损伤诱导辣椒醇合成基因的转录可促进病原菌信号诱导的辣椒醇合成gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物受到各种形式的环境胁迫。病原体的渗透是最严重的环境危害之一。由组织损伤或草食造成的伤害也会影响植物的生长和繁殖。此外，伤害破坏了植物表面存在的物理屏障，增加了病原体入侵的风险。植物通过诱导各种反应来应对环境胁迫。这些胁迫反应必须严格控制，因为它们不必要的诱导对植物生长有害。在烟草中，WIPK和SIPK，两种伤口反应性丝裂原激活蛋白激酶，已被证明在调节伤口反应中发挥重要作用。然而，它们对下游伤口反应如基因表达的贡献尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

为了鉴定受WIPK和SIPK调控的基因，我们分析了WIPK/SIPK抑制植株的转录组。在WIPK/ sipk抑制植物中下调的基因中，最大的群体是那些参与产生抗微生物植物抗毒素的基因。辣椒醇是烟草中一种主要的植物抗毒素，几乎所有参与辣椒醇生物合成的基因都以WIPK/ sipk依赖性和非依赖性的方式被伤害诱导。5 -gydF4y2BaepigydF4y2Ba-马兜铃烯合成酶(EAS)是合成辣椒二醇的承诺酶，是辣椒二醇的启动子gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba是EAS家族的一员。报告基因分析表明，至少有两个40-50 bp长度的区域参与了该基因的激活gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba以及人工激活WIPK和SIPK。与capsidiol合成基因的转录本不同，EAS蛋白和capsidiol本身的积累不受损伤的诱导;然而，损伤显著增强了病原体衍生的激发子随后的诱导作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的结果表明，所谓的启动现象，因为诱导gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba只有在转录水平上才能看到伤口。通过诱导转录本，而不是蛋白质gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba如果病原体侵入伤口部位，植物可以迅速产生大量的capsidiol，而在伤口愈合过程中，当病原体无法进入时，植物可以将能量损失降到最低，避免capsidiol的细胞毒性作用。gydF4y2Ba

在自然界中，各种形式的环境胁迫影响植物的生长。病原微生物的侵染是最有害的胁迫之一，可导致被侵染植物死亡。机械组织损伤或食草性取食造成的伤害也会影响植物的生长。此外，环境压力的影响不是独立的，而是相互作用的。例如，伤害破坏了植物表面的物理屏障，增加了病原体入侵的风险。gydF4y2Ba

为了保护自己免受病原体的侵害，植物已经发展出多种防御机制，分为组成防御和诱导防御(参见[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba])。构成性防御包括预先积累的有毒化学物质和物理屏障，如表皮角质层和细胞壁。物理屏障限制了大多数微生物的入侵，但它们可以被病原体，特别是真菌病原体以及伤害破坏。诱导型防御通常被认为比组成型防御更强，但它们只有在植物识别病原体后才能发挥作用，因为诱导防御反应与能量消耗有关，其中一些防御反应不仅会损害病原体，还会损害植物本身。为了检测病原体，植物已经获得了至少两种系统来感知保守的或特定的病原体分子(参见[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba])。在第一个系统中，被称为微生物相关分子模式(MAMPs)的保守微生物分子被植物跨膜模式识别受体识别。在第二个系统中，特定的病原体效应物，也称为无毒蛋白，被植物抗性蛋白识别。一旦检测到病原体，植物就会以可诱导的防御方式做出反应，比如产生有毒化学物质，表达与防御相关的基因，通常还会出现局部细胞的快速死亡，这种反应被称为超敏反应。植物只有在识别病原体后，才能通过产生强大的防御机制来避免能量损失和组织损伤。gydF4y2Ba

植物抗菌素，低分子量抗菌化合物，是最著名的诱导防御之一(综述于[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba])。植物抗毒素的结构非常多样化，包括萜类、苯丙类、类黄酮和生物碱化合物，它们在健康组织中没有发现，但在对病原体和病原体衍生的激发子的反应中被诱导。烟草(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba)，主要的植物抗菌素是辣椒醇，一种双环二羟基倍半萜，而拟南芥(gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba) camalexin，一种吲哚类生物碱化合物，具有相同的作用。大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba)产生多种二萜类植物抗菌素以及类黄酮。一些植物抗毒素的生物合成途径已经被阐明。例如，辣椒醇是由二磷酸异戊烯基(IPP)产生的，IPP是所有类异戊二烯化合物的前体gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。IPP转化为法尼酯二磷酸(FPP)， FPP在5-作用下转化为辣椒二醇gydF4y2BaepigydF4y2Ba-马兜铃烯合成酶(EAS)和5-gydF4y2BaepigydF4y2Ba-马兜铃素1,3-二羟化酶(EAH)。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(HMGR)催化IPP生成的限速步骤(参见[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])，而EAS和EAH的功能是辣椒二醇生物合成所特有的。植物抗菌素的积累通常与编码其生物合成酶的基因的转录激活有关，调节植物抗菌素生物合成的信号通路越来越清晰。gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联，由三种相互作用的激酶，MAPK, MAPK激酶和MAPK激酶组成，将各种细胞外刺激转化为细胞内反应(综述于[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba])。越来越多的证据表明，MAPK级联控制植物抗毒素的产生。在拟南芥中，由MAPKKKα/MEKK1、MKK4/MKK5和MPK3/MPK6组成的MAPK级联调控病原体诱导的camalexin的生物合成[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在水稻中，由OsMKK4和OsMPK6组成的MAPK级联已被报道调节激发剂诱导的二萜类植物抗利素的积累[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。在烟草中，WIPK和SIPK(病原体和伤口响应的MAPKs)的激活诱导编码HMGR基因的表达[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。研究还表明，WIPK和SIPK是表达gydF4y2BaHMGR2gydF4y2Ba病原菌感染诱导gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

MAPK级联也被激活并在伤口反应中发挥重要作用。我们已经证明，伤口诱导的乙烯和茉莉酸(JA)的产生，调节伤口反应的植物激素，通过抑制WIPK和SIPK而减少[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。的gydF4y2Ban attenuata则gydF4y2Ba据报道，损伤诱导JA积累也需要MAPKs NaWIPK和NaSIPK [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。这些结果表明，WIPK和SIPK在介导创伤反应的植物激素的产生中起重要作用。然而，它们对下游伤口反应如基因表达的贡献尚不清楚。在本研究中，我们在WIPK/ sipk抑制植物的损伤叶片中寻找表达降低的基因。我们发现几乎所有参与辣椒醇生物合成的基因都以WIPK/ sipk依赖性和非依赖性的方式被损伤转录诱导。虽然损伤并没有增加capsidiol本身或EAS蛋白(capsidiol合成的承诺酶)的水平，但它启动了病原体来源信号诱导的后续capsidiol和EAS蛋白的合成，这表明损伤在转录水平上诱导capsidiol合成基因是一种预防性反应，以防止病原体在伤口部位可能的入侵。gydF4y2Ba

通过芯片分析鉴定WIPK/ sipk抑制植物中下调基因gydF4y2Ba

为了鉴定受WIPK和SIPK调控的基因表达，我们使用微阵列技术在WIPK/SIPK抑制植物的损伤叶片中寻找下调的转录本。在烟草中，乙烯释放水平和JA水平分别在伤后3 ~ 6 h和6 ~ 12 h达到峰值[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。因此，在叶片受伤后9 h提取总RNA，并进行芯片分析。在芯片上设置的43,759个寡核苷酸探针中，针对46个基因的59个探针显示，WIPK/ sipk抑制植株与对照植株相比减少了5倍以上(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表1)。NCBI数据库的BLASTX搜索(gydF4y2Bahttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgigydF4y2Ba)来预测目标基因的推测功能，并根据先前描述的分类的修改形式将它们分为14类[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。大约一半的目标基因是参与次级代谢的基因。第二大和第三大类别分别是“未知”和“信号转导”。被纳入“信号转导”范畴的5个基因是WIPK、SIPK和ntl4, ntl4是在WIPK/SIPK抑制植物中表达被抑制的SIPK的同源基因[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。其余类别包含的基因较少，且预测功能各不相同，说明WIPK和SIPK主要调控与次生代谢相关的基因表达。gydF4y2Ba

在被分类为次级代谢的20个基因中，预计有15个参与植物抗毒素合成(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。辣椒二醇是烟草中的一种主要的植物抗毒素，它是通过EAS和EAH从FPP中产生的，FPP是许多代谢物(如甾醇、倍半萜、三萜和泛醌)的生物合成的中间体，也是蛋白质法酰化的底物(参见[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。许多编码EAS、EAH及其同系物的基因被包括在列表中(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。为了检查微阵列分析的再现性，转录物水平gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba和gydF4y2BaEAHgydF4y2Ba通过逆转录-定量PCR (RT-qPCR)分析受伤后一段时间内的情况。的表达gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba和gydF4y2BaEAHgydF4y2Ba在受伤后9-12小时达到峰值，并且在WIPK/ sipk抑制的植物中，它们的转录水平降低(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).相比之下，gydF4y2Ba角鲨烯合成酶gydF4y2BaWIPK和SIPK的沉默对另一种利用FPP作为底物的酶没有显著影响，尽管它也受到损伤的中度诱导。gydF4y2Ba

WIPK和SIPK调节创伤诱导的几乎所有参与辣椒二醇合成的基因的表达gydF4y2Ba

东亚峰会gydF4y2Ba和gydF4y2BaEAHgydF4y2Ba受损伤诱导，受WIPK和SIPK调控;因此，我们研究了其他参与辣椒二醇合成的基因是否受到WIPK和SIPK的调控，以及它们是否受到损伤的诱导。IPP是FPP的前体，通过六种酶的作用通过甲羟酸途径产生，IPP通过IPP异构酶(IDI)和FPP合成酶(FPS)转化为FPP(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。对编码任意一种酶的11个基因的转录本分析显示，除gydF4y2BaFPS2gydF4y2Ba明显是由伤害引起的(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).在WIPK/ sipk抑制的植物中，除gydF4y2BaHMGR1gydF4y2Ba和gydF4y2BaFPS2gydF4y2Ba在实验中至少有一个时间点显著下降。值得注意的是，没有基因在损伤后3小时表现出WIPK/SIPK依赖性，尽管此时大约有一半的基因已经被损伤诱导。此外，当酶由两个同源基因(AACT、HMGR和FPS)编码时，两个基因中只有一个表现出明显的WIPK/ sipk依赖性。在另一株WIPK/ sipk抑制的植物中也得到了类似的结果，排除了这种影响是由引入转化载体引起的可能性(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S2)。这些结果表明，辣椒醇合成基因的损伤诱导是通过WIPK/SIPK依赖性和非依赖性两种方式介导的，表明WIPK和SIPK在相对较晚的时间点调控了特定基因家族成员的表达。gydF4y2Ba

IPP和二甲基丙烯基二磷酸是FPP的直接前体，它们不仅在甲羟戊酸途径中产生，而且在质体中存在的所谓的2- c -甲基- d -赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径中产生(参见[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。虽然人们基本上认为这两种途径是独立起作用的，但一些报告表明，这两种途径之间存在相互联系[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。因此，我们研究了编码MEP通路7种酶中的任何一种的8个基因的转录水平(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S3)。gydF4y2BaIDI1gydF4y2Ba被认为参与了IPP和MEP途径产生的二甲基烯丙基二磷酸之间的转化，因为它编码了一种带有假定的质体转运肽的蛋白质(AB049815)。因此，转录水平gydF4y2BaIDI1gydF4y2Ba也进行了调查。与甲羟戊酸途径的基因相反，所有基因对伤害都没有或非常弱的反应，除了gydF4y2BaIDI1gydF4y2Ba显示WIPK/SIPK依赖性。gydF4y2Ba

WIPK和SIPK都是最大限度诱导辣椒二醇合成基因所必需的gydF4y2Ba

为了研究WIPK或SIPK中哪一个是伤口诱导的辣椒醇合成基因表达所必需的，我们对WIPK或SIPK抑制的植物中这些基因的转录水平进行了量化(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.虽然沉默SIPK比沉默WIPK更能降低这些基因的转录水平，但单次沉默WIPK或SIPK都能降低大多数基因的转录水平。这些结果表明WIPK和SIPK是协同调控辣椒二醇合成基因的表达，而不是冗余调控。gydF4y2Ba

的启动子分析gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba

EAS是一种用于辣椒二醇生产的酶gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba的成员gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba基因家族受各种应激形式的强烈诱导，其启动子对病原体衍生的激发子的反应已被研究[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。因此,gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba作为辣椒醇合成基因的代表，对其启动子进行分析，阐明辣椒醇合成基因是如何被损伤诱导的，以及WIPK和SIPK是如何调控辣椒醇合成基因的。根据数据库信息设计引物，引物长度约为1.1 kbpgydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba克隆了编号为1126p的启动子区域(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA). 1126p包含许多与应力响应相似的序列元素gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-元素，而是介导激活的元素gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba激发子的启动子尚未确定。的唯一功能元素gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子是TAC-box。它被认为是一种消音器或抑制物，因为在TAC-box中引入突变增加了该基因的活性gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

为了分析gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子活性，我们用了gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba-介导的瞬时表达gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba携带gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子融合到gydF4y2Baβ葡萄糖醛酸酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba)作为报告者(EAS4p-GUS)与携带gydF4y2Ba荧光素酶gydF4y2Ba（gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba)由…驱动gydF4y2Ba花椰菜花叶病毒gydF4y2Ba35S启动子(35Sp-LUC)作为内控的gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba感染，然后渗透到树叶中。转录水平gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba,gydF4y2BaNbactin2gydF4y2BaRT-qPCR检测gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba转录本被双重归一化为gydF4y2BaNbactin2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba。我们首先确认1126p是通过损伤激活的。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB、成绩单水平gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba在1126p的驱动下，受伤增加约200倍，反映出受伤诱导约170倍gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba烟草转录本(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).相比之下，gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba在35S启动子的驱动下，不因损伤而增加。接着，连续的5 ' -缺失gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子编号为567p(−567)、160p(−160)、63p(−63)和33p(−33)gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba确定调节启动子伤口反应的区域。删除到- 160大大降低了启动子的活性，但它仍然被超过20倍的损伤激活(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).进一步删除至- 63，使启动子的损伤激活最小化，这表明- 160至- 64区域对损伤激活很重要gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子。启动子片段63p和33p仍然增加了转录物水平gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba轻微的伤害反应。然而，它被认为是一个实验伪影，因为它的5 ' -未翻译区(UTR)gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba和35S最小启动子也显示了与63p和33p相似的结果(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad、附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2Ba

为了进一步描绘负责伤口诱导激活的区域，我们创建了160p、115p(- 115)和160pΔ的两个缺失构建体。内部删除构造160pΔ缺少从−115到−64的区域。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC，这两个结构体几乎不被损伤激活，这表明- 160到- 116和- 115到- 64这两个区域都需要伤口诱导的160p激活。使用功能增益分析进一步证实了- 160至- 116和- 115至- 64区域的重要性，而不是- 63至- 34区域的重要性。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad，−160 ~−116和−115 ~−64区域的4个串联重复，而−63 ~−34区域则没有，对35S最小启动子具有较强的损伤反应活性。gydF4y2Ba

的启动子的突变分析gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba

为了确定- 160至- 64区域的调控元件，在160p (m1-m10)中引入了10-bp的替换，图2。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa). M2、M4、M5、M7和M8区域的替代显著减少gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba损伤诱导的转录物水平(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).相比之下，M1、M9或M10的代换率升高gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba损伤诱导的转录物水平。在没有受伤的情况下，所有的替换都没有影响gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba转录水平。这些结果提示多重创伤反应gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-元素存在于−150至−81度的区域gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子被MEK2激活gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba是WIPK和SIPK的活化剂gydF4y2Ba

功能丧失和功能获得分析确定了该区域gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子是通过损伤激活所必需和充分的启动子(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，但目前尚不清楚激活是否由WIPK和SIPK介导。为了特异性地诱导WIPK和SIPK的激活，我们使用了MEK2gydF4y2Ba^DDgydF4y2BaMEK2的组成活性形式。MEK2是WIPK和SIPK的上游MAPK激酶，它直接磷酸化并激活它们[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。不出所料，MEK2的表达gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba激活了gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子，虽然被MEK2激活gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba弱于损伤(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).这些结果支持gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子可通过WIPK/ sipk依赖性和非依赖性机制激活。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子在−410 ~−310区域包含两个w盒状序列(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). W-box是WRKY转录因子识别的序列，最近的报道表明，WIPK和SIPK及其在其他植物物种中的同源物可磷酸化WRKY转录因子并增强其功能[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。这些证据促使我们研究w盒样序列在MEK2中的作用gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba-诱导的活化gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子。量化的gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba转录本水平由一系列的5 ' -缺失驱动gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子表明，W-box-like序列对于MEK2的激活是必不可少的gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba的gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba160p是MEK2激活所需的最短片段gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).然而，MEK2激活160pgydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba太弱了，不能下结论;因此，进行了功能增益分析。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab，在−160 ~−116和−115 ~−64区域串联重复，但在−63 ~−34区域不重复MEK2gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba- 35S最小启动子的响应活性。此外，从−410到−311的串联重复序列，包含两个W-box-like序列，被MEK2激活gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba。这些结果表明，大脑的多个区域gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子参与WIPK和SIPK的激活。gydF4y2Ba

伤口诱导的辣椒二醇合成基因表达的生理作用gydF4y2Ba

研究表明，大多数辣椒醇合成基因都是通过WIPK/ sipk依赖性和非依赖性机制，以及多个区域的损伤来转录诱导的gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子通过损伤参与其激活(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.这些结果表明，损伤诱导辣椒二醇合成基因的重要性。然而，据我们所知，没有报告表明辣椒二醇的积累是由损伤引起的(类似于大多数植物抗毒素)。我们测定了伤烟叶中辣椒醇的含量，但含量低于检测限。同样，据报道，EAS蛋白的积累是由病原体衍生的激发子诱导的，但很少是由烟草叶片中的伤害诱导的[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。我们也证实了EAS蛋白的积累是由INF1诱导的，INF1是由gydF4y2Ba5种gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，但不是通过伤害(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

由于损伤破坏了叶片表面的物理屏障，并在伤口部位引起病原体入侵的风险，因此在伤口愈合过程中激活伤口部位的辣椒醇生物合成是合理的。然而，生产辣椒二醇需要消耗能量，而且包括辣椒二醇在内的植物抗毒素不仅对病原体有毒，而且对植物本身也有毒[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。因此，如果病原体在伤口愈合过程中没有进入植物，辣椒醇的产生会导致能量损失和对植物组织的不必要损害。这些证据表明，通过损伤诱导的转录物水平，而不是蛋白质水平gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba是一种预防性反应，防止可能的病原体入侵伤口部位。当病原体进入伤口时，植物可以快速合成EAS蛋白，从而导致capsidiol的快速产生，而当病原体不存在时，植物可以最大限度地减少能量损失，避免capsidiol对细胞的伤害。为了验证这一假设，我们研究了损伤前是否会增加INF1诱导的EAS蛋白和capsidiol水平。gydF4y2Ba

在初步实验中，我们发现在技术上很难将INF1溶液渗透到叶盘损伤部位。因此，试验了两种不同的方法来缠绕叶片。第一种方法是用10 μl的针尖在叶片上刺出小孔(孔法)。另一种方法是用钳子用力捏碎茶叶(粉碎法)。两种方法均能明显诱导gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S5)，而挤压法损伤组织中，INF1溶液相对容易浸润，而孔法则不容易浸润。因此，采用压碎法伤叶，伤后9 h INF1渗入伤区，此时积累gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba转录峰(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab，正如预期的那样，损伤前INF1诱导的EAS蛋白水平升高。同样，inf1诱导的capsidiol的产生通过预损伤而增强(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).在INF1处理后6小时和7.5小时，预伤后的辣椒醇水平大约增加了一倍。损伤前的作用在损伤后9小时变得不那么明显，这可能是由于INF1的转录激活gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba和其他辣椒二醇合成基因。gydF4y2Ba

在这里，我们发现几乎所有参与辣椒二醇合成的基因的表达水平都以WIPK/ sipk依赖性和非依赖性的方式被损伤诱导(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.虽然WIPK和SIPK具有很高的序列同源性和上游的MAPK激酶，但它们可能是合作起作用的，但不是冗余的，因为WIPK或SIPK的抑制减少了辣椒二醇合成基因的诱导(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.拟南芥中WIPK和SIPK的同源植物MPK3和MPK6对乙烯和camalexin合成的调控也有类似的结果[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。在WIPK/ sipk抑制的植物中，辣椒二醇合成基因的诱导减少，但没有丧失;特别是在早期时间点，WIPK/ sipk抑制的影响可以忽略不计(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.此外，激活gydF4y2BaEAS4gydF4y2BaMEK2启动子gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba的作用要弱得多，尽管MEK2gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba伤害目标是类似的区域gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.这些结果表明，mapk通路和其他信号通路共同介导了辣椒醇合成基因的损伤诱导。这种信号通路的一个候选是由Ca组成的通路gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}调节激酶。在水稻培养细胞中，通过RNA干扰抑制gydF4y2BaOsCIPK14gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsCIPK15gydF4y2Ba， 2 CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-调节的激酶，部分地减少了植物抗毒素的积累及其由病原体衍生的激发子诱导的生物合成基因的表达[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。Ca的参与gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-调节激酶的激活gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba促进剂应该是未来分析的主题。在WIPK/ sipk抑制的植物中，乙烯的释放和损伤诱导的JA积累减少[j]。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。因为gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba茉莉酸甲酯是茉莉酸的一种甲酯形式[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba的表达gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba和gydF4y2BaEAHgydF4y2Ba是乙烯处理诱发的吗gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba［gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]， WIPK和SIPK可能诱导gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba，gydF4y2BaEAHgydF4y2Ba可能还有其他通过乙烯生物合成的辣椒醇合成基因。值得注意的是，MPK3和MPK6同时调控乙烯和camalexin(一种吲哚型植物抗毒素)的生物合成，但camalexin的产生及其生物合成基因的表达不依赖于乙烯[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。这些结果表明，MAPKs通过不同的机制调节不同类型植物抗毒素的产生。与capsidiol合成基因相比，伤口诱导的gydF4y2BaSQSgydF4y2Ba受WIPK和SIPK沉默的影响不显著(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).最近的一项报道表明，WRKY转录因子WsWRKY1直接结合到的启动子上gydF4y2BaSQSgydF4y2Ba激活了它的转录gydF4y2BaWithania somniferagydF4y2Ba［gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。有趣的是，WsWRKY1激活的不仅仅是gydF4y2BaSQSgydF4y2Ba还有甲羟戊酸途径基因，比如gydF4y2BaHMGRgydF4y2Ba。WsWRKY1的烟草同源物可能参与了创伤诱导的gydF4y2BaSQSgydF4y2BaWIPK/ sipk抑制植物中的辣椒醇合成基因。gydF4y2Ba

报告基因分析显示160p是应答损伤的最小启动子(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab). 160p的缺失和突变分析表明，从- 150到- 81的整个区域对启动子活性至关重要(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.相比之下，使用四个串联重复序列(- 160至- 116和- 115至- 64)进行的功能增益分析显示，35S最小启动子具有很强的伤口响应性。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad). MEK2分析gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba的响应性gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子显示了类似的结果(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.对于这种差异，我们还没有明确的解释，但一种可能性是，一种调节伤口诱导表达的转录因子gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba可能需要至少两个结合位点才能在启动子上形成稳定的复合物。支持这一假设的是，- 149至- 140和- 96至- 87区域的核苷酸序列在相反的方向上彼此相似(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S6)。我们试图用从受伤叶片中提取的几个标记有生物素和核蛋白的160p片段，通过电泳迁移位移试验来检测这种转录因子，但没有观察到与受伤激活相对应的条带移位。Newman等。[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]也未能检测到介导激活的转录因子gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba使用病原体衍生的启动子的启动子。在−150 ~−81区，无伤口反应gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-元素预测，但在- 94至- 89区域存在E-box (CANNTG)基序。E-box序列被bhlh型转录因子识别，参与对盐胁迫等环境胁迫的响应[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。此外，乙烯信号被认为在inf1诱导的gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba［gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，许多转录因子如乙烯反应因子(ERF)在乙烯信号的下游发挥作用。最近，研究表明，erf2样蛋白，一种erf样蛋白，直接结合并激活gydF4y2BaNaEAS12gydF4y2Ba，是EAS家族的一员gydF4y2Ban .减弱gydF4y2Ba［gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。我们的微阵列分析也显示gydF4y2BaERF-likegydF4y2Ba在WIPK/ sipk抑制的植物中减少(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。对这些转录因子的研究应该是未来分析的一个主题。gydF4y2Ba

与直接处理INF1相比，叶片受伤后处理INF1增加了EAS蛋白和辣椒醇的产量(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.这一结果表明，仅在转录水平上通过损伤诱导辣椒二醇合成基因可能是一种启动现象。在伤口愈合过程中，在没有病原体攻击的情况下，启动不仅可以更快、更强地产生capsidiol来对抗入侵伤口的病原体，还可以最大限度地减少capsidiol的能量损失和损伤。值得注意的是，Chassot等。[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba报道称，拟南芥通过伤害引发camalexin的产生是由一种独特的机制诱导的。结果表明，损伤几乎不诱导camalexin合成基因的表达，相反，损伤可以促进camalexin合成基因的表达和诱导camalexin的产生gydF4y2Ba葡萄孢菌gydF4y2Ba。这些结果表明，不同类型的植物抗毒素的启动机制不同。此外，我们发现细菌MAMP鞭毛蛋白的一个表位flg22 [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，也诱导了积累gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba但几乎不影响EAS蛋白或辣椒醇水平。包括flg22在内的MAMPs在许多微生物中都很常见;因此，如果植物为了响应MAMPs而产生了辣椒醇，那么辣椒醇的产生不仅会受到病原体的诱导，还会受到非致病微生物和有益微生物的诱导，从而可能对植物产生不利和有害的影响。与伤害的情况类似，植物可能会通过诱导辣椒二醇合成基因的转录本而不是蛋白质来提防未知的微生物，这样可以最大限度地减少能量损失，并避免当微生物不是病原体时辣椒二醇的细胞毒性作用。目前，尚不清楚其他的辣椒醇合成基因是否以类似的方式受到调控gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba。植物抗毒素合成酶的调控几乎完全是在转录水平上研究的;然而，一些报道表明它们也在转录后水平受到调节。在马铃薯块茎用病原体衍生的激发子处理，转录水平gydF4y2Bahmg2gydF4y2Ba和gydF4y2Bahmg3gydF4y2Ba即使在HMGR活性恢复到基础水平后，编码HMGR仍保持高水平[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。在马铃薯和燕麦中，不亲和和亲和病原菌对植物抗毒素合成基因的表达水平均有相似的诱导作用;然而，高水平的植物抗毒素是由不相容的种族特异性诱导的[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。此外，Keller等人。[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba报道称，EAS活性不一定限制辣椒二醇的生产。这些线索的证据表明，转录后调控辣椒二醇合成的基因除了gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba可能在调控辣椒二醇的产生中起重要作用。gydF4y2Ba

控制翻译的机制gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba目前还没有记录。先前的研究表明，大多数控制特定转录本翻译的元件位于转录本的5 '和3 ' - utr内[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。Xu等。[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]报道，在5 ' -UTR中，一个主要由嘌呤组成的r基序提高了模式触发免疫相关基因的翻译效率。相比之下，有报道称乙烯诱导的翻译调节gydF4y2BaEBF2gydF4y2Ba是乙烯信号的负调节因子，由其3 ' -UTR介导[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。调节更广泛的非特异性转录物翻译的机制也存在。Ohtsu等。[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba报道说，沉默gydF4y2BaNbNup75gydF4y2Ba编码核孔蛋白核孔蛋白75的基因增加了polyA RNA的核积累。的utr是否为gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba和核孔蛋白介导的mRNA转运参与了gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba记录。通过阐明翻译调控的潜在机制gydF4y2Ba东亚峰会gydF4y2Ba转录本，我们将了解植物如何快速产生抗病原体的辣椒醇，同时最大限度地减少能量损失并避免由辣椒醇生产造成的损害。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们认为仅在转录水平上通过损伤诱导辣椒二醇合成基因是一种所谓的启动现象。通过在伤口部位诱导capsidiol合成基因的转录本，而不是蛋白质，当病原体侵入伤口部位时，植物可以迅速产生大量的capsidiol，而植物可以最大限度地减少能量损失，避免在伤口愈合过程中病原体无法进入的capsidiol的细胞毒性作用。gydF4y2Ba

在大多数研究中，植物对病原体和伤害的反应是分开研究的。然而，病原菌感染和损伤的作用不是相互独立的，而是相互作用的;伤害破坏了存在于植物表面的物理屏障，增加了病原体入侵的风险。因此，植物已经进化出复杂的机制来应对伤害和病原体感染的相互作用。本文报道的研究结果有助于我们对这种植物防御机制的理解。gydF4y2Ba

植物材料和植物生长条件gydF4y2Ba

烟草(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba)品种Samsun NN含有gydF4y2BaNgydF4y2Ba基因和gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba被使用。它们的种子最初是从日本烟草烟叶研究中心获得的。一代gydF4y2BaSIPKgydF4y2Ba-，gydF4y2BaWIPKgydF4y2Ba- - - - - -,gydF4y2BaWIPKgydF4y2Ba- - - - - - -gydF4y2BaSIPKgydF4y2Ba-沉默的烟草植物以前曾被描述过[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。植物在含有蛭石的花盆中生长，在25°C的室内保持16小时的光照。5 - 6周大的烟草和烟草植物的完全展开的叶子gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba用于实验。gydF4y2Ba

受伤的治疗gydF4y2Ba

除非另有说明，否则使用直径为10毫米的软木钻从叶片上切除椎间盘进行损伤处理。将叶盘浮于水面，25℃孵育。在无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在美国，树叶被另外两种方法击伤。第一种方法是用10 μl的针尖在与植物体相连的叶片上每1 cm直径的圆上刺出1 ~ 4个小孔。另一种方法是用钳子用力捏碎与植物体相连的叶子。gydF4y2Ba

INF1的制备和治疗gydF4y2Ba

按照前面的描述制备INF1重组蛋白[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。用无针注射器将25 nM的INF1溶液浸润到叶片的细胞间隙中。为了打开气孔，在INF1渗入前，将植物暴露在高湿的光照下约30分钟。gydF4y2Ba

RNA提取，微阵列分析，RT-qPCR分析gydF4y2Ba

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific, USA)提取总RNA。如前所述进行微阵列分析[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。分析只进行了一次，数据已存储在GEO存储库中，登录代码为GSE133681。WIPK/ sipk抑制植物中下调转录本的推测功能如先前所述[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，并根据先前描述的分类的修改形式分为14类[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

采用SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒II (Takara, Japan)进行RT-qPCR分析。每个感兴趣基因的相对表达量计算为2gydF4y2Ba^{−(gydF4y2Ba感兴趣的CTgenegydF4y2Ba−gydF4y2BaCTreferencegydF4y2Ba）gydF4y2Ba}。gydF4y2BaActin2gydF4y2Ba和gydF4y2BaNbactin2gydF4y2Ba作为内参基因。它们是从三个候选基因中选择的，其中两个编码肌动蛋白，一个编码甘油醛3-磷酸脱氢酶[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。引物对在附加文件中列出gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S3。gydF4y2Ba

EAS4启动子的克隆及质粒的构建gydF4y2Ba

引物是根据数据库中的信息设计的[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。的gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba以健康烟叶基因组DNA为模板，用引物PCR扩增启动子片段。gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba含有- 1126至+ 67(开始密码子前)的启动子片段通过PCR扩增gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII和gydF4y2BaBamgydF4y2BaHI位点分别附着在5′和3′端，克隆到pBluescript II SK (+) (X52328)的相应位点上。用引物构建5 ' -缺失结构gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII位点在它们的5 '端。利用KOD - plus - Mutagenesis Kit (Toyobo, Japan)通过反向PCR引入内部缺失和碱基替换。引物对用于基因的删除和替换gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子列在附加文件中gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S3。gydF4y2Ba

准备串联重复结构，子集gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba用PCR扩增启动子片段gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII -gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2BaI位点分别附着在5 '和3 '端，克隆到gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII和gydF4y2BaXhogydF4y2BapBluescript II的1个位点SK(+)，生成pBS2-gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII -gydF4y2Ba萨尔gydF4y2BaI-EAS4启动子片段gydF4y2BaXhogydF4y2Ba1 .启动子片段作为agydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII -gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我从结构中分离出来，克隆到gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII -gydF4y2Ba萨尔gydF4y2BaI个相同结构的位点，导致启动子片段的两个串联重复。启动子片段的四个串联重复序列类似地产生。−46gydF4y2Ba花椰菜花叶病毒gydF4y2Ba35S最小启动子[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]用gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我和gydF4y2BaBamgydF4y2BaHI位点分别附着在5 '和3 '端，并与4个串联重复序列融合gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba启动子片段使用gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我的网站。gydF4y2Ba

启动子片段gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII和gydF4y2BaBamgydF4y2Ba分别连接在5 '端和3 '端的HI位点被克隆到pBE2113-GUS载体的相应位点上[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]取代35S启动子，使启动子片段与gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba。pBE2113-LUC和pBE2113-MEK2的构建gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba之前已经描述过[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的预测gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba元素gydF4y2Ba

独联体gydF4y2Ba-元素存在于gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba使用PLACE (gydF4y2Bahttps://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplacegydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]、PlantCARE (gydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]和PlantProm (gydF4y2Bahttp://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=plantprom&group=data&subgroup=plantpromgydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

启动子活性分析gydF4y2Ba

改造、培养和准备gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba(菌株GV3101)细胞按先前描述的方法进行处理[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba细胞(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.1)承载gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba由各自驱动的启动子分别作为报告子与携带pBE2113-LUC的作为对照gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba侵染(GUS: LUC = 9:1)，然后侵染到叶片中gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba。在25°C下孵育40-48小时后，用直径10毫米的软木钻从叶子上切除叶盘。将叶盘浮于水面，进一步孵育12小时。从叶片中提取总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, Japan)进行DNase处理后转化为cDNA。排除累积的转录本gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba细胞，用oligo-dT引物进行反转录。转录水平gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba,gydF4y2BaNbactin2gydF4y2Ba用qPCR法定量gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba转录本被双归一化为gydF4y2BaNbactin2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的表达式gydF4y2BaMEK2gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba，gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba细胞(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.1)表示gydF4y2Ba格斯gydF4y2Ba与携带pBE2113-LUC和携带pBE2113-MEK2gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba(gus: luc: me2gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba= 8:1: 1)，然后渗透到gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba。25℃孵育48 h后，提取总RNA，用于RT-qPCR分析。gydF4y2Ba

抗eas抗体的制备和纯化gydF4y2Ba

合成EAS4蛋白残基130 ~ 139对应的肽QDENGKFKES，通过在肽的n端引入一个Cys残基，将其偶联到keyhole帽贝血色素载体上。兔制备多克隆抗血清。抗体的纯化步骤如下。的编码序列gydF4y2BaEAS4gydF4y2Ba用PCR扩增gydF4y2Ba以区域gydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2BaI位点分别附着在5 '端和3 '端，并克隆到pET28a载体(Merck, Germany)的相应位点上，从而产生c端HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-标记EAS4 (EAS4- his)。生成的构造用于转换gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株Rosetta2(DE3) (Merck, Germany)。重组蛋白在20°C下加入0.1 mM IPTG过夜诱导表达，并用1ml HisTrap HP色谱柱(GE Healthcare, USA)按照制造商的建议纯化。按照制造商的建议，纯化的EAS4-His蛋白(~ 3mg)偶联到1ml HiTrap nhs激活的HP柱(GE Healthcare, USA)。抗eas抗血清涂于柱上，用缓冲液(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1m NaCl, 1% Triton X-100)广泛洗涤。结合抗体用0.1 M甘氨酸-盐酸，pH 2.5洗脱，立即中和，并用Amicon Ultra-4(默克，德国)浓缩。gydF4y2Ba

蛋白提取和免疫印迹分析gydF4y2Ba

将烟叶中的蛋白质提取物用5体积缓冲液[50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM DTT和Complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science)]研磨制备。上清液在21500 ×离心下清清gydF4y2BaggydF4y2Ba用Bio-Rad蛋白检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories, USA)测定蛋白提取物的浓度，以牛γ -球蛋白为标准。gydF4y2Ba

为了进行免疫印迹分析，蛋白质通过SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜(默克，德国)。用5%脱脂干牛奶阻断后，用Western BLoT Immuno Booster (Takara, Japan)稀释的0.1 μg/ml抗eas抗体在4°C下探针过夜。洗涤后，将膜与用1%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1小时。使用Western BLoT hyperhrp Substrate (Takara, Japan)观察抗原-抗体复合物。gydF4y2Ba

Capsidiol测量gydF4y2Ba

辣椒二醇的提取和定量方法如前所述[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

支持本研究结果的微阵列数据已存储在GEO数据库中，登录代码为GSE133681。本研究中使用和/或分析的其他数据集可根据通讯作者的合理要求提供。gydF4y2Ba

EAH:gydF4y2Ba

5 -gydF4y2BaepigydF4y2Ba3-dihydroxylase -aristolochene 1日gydF4y2Ba

东亚峰会:gydF4y2Ba

5 -gydF4y2BaepigydF4y2Ba-aristolochene合酶gydF4y2Ba

小块土地:gydF4y2Ba

乙烯响应系数gydF4y2Ba

FPP:gydF4y2Ba

通过二磷酸gydF4y2Ba

帧:gydF4y2Ba

FPP合酶gydF4y2Ba

格斯:gydF4y2Ba

β葡萄糖醛酸酶gydF4y2Ba

HMGR:gydF4y2Ba

3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA还原酶gydF4y2Ba

伊迪:gydF4y2Ba

IPP异构酶gydF4y2Ba

IPP:gydF4y2Ba

Isopentenyl二磷酸gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

卢克:gydF4y2Ba

荧光素酶gydF4y2Ba

MAMP:gydF4y2Ba

微生物相关的分子模式gydF4y2Ba

MAPK:gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶gydF4y2Ba

议员:gydF4y2Ba

2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphategydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

逆转录定量PCRgydF4y2Ba

SQS:gydF4y2Ba

角鲨烯合酶gydF4y2Ba

UTR:gydF4y2Ba

翻译区gydF4y2Ba

作者感谢sophia Kamoun提供pFB53载体，Ichiro Mitsuhara提供pBE2113-GUS、pBE2113-LUC和pBE2113-MEK2载体gydF4y2Ba^DDgydF4y2Ba载体和Shigemi SeogydF4y2BaSIPKgydF4y2Ba-，gydF4y2BaWIPKgydF4y2Ba- - - - - -,gydF4y2BaWIPKgydF4y2Ba- - - - - - -gydF4y2BaSIPKgydF4y2Ba-沉默的烟草植物。我们还要感谢吉冈博文、保坂武、下佐藤武和齐藤克春提供的技术和统计援助。gydF4y2Ba

本研究得到了日本科学促进会KAKENHI的支持[资助号:21880020,23688005,17 K07665 to S.K.];日本文部科学省[终身教职制度推广计划(对韩国)]。资助机构不参与研究设计、收集、分析、解释数据或撰写手稿。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 小岛朋也和浅仓信英对这项工作也做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 信州大学农学院，日本长野399-4598gydF4y2Ba

   小岛朋也，浅仓信英，长谷川，平泽太时，加头新平gydF4y2Ba

2. 名古屋大学生物农业科学研究生院，名古屋，爱知县，464-8601gydF4y2Ba

   美津浓和武本大吾gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SK公司构思并设计了这项研究。SK、TK、NA、SH、TH、YM进行实验。SK、TK、NA、SH、TH、DT分析数据。SK和DT撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaShinpei KatougydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您要适当地注明原作者和来源，提供到知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了修改。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

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