玉米TCA循环基因的鉴定与鉴定

背景

三羧酸(TCA)循环是细胞能量代谢和碳骨架供应的关键。然而，玉米TCA循环基因的具体功能尚不清楚。

结果

本研究通过同源性搜索，在玉米中鉴定出91个TCA基因，它们分布在10条染色体和1个染色体上。系统发育结果表明，几乎所有玉米TCA基因都可以按照酶科划分为8个主要分支。序列比对显示，同一亚基中的几个基因具有高度的蛋白质序列相似性。顺式作用元件分析结果表明，多个TCA基因可能参与信号转导和植物生长。表达谱分析表明，许多玉米TCA循环基因在特定组织中表达，且复制基因表达模式相似。qPCR分析结果显示，部分TCA基因在小孢子减数分裂期花药中高表达。此外，我们还预测了玉米TCA基因之间潜在的相互作用网络。接下来，我们克隆了5个位于不同TCA酶复合物上的TCA基因，分别是Zm00001d008244(异柠檬酸脱氢酶，IDH)、Zm00001d017258(琥珀酰辅酶a合成酶，SCoAL)、Zm00001d025258 (α-酮戊二酸脱氢酶，αKGDH)、Zm00001d027558(乌头酶，ACO)和Zm00001d044042(苹果酸脱氢酶，MDH)。共聚焦观察显示，其蛋白产物主要定位于线粒体;而Zm00001d025258和Zm00001d027558也分布在细胞核中，Zm00001d017258和Zm00001d044042也分布在细胞质中的其他未知位置。 Through the bimolecular fluorescent complimentary (BiFC) method, it was determined that Zm00001d027558 and Zm00001d044042 could form homologous dimers, and both homologous dimers were mainly distributed in the mitochondria. However, no heterodimers were detected between these five genes. Finally, Arabidopsis lines overexpressing the above five genes were constructed, and those transgenic lines exhibited altered primary root length, salt tolerance, and fertility.

结论

研究了所有玉米TCA周期基因的序列组成、复制模式、系统发育关系、顺式元件、表达模式和相互作用网络。5个玉米TCA基因在拟南芥中过表达，它们可以改变原根长度、耐盐性和育性。综上所述，我们的研究结果可能有助于揭示玉米TCA基因的分子功能。

三羧酸(TCA)循环，也被称为克雷布斯循环或柠檬酸循环，是汉斯·克雷布斯在1937年发现的。TCA循环在动物、植物和微生物细胞中普遍存在，对细胞能量和碳骨架供应至关重要，尤其是糖分解代谢、脂肪分解代谢和蛋白质分解代谢[1］．一般来说，TCA循环由8种酶组成，柠檬酸合成酶(CSY)、乌头酶(ACO)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、α-酮戊二酸脱氢酶复合物(αKGDHC)、琥珀酸辅酶a合成酶(SCoAL)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、富马酶(FUM)和苹果酸脱氢酶(MDH)。对番茄TCA突变体的一系列研究表明，富马酶、苹果酸脱氢酶和ɑ-酮戊二酸脱氢酶在调节TCA循环的代谢水平方面起着关键作用[2］．此外，除了柠檬酸和琥珀酰辅酶a的合成外，TCA循环的大多数反应都是可逆的[3.，4］．此外，TCA周期中SCoAL和SDH催化的反应只能在线粒体中进行，而TCA周期中的其他反应可以被其他亚细胞区隔中的类似反应所取代[2］．

TCA循环基因与根和子叶发育有关[5，6，叶片衰老[7，花的发育[8，9，10，果实成熟[7，11，种子发芽[12，13和其他发展过程[3.，14］．大多数番茄TCA酶复合物的分子功能已被详细研究[2］．例如，抑制苹果酸脱氢酶、乌头酶或富马酶可以降低根系呼吸活性和干物质积累，提高果实产量。然而，苹果酸脱氢酶和乌头酶反义突变体提高了番茄叶片的光合性能，而富马酶反义突变体降低了番茄叶片的光合性能[15，16，17，18］．奇怪的是，当柠檬酸合成酶、琥珀酸辅酶a合成酶或异柠檬酸脱氢酶被抑制时，突变体没有表现出任何显著变化[19］．这可能是因为TCA循环中的大多数反应可以被其他亚细胞位置的类似反应所取代[20.］．

除了提供能量外，TCA循环还参与细胞中的许多代谢途径，包括光合作用[19，21),光呼吸(22]，非生物胁迫[23，24，25，26，27]、生物钟[28]，激素信号[29，以及糖酵解[30.］．迄今为止，许多直接与TCA蛋白相互作用或调节细胞TCA周期活性的因素也已被确定。例如，在糖异生过程中，TCA循环中的苹果酸脱氢酶可与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶相互作用，表明TCA循环与糖异生之间存在直接联系[31］．此外，已经确定了TCA循环酶亚基与与其他途径(线粒体电子传递复合体/ATP合成、氨基酸代谢和氧化还原应激)相关的蛋白质之间的125种相互作用[14］．硅藻中的转录因子bZIP14Phaeodactylum tricornutum能结合TCA基因的启动子，直接激活TCA循环基因表达[27］．此外，硫氧还蛋白已被证明可以通过调节硫醇氧化还原状态来调节线粒体TCA循环的活性[32］．综上所述，上述结果反映了TCA循环函数的多样性和复杂性。

TCA循环是细胞能量代谢的关键，在许多发育过程中起着关键作用;因此，揭示TCA循环基因的分子功能可能为植物发育提供更深入的认识。迄今为止，关于TCA循环基因的实验大多是在拟南芥和番茄中进行的。在玉米中，TCA代谢水平与根系发育密切相关[33，缺乏磷[34，以及干旱和盐胁迫[35，36，37]，但TCA基因的分子功能尚不清楚。在本研究中，我们鉴定了玉米中所有的TCA循环基因，并分析了它们的系统发育关系和表达模式。随后，分析了它们的顺式作用元件、亚细胞定位和相互作用网络。最后，在拟南芥中分别过表达5个TCA基因，研究其对根生长、抗盐胁迫和生殖生长的影响。

玉米TCA循环基因的生物信息学分析

为了全面分析玉米TCA基因的功能，通过序列相似性搜索，在玉米基因组中识别出91个TCA周期基因，并将少数e值高于阈值的基因纳入本研究(图5)。1和额外的文件2)．在8种TCA酶中，鉴定出20个SDH基因、18个αKGDHC基因和15个IDH基因。此外，CSY和MDH均鉴定出4个基因，MDH、ACO和SCoAL分别鉴定出13、11和6个基因。同时，我们发现位于同一酶或亚基上的基因往往具有较高的蛋白质序列相似性(图1)。1)．所有TCA基因在玉米基因组上的定位表明，它们不均匀地分布在10条染色体上，Zm00001d000295在一个染色体上。基因重复分析表明，玉米TCA循环基因中存在5对重复基因(图5)。2)，每一对重复基因总是来自同一个酶复合体，说明基因重复事件在玉米TCA基因扩增中起着重要作用。

玉米、拟南芥和番茄TCA蛋白的系统发育分析

考虑到拟南芥和番茄TCA基因的分子功能信息越来越多，我们构建了一系列玉米、拟南芥和番茄TCA蛋白的系统发育树(图1)。3.)．结果表明，194个TCA蛋白按TCA酶复合体分为8组。此外，由于酶亚基的存在，IDH、αKGDHC和SDH蛋白被分为三个亚群:SCoAL蛋白有两个亚群，MDH蛋白有四个亚群。通过系统发育分析，发现了ACO(4对)、CSY(1对)、FUM(1对)、IDH(4对)、MDH(4对)、αKGDHC(6对)、SCoAL(2对)、SDH(3对)等多个同源蛋白。玉米TCA蛋白之间存在大量的同源对，说明玉米TCA基因的扩增主要发生在同源基因分裂后。有趣的是，ACO、IDH、MDH、αKGDHC、SCoAL和SDH亚家族中几个不同的分支只由玉米蛋白组成，这表明玉米的一些TCA成员是通过基因复制扩增的。

玉米TCA基因启动子区分析

通过分析各基因启动子区顺式作用元件，揭示玉米TCA循环基因的表达模式。在它们的启动子区发现了一些与重要生理过程相关的调控元件，如光响应、激素响应、环境响应和发育相关元件。4)．光响应元件G-box广泛存在于各基因的启动子区，表明这些基因可能参与光合作用和碳水化合物代谢。ABA和MeJA是植物胁迫响应的重要信号分子，其对应的响应元件ABRE (ACGT-containing脱落酸响应元件)[38， CGTCA-motif (meja响应元件)[39和TGACG-motif (meja响应元件)[39]，也出现在多个TCA基因的启动子区，表明这些基因可能参与生物或非生物的应激反应。此外，几个TCA周期基因的启动子中含有许多与环境响应相关的元件，如STRE(应激响应元件)[40和LTR(低温响应元件)[41]，这表明这些基因的表达水平可能受到环境压力的调节。此外，在启动子中发现了许多MYB和MYC识别和结合元件，提示它们的表达可能受到MYB和MYC转录因子的调控。此外，我们还发现同一酶复合物中部分基因顺式作用元件相似，包括Zm00001d007966与Zm00001d013966 (SDH)、Zm00001d021908与Zm00001d00667 (SCoALɑ)、Zm00001d009640与Zm00001d039089 (MDH)、Zm00001d040721与Zm00001d025258(ɑKGDH)、Zm00001d008244与Zm00001d025690 (IDH)。这表明它们可能在植物发育过程中进行合作。

玉米TCA循环基因的表达谱

首先，比较拟南芥、番茄和玉米中TCA基因的表达水平(图1)。3.:(1) CSY、aKGDHC、IDH、MDH基因大部分在根、叶、花中表达;(2)大部分SDH基因在叶片中表达量低，在根和花中表达量高;(3) ACO和SCoAL基因大部分在拟南芥和番茄的根系中特异性表达，而在玉米的叶片和流苏中特异性表达;(4) FUM基因在拟南芥和番茄的根、叶和花中均有表达，而在玉米的流苏中表达最为明显。

接下来，研究玉米TCA循环基因在不同器官中的表达模式。我们发现玉米TCA基因在几乎所有被测器官中都有广泛的表达，根据表达模式可分为3个亚群(图5)。5A):(1)第一簇基因主要在花药和流苏中表达;(2)第二类基因大部分在不同器官中表达;(3)第三组中其余基因主要在穗和梢中表达。同时，表达谱显示，大部分TCA基因优先表达在花药和流苏中，这可能与雄性生殖器官对能量的大量需求有关。有趣的是，同一个酶复合体中的基因似乎总是具有相似的表达谱，这表明那些具有相似表达模式的重复基因可能是功能冗余的，并可能在进化过程中保留了它们的功能。

进一步，对于在雄性生殖器官中高表达的玉米TCA基因，我们利用qPCR分析其在小孢子发育不同阶段的表达水平(图5)。5b).发现这些TCA基因在花药中的表达特征可分为两类:(1)一些基因的表达水平在不同的小孢子发育阶段似乎相对稳定,如Zm00001d027558 Zm00001d048358, Zm00001d025690, Zm00001d015856, Zm00001d053684, Zm00001d053685,和(2)剩下的基因高表达水平在小孢子减数分裂但低表达水平在有丝分裂期间,如Zm00001d008244 Zm00001d040438, ZM00001d017258, Zm00001d051129, Zm00001d003923, Zm00001d025258, Zm00001d036328, Zm00001d009163,Zm00001d040721, Zm00001d044042。

亚细胞定位分析

本研究基于拟南芥同源位点对玉米TCA蛋白定位进行了初步预测[42］．大多数TCA蛋白位于线粒体中，但也有一些蛋白定位于细胞质、过氧化物酶体或叶绿体(图。1基于上述预测结果，选择5个来自不同酶复合体的基因在烟草叶片中进行进一步的亚细胞定位分析。如图所示。6时，带有红色荧光的线粒体标记在细胞内呈点状分布。此外，对于每个基因来说，它们的大部分绿色荧光与红色荧光重叠，这表明这5个基因都位于线粒体中。如图中箭头所示。6，我们发现Zm00001d017258 (SCoAL)和Zm00001d044042 (MDH)也在细胞质的其他位置。在Zm00001d025258 (αKGDH)和Zm00001d027558 (ACO)转化的叶片中，我们发现细胞核中也出现了一些绿色荧光，表明这两个基因同时位于线粒体和细胞核中。

玉米TCA基因的相互作用网络

植物TCA循环中的蛋白质相互作用是细胞内酶促反应的关键。在此，我们利用STRING软件构建了所有玉米TCA基因之间的相互作用网络(图1)。7)．共有来自5个酶复合物的41个蛋白参与了TCA互作网络，其中来自aKGDHC复合物的15个基因参与了互作网络，ACO、MDH和FUM基因不参与互作网络。根据预测结果，我们发现玉米TCA基因之间的相互作用主要发生在来自同一酶或同一亚基的蛋白质之间。此外，通过BiFC共进行了25组蛋白互作试验，研究了上述5个基因之间的相互作用(图。8a).发现在所有25组蛋白相互作用试验中，只有Zm00001d027558 (ACO)和Zm00001d044042 (MDH)形成同型二聚体，没有观察到异型二聚体(图)。8b).此外，先前的蛋白定位结果显示，Zm00001d027558 (ACO)在线粒体和细胞核中都有定位，而BiFC结果显示其同型二聚体只在线粒体中形成。同样，Zm00001d044042 (MDH)定位于线粒体和细胞质中，但其同型二聚体只存在于线粒体中。

过表达5个玉米TCA基因的拟南芥系根长分析

本研究在拟南芥中过表达了五个TCA基因:Zm00001d008244 (IDH)、Zm00001d017258 (SCoAL)、Zm00001d025258(ɑKGDH)、Zm00001d027558 (ACO)和Zm00001d044042 (MDH)，用于功能研究。选择这5个基因进行功能研究主要是因为它们来自不同的酶复合体，表达模式不同，对它们的功能分析可以反映TCA周期基因的功能多样性。通过抗生素筛选、PCR和共聚焦显微镜，发现了一系列过表达5个TCA基因的单拷贝拟南芥系3.)．其中，Zm00001d008244(#3， #8)、Zm00001d017258(#8， #10)、Zm00001d025258(#6， #8)、Zm00001d027558(#5， #15)和Zm00001d044042(#20， #29)进行进一步表型分析。如图所示。9Zm00001d008244 (IDH)、Zm00001d017258 (SCoAL)、Zm00001d025258(ɑKGDH)和Zm00001d044042 (MDH)过表达株系的主根长度显著小于野生型，而Zm00001d027558 (ACO)过表达株系的主根长度基本不变。上述结果表明，少数TCA基因与根的发育有关。然而，主根长度的变化似乎对植株生长没有明显的影响，因为过表达植株与野生型植株之间没有观察到芽和整体生长的明显变化。

过表达5个玉米TCA基因的拟南芥系的盐胁迫分析

在正常的1/2 MS培养基中，各过表达系的发芽率均在97%以上，与野生型发芽率无差异(图1)。10a).在200 mM NaCl胁迫下，野生型的发芽率约为17%，过表达系的发芽率普遍小于10%(图1)。10b).其中，Zm00001d025258和Zm00001d027558转基因株系的发芽率甚至低于2%，显著低于野生型。以上结果表明，过表达候选基因Zm00001d025258(ɑKGDH-E2)和Zm00001d027558 (ACO)可以提高拟南芥对盐的敏感性。

过表达5个玉米TCA基因的拟南芥系的育性分析

为了揭示TCA循环在植物繁殖中的作用，我们对相应的过表达系进行了镜蕊外观观察。我们发现过表达系Zm00001d017258-、Zm00001d025258-、Zm00001d027558-和Zm00001d044042-的siilique外观与野生型相似(图1)。11a).相比之下，Zm00001d008244 (IDH)过表达系与野生型相比表现出育性缺陷。特别地，在过表达系zm00001d008244中观察到很少短而空的角果(图1)。11b).此外，用western blot方法确认过表达系中Zm00001d008244蛋白的丰度(附文件4)．以上结果表明，Zm00001d008244蛋白的过量积累降低了拟南芥的生育能力。

TCA循环在动植物和各种微生物中普遍存在，它可以产生氧化磷酸化所需的NADH和生物合成所需的有机酸，如草酰乙酸、柠檬酸、富马酸和苹果酸[1，3.，20.］．在本研究中，我们鉴定了构成玉米TCA循环酶复合体的91个基因。其中，Zm00001d008244 (IDH)、Zm00001d017258 (SCoAL)、Zm00001d025258(ɑKGDH)、Zm00001d027558 (ACO)、Zm00001d044042 (MDH) 5个基因分别分布在5个不同的酶配合物上进行进一步的功能分析。亚细胞定位结果显示，这5种蛋白主要位于线粒体中，提示它们主要在线粒体中起作用。而Zm00001d025258和Zm00001d027558也出现在细胞核中，Zm00001d017258和Zm00001d044042的翻译产物分布在细胞质中，提示上述4个基因可能在细胞中具有其他功能。一些TCA周期基因在线粒体以外的多个细胞位置发挥作用，这反映了TCA基因的多样性[2］．

在拟南芥TCA循环中，发现了大量的相互作用，包括相同或不同酶的催化亚基之间的相互作用[43］．在本研究中，我们预测了玉米TCA基因之间的许多相互作用，但这需要进一步的实验验证。进一步，通过BiFC，我们没有检测到以上五个TCA基因之间的异二聚体，只发现Zm00001d027558 (ACO)和Zm00001d044042 (MDH)可以形成同源二聚体。有趣的是，这些二聚体只存在于线粒体中，这与它们的蛋白质定位并不完全一致。除线粒体外，蛋白质Zm00001d027558和Zm00001d044042分别位于细胞核和细胞质中。前人发现异源二聚[44，45，可选拼接[46]，以及外部信号刺激[47，48可以改变蛋白质的细胞定位。在本研究中，我们的结果表明，Zm00001d027558和Zm00001d044042两个蛋白的同源二聚体改变了它们的细胞内定位，但具体意义尚不清楚。

本研究将上述5个TCA基因在拟南芥中过表达，揭示其在植物发育中的潜在作用。研究表明，三羧酸循环基因与根系发育密切相关。例如，在番茄中，抑制MDH、ACO或FUM可降低根系呼吸活性和干物质积累[15，16，17，18］．在本研究中，我们发现Zm00001d008244 (IDH)、Zm00001d017258 (SCoAL)和Zm00001d044042 (MDH)三个基因的过表达显著缩短了拟南芥的主根长度。一些能量相关基因的过表达可能导致线粒体功能障碍，最终影响植物的正常发育[49，50，51］．对于我们的研究结果，我们假设这些TCA循环基因表达水平的升高可能会对线粒体产生一定的负面影响，并最终抑制根的生长。

能量代谢基因的协调表达对胁迫条件下植物的生长发育至关重要[52］．在有利条件下，光合作用是细胞生长的主要能量来源，而在应激条件下，光合作用速率会降低，糖酵解和TCA循环会为细胞提供能量[53］．作为能量代谢的关键环节，TCA循环已被证实与玉米耐盐性有关[36，37，54］．本实验中，Zm00001d025258(ɑKGDH)和Zm00001d027558 (ACO)的过表达增强了拟南芥对NaCl胁迫的敏感性，表明了它们在植物抗逆性方面的应用价值。此外，植物种子会躲避环境胁迫，从而降低了胁迫条件下种子的发芽率[55］．例如，AtFUSCA3在高温条件下延缓种子萌发，但在适当的温度下恢复种子萌发[56］．因此，Zm00001d025258(ɑKGDH)和Zm00001d027558 (ACO)可能通过抑制胁迫下种子萌发参与植物的抗逆性。

TCA循环与植物花的发育密切相关。例如，抑制烟草中丙酮酸脱氢酶E1a亚基的表达可引起雄性不育[9]， SDH功能失调可导致拟南芥配子体发育异常、花粉败育和种子数量减少[10］．异柠檬酸脱氢酶(IDH)氧化异柠檬酸生成ɑ-酮戊二酸。在本研究中，我们发现玉米IDH基因Zm00001d008244过表达会降低植株的育性。在未来，有必要检查是否雄性配子、雌性配子或胚胎发育导致生育能力不足。令人惊讶的是，拟南芥的IDH敲除突变体和番茄的IDH反义突变体都没有显著的表型变化[19，57，58］．我们推测这可能是由于不同物种之间TCA基因功能的差异。例如，在大豆中，GmmMDH1零突变体使绿叶变黄[59]，而棉花中GhmMDH1基因的敲除导致苹果酸含量降低，呼吸速率增加，生物量减少[60］．而抑制番茄线粒体苹果酸脱氢酶可降低根和叶呼吸速率，增加地上部分干物质质量和果实大小，并导致花期提前[16，18］．在拟南芥中，线粒体苹果酸脱氢酶T-DNA双突变体mmdh1mmdh2生长更小、更慢，叶片呼吸速率增加[61］．本试验中除Zm00001d008244外，其余基因均不影响植株的育性。TCA周期与调节植物生殖发育的生物钟有关[62，63，64]，所以确定昼夜节律的变化是否会影响这些过表达植物的生育能力是很有趣的。综上所述，上述结果反映了TCA基因在不同物种间的功能多样性。

综上所述，在玉米TCA循环中鉴定出91个基因，这些基因分布在8个酶复合体上。测定了所有玉米TCA周期基因的染色体位置、复制事件、多基因关系、表达模式、亚细胞定位和相互作用网络。重要的是，通过对拟南芥植物中过表达的5个TCA循环基因的表型分析，我们发现玉米TCA循环与根系发育、盐胁迫和植株育性有关。

植物材料

本研究所使用的植物材料均来自我们的实验室，植物实验研究按照四川农业大学玉米研究所(成都市温江区惠民路211号)的指导方针进行。刘永明负责对样品进行正式鉴定。

玉米TCA循环基因的生物信息学分析

拟南芥中直接参与TCA循环的基因共有48个[42];以其蛋白序列作为查询，利用BLASTP (e-value≤1e-30)对玉米和番茄的TCA基因进行了鉴定。拟南芥蛋白质序列从GRAMENE (http://www.gramene.org/， TAIR10)，玉米蛋白序列从MAIZEGDB (https://www.maizegdb.org/， AGP V4.0)，番茄蛋白序列下载自SGN (https://solgenomics.net/ITAG4.0)。利用MEGA 5.10构建了玉米、番茄和拟南芥TCA蛋白的系统发育树。随后，我们分析了玉米TCA基因之间的复制事件，并根据以下两个标准定义了一个基因复制事件[65]:(1)可对齐核苷酸序列覆盖较长基因的> 70%，(2)它们之间的相同区域包含> 70%的可对齐区域。为了进行顺式元素富集分析，我们从玉米基因组数据库(http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index)，然后提交PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)．玉米TCA基因的基因组和启动子序列从GRAMENE (http://www.gramene.org/, B73 RefGen_V4)。

表达模式分析

比较了拟南芥、番茄和玉米的根、叶和花(穗)中TCA基因的表达水平。拟南芥、番茄和玉米基因的表达数据通过TRAVA (http://travadb.org/), Tomexpress (http://tomexpress.toulouse.inra.fr/)和qTeller (www.qteller.com)．随后，详细分析了玉米TCA基因在各组织中的表达模式。利用qPCR技术分析了玉米自交系黄早四发育花药中TCA基因的表达水平。使用TRIzol试剂提取总RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa, China)按照说明书合成cDNA。用18S内参基因归一化。本研究中所有引物见附加文件1．qPCR采用CFX96™实时PCR系统(Bio-Rad, USA)，使用SYBR Green Real Time PCR Master Mix (TaKaRa)进行。各基因的相对表达量用2^——ΔΔCt方法(66］．每个基因的表达数据从三个生物重复中获得，每个重复至少测量三次。此外，部分表达式数据是从我们之前的报告中检索的[67］．

亚细胞定位分析

克隆了5个TCA基因(Zm00001d008244、Zm00001d017258、Zm00001d025258、Zm00001d027558和Zm00001d044042)，并在烟草中瞬时过表达(烟草benthamiana)叶进行亚细胞定位分析。以上5个基因是用高保真iProof DNA聚合酶(Bio-Rad, USA)从玉米自交系B102中扩增得到的。然后通过BP反应将扩增片段插入pDONR221载体。测序确认后，所有BP产物通过LR反应融合到pB7FWG2.0载体中增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的n端。最后用冻融法将重组体转化为农杆菌感受态细胞(C58C1)，在烟叶中异位表达。在温室栽培3 d后，用德国徕卡TCS SP2激光共聚焦显微镜观察绿色(Ex = 488 nm, Em = 500~530 nm)和红色(Ex = 561 nm, Em = 600~630 nm)荧光。本实验采用35S::mts-RFP作为线粒体标记。

玉米TCA基因的互作分析

利用STRING软件构建玉米TCA蛋白相互作用网络(https://string-db.org)．然后，我们利用BiFC分析了五个TCA基因(Zm00001d008244、Zm00001d017258、Zm00001d025258、Zm00001d027558和Zm00001d044042)之间的相互作用。如前所述，这5个基因首先通过Gateway BP反应插入进入载体pDONR221，通过LR反应构建表达载体35S::CDS-YC GFP (GFP C-terminus)和35S::CDS-YN GFP (GFP N-terminus)。将重组质粒转化到农杆菌C58C1细胞中烟草benthamiana进行荧光观察。具体步骤与上文相同。

TCA基因过表达拟南芥植株的生成及表型分析

为了分析TCA循环基因在植物发育过程中的分子功能，在拟南芥中分别过表达上述5个基因。首先，按照上述方法构建所有35S::CDS-eGFP表达载体。其次，利用冻融法将构建的表达载体分别转化为农杆菌C58C1，并浸润到拟南芥(Col-0)的花序中。在1/2 MS培养基上用抗生素(50 μg/mL BASTA)和PCR同时筛选转基因阳性植株。PCR鉴定引物为attB1F (5 ' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC-3 ')和attB2R (5 ' -ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC-3 ')，以及拟南芥的管理基因EF1α(F: 5 ' -GGCTGCTGAGATGAACAA-3 '， R: 5 ' - gtggtagtcaatgataag -3 ')作为阳性对照进行PCR扩增。检测转基因拟南芥叶片和主根的绿色荧光强度，确定高表达系。最后，同源和单拷贝T_3.选择过表达系进行表型分析。

本研究对过表达拟南芥的根长、耐盐性和育性进行了分析。初生根长分析时，每品系20粒种子先置于1/2 MS培养基上，然后在4℃春化3天。然后，将所有培养皿垂直放置于光照周期为16 h /暗周期为8 h的生长室中，23℃培养9 d后测量原根长度;对根长度分析进行了三个独立的测试。在1/2 MS和1/2 MS 200 mM NaCl培养基上分别放置40粒转基因株系种子进行耐盐性分析。春化后，将平板垂直放置于生长室内9天，计算各品系的发芽率。进行了三个独立的耐盐实验。为了分析转基因系的育性，将植株在温室中23°C培养40天，观察主茎上发育的角果。对植物的育性进行了两个独立的实验研究。以野生型(Col-0)为对照进行上述表型观察。

免疫印迹分析

western blot法[68]在拟南芥过表达系中检测Zm00001d008244蛋白水平。在花期从过表达植株的地上部分提取总蛋白。一抗采用兔抗gfp多克隆抗体(中国生工公司)，二抗体采用hrp标记山羊抗兔IgG(中国生工公司)。管家蛋白β-肌动蛋白作为内对照。

统计和数据分析

采用单因素方差分析(方差齐性下)或Welch 's方差分析(方差非均质性下)检验对初根长度、发芽率和角果育性进行统计分析[69］．所有的计算都在SPSS20.0 (IBM, USA)中进行。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。

华:

顺乌头酸酶

BiFC:

双分子荧光互补

CSY:

柠檬酸合成酶

eGFP:

增强型绿色荧光蛋白

FP亚基:

黄素蛋白亚基

嬉笑:

延胡索酸酶

IDH:

异柠檬酸脱氢酶

LTR:

低温响应要素

马亚基:

膜锚亚基

MDH:

苹果酸脱氢酶

SCoAL:

琥珀酰辅酶合成酶

SDH:

琥珀酸脱氢酶

压力:

逆境应答元件

三羧酸循环:

三羧酸循环

αKGDHC:

α酮戊二酸脱氢酶复合体

不适用。

国家重点研发计划项目(2016YFD0101206)资助;成都市农业科技中心地方财政专项基金项目(NASC2019TI13);中央科研院所基本科研业务费专项基金(19-001-09)。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与撰写手稿。

从属关系

1. 中国农业科学院成都城市农业研究所，四川成都610213

   刘永明，任茂志

2. 成都市国家农业科技中心，四川成都610213

   刘永明，任茂志

3. 四川农业大学玉米研究所农业部西南玉米生物学与遗传改良重点实验室，四川成都611130

   刘永明，曲景涛，张玲，魏贵，赵卓凡，曹莫举

4. 根特大学植物生物技术和生物信息学系，比利时根特B-9052

   象屿徐

5. VIB植物系统生物学中心，比利时根特B-9052

   象屿徐

6. 四川农业大学农学院，四川成都611130

   Gui魏

贡献

YML设计了这项研究并进行了大部分实验。YML和LZ撰写了文章。JTQ对生物信息学分析做出了贡献。XYX、GW和ZFZ进行了一些实验。MZR和MJC协助数据分析和修改文章。所有作者已阅读并认可最终稿。

作者的信息

杨敏毕业于四川农业大学，现就职于中国农业科学院城市农业研究所。

相应的作者

对应到Maozhi任或Moju曹．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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