种间F .的高密度遗传图谱构建及叶片性状和植株生长的QTL定位₁人口梓文艺×梓duclouxiiDode

背景

梓文艺是中国重要的木材树种，因经济和观赏用途而广泛栽培。的高密度链接图c .文艺将是一种有效的工具，不仅可以识别影响重要性状(如植物生长和叶片性状)的关键数量性状位点(qtl)，而且还可以用于其他遗传研究。

结果

限制性内切位点相关DNA测序(RAD-seq)用于识别分子标记并构建遗传图谱。测序后获得了大约280.77 Gb的干净数据，总共在200个a . a .个体的基因组中初步鉴定出25614295个单核苷酸多态性(SNPs)和2871647个插入-缺失(InDels)c .文艺(7080)×梓duclouxii(16-PJ-3) F₁人口和他们的父母。最终获得9072个符合构建遗传图谱要求的SNP和521个InDel标记。综合遗传图谱包含20个连锁群的9593个多形性标记，全长3151.63 cM，相邻标记间平均距离为0.32 cM。采用包涵复合区间作图(ICIM)方法鉴定了7个叶片性状的20个qtl和5个时间点株高的13个qtl。Q16-60被鉴定为5个叶片性状的QTL, 3个与植物生长相关的显著QTL (Q9-1、Q18-66和Q18-73)被检测到至少2个。基因组注释表明，有一个细胞周期蛋白基因参与了叶片性状的发育c .文艺可能受到CDC48C和与植物激素合成相关基因的影响。

结论

这是第一个在c .文艺为进一步的遗传研究、分子标记辅助育种和基因组组装提供了有用的工具。

梓文艺(2n = 2 × =40)属木本植物梓，牛蒡科[1]，是一种重要的观赏树种，因其花朵美丽，茎直，对颗粒物的去除效率适中，在中国中北部城市森林中广泛使用[2，3.］．c .文艺原产于中国，目前主要分布在中国。据记载，中国古代的人们就开始了耕种和利用c .文艺早在汉代(公元前202年至公元220年)[4］．除了在景观美化方面的价值，c .文艺具有优良机械性能和高耐久性的木材，可以抵抗微生物和昆虫造成的腐蚀。中国古代常用于制作棺材、乐器、船只等高档木制品[5，6，7，8］．即使在今天，它仍然是高档家具制作和房屋装饰的流行材料。为了满足中国对木材供应和城市绿化的巨大需求，人们一直在努力c .文艺以经济和生态为目的的杂交[9，10］．然而，由于缺乏目标性状的遗传信息，目前还无法制定高效的育种策略c .文艺比种植农作物难多了。

作为c .文艺是一种木材和城市森林树木，其生长性状是其最重要的经济性状，最近的研究表明，叶片性状如叶面积(LA)、叶柄长度(PL)和其他性状与它从空气中捕获颗粒的能力有关[11］．这些性状是复杂的数量性状，可能由多种因素决定，包括细胞分裂和扩张、物候和光合作用效率[12］．了解数量性状位点(qtl)有助于揭示这些重要性状的遗传结构。

遗传作图是用于识别qtl和调节复杂但重要性状(如植物生长)的基因的主要方法之一[12]，开花时间[13]和非生物抗逆性[14，15]，用于植物育种。森林研究中的遗传作图大多采用F₁由于树木的寿命长，体型大，建立遗传图谱群体通常需要大面积的土地和长时间的土地使用，这使得遗传图谱在多年生森林物种中的应用远不如一年生作物中常见。尽管群体构建存在困难，但有限的研究表明，连锁图谱仍然是解剖森林物种复杂数量性状的有力工具。例如，Xia et al.利用F . qtl构建的遗传图谱识别了9个调控叶片形状的qtl和候选基因₁人口摘要×杨树simonii卡尔(16］．Du等人利用连锁分析和关联研究揭示了杨树生长性状的遗传结构[17］．其他性状，如萌芽时机[18]、木质素含量[19]、与繁殖有关的性状[20.]，以及与水果有关的特征[21，22]，也在森林物种和其他木本植物中进行了基于连锁的QTL定位。根据QTL研究，遗传作图仍然是研究遗传特征最有效的方法之一。此外，遗传图谱也是基于图谱的克隆和其他遗传分析的基础[23，24］．

遗传图谱是根据基因组中分子标记之间的连锁关系构建的，包括随机扩增多态性DNA (RAPD) [25，26]，扩增片段长度多态性(AFLPs) [26，27，28]，简单序列重复(SSRs) [26，28，29，30.]，序列相关扩增多态性(srap) [31]、单核苷酸多态性[32，和插入-删除(InDels) [33］．在这些类型的标记中，snp和indel被认为是潜在的应用分子标记[34］．目前，新一代测序(NGS)技术，如全基因组重测序和减少表达基因组测序(RRGS)，促进了SNP和InDel标记的鉴定，以及利用整个植物基因组的分子标记构建高密度遗传图谱[35］．限制性内切位点相关DNA测序(RAD-seq)是一种RRGS方法，已有效应用于木本植物重要性状的高通量分子标记发现和QTL定位[36，37，38］．因此，构造ac .文艺使用RAD-seq的高密度遗传图谱不仅有助于遗传研究标记的开发，而且有助于加速育种过程c .文艺；然而，这种工作尚未得到报道。

在这项研究中，F₁由两个分离出的种群梓品种,即c .文艺“7080”(女性父母)和梓duclouxii生成“16-PJ-3”(父本)。基于F₁人口。随后，我们利用遗传图谱定位并分析了与叶片性状相关的qtl。此外，我们还研究了生长季节6个时间点的株高相关qtl。这是第一张基因图谱c .文艺为今后的遗传研究和标记辅助选择(MAS)奠定了基础c .文艺．

基因图谱的构建

Illumina对200 F测序产生了近288.75 Gb (288,747,675,610 bp)的原始数据，其中包含配对的末端reads₁后代和他们的父母使用rad测序(后代个体)和重测序(父母)。经过数据过滤，我们获得了963,326,642个clean reads，总计超过280.72 Gb的清洁数据，平均Q30(%)值为93.0%，鸟嘌呤-胞嘧啶(GC， %)含量为37.0%。对于两个亲本，从16-PJ-3和0708中分别获得了约9.90和9.97 Gb的重测序干净数据，重测序覆盖率分别为10.09×和10.47×。对于后代，获得了平均约1.30 Gb的干净数据(范围约为0.83 - 2.17 Gb)1)．干净的读取与c .文艺基因组(附加文件)1)．在参考基因组中排列在多个位置或没有位置的干净reads被丢弃。结果表明，母本和父本的clean reads分别为90.76%和93.74%。F₁个体，平均94.79%的清洁reads对齐到参考基因组的独特位置。所有在参考基因组中排列到唯一位置的干净reads被保留，用于后续SNP调用和基因型测定。

使用统一基因型过滤干净的reads来鉴定SNPs和indel。总共有25,614,295个SNPs和2,871,647个indel在200 F中被初步鉴定₁个人(表1)．去除质量低、测序深度浅的标记后，保留712,786个多态性位点，并将其分为8种分离模式。然后，我们去除了碱基异常、后代个体召唤率低、分离畸变严重的SNP标记。最后选取“nn × np”(3570)、“hk × hk”(1119)、“lm × ll”(4883)和“ef × eg”(21)4种分离模式的9593个多态性位点(包括9072个SNPs和521个InDels)进行连锁分析。9593个多态位点上各等位基因的读计数见附加文件2:表S1。

首先使用选定的标记构建女性和男性地图。在女性图谱(7080)中，共有6023个多态性标记分为20个连锁群(LGs)，总距离3440.02 cM，平均标记间隔距离0.57 cM。LG2是最大的LG，总距离为212.84 cM，标记179条(表2)2)．LG18有662个标记，是20个LG18中标记数量最多的。平均距离为0.22 (LG12) ~ 1.81 (LG20) cM。6003个缝隙长度均不小于5 cM，最大的缝隙位于LG2，长度约为4.53 cM。在男性图谱中，4710个标记落在20个lgg中，总遗传距离为3226.28 cM，平均标记间隔距离为0.73 cM。在20个lgg中，LG1的标记数量最多(413个)，总距离为173.48 cM, LG11的总距离最长(198.42 cM)，有119个SNPs。平均标记距离为0.37 (LG18) ~ 1.8 (LG10) cM。在男性图(16-PJ-3)中，LG11中最长的间隙为3.35 cM，长度均不小于5 cM(表16-PJ-3)3.)．随后，男性和女性地图被合并成一张综合地图。最终的地图跨度为3151.63 cM，包含9593个标记，分布在20个lgg中。其中LG5和LG14的长度分别为198.05 cM和125.5 cM，多态性位点分别为450个和441个。标记间平均距离为0.32 cM，范围为0.16 cM (LG18) ~ 1.08 cM (LG10)。所有间隙长度均小于5 cM, LG2最大间隙为4.12 cM3.)．用于基因图谱构建的标记和相邻标记之间的距离的详细信息在附加文件中提供3.:表S2。

单倍型分析和热图是评价遗传图谱质量的两种有效方法[39］．在我们的研究中，我们构建了20个具有多态标记的lg的单倍型图，以反映每个后代的重组事件。单倍型图谱显示，该基因图谱中缺失标记的比例为0.19%，质量较高(附加文件4:图S1和附加文件5:表S3)。热图可以反映同一LG中所有标记之间的重组关系。20个lg的热图显示，连锁群中相邻标记之间的连锁关系较强，且随着距离的增加，相邻标记之间的连锁关系逐渐减弱，这表明大多数lg中标记的顺序是正确的(附加文件)6:图S2)。此外，对于大多数lg，遗传和物理位置之间的Spearman相关系数为0.99，平均物理覆盖率为99%，表明遗传共线性水平较高(附加文件7:表S4)。

叶片及生长性状分析

7个叶片性状和株高在6个时间点上均有较大差异(表2)4)．“7080”的叶片比“16-PJ-3”的叶片更大、更宽，但其余5个叶片性状在亲本间无显著差异。此外，根据我们之前的研究，“7080”在所有6个时间点上的生长速度都快于“16-PJ-3”，这在一定程度上可能是由于光合系统中氮的利用和分配效率更高[10］．频率分布分析(图;1)表明，大部分表型值基本呈正态分布，表明该表型数据可用于进一步的QTL分析。7个叶片性状的变异系数(CV， %)为11.18 ~ 25.61%。叶片周长(LP)和叶长(LL)的cv值相近，分别为17.93和17.03%。10月10日株高变化范围为1.78 ~ 3.75 m, 6个时间点的CV变化范围为10.02 ~ 14.42%。7月31日、8月15日、8月31日和10月10日株高的cv值非常接近(分别为10.07、10.15、10.02和10.20%)，说明各生育期间差异不大。

7个叶片性状与株高(10.10)的相关分析表明，叶片性状与株高没有相关性，表明这两类性状可能是相互独立发展的(图10)。1)．SPAD值与其他6个叶片性状无显著相关性，说明叶绿素含量对叶片发育的影响可能不显著。LA与叶宽(LW)呈强正相关(0.87)，与LL(0.69)、LP(0.68)呈中度正相关，与PL(0.31)呈弱正相关(0.31)，与L/W无相关性。LA、LL、LW和LP 4个叶片性状之间存在一定的正相关;PL与LA(0.31)、LL(0.24)、LW(0.35)、LP(0.29)呈弱正相关，提示叶柄发育与叶片发育可能存在较小的相关性。此外，除L/W比和LW(−0.35)外，其余均无显著负相关。

叶片与生长性状的QTL定位

利用综合遗传图谱和表型数据，在5个时间点成功鉴定了7个叶片性状和株高的33个qtl(附加文件)8:图S3和附加文件9:图S4)。叶片性状的20个qtl(包括6个LA关联、5个LL关联、1个LW关联、1个LP关联、1个长宽比关联、4个PL关联和2个SPAD值关联)解释了2.33 ~ 16.51%的表型变异。Q3-172 (LA)和Q17-84 (SPAD)两个qtl表现出超显性，Q16-60 (LA)、Q16-67 (LA)、Q16-60 (LL)、Q16-60 (LP)、Q16-60 (L/W)和Q16-60 (PL) 6个qtl表现出部分显性。20法对叶特征,Q16-60,杆子有着97 - 67和杆子有着-映射到16号染色体和Q16-60,确定拉,噢,LP L / W比率和PL,解释5.16,16.51,14.0,和6.21%的表型变异在洛杉矶,噢,LP和L / W LOD得分为3.28,17.64,5.47和4.27,分别和高表型方差解释(牛皮纸)洛杉矶和我Q16-60表明,这个网站可能高度相关的这两个特征。此外，在19号染色体上检测到4个qtl，其中3个Q19-106、Q19-116和Q19-126与LA相关，1个Q19-137与SPAD值相关。

除7.31时间点外，在5个时间点均检测到13个qtl。qtl解释了表型变异的5.81 (Q18-60) ~ 9.02% (Q18-73)。8个QTL位点(13个关联)被定位到LG3(1)、9(1)、16(2)、18(2)和19(1)，8个QTL在多个时间点被检测到:Q9-1(时间点6.30和7.15)、Q18-66(时间点8.15和8.31)和Q18-73(时间点6.30、7.15、8.15和8.31)。13个qtl中Q9-1(6.30)、Q9-1(7.15)和Q19-59(7.15)表现为超显性，Q16-56(8.15)表现为部分显性。关于qtl的详细信息已在附加文件中提供10:表S5和附加文件11:表S6。

qtl子集中的候选基因预测

为了进一步测试我们的遗传图谱的准确性和可用性，我们使用了叶片性状QTL Q16-60和株高QTL Q18-66和Q18-73进行基因预测，因为它们在多个时间点或多个叶片性状中被识别出来(图17)。2，附加文件12:表S7)。Q18-66为株高(8.15)和株高(8.31)的QTL。Q18-73作为株高(6.30)、株高(7.15)、株高(8.15)和株高(8.31)的QTL。虽然Q9-1在两个以上的时间点(株高6.30和7.15)也被鉴定为QTL，但在物理图谱中，在标记sca9_231994和sca9_261968之间没有发现任何基因。Q16-60的QTL区域长度为0.45 cM，物理距离约为58 Kb，包含5个推测的预测基因c .文艺．其中4个基因在基因本体论(GO)数据库中被注释，但在京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径数据库中没有一个被识别。GO注释表明这些基因参与了DNA结合(evm.model.group5.473)、细胞周期蛋白调控(evm.model.group5.471)和胚胎发育(evm.model.group5.475)等过程。

Q18-66和Q18-73的QTL定位区域分别为0.320和0.359 cM，其物理距离分别为213 Kb和52 bp。Q18-73的52 bp序列位于evm.model.group7.1784推测基因的编码区，根据其注释，该基因可能编码一个卵裂和聚腺苷酸特异性因子3 (CPSF)亚基3- ii亚型X3。GO注释表明该基因主要参与催化活性、mRNA加工、极核融合、蛋白结合等过程。在Q18-66中发现15个推测的预测基因。GO注释表明Q18-66中除一个未知基因外，其余14个基因主要参与类黄酮生物合成、DNA结合、镁离子结合等过程。KEGG注释表明，evm.model.group7.1478和evm.model.group7.1479两个基因主要参与糖酵解、碳代谢和氨基酸生物合成等过程，可能在植物生长中发挥作用。Q18-66中的其他基因可能参与花青素生物合成、α -亚麻酸代谢、氨基苯甲酸盐降解和mRNA监测途径等。

使用RAD-seq策略识别分子标记

遗传图谱已被用作辅助植物育种和阐明育种家感兴趣的复杂数量性状的遗传结构的重要工具。具有高标记密度的遗传图谱对于标记发现和精确的QTL定位至关重要。RRGS方法，如RAD-seq、基因测序分型(GBS)和特定位点扩增片段(SLAF)测序，极大地促进了分子标记物的鉴定。例如，Zhang等利用GBS鉴定的3868个snp构建了牡丹的高密度遗传图谱(牡丹Andr.)的总遗传距离(13175.5 cM)和平均标记间隔距离(3.40 cM)远高于Guo等在同一作图群体中获得的含有35个SSR标记的遗传图谱(平均标记间隔9.70 cM，总遗传距离338.2 cM) [40，41］．花生的遗传图谱也观察到了类似的结果，其中基于ssr的遗传图谱包含大约135至191个标记，而基于rrgs的遗传图谱包含1685个snp [42］．RAD-seq已被证明是一种识别植物中大量多态位点的有效方法。例如，在一份关于葡萄属利用RAD-seq技术，在亲本和176 F中鉴定出8481484个SNPs和1646131个indel₁利用其中的65299株和4832株，构建了跨度3014 cM的高密度遗传图谱，平均覆盖率为99.83%，99.99%的缺口长度小于5 cM [35］．Guo等用同样的方法构建了桃的遗传图谱(碧桃)，包括1310个snp，跨度为454.2 cM，平均标记距离为0.347 cM [43］．这张地图比用SSRs或其他标记绘制的地图质量要高得多[44，45]因为前者包含更多的标记，规模更大。虽然构建RAD文库的过程比双消化体-RAD (dd-RAD)、SLAF和GBS更为复杂，但可以获得更长的基因组片段用于其他研究[46］．从200个子代中共获得260.85 Gb RAD reads，平均长度近290 bp，这些数据也可用于其他研究。RAD序列GC含量约为37.11%，与参考基因组(34.12%)略有差异;这种差异可能是由于限制性内切酶的选择。根据RAD序列，我们初步发现了22,319,406个SNPs和1,563,074个indel。对于snp，大约66.85%为过渡型，这与Taxodium distichum(64.52%) (12]，胡桃regia(68.32%) (47]，Corchorus capsularis(69.07%) (48和其他物种。此外，在初始变异中，超过50%的SNPs在亲本间表现出多态性，表明亲本间具有较高的遗传多样性c .文艺并为进一步研究提供了各种遗传和基因组信息．

基因图谱分析

我们用F₁群体，由于森林树木的生命周期长，通常用于遗传图谱的构建c .文艺×c . duclouxii．最终的遗传图谱包含9593个多态标记和20个LG，平均每个LG上有近500个标记。与采用RRGS策略构建的其他木本物种的遗传图谱相比，该物种的遗传图谱的标记数要多于其他木本物种Ziziphus枣［49］，大胡桃［47),牡丹［50]，但少于Taxodium distichum［12]，葡萄属［35),而猕猴桃对［51］．与之前的一些研究相比，所绘制的标记数量较少，部分原因可能是我们研究中子代个体的测序深度较小，这可能导致了不满足测序深度阈值的标记被排除。为了进一步优化我们的基因图谱，我们将在未来添加更多的标记。遗传图谱总遗传距离为3151.63 cM，平均间隔距离为0.32 cM。此外，所有的缝隙(相邻标记之间的距离)都小于5 cM，表明密度较高。通过检测减数分裂中重组率较低的染色体的同源重组，增加作图群体中的个体数量可以有效提高遗传图谱的分辨率[12］．我们的结果表明，200个个体的定位群体可能足以构建高密度的遗传图谱。在我们的研究中，20个LG上的标记分布不均匀:LG 18上发现了最多996个标记，LG 10上发现了最少165个标记。超过一半的lgg(11个)含有少于500个标记(低于平均水平)，这可能表明这些lgg缺乏遗传信息。使用双酶消化的RRGS策略，如dd-RAD和SLAF，可以获得分布更均匀的标记，这些技术可以在以后的研究中考虑。

叶片和生长性状的QTL分析

在叶片和生长性状变异方面，我们发现所有测量性状都具有较高的重复性。重复性范围为0.86 (L/W) ~ 0.94 (PL)。结果表明，子代无性系的表型稳定性较高。本研究构建的高质量遗传图谱可以进行高分辨率的QTL定位，共定位了7个叶片性状的16个QTL，其中Q16-60被鉴定为LA、LL、LP、L/W比和PL共5个性状的QTL。通过相关分析，6个叶片性状(LA、LL、LW、LP、L/W比和PL)之间大部分呈相关性;但未发现与6个叶片性状相关的QTL。类似的结果也可以在其他物种叶片或生长性状的QTL定位中找到[12，52，53］．这可能是因为这些性状是由多个qtl控制的复杂数量性状，要精确识别目标性状的所有qtl并不容易。此外，已有多项研究发现，作物旗叶大小QTL作图的结果会受到环境的影响，这表明可以利用不同环境的QTL作图来提高精度，事实上，这一策略在其他研究中也有尝试[54，55］．在最近的一项研究中，Xia等人绘制了F₁其中9个qtl分布在2个或2个以上时间点。这种不同时间点的可重复性表明QTL映射有较高的置信度[16］．然而，在我们的研究中，只绘制了一个时间点;在未来的研究中，我们将在多个时间点和位置对叶片性状的QTL进行定位，以提高QTL定位的准确性。叶片大小由细胞分裂和细胞扩张之间的相互联系控制[56］．根据之前的研究，改变cyclin B1;1等细胞周期相关基因的表达显著影响叶片的细胞分裂率[57，58]和适度增长CYCD3表达拟南芥增加细胞数量和LA [59，60］．此外，cyclin基因也影响叶片平整度和直立度[61，62］．在我们的研究中，在Q16-60中发现了一个可能的细胞周期蛋白基因(evm.model.group5.471)，这意味着细胞周期蛋白介导的细胞分裂可能参与了叶片性状的形成。

近年来，在连续时间点上对植物生长特性的动态qtl进行了检测;例如，Du等人绘制了杨树连续12个时间点的生长性状图谱，发现有些qtl是特定于一个时间点的，而有些qtl是在几个连续或不连续的时间点上发现的，这可能是由于它们在不同生长阶段在植物生长中的特定功能[63］．本研究共定位了5个时间点的株高qtl，在1个以上时间点检测到8个qtl，累计PVE为61.4%。因此，这些位点被进一步检测以分析候选基因。本研究采用包涵复合区间作图(ICIM)方法对叶片性状和株高相关的qtl进行了定位。Yang等人绘制了植物生长性状的qtlTaxodium Zhongshansha”采用CIM和ICIM方法鉴定了5个常见qtl，以保证qtl的可靠性。在他们的研究中，CIM方法检测到的qtl数量仅为ICIM方法检测到的qtl数量的一半，这可能是由于ICIM方法的检测能力更高[12］．同样，Dodia等人使用CIM和ICIM相加(ICIM- add)方法绘制花生茎秆腐病抗性和植株结构的qtl，并获得了不同的结果:用CIM方法获得的qtl解释了更多的表型方差[42］．作图方法不当可能导致结果错误，不同的作图方法可能影响QTL作图结果;因此，使用更多的作图方法可能是提高QTL作图精度的有效策略[12]，需要使用更多的映射方法来精确识别qtl。

通过QTL定位，我们在Chr18染色体213.76 Kb和52 bp的两个基因组区域中发现了株高的QTL。在213.76 kb的基因组区，两侧标记为sca18_15484674和sca18_15698439(遗传图中为0.32 cM)， PVE约为6.6%。根据基因组注释，在该区域共鉴定出15个基因。位于该区域的evm.model.group7.1464基因是的同源基因AT3G01610.1在基因组中拟南芥。AT3G01610.1编码细胞分裂控制蛋白48同源体c样(CDC48C)，参与细胞分裂、细胞扩张和细胞分化等过程[64］．据报道，CDC48参与植物生长:Bae等人通过病毒诱导的基因沉默抑制了烟草中CDC48同源基因的表达，反义RNA干扰不仅导致茎叶严重生长停止，还导致花不育[65］．位于该区域的另一个基因evm.model.group7.1477是一个同源基因AT1G76680.2在答:芥，该酶编码参与茉莉酸(JA)生物合成的12-oxophytodienoate还原酶[66，67］．虽然高水平的JA会抑制植物茎的生长[68]，低浓度JA可促进细胞扩张和芽伸长[69，70]，表明内源JA合成可能影响我们定位群体的株高;然而，这种可能性需要进一步验证。此外，我们发现了一个AT5G04660.1同源体，即evm.model.group7.1470，可能编码细胞色素P450家族成员。一些细胞色素P450家族成员已被证明参与植物生长。例如,EUI1，一种在水稻中克隆的细胞色素P450单加氧酶，通过调节赤霉素反应来调节节间伸长[71，72］．此外，细胞色素P450成员也参与油菜素类固醇[73]和吲哚-3-乙酸[74]影响细胞伸长或株高[75，76］．Q18-73的52 bp序列位于物理图谱中的evm.model.group7.1784，可能编码了一个可能的卵裂和多聚腺苷酸特异性因子73 (CPSF73)同源亚基。CPSF73是一种参与小核RNA (snRNA) 3 '端加工的核酸内切酶，在花和胚发育中发挥作用[77］．然而，尚不清楚它是否影响株高。

为了提高候选基因预测的准确性，可以使用转录组学或实时荧光定量PCR分析来识别RNA变异和基因在QTL区域内的表达。其他组学分析，如代谢组学，也可以提供与表型变异相关的化合物的一些信息。在未来的研究中，这些分析将用于进一步验证我们研究中的候选基因。

的高密度遗传图谱c .文艺×c . duclouxii采用RAD-seq策略构建，分别鉴定出20个和13个与叶片和生长性状相关的qtl，解释了中等的表型变异。本研究为分子标记辅助育种奠定了基础c .文艺．此外，我们获得的基因组序列为公众研究动物的进化和功能基因组学提供了丰富的资源c .文艺．在qtl中鉴定的候选基因可能是调控叶片性状和促进植物生长的有前途的基因c .文艺并将进一步研究。

绘制种群和DNA提取

c .文艺" 7080 "(母本，全叶，附加文件13:图S5)是河南省洛阳市农林科学院选育的优良无性系，经洛阳市农林科学院批准将“7080”作为育种材料进行栽培c .文艺2006年在洛阳(34.71°N, 112.54°E)中国林业科学研究院林业研究所人工林中克隆。c . duclouxii多德“16-PJ-3”(父本，裂叶，附加档13:图S5)是生长在中国贵州盘江镇(25.75°N, 103.83°E)的野生个体。2016年，马文军博士采集了“16-PJ-3”的花粉和芽叶(我们咨询相关部门后，“16-PJ-3”的采集不需要任何必要的许可)并进行了杂交。最后，一共681个F₁将“7080”与“16-PJ-3”杂交获得后代。F的种子₁2017年在中国林业科学研究院温室播种育苗。2018年，随机抽取200名F₁在洛阳农林科学院试验田(洛阳，北纬112.55°，东经34.71°)进行无性繁殖和种植。采用随机区组设计，每个小区每克隆2分株，5个重复。本研究收集的所有植物材料均符合国家标准。我们所做的野外实验是按照当地的法规进行的。代金券标本保存于中国林业科学研究院林业研究所。马文军博士和王俊辉博士对样品进行了正式鉴定。

双亲和200华氏度的年轻和健康叶片样本(先端的第二或第三叶)₁这些个体是在2018年6月收集的。所有叶片样品立即在液氮中冷冻，并保存在−80°C。我们使用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法提取基因组DNA [78，79］．为了消除残留的RNA，所有提取的DNA样本都用RNase处理(Takara, Shuzo, Otsu, Japan)。最后，用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计测定DNA浓度和纯度，并在1%琼脂糖凝胶上进行检查。

RAD文库构建和高通量测序

我们根据快速应用程序开发协议准备了200个快速应用程序开发库[80稍加修改。简单地说，从每个样本中提取200ng合格的基因组DNA (200f₁个体)被20u的限制性内切酶完全消化EcoRI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)在37°C的50 μl反应混合物中，基于参考基因组的评估和DNA消化预实验的结果(附加文件)14:图S6)。消化后，将条形码P1接头连接到EcoR我限制站点为每个样本单独。然后，使用Bioruptor (Diagenode, Liège, Belgium)将所有样品剪切至平均500bp大小。用2%琼脂糖凝胶收集350 ~ 450 bp大小的DNA片段，用于文库构建。随后，将片段钝端修复，并在序列中添加一个3 '腺嘌呤悬垂。最后，每个库都添加了一个P2适配器，其中包含唯一的Illumina条形码(San Diego, CA, USA)。所有文库均采用高保真耐高温DNA聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) PCR扩增，测序前进行纯化。同时构建了“7080”和“16-PJ-3”两个亲本的重测序库。RAD文库和两个重测序文库使用Illumina HiSeq X Ten平台，由上海美吉生物医药科技有限公司提供150 bp对端reads测序。

SNP和InDel呼叫及基因图谱构建

为了确保后续分析的读取质量，所有原始读取都使用Trimmomatic [81]，以丢弃低质量的读取(质量分数低于30)，读取超过10%的未知核苷酸和读取对齐到适配器。接下来，使用标准SNP和InDel调用管道分析干净的数据。简单地说，所有干净的读取首先映射到c .文艺使用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)软件的参考基因组[82]，设置为“mem -t 4-k 32-M”。为了避免错误的定位结果，使用SAMtools对基因组中定位位置唯一的reads进行排序[83］．随后，使用基因组分析工具包(GATK)统一[84]根据GATK最佳实践管道使用标准过滤参数[85］．然后，根据以下三个严格的标准对变量进行更精确的筛选:(1)映射质量小于37;(2)质量深度小于24;(3)序列深度小于10倍(亲本)或3倍(子代)。将筛选的变异标记进一步分为8种分离模式:“ab×cd”(4个等位基因)、“nn × np”(2个等位基因和1个亲本杂合)、“hk × hk”(2个等位基因和2个双杂合)、“ef × eg”(3个等位基因和2个双杂合)、“cc × ab”(3个等位基因和2个母本纯合)、“aa×bb”(2个等位基因和2个母本纯合)、“ab×cc”(3个等位基因和1个母本纯合)和“lm × ll”(2个等位基因和1个母本杂合)。最后，根据以下三个严格的标准，进一步去除不合格的分子标记:(1)异常碱基;(2)变型呼叫率(缺失率)小于70%;(3)偏析畸变显著(卡方检验，P值< 0.05)。SNP呼叫参数是我们综合考虑几个参数组合的结果后确定的，以保证我们有足够的可信标记供后续研究(附加文件)15:表S8)。

因为F₁以群体为研究对象，选择分离模式为“ab×cd”、“ab×cc”、“cc × ab”、“ef × eg”、“nn × np”、“hk × hk”和“lm × ll”的标记构建遗传图谱。将筛选后的标记按其在同一染色体上的物理位置分为20组，利用MSTmap软件对标记进行排序[86］．接下来，平滑算法[87]根据排序标记之间的关系对基因分型错误或缺失进行校正。利用Kosambi作图函数计算标记间的遗传距离。此外，利用单倍型图和热图分析评价了遗传图的质量。

叶片性状和动态株高的表型分析

对“7080 × 16-PJ-3”F₁2018年9月5日对人口进行了测量。我们选择顶点以下的充分展开叶的第3轮来检测叶片性状(根据我们之前的研究，充分展开叶的第3轮c .文艺为成熟的功能叶，在采集时间性状较为稳定)。使用SPAD-502 Plus叶绿素仪(柯尼卡美能达控股有限公司，千代田区，东京，日本)在每片叶片表面不同位置测量叶绿素含量5次，计算平均值代表叶绿素含量。测量叶绿素含量后，采集叶片，用CI-203便携式激光叶面积仪(CID Inc.， Washington, USA)扫描叶片共5个参数:叶长(LL)、叶宽(LW)、叶长/宽(L/W)比、叶面积(LA)和叶周长(LP)。叶柄长度(PL)用尺子测量。

树木的发育是一个复杂的动态过程，受基因网络和环境的共同调控。使用仅在一个时间点测量的表型数据的传统作图策略可能不能准确反映发育过程的遗传控制[88]，因此使用多个时间点的生长数据来绘制qtl。根据我们之前的观察，的增长c .文艺在洛阳，一般四月底开始，七月初迅速进行，九月底结束。所有植物的高度测量时间分别为2018/6/30(快速生长期前)、2018/7/15(快速生长期)、2018/7/31(快速生长期)、2018/8/15(快速生长期)、2018/8/31(快速生长期结束)、2018/10/10(生长季节结束)，共6个时间点，包括一个生长季节的整个快速生长期(7月至8月)。

在每个小区中，每个无性系各2株，从同一无性系的单株幼苗中计算各小区各项参数的平均值作为性状数据。这5个植物块被测量为5个重复。不同性状间的相关性与F₁采用R软件，采用Pearson法计算种群数量[89］．利用R ASReml包计算株高和叶性状的重复性[90］．利用SPSS 19.0版本(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)对表型数据进行单因素方差分析，以区分“7080”和“16-PJ-3”之间的7个叶片性状和6个生长性状。

QTL定位与候选基因选择

采用GACD软件进行QTL分析[91]使用包含复合区间映射(ICIM)方法[92］．采用1000次排列试验确定显著对数几率(LOD)阈值(P各性状均< 0.05)。最后，由于7个叶片性状和6个生长性状的LOD平均显著性阈值均为3.0，因此，将性状的LOD显著性阈值确定为3.0，置信区间为95%。63］．根据qtl的LOD峰值位置及其周围区域描述qtl的潜在位置。添加剂(一个)和支配(d)，根据Muchero [93]，根据Nzuki详细介绍的GACD计算结果[94］．QTL作用方式计算为优势度与绝对加值之比(d/|一个|),d/|一个|比值大于1被视为过度支配;比值在0到1之间被认为是部分优势，比值小于1被认为是劣势[95］．根据参考基因组的注释，获得QTL区域的候选基因信息。

200个后代个体和父母的干净数据已上载至NCBI SRA数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，收录号:PRJNA551333，其他支持文章结论的资料已作为补充文件上传。

CIM:

复合区间映射;

CTAB:

Cetyltrimethylammonium溴化

GBS:

基因测序分型

ICIM:

包含复合区间映射

InDel:

Insertion-deletion

L / W:

叶长/叶宽

拉:

叶面积

格林:

连锁群

噢,

叶片长度

LOD:

概率对数

LP:

叶周边

LW:

叶宽度

MAS:

分子标记辅助选择

门店:

新一代测序

PL:

叶柄长度

QTL:

数量性状位点

RAD-seq:

限制性位点相关DNA测序

RRGS:

减少代表基因组测序

SLAF:

特异性位点扩增片段测序

单核苷酸多态性:

单核苷酸多态性

SPAD:

土壤和植物分析仪的开发

感谢洛阳市农林科学院提供的植物材料;我们非常感谢贵州省林业研究院在植物资料收集方面的帮助。

国家重点研发计划项目(2017YFD0600201)资助。资助者在研究设计、数据分析和解释以及手稿写作中没有任何作用，只是提供了资金。

从属关系

1. 中国林业科学研究院林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，国家林业局林木育种与培育重点实验室，北京100091

   吕楠，张苗苗，肖尧，张宇，易飞，朱天庆，马文军，范二芹，王俊辉

2. 南京林业大学园林学院，江苏南京210037

   深圳市东华汉

3. 西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100

   刘英

4. 东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨，中华人民共和国

   范二琴观正曲

贡献

NL, YX, MZ和YL对数据进行分析。QTL分析由NL和MZ负责。DH、TZ、YZ和FY采集植物材料，参与表型测定和DNA制备。WM、EF和GQ进行杂交，构建映射群。NL写了手稿。JW设计了项目并修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Junhui王．

伦理批准并同意参与

本文不包含任何作者对人类参与者或动物进行的任何研究。本研究所用植物材料均由中国林业科学研究院林业研究所提供。实地试验是在当地立法和许可下进行的。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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