]．

预计12次次数靶向10个Zn响应的miRNA，其中一半显示Zn缺乏下的miRNA和/或Zn补充的差异表达（表4)，提示mirna与其潜在靶基因之间的相互作用。然而，这并不排除zn应答mirna的其他潜在靶基因的响应性。qRT-PCR结果显示，miR397b、miR408和miR398a的几个潜在靶基因也被锌缺乏和/或锌补充诱导或抑制(表)3.,无花果。5b).本研究中可能受锌反应mirna调控的DEGs数量远低于我们的预期。其中一个可能的原因是，用于定义DEGs的公认标准可能会遗漏一些mirna与其潜在靶基因之间的相互作用，通过降低阈值可能会发现更多的相互作用对。

mirna可能参与水稻缺锌反应的调控

mirna已经被证明参与了营养胁迫反应的信号传导和调控，如氮缺乏、磷酸盐缺乏、硫酸盐剥夺和铜缺乏[38，39，40，61，62]．在本研究中，我们分析了锌缺乏和锌补充下的miRNA表达谱，发现68个miRNA对锌缺乏和/或锌补充有响应(图2)。3.）.一些miRNA家族也被发现对锌缺乏有反应高粱二色的，如mir171，mir398，mir399，mir408和mir528 [2，表明它们在植物对缺锌反应中的保守作用。

在Zn响应的miRNA中，其中38个（56％）是新的miRNA。大多数这些新颖的miRNA（36/38）由单个轨迹编码（附加文件1表S12)，表明它们的近期进化起源。大多数的新miRNAs(30/38)包含一个相反的链(miRNA*)，可以被小RNA测序检测到，大多数的新miRNAs(28/38)是24 nt长(附加文件1:表S12;额外的文件2:图S5)。在水稻中，部分pri-miRNAs可分别被Dicer-like 1 (DCL1)和DCL3加工成规范miRNAs (21 nt)和长miRNAs (24 nt) [63，64]．将24nt长miRNA分类为效应器argonaute 4（前4），并通过碱基与靶基因衍生的转录物进行直接DNA甲基化[26，63]．DNA甲基化调节基因表达并抑制转座元件的转录和运动。一些关键营养应激反应基因的表达已经建议可以通过DNA甲基化特定营养胁迫条件下调节[65]．在本研究中，许多锌应答的新型miRNAs(20/38)因锌缺乏而下调，或因锌再供给而上调(图。3.）.这些锌反应的新mirna的潜在靶基因编码各种蛋白质，如转录因子、转运蛋白、蛋白激酶、含锌蛋白和氧化还原酶(附加文件1:表向)。无论是这些最近演化的和可能的特异性Zn响应性新的miRNA与水稻中的淹没和低Zn条件的适应相关，也参与Zn缺乏反应的表观遗传调节，应得到进一步的研究。

mirna在植物Cu-Zn相互作用中的潜在作用

在本研究发现的锌应答miRNA中，一些miRNA家族之前被证实对铜缺乏有响应，如miR397、miR398和miR408，这些miRNA家族都是由铜缺乏诱导的，其靶基因编码各种含铜蛋白[39]．在水稻中，已经验证了19个Cu/ zn响应mirna的潜在靶基因，其中大多数编码含Cu蛋白，如csd、漆酶、植物花青素样蛋白和uclacyanin样蛋白(见表)3.）.在Cu离子结合和漆酶活性的GO术语中显着富集Zn响应MiRNA的潜在靶基因（图。4）.这些结果表明miRNA参与在植物中Cu和Zn营养之间的相互作用中。

研究表明，Cu和Zn可以通过多种方式相互作用:Cu竞争抑制Zn吸收，Zn强烈抑制Cu吸收，Cu影响Zn在植物体内的再分配[66，67]．发现Cu和Iron（Fe）的上游被米幼苗的Zn缺乏增加[68]．在本研究中，我们发现miR398和miR528是由缺锌引起的。miR398和miR528的诱导可抑制含锌靶基因的表达CSDS [2，50]，可被铁超氧化物歧化酶和锰超氧化物歧化酶功能替代，从而进一步允许有限的锌分配到其他必需的含锌蛋白，以适应低锌环境。mirna介导的Zn稳态调控可能与之前报道的Cu稳态调控类似[69，70]．有趣的是，另两种铜响应mirna, miR397和miR408被锌再供给诱导(图)。3.）.这两种mirna的诱导可能是Zn补给的直接作用，也可能是Zn补给诱导拮抗Cu营养的间接作用。miR397b和miR408的主要转录本被锌缺乏所抑制(图。5）.miR397b和miR408的抑制是否与缺锌诱导的植物组织铜积累有关，值得进一步研究。

mirna介导的氧化应激对锌缺乏的反应

锌缺乏可干扰膜结合的NADPH氧化酶产生ROS，进而通过过量的ROS对关键细胞化合物造成氧化损伤，这是锌缺乏下影响植物生长的主要因素[11.]．有报道称，缺锌会导致叶片和根系的细胞损伤，保持较高的ROS防御水平与减少水稻叶片的细胞损伤有关[2，71，72]．在本研究中，氧化还原酶活性的氧化石墨烯项显著富集于锌反应miRNAs的潜在靶基因中(图。4）.据报道，miR398通过沉默的表达参与了氧化应激反应的调控CSD1和CSD2在拟南芥[73]．在这里，MiR398被射击缺乏诱导。miR398的诱导可以抑制其靶基因的表达（csd，Sodx.，冲洗液)，进而促进ROS的积累。miR398也被其他胁迫诱导，如盐、热和稻瘟病菌感染Magnaporthe oryzae［29，52]．miR398的诱导已经建议需要为在拟南芥耐热和耐稻瘟病水稻[51，52]．另一种锌应答miRNA, miR528也被报道参与调节ROS积累[55，56]．其中miR528的靶基因的，CSD4（Os08g0561700)可能参与活性氧清除。另一个miR528的靶基因，OS06G0567900.，编码L-抗坏血酸氧化酶（AO），通过氧化质外体l -抗坏血酸来调节质外体的氧化还原状态，从而参与产生ROS [56]．过表达osa-miR528可降低匍匐bentgrass的AO活性，增加ROS清除，进一步提高植物对盐和氮缺乏胁迫的耐受性[55]．在本研究中，miR528被锌缺乏诱导，提示其在锌胁迫下平衡ROS积累和清除的作用。

本研究首次尝试整合整体miRNA和mRNA表达谱，以识别水稻锌缺乏和恢复的调控miRNA/target模块。一组68个mirna，包括38个新mirna和5个铜响应mirna被鉴定为差异表达。至少有12个锌敏感mirna的靶基因被锌缺乏和锌恢复改变。发现97个锌缺乏应答基因通过锌补给得到了恢复。这项对水稻miRNAome和转录组在锌缺乏和恢复反应中的整体分析确定了候选mirna和基因，可以进一步表征，以增加我们对锌缺乏反应的分子机制的理解。所鉴定的差异表达miRNA/target模块和基因也可以作为基因工程方法提高锌缺乏性的候选基因。

植物材料及生长条件

稻子(奥雅萨苜蓿l . ssp。粳稻的履历。Nipponbare)，表面用10% (v/v) H消毒₂O₂20分钟并用无菌水冲洗[74]．然后将种子转移到浮在无菌水上的苗盘中发芽。幼苗在无菌水中生长10天后，转移到装有2.5 L吉田溶液的塑料容器中[75]．在营养溶液中生长后（ZnSO为1.5μm₄)处理1周后，采用统一苗进行缺锌(−Zn)处理。对于-Zn处理，没有ZnSO₄加入到营养溶液中。每2天补充新鲜的营养溶液，将pH调节至5.6。植物在受控条件下在生长室中生长。光强度约为180μmolm⁻² s⁻¹在26°C/24°C条件下，日/夜循环16 h/8 h。相对湿度为50%。在缺锌处理2周后采集水稻幼苗的根和芽。补充锌处理时，将缺锌幼苗转移到含1.5 μM ZnSO的正常营养液中₄for 3 days. After Zn-resupply treatment, roots and shoots were collected for analyses at the same time point as collecting the Zn-deficient samples (4 hours after illumination).

锌含量测定

如先前所描述，分析Zn的含量[23，76]．采集植物组织，置于80°C烘箱中干燥3天。取根前用去离子水冲洗三次。将干燥的根或芽磨碎，约0.10 g样品用于分析。经HNO消化_3./ HClO₄（4：1，v / v）在180℃下4小时，将溶液用1％HNO稀释五次_3.，然后用电感耦合等离子体质谱(Perkin-Elmer NexION 300X, Waltham, MA)测定锌的浓度。

cDNA文库构建及RNA测序

采用缺锌和补锌处理采集水稻幼苗和根系。采集三株水稻幼苗，并将其混合作为一个样本。18个样品(锌加苗，ZPS;锌减去芽，ZMS;Zn +根，ZPR;Zn -根号，ZMR;锌补枝，ZRS;采得补锌根ZRR，每根3个生物复制)，用于RNA文库构建和测序。使用Trizol试剂(Invitrogen, CA, USA)提取总RNA，使用Bioanalyzer 2100和RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA)进行数量和质量分析。所有RNA样本的RIN值(RNA完整性数)均在8.0以上。 Ten μg of total RNA of each sample was subjected to isolate Poly (A) mRNA with poly-T oligo-attached magnetic beads (Invitrogen, Carlsbad, CA). After purification, the mRNA is fragmented into small pieces using divalent cations under elevated temperature. The cleaved RNA fragments were reverse-transcribed to create cDNA libraries according to the instructions of the mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina, San Diego, USA). The average insert size of the paired-end libraries was 300 ± 50 bp. The paired-end sequencing was performed on an Illumina Hiseq4000 at the LC-BIO (Hangzhou, China). The RNA-seq datasets of this study were deposited in NCBI’s Gene Expression Omnibus and are accessible through GEO accession number GSE130980 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE130980）.

RNA-seq序列的定位和差异表达基因的鉴定

Illumina分析管道(Fastq格式)生成的读取的初始基础调用和质量过滤使用自定义Perl脚本和Illumina管道的默认参数(http://www.illumina.com）.使用FastQC软件包中的FASTX-toolkit对质量差的碱基进行额外过滤(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）.水稻参考基因组(版本IRGSP-1.0) (https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)被Bowtie2索引，以方便读取映射。读取映射使用Tophat软件(版本2.1.1)包执行[77]．TOPHAT允许每次读取的多个对齐（最多40）和最多在将读取映射到参考基因组时的两个不匹配。首先使用索引直接映射到基因组的读取，并使用未映射的读取来识别新颖的剪接事件。通过使用归一化RNA-SEQ片段计数来处理对齐的读取文件以测量转录物的相对丰度。根据每百万映射的读数（FPKM）每千碱基的片段测量估计的基因丰度。使用袖口（2.1.1版）鉴定了两种处理之间的次数。只有LOG2折叠变化≥1或≤ - 1的基因，以及调整的P-value (FDR≤0.05)被认为是显著的deg。基于每个样本的标准化mrna计数，使用R Stats包(版本3.5.0)计算Pearson相关性并绘制。

功能注释和基因本体(GO)富集

基因本体论(GO)术语注释缺锌反应基因和mirna的潜在靶基因[78并将其分为分子功能、细胞成分和生物过程三类。采用单一富集分析工具在AgriGo (http://bioinfo.cau.edu.cn/agrigo/）[79]．类别(http://geneontology.org/）调整后的p值≤0.05被认为是显着富集的。

施工小RNA文库和测序

共收获18个样本(ZPS、ZMS、ZPR、ZMR、ZRS、ZRR，每个生物复制3个)，用于小RNA文库构建和测序。使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)从样品中提取总rna。根据TruSeq small RNA Sample Prep Kits (Illumina, San Diego, USA)的说明书，使用约1.0 μg总RNA制备小RNA库。Illumina Hiseq2500测序仪在中国杭州的LC-BIO进行了长度约50 bp的单端测序。本研究的小RNA测序数据存储在NCBI的基因表达综合数据库中，可通过GEO登录号GSE131003 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE131003）.

mirna的鉴定及其靶基因的预测

原始读段上的内部程序ACGT101-MIR（LC科学，休斯敦，得克萨斯州，美国），除去接头序列，低复杂度序列，垃圾读取，重复序列，并读取匹配常见的非编码进行存放在数据库RFAM RNA家族（的tRNA，rRNA基因，的snoRNA和snRNA启动）（http://www.sanger.ac.uk/software/rfam.）.随后，用20-24个核苷酸（nt）的长度独特序列通过BLAST（2.6.0版本）来识别已知的miRNA和新颖3p-和5p-衍生的miRNA映射到的miRBase 22.0米的miRNA前体。在两个3'和5'端，并且用于对准所述miRNA序列中的一个错配核苷酸长度变化被允许。映射到水稻独特序列在成熟前体的miRNA被鉴定为已知的miRNA。映射到已知的水稻miRNA前体发夹的相对臂的独特的序列被认为是新颖5p-或3p-衍生的miRNA的候选者。剩余的序列映射到其它植物物种的miRNA前体中的miRBase 22.0（http://www.mirbase.org/）通过BLAST（2.6.0版），并将映射的前miRNA与水稻基因组进一步对齐以确定其基因组位置。剩余的未映射的序列与水稻基因组进一步对准，并使用RNAFOLD软件收集具有长度120nt的侧翼序列（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）.新型miRNA预测和表征的标准基于先前的研究[80]．

The abundance of each miRNA were normalized to the expression of tags per million (TPM) following the formula: normalized expression = actual miRNA count/total count of clean reads*10⁶．为了识别锌缺乏或锌再供给反应的mirna，只有log2倍变化≥1或≤−1和ap-value≤0.05为差异显著的mirna。为了预测锌响应mirna的潜在靶基因，psRNATarget(植物小RNA靶分析服务器)(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）（V2，2017释放）是基于miRNA的序列和它们的靶基因[之间的不完善互补采用46]．

定量rt - pcr分析

定量RT-PCR (qRT-PCR)在MyiQ Single Color Real-time PCR系统(Bio-Rad)上进行，如前所述[81]．如前所述进行原发性miRNA（PRI-miRNA）的QRT-PCR分析[59，82]．茎环序列用于引物设计，如果没有找到令人满意的引物，则在每侧的侧翼基因组序列100bp延长茎环序列以进行底漆设计。相对表达水平被标准化为两个内部对照基因的OsACTIN1（Os03g0718100),OsUBQ2（OS02G0161900.）using the Pfaffl method (Ratio = (E_目标）^∆CT_目标^{(对照试样)}/（E_裁判）^∆CT_裁判^{(对照试样)}）[83]．所有引物的计算效率(E)均在1.8 ~ 2.2之间。引物的序列列在附加文件中1S1:表。

在本研究中使用的数据集可从通讯作者在合理的要求。

AGO4:

Argonaute 4

AO：

L-ascorbate氧化酶

bZIP:

基本亮氨酸拉链

孔:

铜伴侣超氧化物歧化酶

CSD:

铜/锌超氧化物歧化酶

铜：

铜

DCL1：

Dicer-like 1

度:

差异表达基因

菲:

铁

FPKM：

每百万每成绩单的碱基片段短片段

GA：

赤霉素

走:

基因本体论

H3K9:

组蛋白H3赖氨酸9

miRNA：

微

NAS:

尼古拉胺合成酶

存在:

定量RT-PCR

那么使用RLM 5 '运动中:

RNA连接酶介导的5'CDNA的快速扩增

ROS:

活性氧

SODX:

超氧化物dismutaseX

TF：

转录因子

ZDRE：

缺锌响应元件

ZIFL:

Zinc-induced主持人

压缩：

ZRT，IRT-相关蛋白

锌:

锌

我们感谢Jin Xu博士（西双版纳热带植物园，中国科学院）为此手稿的批判性阅读。

这项工作得到了中国浙江省自然科学基金（No.Ly20C150002）和中国国家自然科学基金（No.31471937和31800201号）的支持。该资助者在研究设计，数据分析和解释以及稿件写作中没有作用，但只提供财政支持。

作者指出

1. Houqing曾和辛章同样为这项工作贡献。

隶属关系

1. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州311121

   Houqing曾

2. 农业与生物技术，人文，湖南科技大学，湖南娄底，417000中国学院

   鑫张

3. 南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京210095

   丁明，朱一勇

贡献

赫兹。和Y.Z.构思了研究并设计了实验。H.Z.，X.Z.和M.D。执行了实验。赫兹。和Y.Z.分析了数据并写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应于Houqing曾．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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