一氧化氮诱发gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba差异调节植物防御和耐旱性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物暴露于不同的环境伤害会引起细胞氧化还原色调的显著变化，部分原因是促进活性氮的产生。一氧化氮(NO)是一种小的气态双原子分子，以其在压力下的信号传递作用而闻名。在本研究中，我们重点研究了ABA代谢相关基因，这些基因在NO供体反应中表现出差异表达gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba亚硝基的- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba-半胱氨酸(CySNO)的转录组分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

对cysno诱导的aba相关基因进行鉴定并进一步鉴定。生物过程的基因本体术语表明，大多数基因与蛋白质磷酸化有关。启动子分析表明有几种gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控元件在生物和/或非生物胁迫条件下被激活。ABA生物合成基因gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba选择使用功能基因组学进行验证。功能缺失突变体gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba发现对氧化应激和亚硝化应激有不同的调节作用。进一步调查，以确定的作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba在植物防御中提示植物基底防御负调控gydF4y2BaRgydF4y2Ba-gene-mediated阻力。的gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba植物对毒力表现出抗性gydF4y2Ba两gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba番茄gydF4y2Ba应变DC3000 (gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000)，并逐渐增加gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba基因的表达。同样的,gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba胁迫下植物的超敏反应(HR)增加gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)．的gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba突变体表现为易感表型gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba记录积累。耐旱试验表明gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba缺乏aba的突变体表现出早期枯萎，随后植株死亡。气孔结构研究表明gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba干旱胁迫7 d后气孔仍不能关闭。此外，与野生型(WT)植物相比，它们的ABA含量降低，电解质泄漏增加。定量聚合酶链反应分析表明，ABA生物合成基因表达下调，而大部分干旱相关基因表达上调gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba小于WT。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

AtAO3gydF4y2Ba负调控病原体诱导的水杨酸途径，尽管它是耐旱性所必需的，尽管ABA的产生并不完全依赖于此gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba与干旱相关的基因gydF4y2BaDREB2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaABI2gydF4y2Ba与ABA含量无关，对干旱有响应。gydF4y2Ba

一氧化氮(NO)是一种小的气态分子，被认为是动植物体内最好的信号分子，被评为“年度分子”gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba1992年[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．许多研究都集中在探索它在不同生命过程中的作用。虽然人们对动物细胞中NO的来源和产生已经有了很好的了解，但在高等植物中，特别是通过氧化途径产生NO还不确定[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，科学家们一直试图在高等植物中找到一种合适的NO合成酶。NO正在成为多种植物过程的关键调节因子，如生长、发育、气孔调节、衰老、防御和环境相互作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与经典的信号转导不同，NO及其称为活性氮的化学衍生物(RNS)通过与不同蛋白质中的特定靶标发生化学反应而起作用[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝半胱氨酸(CySNO)和gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)被认为是两个关键的NO供体，因为它们在水溶液中自发分解释放NO [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．CySNO具有通过特异性渗透植物细胞的能力gydF4y2BalgydF4y2Ba型氨基酸转运蛋白[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，在那里它可以经受gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝化，一种翻译后修饰，其中NO部分共价附着在溶剂暴露的半胱氨酸残基上形成gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-nitrosothiols (sno)。当NO过量时，SNO可使NO附着在谷胱甘肽上形成相对稳定的NO流动库GSNO [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．因此,gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝化作用被认为是转移NO生物活性的最相关机制，从而改变蛋白质功能[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．许多蛋白质已经被报道过gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝基化，尽管该名单正在不断增加[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．其中包括拟南芥水杨酸(SA)结合蛋白3 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，发病相关基因-1的非表达子[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，生长素受体转运抑制剂response-1 [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．类似地，许多蛋白质通过gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝化反应对非生物应激，如AHb1参与缺氧;Rubisco调节低温胁迫;GAPDH对盐胁迫的响应;高光条件下APX、GR和GAPDH的响应;CAT和GOX对镉胁迫的响应(综述于[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba])。细胞SNO水平由一种关键酶GSNO还原酶(GSNOR)调节，突变会导致生长和植物防御受损[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

干旱胁迫是影响世界范围内植物生长和生产力的主要环境因子。缺水所造成的损害甚至比其他环境因素所造成的损害加起来还要大[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．干旱条件会导致明显的表型变化，如梢和根的生长减少，茎的直径减小，破坏了植物与水的关系，降低了水分利用效率[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．还研究了NO在干旱胁迫调节中的作用[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．据报道，NO通过增强几种植物的抗氧化系统、脯氨酸和渗透液代谢，在抗旱性中发挥关键作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．NO还可能通过各种信号级联(包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等)，通过aba介导的气孔反应限制水分损失，间接帮助抗旱性的提高。[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．NO还在分子水平上通过DNA甲基化等途径在抗旱性中发挥多维度作用。同样，NO也调控了若干干旱胁迫响应基因的表达，包括转录因子(TFs)和抗氧化相关基因[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．最近在一项基于RNA-seq的转录组学研究中，[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba我们报道了几个干旱相关基因在1 mM CySNO (NO供体)的反应中表现出差异表达。同样，干旱胁迫诱导的几种tf也对NO有反应。例如，NAC19 TF显示出超过150倍的CySNO变化[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba];据报道，这种TF是由干旱、高盐度和ABA诱导的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．同样，MYB和WRKY TF家族的几个成员也被报道在NO反应中受到不同的调控[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

脱落酸(ABA)，通常被称为“应激激素”，是参与调节植物水分状态和气孔运动的关键激素。ABA的生物合成涉及两个主要基因玉米黄质环氧氧化酶[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]和9-顺式类环氧素双加氧酶[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．然而，包括脱落酸醛被基因家族的醛氧化酶(AO)氧化在内的最后一步在ABA合成中起着关键作用。ao至少由四个基因组成(gydF4y2BaAAO1, AAO2, AAO3, AAO4gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba];在这些基因中，gydF4y2BaAAO3gydF4y2Ba编码AOδ，对脱落醛有很高的特异性[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．还研究了NO与ABA的相互作用;在耐旱条件下，NO诱导ABA的产生，进而调控气孔响应[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．这已被进一步证实使用反向遗传学方法，其中no缺乏双突变体gydF4y2Bania1nia2gydF4y2Ba[硝酸还原酶(NR) KO突变]不能响应ABA关闭气孔，提示ABA诱导气孔关闭需要NO [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．另一种涉及NO介导的气孔关闭的机制表明，干旱诱导的ABA生成激活NADPH氧化酶、RBOHD和RBOHF(呼吸突发氧化酶同源物D和F)，从而产生超氧化物破裂，导致NR的NO生成激活，进而激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号级联，从而驱动气孔关闭[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此前，我们通过进行RNA-seq-based转录组分析，报道了数千个对NO供体CySNO有反应的基因[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．在本研究中，我们重点研究了cysno诱导的ABA生物合成和信号相关基因。通过在体和硅相结合的方法，我们证实了no诱导的ABA基因的调节作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba)用于植物防御和干旱调节。gydF4y2Ba

aba相关基因的鉴定与鉴定gydF4y2Ba

在基于rna序列的转录组中，共发现26个参与ABA代谢的deg(17个上调，9个下调)对CySNO有反应。所有基因的表达量都有至少2倍的变化。详细的列表随着折叠变化和gydF4y2BapgydF4y2Ba-value在附加文件中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在上调的deg中，有最高的折叠变化记录gydF4y2BaKin1gydF4y2Ba(At5g15960)，作为一种抗冻蛋白;根据TAIR的描述，低温、ABA和脱水胁迫诱导了该基因的转录积累。同样，在下调的DEGs中，最高的折叠变化被记录下来gydF4y2BaAtHVA22HgydF4y2Ba(At1g19950)，是aba应答基因。生成了热图来显示表达模式，以及树状图来显示cysno诱导的ABA代谢相关基因的层次聚类(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa). MDS图显示数据中的离散度，显示对照样品的离散度较低，而cysno处理样品的离散度略高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).我们进一步分析了所有cysno诱导的GO生物过程和分子功能方面的aba相关基因，鉴定其折叠富集，了解其假定功能。我们发现，在生物过程的GO术语中，相对于所研究的基因总数，约11.54%的基因对蛋白质磷酸化进行了注释，富集量为25.8倍(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).生物过程GO项中FE的丰度最高(70.52 FE)的是维生素生物合成过程。同样，在分子过程的GO术语中，与氧化还原酶活性相关的基因数量最多(23.40%)，而激酶抑制活性的基因数量最多(38.23%)(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

启动子分析的存在gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba监管元素gydF4y2Ba

ABA主要与非生物胁迫条件有关;然而，生物和非生物胁迫之间存在着显著的串扰。曹等人[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]报道了ABA不仅在介导非生物胁迫反应中起重要作用，而且在植物防御反应中起关键作用。因此，我们打算分析cysno诱导的aba相关基因的启动子区域。许多gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控元件存在于不同基因的启动子中。为了方便起见，我们选择了在所有基因中都存在的12个元素，它们与生物和非生物胁迫都有关;我们用RSAT对它们进行了测绘。其中包括在100%的序列中发现的CAAT-box;ABRE，在50%的序列中发现;和GARE，在23%的序列中发现。WRKY转录因子结合位点(W-box)在53.84%的序列中被发现，其频率位居第二gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-在CAAT-box后面找到元素。另一个基序CGTCA在50%的序列中被发现，而MBS在26.9%的序列中被发现(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在氧化和亚硝化胁迫条件下，AtAO3对根和茎长有差异调节作用gydF4y2Ba

在本研究中，我们主要研究乙醛氧化酶(gydF4y2BaAOgydF4y2Ba)在ABA合成中起关键作用。在gydF4y2BaAOgydF4y2Ba家族的基因,gydF4y2BaAtAO2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba对NO有不同的反应。如引言部分所述，AtAO3编码AOδ，对脱落醛具有很高的特异性[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．因此，我们使用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba敲除(KO)突变体进行下游分析。的可能作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba通过分析WT和功能丧失突变体的CDF、茎长和根长等生长参数，确定其对植物生长发育的影响gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3。gydF4y2Ba的gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba缺乏AtGSNOR1和gydF4y2Baatcat2gydF4y2Ba由于AtCATALASE2在植物生长和防御中已确立的作用，它们被用作对照植物[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．不同基因型在控制和不同胁迫条件下的表型可以在(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).我们的结果表明，的CDF没有显著差异gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba与野生型(WT)相比，在控制和亚硝化胁迫条件下(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).相反，在甲基暴力介导的氧化应激下，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示CDF显著降低(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba与WT相比，突变体CDF增加(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).同样，在亚硝化胁迫下，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示出供体依赖反应。在cysno诱导的亚硝化胁迫下，两者之间没有显著差异gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba和WT;相比之下，gsno介导的亚硝化胁迫导致茎长显著延长gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba与WT相比(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).的根长度gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba在控制和氧化应激条件下减少，而在亚硝化应激下增加(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad)。因此,gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba在控制和氧化应激条件下，对根长有正调控作用，而在亚硝化应激条件下，对根长有负调控作用。gydF4y2Ba

我们进一步试图确定总的细胞SNO水平，这被认为是包括gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝化蛋白和低分子量SNOs，包括GSNO [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．虽然还没有开发出测量GSNO水平的可靠方法，但已经确定的是，在生物系统中，GSNO水平与总SNO水平是一致的[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．为方便起见，我们选择了仅暴露于CySNO、GSNO和H的植物gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分别为亚硝化和氧化应激的代表。我们的结果表明，在控制条件下gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显着增加(gydF4y2BapgydF4y2Ba与WT相比，细胞SNO水平≤0.05)gydF4y2Baatcat2gydF4y2Ba显示出与WT相似的SNO水平(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae). gsno介导的亚硝化应激后，细胞SNO水平在gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显著高于(gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别≤0.01)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae).在突变系中，gydF4y2Baatcat2gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3,gydF4y2BaSNO水平变化不显著。同样，CySNO处理的植株在野生型中SNO含量降低，而在野生型中SNO含量增加gydF4y2Baatgsnor1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．细胞SNO水平gydF4y2Baatcat2gydF4y2Ba，gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba在CySNO介导的亚硝化胁迫条件下，两者基本相似。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae).相反，在H之后gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与WT相比，几乎所有基因型的细胞SNO水平都降低了(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

AtAO3负向调控植物基底防御gydF4y2Ba

是否gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba是通过接种WT确定的，gydF4y2BaAtao3, atnced3, atgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba具有毒性的植物gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba以评估所有基因型对毒性病原体的表型反应。我们发现，接种6天后(dpi)，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示耐药表型，而gydF4y2Baatgsnor1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba显示敏感表型(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).我们进一步研究了病原体在WT中的生长情况gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba以及相关的对照突变体。我们的结果表明，在0 dpi时，所研究的所有基因型的细菌生长均无显著差异;然而，在1和2 dpi时，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba与WT相比，病原菌生长显著降低(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。此外,gydF4y2Baatgsnor1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba在1和2 dpi时，病原菌生长增加。但两组间病原菌生长无显著差异gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba和WT(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).植物在生物营养性病原体攻击时的反应主要由植物关键激素SA介导[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．因此，我们旨在确定的作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba通过决定转录本积累的SA通路信号gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba，与SA通路相关的关键标记基因。在早期，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示转录本积累减少gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba；然而，在接种48 h时，转录本积累显著增加gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba与WT的基因比较(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外,c)。gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba在所有时间点上，与WT相比，转录本积累减少。所有基因型均显示减少gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba与WT中的表达式相比(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

AtAO3负向调控r基因介导的抗性gydF4y2Ba

植物利用gydF4y2BaRgydF4y2Ba由核苷酸结合位点-富亮氨酸重复序列(NBS-LRRs)编码的基因，识别病原体释放的效应分子，从而诱导gydF4y2BaRgydF4y2Ba-基因介导抗性[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．这种耐药性的最终命运是HR，在感染部位限制病原体在感染组织内。我们接种WT，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba突变体，以及相关的对照gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)，台盼蓝染色观察HR。我们的结果表明增加的人力资源gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba，然后是ingydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba,而gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba接种12 h后几乎无HR(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).然而，观察到心率增加gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba，然后是gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba接种24 h后(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).我们进一步研究了接种病原体后感染叶片转录本的积累，发现gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示增加gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba在接种后6、12和24 h表达(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba转录本积累减少gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatgsnor1gydF4y2Ba3(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab)。gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba转录本积累仅在接种后12小时增加(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

我们还研究了细胞SNO水平gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba突变系用作比较对照，如gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba后gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)接种。我们的结果表明，细胞SNO水平gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba与WT相比，随时间的推移显著升高(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bad)。同样的,gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba与WT接种12 h时相同，0 h时略有降低，24 h时显著升高。如果gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba细胞SNO水平在接种后0和24 h均有升高，但在接种后12 h无显著差异(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

Atao3对全身获得性耐药表现出不同的反应gydF4y2Ba

系统获得性抗性(Systemic acquired resistance, SAR)是一种重要的防御系统，是由植物感染部位向其他部位发出的信号所诱导的。据报道，NO、ROS参与了SAR的激活[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．因此，我们研究了AtAO3是否在SAR中起作用，并接种植物gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)在5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU。从接种病原体后的系统叶片中采集叶片样本，对关键SAR标记基因如gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gydF4y2BaG3PDHgydF4y2Ba)和杜鹃酸诱导剂(gydF4y2BaAZIgydF4y2Ba)随着时间的推移进行分析。的gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba6 h和12 h时，叶片基因转录物积累显著增加gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba，然后是ingydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba，与WT相比(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).相比之下，模拟处理的植物表现出减少gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba所研究的所有基因型的转录物积累(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)。同样的,gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba几乎没有显示gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba表达式(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个)。gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba6 h时表达量高gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba叶间差异无统计学意义(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。此外,gydF4y2BaG3PDHgydF4y2Ba接种后12 h转录本积累增加gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba系统性叶(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).易感突变系gydF4y2Baatgsnor1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba与WT相比，表达降低，而gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba接种后12 h转录本积累量最大(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).同样，另一种SAR标记基因gydF4y2BaAtAZIgydF4y2Ba随时间的变化而不同。在早期时间点，即接种后0、6和12 h，gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示增加gydF4y2BaAZIgydF4y2Ba而在24 h时，其表达量降低(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).类似于gydF4y2BaG3DPHgydF4y2Ba，gydF4y2BaAZIgydF4y2Ba显示转录本积累增加gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba12 h(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)。gydF4y2Baatgsnor1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba显示下降gydF4y2BaAZIgydF4y2Ba随时间变化的表达式(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

AtAO3可能通过aba介导的气孔调节来实现抗旱性gydF4y2Ba

AtAO3参与了ABA生物合成的最后一步。aba诱导的NO生成在干旱胁迫下调节气孔运动[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．因此，我们打算研究no诱导的可能作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba在干旱胁迫调节方面。大约4周大的WT，gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba,gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba突变体在干旱胁迫下保持水分7至10天。这两个gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba与WT相比，表现出严重的干旱症状(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).轻度干旱症状，如叶片枯萎早于(胁迫3天)gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba在WT中突变植株比在WT中突变植株多。gydF4y2Ba

气孔调节在干旱胁迫下限制水分流失方面起着关键作用。我们假设，快速干旱的症状，如萎蔫可能是由于无力gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba关闭气孔因此，我们对WT和的气孔结构进行了可视化gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba控制系和抗旱植株。野生型植株气孔为闭合型，而两者气孔均为闭合型gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba保持开放(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Bab).利用ImageJ程序对气孔开度进行量化。结果表明，在干旱后7d (dpd)，土壤水分含量显著降低gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba突变体显示显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.0001)与WT相比，打开气孔数更高(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

同样，干旱诱导的ABA产生对气孔调节至关重要[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba参与ABA生物合成的最后一步;因此，从理论上讲，与WT相比，该基因功能的丧失应该产生更少的ABA。因此，我们确定了WT和敲除系的ABA水平gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba在控制和干旱胁迫下。我们的结果表明，在控制条件下，gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba与WT相比，ABA含量显著降低，但两者之间无显著差异gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba相比之下，在7 dpd时，显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05)ABA含量显著降低gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba与WT相比(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).我们进一步研究了细胞膜稳定性或电解质泄漏，发现在0 dpd时，包括WT在内的所有基因型的电解质泄漏没有显著差异。然而，在7 dpd时，观察到的电解质泄漏显著增加gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).进一步测定不同基因型的回收率;我们重新浇水，24小时后观察。我们发现，生存率gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba均小于WT(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Bae).这些结果表明，干旱条件下ABA的产生需要AtAO3。气孔打开gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba干旱胁迫后的KO株系的闭合能力受到一定程度的影响，原因是干旱胁迫下ABA的产生较低gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba在干旱条件下。gydF4y2Ba

ABA生物合成和干旱信号基因的转录积累gydF4y2Ba

接下来，我们确定是否丧失了功能gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba影响其他ABA生物合成基因。我们选择了关键的生物合成基因，如gydF4y2BaAtABA2gydF4y2Ba，gydF4y2BaAtABA3gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtNCED3gydF4y2Ba并采用实时qPCR技术进行分析。我们的结果表明，除了gydF4y2BaABA3gydF4y2Ba，与WT相比无显著差异，其余ABA生物合成相关基因在gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba与WT相比(图;gydF4y2Ba8gydF4y2BaA, C和G)。然而，参与ABA信号或干旱调控的基因，如gydF4y2BaAtABI2, AtDREB2gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtAPX1gydF4y2Ba显示转录本积累增加gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba与WT相比(图;gydF4y2Ba8gydF4y2BaB, D, E和F)。gydF4y2BaAtDREB1gydF4y2Ba与WT相比，干旱胁迫后转录本积累无显著差异(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

ROS和RNS都是氧化还原活性分子，是在受到环境伤害后产生的。这些分子具有灭活细胞抗氧化系统的能力，从而改变细胞的氧化还原状态[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．后者的研究较少，在过去的几十年里，由于其在各种植物过程中的显著调节作用，引起了科学家的关注。RNS由NO(一种具有高扩散率的氧化还原活性小分子)产生，调节许多细胞过程，如气孔调节、种子萌发、抗病和植物对非生物胁迫的反应[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．NO通过调控某些基因的转录机制直接控制生理过程。利用微阵列研究了NO对基因表达的整体响应变化[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba， RNA-seq [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]，以及qRT-PCR [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

拟南芥AO基因家族由4个等位基因组成(gydF4y2BaAAO1-4gydF4y2Ba）;它们被认为在ABA生物合成中至关重要，因为它们催化ABA生物合成的最后一步，包括脱落醛的氧化[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．在本研究中，我们重点研究了aba代谢相关基因gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba通过基于rna序列的转录组分析，显示出对常见NO供体CySNO的差异反应。MDS图的生成是为了检测数据的分散性，我们发现在处理过的样本中有一个复制体显示了分散性，这可能是因为该复制体的基础基因表达水平较低(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).所有基因都参与了ABA的生物合成或信号传导(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．有趣的是，大多数ABA生物合成相关基因在NO供体反应中被下调，而大多数信号基因在NO供体反应中被上调。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．以往的研究也发现aba相关基因存在差异表达。有关臭氧处理的研究[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]报道了大约14个与ABA代谢有关的基因，这些基因也在我们的转录组中发现。这表明响应ROS和NO的基因之间存在显著的串扰，如[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．生物过程的GO术语揭示了大多数与蛋白质磷酸化相关的基因(11.5443%)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)，这是一种重要的翻译后修饰，调节蛋白质的功能以响应内部和外部刺激[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．这进一步支持了NO可能导致某些蛋白质翻译后发生重大变化的观点。NO被认为在生物系统中通过gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝化[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．类似地，在GO分子功能方面，大多数基因(23.40%)与氧化还原酶活性相关(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).氧化还原酶是调节NO生成和/或信号传导的关键酶[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

许多gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控元件在cysno诱导的ABA代谢相关基因的启动子区域发现，这些启动子区域距离转录起始点的距离不同。其中包括参与调控干旱响应基因的ABRE (TACGTG) [gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]， EIRE (TTCGACC)参与最大诱导因子介导的基因激活[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]和ERE (ATTTCAAA，乙烯响应元件，顾名思义，调节乙烯介导的反应)[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．一些重要的干旱响应基因包括参与干旱胁迫调控的MBS (CAACTG myb结合位点)[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]， WRKY转录因子结合位点W-box (TTGACC) [gydF4y2Ba61gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，提示cysno诱导的aba相关基因可能参与生物和非生物胁迫相关基因的机制控制。生物信息学方法揭示了no响应基因在其启动子中含有大量的转录结合位点[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba突变体在茎和根的生长方面对氧化和亚硝化胁迫表现出不同的响应。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, c, d).氧化环境下茎根生长的减少主要是由于ROS的过度积累。ROS和RNS是在环境压力下产生的[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．Vanderauwera等人的一项研究[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]表明植物对氧化应激的高敏感性可能是由于除了其他类型的ROS外，还含有高水平的过氧化物。增加笋和根的生长gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba这可能是由于NO在种子萌发和幼苗生长中的积极作用，Kopyra和Gwozdz [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．同样，NO也被认为能打破种子休眠，促进植物生长，效果比GA更好gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．类似地，通过使用各种NO供体，Giba等人[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]揭示了NO在光敏色素控制后树萌发过程中的作用(gydF4y2Ba泡桐tomentosagydF4y2Ba)．中SNO水平的增加进一步支持了这一点gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba在对照组和gsno介导的亚硝化应激条件下，而在氧化应激条件下降低(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae).相反，与GSNO处理的植株相比，CySNO处理的植株在所有基因型中都表现出较低的SNO水平，但与WT CySNO处理的植株相比gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显示SNO积累增加(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae).奇怪的是，CySNO和GSNO处理的植物在SNOs积累方面表现出明显不同的行为，但这可能是由于He等人认为两种NO供体释放NO的能力不同。[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

如前所述，aba相关基因的启动子分析提示存在gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-涉及防御的调控要素;因此，我们研究了gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba在基础和gydF4y2BaRgydF4y2Ba-gene-mediated阻力。我们的研究结果表明gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba负调节基础和gydF4y2BaRgydF4y2Ba-gene-mediated阻力。减少病原体的生长gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba其次是增加gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba基因表达(图;gydF4y2Ba4gydF4y2BaA, b，暗示gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba负调控病原体诱导的SA通路。另一个SA通路相关基因的转录积累gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba与的相比减少了gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba．这可能是因为增加了gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba这种表达已经有助于抵抗病原体，部分可能是一种储存额外代谢能量的策略，这些能量本可以被gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba归纳。我们还观察到HR和gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba对无毒病原体的反应(gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000表达gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba效应)gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba植物，表明gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba同时也是消极调节gydF4y2BaRgydF4y2Ba-gene-mediated阻力。这有力地支持了假设gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba作为SA缺陷突变体负调控病原体诱导的SA通路gydF4y2Baatsid2gydF4y2Ba表现为症状发展严重，病原体生长以增加为减少gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba表达对有毒物质的反应gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, b, c)，减少人力资源和gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba对无毒反应的表达gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).先前的研究也表明aba缺失突变体对生物营养性病原体的抗性[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．广泛的研究已经证实，植物和它们的病原体不断竞争生存和食物。病原体相关分子模式(pamp)被植物模式识别受体识别，导致pamp触发免疫(PTI) [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．然而，一些病原体已经进化并通过修饰的PAMPs逃避PTI，导致效应剂触发的易感性。作为这一策略的一部分，植物已经进化出复杂的防御系统，包括植物抗病能力(gydF4y2BaRgydF4y2Ba)由NBS-LRR编码的基因来识别病原体释放的效应分子[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．因此,gydF4y2BaRgydF4y2Ba-基因介导的抗性是由gydF4y2BaRgydF4y2Ba-基因产物和gydF4y2Baavr的gydF4y2Ba限制病原体在寄主植物内的生长，主要导致HR [gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．通过突变破坏SA通路(例如，gydF4y2BaNahGgydF4y2Ba而且gydF4y2Basid2gydF4y2Ba)显著降低了对病原体的抵抗力[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．SAR标记基因的表达提示gydF4y2BaAtAO3gydF4y2BaSA是一种小的酚类化合物，被认为在植物防御中起着关键作用。研究表明，SA在病原体识别，随后建立局部抗性，并最终将信号传递到系统组织和整个植物中所必需[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ABA，又称“应激激素”，是一种植物激素，在调节水分状态和气孔运动中起关键作用，以保护植物在不利干旱条件下的生长[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．此外，ABA已被证明可以通过外源施药或过表达参与ABA生物合成的基因对特定胁迫的耐受性产生积极影响[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．因此，我们打算确定ABA生物合成基因的作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba朝着耐旱性的方向。我们的研究结果表明gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba突变体在干旱后7d出现快速枯萎，导致植株死亡(dpd;无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).同理，两者都是gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba与WT相比，在干旱条件下ABA含量显著降低(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).更早的枯萎gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba这可能是由于它们无法关闭气孔，作为适应外部环境的一部分。当我们观察两者的气孔结构时，进一步证实了这一点gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba7 dpd后气孔仍保持开放状态(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Bab)并得到气孔开度定量的支持(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这在一定程度上是预期的gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba参与ABA的生物合成，主要被认为是调控气孔运动。类似地，Christmann等人。gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]报道了ABA参与了干旱条件下气孔的关闭。这主要是为了限制水分流失。我们的结果进一步支持了这一点，即功能突变体的丧失gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba与WT相比，显示出快速和过度的水分流失。先前的研究结果也表明，aba控制的过程对植物的生存至关重要，aba缺乏突变体对水分胁迫很敏感[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．中ABA含量明显增加gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba和WT几乎相似;而在干旱条件下，ABA含量降低gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba显著降低(图;gydF4y2Ba7gydF4y2BaC)，暗示gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba可能只有在干旱条件下才需要ABA的生物合成。gydF4y2Ba

我们进一步打算确定功能丧失是如何突变的gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba影响其他干旱胁迫相关基因的表达。我们发现除了gydF4y2BaABA3gydF4y2Ba，两组转录本积累无显著差异gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba和WT，其余与ABA生物合成相关的基因如gydF4y2BaAtABA2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAtNCED3gydF4y2Ba与WT相比，转录本积累减少(图;gydF4y2Ba8gydF4y2BaC, G).然而，即使没有gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba时，注意到一些ABA的产生，这表明，在缺乏gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba，其他基因如gydF4y2BaAtAO2gydF4y2Ba可以执行此功能。在干旱条件下，主要参与ABA信号传导的基因，如gydF4y2BaAtABI2, AtDREB2gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtAPX1gydF4y2Ba表现为诱导表达，表明这些基因对干旱胁迫的反应与细胞中ABA的含量无关;因此，它们被认为是干旱胁迫的关键调节器[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

考虑到在生物和/或非生物应激条件下产生的氧化还原活性分子之间发生了显著的串扰，确定NO在调节这些损伤中的作用将是有趣的。由于其物理化学性质，NO是一种转向分子，具有调节孪生(ROS和RNS)氧化还原分子的潜力。然而，NO的机制控制似乎相当复杂，因为NO可以直接控制某些基因的表达，并具有通过翻译后修饰等改变蛋白质功能的巨大潜力gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚硝化[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，酪氨酸硝化[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，以及甲基化[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．aba代谢相关基因对NO供体的反应表明NO直接或间接参与了干旱调节。然而，需要彻底的调查来阐明潜在的机制。gydF4y2Ba

本研究提示NO可能在调节植物ABA代谢中发挥作用。ABA生物合成基因作用的进一步研究gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba在生物和非生物胁迫条件下表现出不同的作用。gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba负向调控病原体诱导的SA通路，正向调控干旱胁迫。生化分析表明，在正常条件下gydF4y2BaAtAO3gydF4y2BaABA生产可能不需要，但在干旱条件下是需要的，如gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba与野生型植株相比，野生型植株ABA含量显著降低。我们还认为干旱相关基因如gydF4y2BaDREB2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaABI2gydF4y2Ba不同ABA含量对干旱有不同的响应。gydF4y2Ba

ABA代谢相关基因的转录组范围鉴定和分析gydF4y2Ba

此前，Hussain等人在一项基于rna序列的转录组学研究中报道了许多差异表达基因(DEGs)对1mm CySNO的响应。[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．在本研究中，我们重点研究了cysno诱导的ABA生物合成/代谢相关基因(包括上调和下调，直到另有说明)。Hussain等人描述了植物材料和RNA提取和RNA-seq分析方法的细节。[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．简单地说，RNA是从新鲜叶子中提取的，使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen USA)，按照制造商的标准程序。使用生物分析仪(Agilent®2100 Bio-analyzer;Agilent)， RNA文库使用TruSeq™RNA文库准备试剂盒(Illumina USA)生成。接下来，使用KAPA文库定量试剂盒(Illumina USA)合成双链cDNA文库，并使用HiSeq-2500测序仪(Illumina USA)进行测序。通过使用Q20 > 40%的阈值水平处理原始序列读取来识别高质量的读取。Q20 < 40%，或者有10%歧义碱基的读取被丢弃[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．然后将高质量的读数对准gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba使用TopHat和默认参数[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．基因注释来源于Ensembl [gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]，并使用Cufflinks软件包v2.2.1 [gydF4y2Ba85gydF4y2Ba］．使用Cuffdiff v.2.2.1计算对照和处理条件下基因和转录本的表达量[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]，以鉴定显著性的DEGs (Q < 0.05)，然后进行进一步分析。gydF4y2Ba

所有的deg通过MapMan 3.6.0RC在拟南芥数据库中进行映射，如[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．基于为ABA代谢指定的BIN数(17.1.1,17.1.1.1.1,17.1.2和17.1.3)，我们确定了约26个参与ABA代谢的DEGs(17个上调，9个下调)。所有的基因都是人工检查的，重复的条目被删除。利用FPKM值生成热图gydF4y2BaRgydF4y2Ba3.3.1版本。R (gydF4y2Bahttps://www.r-project.org/gydF4y2Ba)以可视化处理样本和对照样本之间的表达值差异，并开发了表示层次聚类的树状图。多维散射(MDS)图也由三份对照和cysno处理样本的FPKM值生成，以可视化数据中的离散性gydF4y2BaRgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

启动子分析gydF4y2Ba

aba相关基因大多被认为只参与非生物胁迫。然而，这些基因对NO供体的反应也可能使它们成为生物应激的潜在目标。因此，我们打算研究cysno诱导的ABA代谢相关基因的启动子区域是否存在gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba监管元素。所有这些基因转录起始位点上游1 Kb的启动子序列从TAIR (gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba)，并使用PlantCARE (gydF4y2Bahttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/gydF4y2Ba)．许多gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-调控元件在启动子区被发现，其中少数在生物和非生物胁迫条件下都有重要作用的调控元件被选择出来;然后使用调控序列分析工具中的模式匹配工具进行映射[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba]包，使用默认参数。使用microsoftpowerpoint (gydF4y2Bahttps://www.office.com/gydF4y2Ba)及adobephotoshopcs6 (gydF4y2Bahttps://www.adobe.com/products/photoshop.htmlgydF4y2Ba)．gydF4y2BaAtAAO3gydF4y2Ba(AT2G27150)在ABA生物合成途径中起关键作用，因此选择其进行体内分析。它调节ABA生物合成的最后一步，在这一步中它将脱落醛转化为ABA。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

拟南芥种子，野生型Col-0gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baataao3gydF4y2Ba(AT2G27150)，功能缺失突变体，从诺丁汉拟南芥种群中心(NASC) (gydF4y2Bahttp://arabidopsis.info/gydF4y2Ba)．的gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2BaATGSNOR1基因缺失是由爱丁堡大学的Gary Loake教授提供的。植物在1/2 Murashige和Skoog (MS)培养基上或23±2°C的土壤上生长，在长日照条件下(光照16小时和黑暗8小时)。植株在莲座期(4周龄植株)进行基因分型，以鉴定纯合子系。拟南芥WT和其他所有用于研究的系均具有Col-0遗传背景。ROS和RNS细胞水平的变化会影响含金属的酶，如过氧化物酶和过氧化氢酶[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．既然我们打算确定的作用gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba基因在植物氧化还原胁迫条件下(氧化和亚硝化)，我们使用gydF4y2Baatgsnor1-3gydF4y2Ba而且gydF4y2Baatcat2gydF4y2Ba由于突变体在植物免疫和生长中已被证实的作用，它们可作为比较对照[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．类似地,gydF4y2Baatsid2gydF4y2BaSA途径缺失突变体作为SA介导防御途径的对照[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba),而gydF4y2Baatnced3gydF4y2Ba缺乏gydF4y2BaAtNCED3gydF4y2Ba用于aba相关的防御反应[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

氧化还原应力试验gydF4y2Ba

的可能作用gydF4y2BaAtAAO3gydF4y2Ba如前所述，将WT和KO突变体置于亚硝化和氧化应激条件下[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba］．简而言之，拟南芥种子WT和gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba种子表面用含0.1% Triton X-100 (Sigma Aldrich，美国)的50%漂白剂溶液消毒5分钟。然后用无菌蒸馏水冲洗种子3次，在4℃下分层24 h，使种子均匀发芽。然后在添加2 mM H的1/2强度MS培养基上发芽gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加1 μM甲基紫精(氧化应激)、1 mM GSNO和1 mM CySNO(亚硝化应激)，每重复至少8粒。处理1周和2周后记录子叶发育频率(CDF，绿色发育种子的数量)，处理2周后记录根和茎长。gydF4y2Ba

病原体生长和接种gydF4y2Ba

两种类型的细菌菌株，毒性和无毒gydF4y2Ba两gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba番茄gydF4y2Ba（gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba)被用于这项研究。致命的gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000无毒gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000表示gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba如前所述，培养、维持和接种效应物[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．简单地说，两株细菌都在含有Luria-Bertani (LB)-琼脂培养基的培养皿上培养，并加入相关抗生素进行筛选(100 mg/mL利福平为毒力gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000和卡那霉素(50 mg/mL)和利福平用于gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (avrB)。在28℃下孵育过夜，然后将单个菌落转移到LB肉汤中，在28℃下连续震动孵育过夜。然后在台式离心机(LaboGene Model no 1524 Korea)中以8000 rpm离心3分钟收集细菌，在10 mM MgCl中重新悬浮gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，以5 × 10的浓度向叶片背面注射gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU为毒，而5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU为无毒菌株。接种三次，每株接种三片叶子。对照植物仅用缓冲液(10 mM MgCl)浸润gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．定期观察植物的疾病症状，并随着时间的推移收集叶片样本进行进一步分析。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR分析gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析方法如下[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．简单地说，根据制造商的协议，使用Trizol®(Invitrogen, USA)从接种的叶片中提取总RNA。根据制造商说明，使用DiaStar™RT试剂盒(SolGent，韩国)合成互补DNA (cDNA)。然后将合成的cDNA作为模板，在实时PCR仪(Illumina, USA)中研究植物防御标记基因，如gydF4y2Ba公关gydF4y2Ba，参与sa依赖防御通路。这些基因及其引物序列的详细列表在附加文件中提供gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．PCR使用EcoTM实时PCR仪，使用2× real-time PCR Master Mix(包括SYBR®Green I BioFACT™Korea)，加入100 ng模板DNA和每个引物10 nM，最终体积为20 mL。“无模板对照”被用作含有蒸馏水而不是模板DNA的阴性对照。两步pcr在以下条件下进行40个循环:聚合酶在95°C激活15分钟，在95°C变性15秒，在60°C退火和延伸30秒。在60-95°C下评估熔化曲线，以验证每个引物对的扩增子特异性，并使用肌动蛋白作为内参基因。gydF4y2Ba

组织学染色gydF4y2Ba

小波型和小波型的超敏反应(HR)gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba植物对gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)按照Koch和Slusarenko的描述，使用台盼蓝组织学染色对浸润进行定量[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．对于这个，WT的叶叶和gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba植物接种gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)用乳酚台潘蓝染色，然后用饱和水合氯醛脱色。然后将叶子装在70%甘油的载玻片上，用光学显微镜捕捉图像。如前所述，使用Adobe Photoshop CS6根据台盼蓝染色强度定量细胞死亡(任意单位)[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

SNO测量gydF4y2Ba

如前所述，评估各种应激后细胞SNO水平[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．简单地说，对于在氧化或亚硝化胁迫(在“氧化还原应激试验”小节中详细提到)的1 / 2 MS培养基上生长的植物，在暴露于各自的(氧化和亚硝化)胁迫条件后2周收集样品。用于测定植物致病后的SNO水平;选取4周龄的植株，分别于0、12、24 h采集样品gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000 (gydF4y2BaavrBgydF4y2Ba)接种。植物样品(各两片叶子作为一个重复)在液氮中研磨，并在PBS缓冲液中均质。然后，样品在冷藏离心机中以15000转/分的速度离心(1736 R LABOGENE Korea;转子GRF-L-m2.0-30) 10分钟。上清液转移到新鲜试管中，再次以15000转/分离心5分钟。将约100 ul上清液注入NO分析仪(NOA- 280i, Sievers, and USA)的吹扫容器中，记录峰值。采用Bradford法测定所有植物样品中的总蛋白质含量[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．用光密度法(OD)建立了测定样品中蛋白质浓度的标准曲线gydF4y2Ba_595gydF4y2Ba)的牛血清白蛋白(BSA)标准。SNO含量(pmol。μggydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}通过比较每个样品的峰值与各种CySNO标准得到的值来计算样品中的蛋白质)。gydF4y2Ba

耐旱性试验gydF4y2Ba

以4周龄植株为研究对象，采用保水法进行干旱胁迫[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．用等量的水灌溉避免了实验误差，在水分完全吸收后将托盘转移到干燥的托盘底座上。将植物置于干旱条件下7 ~ 10天。对照植物定期浇水。研究了电解质泄漏和气孔调节等参数。研究了可能参与干旱胁迫调节的基因的转录积累。10 d后重新浇水，浇水24 h后计算回收率。对所有基因型在干旱胁迫下的表型反应进行了评估。gydF4y2Ba

用于细胞死亡定量的电解质泄漏测量gydF4y2Ba

离子或电解质泄漏的测量方法如下[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba作了一些修改。在干旱后0天和7天，分别从对照和干旱胁迫处理的植株中采集叶片样本。叶盘(直径1 cm)分3个重复收集，每个重复至少3个(来自不同叶片)。用去离子水冲洗叶片，去除表面电解质，并转移到装有5毫升去离子水的玻璃管中。试管在室温下保持24小时，并持续轻度震动，使用便携式电导率仪(HURIBA Twin Cond B-173;日本);这被称为电解质泄漏(EL1)。然后将样品在120°C下高压灭菌20分钟，冷却至室温(~ 25°C)。再次测量各样品的电解质泄漏量(EL2)。EL(%)测定如下:gydF4y2Ba

El (%) = (el1 / el2) × 100。gydF4y2Ba

气孔结构分析gydF4y2Ba

以确定是否gydF4y2BaAtAO3gydF4y2Ba参与气孔调节，我们研究了WT和gydF4y2Baatao3gydF4y2Ba在控制和干旱条件下的突变体，如前所述[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．简单地说，在叶子的背面涂上一层薄薄的透明指甲油，然后晾干几分钟。将透明透明胶带小心地涂在干指甲油上，轻轻按压，使气孔清晰可见。胶带被小心地从叶子上取下来，安装在一个显微镜载玻片上。在Axioplan 2成像显微镜下观察制备的载玻片(Axioplan 2成像;卡尔蔡司，耶拿，德国)。为了量化干旱胁迫后WT和转基因株系的气孔开放程度，并从统计学上评价其气孔响应，我们使用ImageJ成像显微镜对图像进行了分析。gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．选择直线工具测量每幅图像上的比例尺，将比例尺值设置为200 μm。设定刻度值后，在一个保护细胞内壁到另一个保护细胞内壁最宽处测量气孔。计算并绘制了野生型和转基因系各18个气孔的平均值。gydF4y2Ba

ABA含量测定gydF4y2Ba

齐等人的详细方法。gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]用于内源ABA的定量。在对照和干旱条件下采集的植物样品进行冷冻干燥和研磨，得到细粉，然后用ABA (Me-[2H6]-ABA)标准提取和色谱。样品的部分因此甲基化使用重氮甲烷。最后采用GCMS (6890n网络气相色谱仪)对ABA进行检测和定量。信号离子(m/z-162和m/z-190对于Me-[2H6]- aba)和(m/z-166和m/z-194对于Me-[2H6]- aba)使用ThermoQuset(曼彻斯特，英国)监测。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有实验都重复了两次以上，并给出了具有代表性的结果。氧化还原胁迫试验的数据点平均为3个重复，每个重复5株植物，而致病性评估和菌落生长的数据点平均为5个重复。对于具有多重应力的实验，数据进行单向方差分析(one-way ANOVA)，然后使用SAS统计程序9.2版(Cary, Nc，美国)进行邓肯多范围检验(DMRT)。其余数据进行标准误差(±SE)和学生分析gydF4y2BatgydF4y2Ba．测试计算gydF4y2BapgydF4y2Ba价值使用微软Excel程序。所有的图表都是在Origin 9.0软件中制作的。gydF4y2Ba

所有的支持性数据都可以作为附加文件与此手稿一起找到。在本研究中分析的进一步数据可根据通讯作者的合理要求提供。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

代谢:gydF4y2Ba

醛氧化酶类gydF4y2Ba

AtSABP3:gydF4y2Ba

拟南芥水杨酸结合蛋白3gydF4y2Ba

AZI:gydF4y2Ba

壬二酸诱导剂gydF4y2Ba

爆炸:gydF4y2Ba

基本的本地对齐搜索工具gydF4y2Ba

提供:gydF4y2Ba

子叶发育频率gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

公司:gydF4y2Ba

干旱后的天数gydF4y2Ba

EL1:gydF4y2Ba

电解质泄漏1gydF4y2Ba

G3PDH:gydF4y2Ba

甘油醛3-磷酸脱氢酶gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

谷胱甘肽:gydF4y2Ba

谷胱甘肽gydF4y2Ba

人力资源:gydF4y2Ba

过敏的反应gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige和SkooggydF4y2Ba

NBS-LRR:gydF4y2Ba

核苷酸结合位点-亮氨酸富重复序列gydF4y2Ba

nc:gydF4y2Ba

9-cis-epoxycrotenoid加双氧酶gydF4y2Ba

NPR1:gydF4y2Ba

发病相关基因-1的非表达gydF4y2Ba

哦:gydF4y2Ba

氢氧自由基gydF4y2Ba

PMT:gydF4y2Ba

翻译修饰gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

RNA-Seq:gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

RNIs:gydF4y2Ba

活性氮中间体gydF4y2Ba

roi:gydF4y2Ba

活性氧中间体gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

山::gydF4y2Ba

激素水杨酸gydF4y2Ba

特别行政区:gydF4y2Ba

全身获得性耐药性gydF4y2Ba

TAIR:gydF4y2Ba

拟南芥信息资源gydF4y2Ba

TFs:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

感谢拟南芥生物资源中心提供种子，感谢Adamu Tefere Alem先生和Rolly Nukulu Kabange先生在实验过程中的指导。gydF4y2Ba

这项工作得到了下一代生物绿色21计划(SSAC，授权号:SSAC)的资助。， PJ01342501)，韩国农村振兴厅。此外，资助机构在研究设计、数据收集和解释或撰写手稿方面没有任何作用。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Murtaza Khan, Qari Muhammad Imran和Muhammad Shahid对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 植物功能基因组学实验室，庆北大学植物生物科学系，大邱，韩国gydF4y2Ba

   文奉圭，李相旭，尹炳旭gydF4y2Ba

2. 庆北大学植物生物科学系植物生理学实验室，大邱，韩国gydF4y2Ba

   穆罕默德·阿齐尔·汗和李仁贞gydF4y2Ba

3. 巴基斯坦马尔丹，KPK Abdul Wali Khan大学农业部gydF4y2Ba

   阿迪尔侯赛因gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

QMI和B-WY设计了研究;MK、QMI和MS进行实验;MK、QMI、AHU和BGM对数据进行分析;MK、QMI、MS、SL测定SNO水平，MAK测定ABA水平，QMI、AHU起草稿件;IL和B-WY监督并严格审查了手稿。所有作者都已阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaByung-Wook云gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

本研究所用植物材料均从拟南芥生物资源中心订购。所进行的实验符合国家和国际准则。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba