野生和驯化小麦基因型的转录组学和代谢比较分析揭示了对蚜虫的化学和物理防御反应的差异

背景

小麦幼苗不断受到草食性昆虫的侵害。为了减少昆虫的伤害和维持植物的生长，植物进化出了不同的防御机制，包括生物合成名为苯并恶嗪类的威慑化合物，和/或形成提供物理屏障的毛状体。目前尚不清楚这两种机制在为小麦幼苗提供有效防御蚜虫方面是否同样重要。蚜虫是谷物生产中一种经济上昂贵的害虫。

结果

在这项研究中，我们比较了三种小麦基因型的转录组、代谢组、苯并恶嗪类和毛状体密度，重点研究了与防御机制相关的差异。我们选择了多种小麦基因型:两种四倍体小麦基因型，驯化硬粒‘sevo’和野生二粒小麦‘Zavitan’，以及一种六倍体面包小麦‘中国春’。“全转录组学分析揭示了三种基因型之间的主要差异，而显著不同基因的聚类表明，两种驯化小麦之间的相似性高于任何一种小麦与野生小麦之间的相似性。”途径富集分析表明，三种基因型中与初级代谢相关的基因以及与防御相关的途径(如植物激素和专门代谢物)存在差异。在萌发后11、15和18天的三个时间点上，两种驯化基因型的苯并恶嗪类化合物含量较高，而野生二粒小麦的苯并恶嗪类化合物含量低于检测水平。与苯并恶嗪浓度相反，野生小麦的毛状体密度显著高于驯化小麦。最后，我们测试了鸟樱桃燕麦蚜虫(Rhopalosiphum padi结果表明，中国春比四倍体基因型更具抗性。

结论

我们的研究结果表明，苯并恶嗪类药物比毛状体具有更显著的防御作用。野生小麦和驯化小麦的防御机制丰度存在差异，其中野生小麦具有较高的物理防御能力，而驯化小麦具有较高的化学防御能力。这些发现为小麦植物对蚜虫的防御适应性提供了新的见解。

农作物持续暴露在不同的环境胁迫条件下，例如草食动物的侵扰[1]。昆虫取食是造成农作物产量损失和品质退化的重要因素。平均损失可达产量的20-30%，在某些情况下，它们可造成总产量损失[2]。蚜虫科(半翅目:蚜虫科)是最具经济价值的食草动物之一。[3.]，一种以韧皮部汁液为食的刺吸害虫。蚜虫的侵染通过消耗水分和养分造成直接损害，以及通过植物病毒传播造成间接损害[4，5，6]。为了应对虫害，植物产生组成性和诱导性防御，以减少损害并增强自身的适应性[7]。尽管许多植物防御系统是在特定的发育阶段产生的，而不考虑昆虫的攻击，但其他防御系统是在昆虫伤害时诱导产生的。草食动物诱导的防御机制的例子是有毒化学物质的积累，如苯并恶嗪类、硫代葡萄糖苷和生物碱，它们是一类具有威慑作用的特殊代谢物。另一种机制是机械防御，包括物理屏障，如增加刺、刺或毛的密度[8，9，10，11，12，13]。大多数毒性防御在幼苗中丰富，并在进入幼期的发育过程中减少[14，15，16]。草食诱导的机制是通过信号修饰介导的(即茉莉酸和水杨酸)[17]，这使得植物可以在没有昆虫食草的情况下保存代谢资源和能量，用于生长和繁殖。

小麦是一种主要作物，为世界人口提供20%的热量和蛋白质摄入量[18]。它最早是在一万多年前被驯化的，是最早被驯化的作物之一。19]。驯化过程、几个世纪的栽培和现代小麦育种使其遗传变异与其野生祖先相比减少或缩小[20.]。这种减少是由于初始作物数量少，加上对农艺性状的强烈选择，被认为是“驯化瓶颈”[21，22]。驯化小麦和小麦品种对当地条件的适应加剧了减产，产生了地方品种[23]。此外，由于遗传易受生物和非生物胁迫，种植遗传基础狭窄的种质会带来风险，可能导致严重的作物损失。以小麦野生近缘种为代表，可以比较驯化前后农业重要性状的遗传多样性[21]。一些重要的农业性状，如生物和非生物抗逆性，在小麦驯化过程中显著降低。24，25]。据报道，这降低了抵抗食草动物攻击的能力[26，27]，细菌性枯萎病[28]和真菌疾病[29]，在豆科和芸苔科植物的驯化成员中发现[25]。相比之下，驯化小麦对蚜虫的抗性增强也有报道[30.]。有人认为，植物驯化防御机制的调整依赖于害虫的摄食习性[31]。

转录组学和代谢数据集之间的整合通常用于揭示昆虫如何修改其寄主植物以使其受益[32，33]。在本研究中，我们研究了小麦幼苗转录组和代谢组的差异，并研究了化学和物理防御的影响Rhopalosiphum padi蚜虫。两者之间的差异小麦属植物谷物蚜虫抗性品种已经证明了利用四倍体小麦揭示植物防御机制的潜力[34，35，36]。因此，我们重点研究了三个具有代表性的小麦基因型:1)四倍体硬粒小麦品种sevo (膨松小麦。硬质)， ii)野生四倍体，扎维坦，现代驯化四倍体的四倍体祖先(膨松小麦。dicoccoides);这两种四倍体已被广泛研究作为抗性基因和标记的潜在来源[30.，37];以及iii)中国春小麦基因型，该基因型被广泛用作参考基因组和细胞遗传学研究[20.，38，39，40，41，42，43]。我们研究了小麦幼苗(11-18天)，它们产生了高水平的化学和物理防御。对化学威慑代谢物(苯并恶嗪类)和物理防御物(毛状体)进行了分析和比较r . padi蚜虫繁殖。总之，本研究评估了防御机制的动态响应蚜虫的攻击。

三种小麦基因型转录组数据差异综述

为了研究3种小麦基因型的全球转录组学特征，从具有相同物候(两叶期;额外的文件2:图S1)。将转录组学数据与中国春季参考基因组序列中发现的带注释的基因模型进行比较[20.，38]，绘制的序列reads在基因型间具有较高的相似性:Svevo, 95.85%;Zavitan, 94.68%;和Chinese Spring, 96.72%来自总映射读取(附加文件)1:表1)。由于亚基因组数量的差异，我们排除了所有注释到D亚基因组或未识别亚基因组(U)的转录本。该分析共发现42,474个转录本(附加文件)1表2)。总转录本水平用于主成分分析(PCA)图。如图1所示。1PCA图显示，各基因型样品相互聚类，但基因型完全分离，其中成分1(45%)表示中国春小麦与四倍体小麦基因型分离，成分2(36%)表示野生小麦(扎维坦)与栽培小麦(斯韦沃和中国春小麦)基因型分离。总的来说，三种基因型的转录组学分析显示每种基因型都有独特的模式。

转录组学数据中表达模式的聚类、途径富集和基因本体

为了检测RNA-seq数据中的差异表达基因，使用R软件包DESeq2，通过负二项广义线性模型，使用每个样本中与每个基因相关的序列数(计数)来统计比较条件间和条件内变异性。利用似然比检验(LRT)对DESeq2的输出进行了log转换，得到的热图清楚地区分了两种培养基因型(sevo和Chinese Spring)和野生基因型(Zavitan)的总体转录谱，见附加文件2:图S2。差异表达基因(问-value < 0.05;|日志₂(fold change)| > = 1)得到8735个独特的转录本。我们使用clusGap[]估计结果的聚类数。44]，其中建议将数据分成8类。的k对缩放和居中的rlog值进行-均值分析，每个聚类用三种小麦基因型中表现出相似反应模式的基因集的基因表达的z分数(标准分数)表示(图2)。2）.根据标准评分的趋势，将8个基因簇分为5个表达组:i) 1和2个基因簇:Zavitan的表达水平高于sevo和Chinese Spring。聚类2的Z-score高于聚类1。ii)聚类3和聚类4:Zavitan的水平低于sevo和Chinese Spring。聚类4的基因Z-score低于聚类3。iii)类群5和类群6:sevo的基因水平低于Zavitan和Chinese Spring。聚类5的Z-score高于聚类6。iv)聚类7:Zavitan的基因水平低于sevo和Chinese Spring。v)聚类8:中国春季的基因水平低于sevo和Zavitan(图2)。2）.基因在8个簇中的分布在附加文件中1:表S3。

为了阐明代谢过程，使用MetGenMAP对每个簇进行了过度表征途径富集分析[45]，使用水稻同源物(LOC基因ID;额外的文件1:表S4)。表格1描述了每个集群中显著丰富的通路。在簇1和簇2中显著富集(Zavitan含量高)的途径主要与多胺生物合成和糖降解有关。与苏氨酸和高丝氨酸生物合成、苯丙素生物合成、细胞结构生物合成(纤维素)磷脂酶和抗坏血酸生物合成相关的基因在Zavitan中表达较低(簇3和4)。在簇5和6中显著富集的途径(在Svevo中略低)主要与类异戊二烯磷酸途径、甘氨酸和甘油降解、油菜素内酯、jasmonic酸(13-脂氧合酶;13-LOX)和赤霉素植物激素生物合成、n-乙酰半乳糖胺生物合成、TCA-、Calvin-和γ-谷氨酰循环和糖降解。在Cluster 7中显著富集(在Zavitan中略低)的途径主要与谷胱甘肽、β-丙氨酸、甲硫氨酸、同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物合成以及糖异生、酪氨酸降解、磷脂去饱和和脂肪酸β-氧化有关。此外，群集8中显著富集的通路(中国春季略低)主要与植物激素细胞分裂素的生物合成有关。总之，这些观察结果表明，每种小麦基因型都有独特的基因表达，涉及从初级和次级代谢物、植物激素、氧化状态和细胞壁的不同途径。

为了确定哪些基因本体类别被代表，我们使用agriGO v2进行了单一富集分析(SEA) [46]，参数默认。使用国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)数据库的基因id作为SEA的背景。在附加文件中1表S5，所有8个集群的生物过程的GO术语成对呈现。以Cluster 5为例，Zavitan-Svevo和Zavitan-Chinese Spring的对比揭示了类异戊二烯生物合成、脂质代谢、氧化还原过程、光合作用和四吡咯代谢相关的生物过程。簇5的结果与路径富集结果部分冗余(表5)1)，关于脂质/13-LOX生物合成和类异戊二烯生物合成。该簇中的功能富集项与三种基因型之间的防御适应性差异最为一致。其他簇包括有机酸代谢过程、细胞氨基酸代谢过程、细胞氧化还原稳态和金属离子运输等功能(簇7)、氧化还原过程(仅sevo与Chinese Spring的差异表达基因;簇6)和苯丙氨酸分解代谢过程(只有sevo和Zavitan的差异表达基因;其余的簇包括功能富集项，如蛋白质磷酸化、脂质转运和花粉识别。

小麦3个基因型代谢生理差异的研究

与中枢代谢相关的几种途径，如碳水化合物、氨基酸、脂肪酸和TCA循环，在三种基因型之间显示出基因表达的差异(表1)1）.因此，我们使用气相色谱-质谱(GC-MS)对11天龄小麦幼苗进行了代谢分析。该分析揭示了72种代谢物的相对水平，包括氨基酸、有机酸、糖和糖醇(附加文件)1表6)。表格2用单因素方差分析显示了24种显著不同代谢物的相对水平。结果表明，三种芳香族氨基酸、有机酸和糖类含量显著降低。其他代谢物没有显着差异，并在附加文件中提出1表S6。

簇2的通路富集分析(表2)1)和集群5的GO条款(附加文件1表S5)显示，与多胺生物合成和氧化还原过程相关的基因在三种基因型中表达不同。多胺作为氧化反应的底物产生过氧化氢(H)₂O₂)细胞内和细胞外[47]。在许多环境胁迫中，最早的信号作用之一涉及活性氧(ROS)。过氧化氢作为最稳定的活性氧，在植物的生长发育和生殖生长等生理过程中起着至关重要的作用，也参与了对病原体和疾病的防御[48]。我们用DAB染色法(3,3′-二氨基联苯胺)测量了11天树龄植物叶片中的过氧化氢。扎维坦的叶片产生的深褐色沉淀物比其他两个基因型多。磷酸钠对照处理无沉淀(图2)。3.a).这表明Zavitan的氧化状态高于sevo和Chinese Spring。

各种非生物和生物胁迫对光合机构的影响不可避免地与有害活性氧的形成有关[49，50]。此外，氧化还原过程和光合作用过程在GO术语分析中都得到了显著的体现(附加文件)1(表S5，聚类5)。作为光合作用差异的指示，我们通过量化叶绿素a和b的水平来测量总叶绿素含量[51]。如图所示。3.b，紫檀叶片的总叶绿素含量显著低于雪叶和春叶。

与蔗糖和淀粉降解相关的基因在Zavitan中的表达水平高于其他两种基因型(集群1)。先前的研究将碳水化合物代谢的影响与光合机构的状况联系起来[52]及含水量[53]。因此，我们还测量了叶片含水量，这是植物对不同环境胁迫反应的重要指标[54，55，56，57]。如图所示。3.c，竹藤叶含水量显著高于紫叶和春叶。叶片的新鲜、膨胀和干重在附加文件中显示1表S7。总的来说，这些结果支持我们的转录组学分析，并显示出与野生小麦相比，栽培小麦的基因型有一些相似之处。

与化学和物理防御适应性相关的基因表达差异

途径的富集表明，不同基因型的植物防御机制的相关途径存在差异。其中包括与JA生物合成有关的13-LOX和13-HPL途径[58]、二磷酸异戊烯基生物合成(萜类)[59]和类黄酮生物合成[60]集群3(表1）.因此，我们进一步研究了苯并恶嗪类化合物作为化学毒性化合物和毛状体作为物理防御机制的基因表达。为了生成一个基因列表，我们搜索了BREADWHEATCYC2.0数据库(www.plantcyc.org)和文献(将苯并恶嗪类生物合成基因命名Bx1系列通过Bx14) [16，61，62]。在未知的情况下Bx小麦基因(Bx6, Bx7,Bx10-14)，我们比对了玉米蛋白序列[63，64，65]到小麦集成植物数据库(见附加文件)1:完整基因列表见表S8)。的表达式值Bx每个基因型中的基因在热图中呈现，并通过分层聚类对样本进行排序(图2)。4a).热图显示，sevo栽培小麦样品更接近中国春季，而不是Zavitan。研究还表明，一些基因，如细胞色素P450，Bx3,和Bx5,在Zavitan中表达水平较高，而其他基因，如下游葡糖苷酶和O-methyltransferases，在斯沃沃和中国春较高。这表明在苯并恶嗪类生物合成基因方面，sevo和Chinese Spring有一些相似之处。

我们还比较了作为物理屏障代表的毛状体形成相关基因的基因表达[66，67]。为了生成一个基因列表，我们检索了文献并找到了一些水稻中毛状体形成基因的证据，包括无毛水稻，编码同源结构域蛋白[68]，短柔毛基因GL6 [69]。我们还发现了玉米蛋白同源物，包括i) HD-ZIP IV转录因子OCL4，这是毛状体模式形成所必需的[70];ii) UMC1273，是一种类似于毛状体双折射的蛋白;iii) UMC1601蛋白毛状体双折射样28;iv) AY110056蛋白毛状体双折射样26;5)抗白粉病蛋白5 (prm5);(见附加文件)1(完整基因列表见表S9)。每个基因型中毛状体形成基因的表达值以热图形式呈现，并对样本进行分层聚类排序(图2)。4b).热图没有显示出清晰的模式，两个Svevo样本与Zavitan聚在一起，一个与Chinese Spring聚在一起。

植物发育过程中苯并恶嗪类物质含量变化的定量分析

我们将防御代谢产物的分析重点放在苯并恶嗪类化合物(BXDs)上，这是一种主要的威慑化合物，已被证明在小麦叶片的化学防御中起作用[71，72]。BXDs在小麦幼苗中含量丰富，在幼苗期活性最高[14，15，16]。本试验采用高效液相色谱-紫外分光光度法测定小麦幼苗萌发后11、15和18天的BXDs含量。共检出3个BXD化合物，包括2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3- 1,4-二羟基-7,8-二甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3- 1糖苷(DIM)₂BOA-Glc)和2-羟基-4,7-二甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3- 1糖苷(HDMBOA-Glc)，如图所示。5得了。通过使用UPLC-QToF-MS和之前的研究比较其片段的模式，进一步对这些化合物进行注释(附加文件)1:表S10 [73，74];)。在驯化小麦基因型中，所有化合物至少在一个采样时间点被检测到，而在野生小麦中，它们的检测水平低于Zavitan。Svevo和Chinese Spring基因型的DIMBOA在第11天达到最高水平，到第18天逐渐下降。在中国春季，DIMBOA水平下降的速度快于斯沃沃。昏暗的₂BOA-Glc水平的积累模式与DIMBOA不同，在第15天达到最高水平，而中国春季远高于Svevo。总体而言，DIMBOA和DIM的双向方差分析₂BOA-Glc在萌发后的时间和两种小麦基因型中表现出显著差异。HDMBOA-Glc含量远低于其他两种BXD化合物，仅在中国春萌发后11和18天检测到，在sevo叶片中仅在萌发后18天检测到。

计算毛状体密度

为了探索小麦植物对蚜虫入侵的物理适应性，我们评估了叶缘和表面的毛状体密度作为物理屏障(图2)。6）.如图1所示。6a，双向方差分析表明，三种小麦基因型在边缘毛状体数量上存在显著差异(F_{基因型(2224)}= 498.36,P值< 0.0001)，发芽后第一天(F_时间(2224)= 5.30,P值= 0.0056)，交叉效应(F_{基因型*时间(2224)}= 3.05,Pvalue = 0.0178)。叶缘毛状体数量最多的是扎维塔，而除萌发后18 d毛状体数量最少外，斯沃沃和中国春的毛状体数量基本相同。随着时间的推移，毛状体的数量略有增加，主要是在Zavitan和sevo。在无花果。6B，叶片表面毛状体密度。双因素方差分析表明，三种小麦基因型表面毛状体数量存在显著差异(F_{基因型(2372)}= 268.32,P值< 0.0001)，发芽后第一天(F_时间(2372)= 15.99,P值< 0.0001)，交叉效应(F_{基因型*时间(2372)}= 8.70,P值< 0.0001)。叶片表面毛状体数量最多的是扎维坦，而中国春的毛状体数量最少。毛状体的图像表明，毛状体的长度和角度也不同。如图所示。6c，扎维坦和中国春叶片表面的毛状体长度比斯沃沃长。此外，在扎维坦和中国春，边缘的毛状体只面向一个方向，而在斯沃沃，它们面向两个方向。总的来说，这表明Zavitan比其他两种基因型有更多的毛状体作为物理屏障。

小麦不同基因型蚜虫繁殖的评价

在萌发后15天和18天两个时间点，评价了小麦幼苗对蚜虫侵染96 h后的蚜虫表现。双因素方差分析表明，3个小麦基因型的蚜虫子代差异显著(F_{基因型(45)}= 20.60,P值< 0.0001)，发芽后第一天(F_时间(45)= 161.93,P值< 0.0001)，交叉效应(F_{基因型*时间(45)}= 4.24,P值= 0.021)，表明基因型和年龄(萌发后天数)对蚜虫繁殖的影响(图2)。7）.在萌发后15和18 d的2个测定中，中国春基因型的抗蚜能力强于其他2个基因型，而扎维坦和斯韦沃基因型的抗蚜能力差异不显著。此外，18天的小麦幼苗比15天的小麦幼苗对蚜虫更敏感。

在本研究中，我们选择了三种小麦基因型，包括野生二粒小麦、硬粒小麦和面包小麦，以解决驯化对植物抗蚜能力的影响这一基本问题。了解基因总体水平及基因型间基因表达差异[75]，我们比较了这三种基因型11日龄幼苗的转录组。而基于转录组学数据的PCA图显示了每种基因型的独特模式(图2)。1)，差异表达基因(8735个独特转录本)的热图显示驯化小麦基因型之间的相似性高于野生小麦(附加文件)2:图S2)。当我们比较苯并恶嗪类途径的特定生物合成基因的基因表达时，这种模式是相似的。4）.最近的一项研究对大约500种小麦基因型的外显子组进行了比较，结果表明野生二粒小麦是所有现代四倍体和六倍体基因型的a和B亚基因组的祖先，支持了sevo和Chinese Spring之间的相似性。的t .硬质谱系被发现是最有可能的面包小麦栽培种质的祖先[20.]。sevo和Chinese Spring之间的相似性可能是由于“驯化瓶颈”[21，22，23]。

先前的一项研究探索了19个六倍体面包小麦全基因组之间的差异，报告称参与环境应激反应和生物应激防御的基因在基因组之间是可变的[76]。同样，在我们的研究结果中，参与环境应激反应和防御反应的几个富集功能基因在三种基因型之间是可变的，包括多胺生物合成和13-脂氧合酶，这是植物激素茉莉酸的第一个酶促步骤(表1)1）.此外，过度表征途径富集分析表明，与氨基酸代谢和碳水化合物、细胞结构、脂肪酸和脂质、植物激素和特殊代谢物的生物合成相关的基因在三种基因型之间存在显著差异。这些观察结果表明，基因型之间的基础基因表达存在主要差异。这得到了几个实验的支持，我们测量了水的含量(图2)。3.c)和11日龄叶片的初级代谢物(表2)2）.主要结果表明，Zavitan的氨基酸、有机酸和糖含量高于其他两个基因型。

最近的一项研究表明，驯化小麦在驯化过程中保持了对与作物共存的特殊食草动物的防御特性，但对通才食草动物的防御效率较低[31]。我们比较了繁殖的r . padi3种小麦基因型对蚜虫的影响(图2)7)，是经济上最重要的蚜虫之一，寄主范围超过100种[77，78]。我们的研究结果表明，具有大量毛状体且苯并恶嗪类药物含量低于检测水平的野生四分之一毛状体更容易受到r . padi蚜虫比中国春天(图)。5，6和7）.扎维坦也更容易受到r .麦迪蚜虫然后Svevo [30.]。与我们的研究结果相反，Migui和Lamb(2003)之前的一项研究在田间测试了41种野生和栽培小麦对三种蚜虫的抗性，包括r . padi．结果表明，对蚜虫的抗性以二倍体最高，以六倍体最低[35]。这种不一致可能是由于添加物特异性差异引起的，也可能是由于与受控条件下的幼苗相比，在田间条件下对成熟小麦植株进行的实验(附加文件)2:图S1)。另一项研究支持了这一观点，该研究表明，与实验室中的幼苗相比，蚜虫偏好的差异取决于植物在田间的发育阶段[79]。

在小麦中，编码防御机制的基因存在于六倍体面包小麦(基因组BBAADD)、四倍体小麦(基因组BBAA)以及六倍体小麦的三个二倍体祖先(基因组AA、BB和DD)中[qh]16，80]，而一些酶的步骤尚未确定。六倍体小麦三个亚基因组转录物水平的比较表明，B亚基因组上的同源物是苯并恶嗪类生物合成途径的主要贡献者，特别是在茎中[j]。16，81]。有研究认为，二倍体和四倍体的基因表达比六倍体的多样性要大得多，这表明前者可能编码了更大的等位基因变异，从而促进了害虫抗性的育种[82]。在这项研究中，Bx三种基因型均有基因表达，而两种驯化小麦基因型表现出比野生小麦更接近的基因表达模式和BXD水平(图2)。4一个)。

bxd是一种多样化的专门代谢物，主要以其威慑功能而闻名。众所周知，它们对植物抵抗蚜虫等昆虫有至关重要的作用[71，83，84]，咀嚼食草动物[85，86，87]、真菌感染[88]以及其他昆虫、疾病和杂草[89]。最近的一项研究报道，bxd的分子功能除了它们的毒性外，还具有多种功能。这表明BXDs通过选择性地吸引对植物有益的根细菌来形成根微生物群假单胞菌putida［90，91]，也被用作铁螯合剂[92]。此外，据估计，自然发生的DIMBOA可能通过胼胝质的积累来控制抵抗蚜虫摄食的物理防御机制[93]。此外，据报道，在玉米中，植物蚜虫侵染使DIMBOA-Glc分泌到胞体中，而不分泌HDMBOA-Glc [71]，这可能表明DIMBOA-Glc具有独特的功能。结果表明，蚜虫后代数量最少的中国春面包小麦具有多种BXDs，包括DIMBOA和DIM₂BOA-Glc和HDMBOA-Glc(图2)5）.

有趣的是，总叶绿素和叶绿素a和b水平与第11天测量的DIMBOA量聚集在一起(图2)。8）.先前的研究揭示了BXDs在根中作为铁螯合剂的新功能[94，95]。在植物中，铁是一种必需的微量营养素，在许多代谢过程中起着氧化还原活性金属的作用，包括光合作用、线粒体呼吸、氮同化、激素生物合成以及ROS的产生和清除[qh]96]。缺铁的面包小麦植株的叶绿素含量显著降低，叶绿素褪绿，叶片和籽粒中的铁浓度也较低[97]。本研究结果提示DIMBOA可能在叶片中发挥铁螯合作用。因此，高水平的DIMBOA(如在sevo和Chinese Spring中发现的)可能决定叶绿素水平或其他可以影响光合作用的过程。然而，这需要进一步的调查。

bxd是在幼嫩植物中组成性产生的[14，15，16]，并随着植物年龄的增长而下降[98]。结果表明，随着时间的推移，蚜虫后代数量增加，而BXD水平下降(图2)。5，7,8）.叶子表面是昆虫的第一道防御屏障;它包括毛状体、刺、二氧化硅和蜡。8，99，One hundred.]。毛状体通过干扰草食动物的运动、发育和产卵来作为一种物理防御，而腺状毛状体则用于分泌物的储存和分泌[101]。毛状体表面密度及其在叶缘的分布与蚜虫子代数不成正比。这表明化学防御比物理防御屏障更有效。此外，代谢谱和水分含量表明，11日龄扎维坦幼苗的水分含量，以及某些氨基酸、有机酸和糖的含量高于栽培小麦基因型。相对于驯化小麦，这种化学防御的缺乏和较好的水分和营养状况可能有利于蚜虫在扎维坦上的繁殖。

在这项研究中，我们结合转录组学、代谢组学和生理学的方法来更好地了解小麦防御机制的差异。我们的研究结果表明，苯并恶嗪类药物提供了比毛状体更好的防御机制r . padi蚜虫。基因表达、表型特征、化学防御和物理反应的比较表明，驯化小麦基因型与野生小麦基因型的相似性高于驯化小麦基因型。这表明，在昆虫胁迫下，小麦植物可能经历了进化趋同，这导致了防御机制的相似性，通过生物合成防御代谢物，并在较小程度上形成毛状体。

小麦基因型

本研究选取了3种小麦基因型:2种四倍体(小麦属植物turgidum)和六倍体(小麦）.四倍体小麦基因型包括:野生二粒小麦扎维坦(膨松小麦。dicoccoides) [102，103]和起源于意大利的硬粒小麦，Svevo (膨松小麦。硬质) [103，104]。六倍体小麦为中国春基因型，被广泛用作小麦细胞遗传学研究的标准材料[105，106]。所有植物材料都由Assaf Distelfeld教授(以色列特拉维夫大学)进行了表征和提供。

植物生长条件

小麦幼苗生长在湿润的HR2(土壤混合物)上。小麦种子在330-cm深1.5-2 cm处播种^3.单独的塑料盆和放置在一个生长室。在恒定室温26℃、相对湿度63%、250 ~ 350 μmol光子m、16 h光照和8 h夜间光周期的条件下维持生长室²年代¹3000 lm LED (LG-06A-12-364,000 k)在距离光源40 cm处(从塑料罐顶部测量)的光强。

蚜虫生物

鸟樱桃燕麦蚜虫(Rhopalosiphum padi)在田间收集并鉴定，并在两周的小麦植株上维持菌落小麦名为Rotem的品种(Agridera Seeds & Agriculture LTD，以色列)。菌落在恒室温25℃下，在16 h光/8 h暗光周期下生长。用于昆虫生物测定，成虫10只r . padi蚜虫(约7-10日龄)被限制在幼苗(11日龄和14日龄小麦)第二叶的上部，使用直径4.5厘米的夹子笼。为了减少蚜虫年龄的变化(这可能影响繁殖)，我们在每个笼子里放了10只蚜虫。蚜虫子代的计算方法是计算侵染96 h后的蚜虫(成虫和若虫)总数，并除以10(实验中使用的成虫数量)。

RNA提取，转录组测序和分析

从第二叶顶部采集叶片样品。将两株11日龄植物的组织样本组合成一个实验重复，每个基因型收集3个重复。总RNA提取采用SV总RNA分离试剂盒，柱上处理(QIAGEN)。对纯化的RNA进行定量，每个样品取2.5 μg，使用GeneWIZ公司的Illumina HiSeq 4000仪器进行下一代测序，对端读取长度为150 bp (www.genewiz.com）.使用FASTQC和适配器进行质量控制，使用Trimmomatic v0.36修剪和去除低质量序列。使用STAR对准器v2.5.2b对小麦参考基因组v1.1 [38]。使用Subread v1.5.2检索对准外显子的Reads。对于差异基因分析，DESeq2 v1.22.2 [107]采用似然比检验(LRT)一次性评估多个基因型(调整后)p-value < 0.05)。IWGSC refseq v1.0高置信度(HC)功能注释没有D基因组的序列，因为该基因组不存在于野生和栽培的四倍体小麦中，并且来自未知基因组。接下来，对LRT中具有统计学意义的基因执行DESeq2，并对结果应用正则化日志。使用MetGenMAP进行途径富集分析[45]，使用水稻同源id，这些同源id是由小麦Phytozome转录本id转换而来的。为了在IWGSC和Phytozome小麦转录本id之间进行转换，我们进行了相互的BLASTp比较，只检索到相互匹配的转录本id。MetGenMAP分析使我们能够将特定的生化途径与我们研究中发现的差异表达基因联系起来。使用AgriGO v2对差异表达基因进行功能富集分析。该分析通过比较基因标识符的查询列表及其相应的GO术语，以及从查询列表中导出的背景种群列表，来识别富集的基因本体(GO)术语。基因背景列表和GO注释从国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)数据库中提取。IWGSC是一个由2400名成员组成的国际合作组织，它已经产生了高质量的测序和注释t . aestivum基因组(108，109]。

苯并恶嗪类化合物的提取、分析和鉴定

从第二叶片顶部收集小麦组织，在液氮下研磨成细粉。然后称量冷冻后的粉末，提取溶剂以1:10 (w:v)比为80%甲醇(0.1%甲酸)。混合物短暂地旋转了一下;4℃振荡40 min, 14000 g离心5 min。样品在0.22 μm滤板(EMD Millipore Corp.， Billerica, MA, USA)上以3000 g离心5分钟进行过滤。74，110，111]。提取的混合物用WebSeal垫覆盖，保存在10°C。样品进入DIONEX UltiMate 3000高效液相色谱(HPLC)系统，C18反相Hypersil GOLD柱(孔径3 μm, 150 × 4.60 mm;赛默飞世尔科技，德国)。柱箱温度为40℃，紫外可见吸收光谱范围为190 ~ 400 nm。对于BXD代谢物的分离，水(0.1%甲酸)(溶剂a)和乙腈(0.1%甲酸)(溶剂B)的梯度，流速为1ml × min⁻¹是使用。采用以下线性梯度:0 ~ 10 min，梯度从5 ~ 55% B;10 - 13分钟，梯度从55到100% B;13-14分钟，梯度从100到5%;使用Chromeleon软件(Thermo Fisher Scientific Inc.) 7.2版本进行系统控制和数据采集。在苯并恶嗪类化合物的定量方面，将色谱图与标准品和植物粗提物进行了比较。采用DIMBOA和DIBOA商业正品标准(Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)。此外，还使用了两种粗提物:i) DIMBOA-Glc:DIM的混合物₂BOA-Glc的比例分别为81:19，以及ii) HDMBOA-Glc:HDM的混合物₂BOA-Glc的比例分别为86:14。分别在0.5 ~ 50 μg/ml范围内运行真标和粗提物，计算校准曲线。用Chromeleon软件测定各化合物的峰面积，最终浓度归一化为mg / g鲜重。本分析仅检测到3种bxd，即DIMBOA、DIM₂BOA-Glc和HDMBOA-Glc。三个bxd的紫外光谱在附加文件中给出2:图S3和附加文件1表S11。

为了准确鉴定BXDs的质量，将10 μg/ml的正品标准品和粗提取物5 μl注入具有ESI接口的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪(UPLC-QToF-MS)系统(Waters MS Technologies, Manchester, UK)，在负离子和正离子模式下运行。色谱柱为C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)，柱温保持在40℃，自进样器温度保持在10℃。对于锁相质量校准，使用浓度为0.4 ng/L的亮氨酸脑啡肽进行分析，溶解在50%乙腈和0.1%甲酸中。质谱条件的设置基本如前所述[112]。样品在梯度程序中运行，流动相包括95%水:5%乙腈和0.1%甲酸(溶剂a)， 0.1%甲酸在乙腈中(溶剂B)，流速为0.5 ml/min，扫描重复15分钟，如前所述[113]。系统控制和数据采集使用MassLynx软件(Waters) 4.1版。对于苯并恶嗪类化合物的破碎模式，我们将色谱图与DIMBOA (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)， DIM的正品标准进行了比较₂BOA-Glc和HDMBOA-Glc从植物粗提取物中提取，并有先前的出版物[73，74，114]。BXDs, DIMBOA, DIM的注释₂BOA-Glc和HDMBOA-Glc，以及它们的碎片模式在Additional file中给出1表S10。

气相色谱-质谱联用代谢分析

提取代谢物时，将200 mg冷冻植物组织与1 ml预冷提取溶剂混合，溶剂中含有55%甲醇:23%氯仿:22% milliq过滤水(Millipore, Merck)和200 μl 1 mg/ml利比醇和d -山梨醇¹³C₆作为内部标准。样品短暂旋转，在25°C的温度下，在1000 rpm的温度下在混合器中孵育10分钟，然后进行10分钟的超声处理;然后以最大转速离心10分钟，收集上清。然后，加入300 μl氯仿和300 μl milliq水，强力混合，6800 g离心5 min。相分离后，收集上亲水层100 μl，真空干燥。样品在37°C, 1000 rpm的轨道摇床中孵育2 h后，加入溶解于吡啶中的20 mg/ml盐酸甲氧胺(Sigma-Aldrich) 40 μl，衍生化。然后，在每个样品中加入体积为77 μl的n -甲基- n -(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)，包括标准混合物(烷烃)，然后在37°C的轨道振动器中孵育30分钟。将样品转移到玻璃小瓶中，随机装入GC-MS单四极杆质谱仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)。然后，将1 μl的样品在VF-5 ms毛细管柱(30 m长，0.25 mm id, 0.25 μm膜厚+ 10 m EZ-Guard (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上，以15:1的劈裂比，以玻璃棉(Restek, USA)注入惰性流道劈裂/无劈裂进气口。在14.5℃/秒的速度下，注射样品的程序温度蒸发(PTV)范围为70 ~ 300℃; the transfer line was at 350 °C, and the ion source was adjusted to 250 °C with gain factor 1. Helium was used as a carrier gas with a constant flow rate of 1.8 ml per min. For primary metabolite analysis, the temperature program was as follows: 1 min isothermal heating at 70 °C, followed by a 1 °C/min oven temperature ramp to 76 °C, followed by a 6 °C/min oven temperature ramp to 340 °C, and a final 5 min heating at 340 °C. Mass spectra were recorded at 1.6 scans per second with a mass-to-charge ratio of 70 to 550 scanning range [115]。数据采集由Mass Hunter软件和NIST质谱库进行。此外，保留指数(RI)文库(位于Golm的Max-Planck植物生理研究所，(http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/)进行验证[113，116]。代谢产物归一化为d -山梨醇¹³C₆作为内标，以离子计数的相对丰度表示。

毛状体密度

收集第二叶上部(与施用夹笼相同)，叶绿素用70%乙醇在85℃下漂白8 min，然后用水冲洗。将组织置于玻璃显微镜载玻片上，面朝正面(叶面朝上)。用数码相机(Axiocam 305彩色)与蔡司Axioplan 2立式光学显微镜(蔡司，Oberkochen，德国)连接拍摄毛状体密度图像。每张叶子都拍摄了9张照片，其中每边3张(左、右)，中间3张(上、中、下位置)。我们计算了每毫米边缘上毛状体的数量和以毫米为单位的密度²使用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/）.

叶片中的水分含量

收集11日龄小麦幼苗的第2片叶片(距叶尖10 cm处)。测量总新鲜重量，然后将样品放入2-3 ml的5 mM氯化钙中₂溶液浸泡8小时，然后在60℃烘箱中干燥3-4天;然后测量干重。叶片相对含水量的计算方法先前有描述[117]。叶片的新鲜、膨胀和干重在附加文件中显示1表S6。

过氧化氢检测

为了检测小麦叶片中过氧化氢的基础水平，采用了3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB)染色法进行原位检测。118]。按照上述方案，用DAB溶液轻轻真空浸润11 d龄小麦幼苗的第二叶。作为对照处理，重复叶片施用10 mM磷酸钠。抽真空后，样品在DAB溶液中培养4小时，然后用漂白溶液(乙醇:乙酸:甘油3:1:1)代替，以去除叶绿素，并观察过氧化氢形成的沉淀物(使沉淀物呈深棕色)。

叶绿素含量

新鲜叶组织(50 mg)在5 ml 80%的冰晶丙酮中孵育48 h，在5000×g离心5 min，在663和645 nm波长处记录吸光度。叶绿素含量按Arnon(1949)的计算方法计算，以mg g表示⁻¹弗兰克-威廉姆斯(51]。

统计分析

对于主成分分析(PCA)图，数据使用正则化对数变换进行归一化处理，图形使用r中的ggplot2软件包绘制。单因素和双向方差分析(方差分析)使用JMP软件(SAS;www.jmp.com）.在双向方差分析中，每个人的劣数F值表示自由度和用于测试的样本总数。使用Microsoft Excel进行图形表示。为了检测三个基因型组，使用DESeq2进行LRT。LRT是一种统计检验，类似于方差分析，它允许一次比较一个因素的所有水平。集群数量(k)是使用clusGap [44),而k使用r中的k-means基函数进行-means聚类。使用agriGO v2评估所得基因簇的过度和不足表征[46]。

在当前研究中使用和/或分析的数据集可在本文的补充文件中获得，或应合理要求从通讯作者处获得。

BXD:

benzoxazinoid化合物

昏暗的₂BOA-Glc:

2,4-二羟基-7,8-二甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3- 1糖苷

DIMBOA:

2 4-dihydroxy-7-methoxy-1 4-benzoxazin-3-one

DIMBOA-Glc:

2 4-dihydroxy-7-methoxy-1 4-benzoxazin-3-one葡萄糖苷

HDMBOA:

2-hydroxy-4、7-dimethoxy-1 4-benzoxazin-3-one葡萄糖苷

我们感谢Noga Sikron Peres博士对UPLC-QToF-MS分析的帮助。我们还感谢瑞士伯尔尼大学的Matthias Erb提供的苯并杂嗪类粗提取物，以及以色列特拉维夫大学的Assaf Distelfeld教授提供的小麦种子。

这项研究得到了两国农业研究与发展基金(BARD资助号IS-5092-18R)的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

从属关系

1. 法国干旱地区农业与生物技术联合研究所，Jacob Blaustein沙漠研究所，内盖夫本古里安大学，Sede Boqer校区，8499000,Midreseht Ben Gurion，比尔谢瓦，以色列

   Zhaniya S. Batyrshina, Beery Yaakov, Reut Shavit, Anuradha Singh和ered Tzin

2. Ilse Katz纳米科学与技术研究所，内盖夫本古里安大学，比尔谢瓦，以色列

   维尔Tzin

贡献

ZB, RS, BY, AS和VT撰写了稿件，并对文献检索和稿件结构做出了贡献。ZB, RS, BY设计并进行了研究。所有作者修改并批准了手稿的最终版本。

作者的信息

VT是Sonnenfeldt-Goldman沙漠研究职业发展的主席。

相应的作者

对应到维尔Tzin．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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转载及权限