转录组分析在使用持续种植土壤中使用土壤修正后，揭示了草莓根中的回收策略

背景

在草莓种植中，连作障碍严重威胁生产。一种获得专利的土壤改良剂(SA)可以有效缓解CC对草莓种植的阻碍，但对这种现象的恢复机制了解有限。

结果

本研究利用RNA-Seq技术对添加和不添加SA的土壤中草莓根系进行转录组分析，以揭示SA处理对草莓根系基因表达的影响。共鉴定出188个差异表达基因，其中144个表达上调，44个表达下调。SA处理导致genotype-dependent响应,响应模式,包括全面提高养分运输的表达基因和防御反应基因的表达下降,可能是一个可能的机制在草莓根恢复策略的应用SA CC土壤。我们还发现9Hsp在sa处理的根中，参与植物防御途径的基因均下调。

结论

本研究表明，当SA处理缓解CC土壤环境的胁迫时，草莓植株将防御资源重新分配到发展中去。本研究为揭示草莓生长与防御平衡的基本机制提供了机会。

草莓(草莓属×ananassa杜赫），一个主要的经济果实，被广泛种植在许多国家[1］.栽培草莓是一种典型的一年生植物，主要在温室条件下种植。然而，草莓受到连作(CC)问题的严重威胁[2，3.，4，5，6］.每年都能看到由于CC障碍造成的大量农业损失，草莓的可持续种植在世界范围内受到阻碍[3.］.

CC条件下，移栽障碍因素复杂，根系脆弱，生产力低下，经济寿命短[2，3.，4，5，7］.对于连作土壤，长期单一栽培会严重干扰土壤环境，如土壤肥力降低、自毒物质积累、特定微生物群落和线虫群落的积累等[2，3.，4，5］.目前，土壤消毒是控制草莓CC障碍的常用措施[8，9］.然而，使用多年的甲基溴土壤熏蒸剂在世界范围内已被禁用，现有的替代产品或技术存在一定的局限性，如毒性大、成本高、分解缓慢等[10.，11.，12.］.因此，开发非化学替代品需要长期的研究，这将需要与农业管理有效结合[13.］.本实验室自主研发专利土壤改良剂(SA)产品，可缓解草莓CC障碍，显著提高草莓植株生物量，改善土壤酶活性，提高土壤矿质氮含量[14.］.SA的草莓移植过程中的应用可以提高CC-生产草莓的果实产量和质量[15.］.

植物经常面临变化的环境，并已进化出许多适应反应，以适应各种生长条件[16.］.Yang等人发现了一些不同表达的mirna参与了块根的发育地黄CC障碍(17.］.在我们之前的研究中，我们发现几个WRKY组III成员可能在草莓对CC障碍的反应中发挥重要作用[18.］.然而，在CC土壤中施用SA后，植物根系的恢复策略尚未见报道。以往的研究仅侧重于确定施用SA后发育、产量和品质的致病因素[14.，15.］.

虽然了解植物耐CC的分子机制是必要的，但了解植物施用SA后的恢复策略也很重要。本研究采用RNA-Seq技术分析CC土壤施用SA后草莓转录水平的差异。本研究的主要目的是了解土壤改良后植物根系恢复策略的分子机制，并为鉴定与CC耐受性相关的基因提供有价值的线索。

SA对生长的影响

草莓植株的根和茎的长度和鲜重受SA的影响(图。1）.根和芽的长度显著(P< 0.05)，与对照相比分别增加10.37和8.80%(图3)。1a - b)。此外，根鲜重显著(P < 0.05) increased by 27.17%, and shoot fresh weight was extremely significantly (P< 0.01)，在含SA的土壤中(图。1c - d)。

差异表达基因(DEGs)鉴定

为了全面了解草莓根中基因表达的差异，我们构建了6个文库(CC-1、CC-2、CC-3、CC + SA-1、CC + SA-2和CC + SA-3)。每个库产生超过2500万个干净的库，Q30百分比大于91.5%1）.超过72％的清洁读数映射到唯一的位置或多个基因组位置。

我们的主要目标之一是确定不同库之间的deg的全局变化。在本研究中，共鉴定出了188个CC和CC + SA之间的deg，其中有144个上调基因和44个下调基因(图)。2）.所有deg的层次聚类(h -聚类)分析如图所示。2A-B。结果表明，在SA治疗和对照组中，所有188次将所有188次分类为2个亚型（图）（图。2b).通过整体离散表达水平测量每个样本中的表达水平(图。2c).两组基因表达丰度的总体分布和差异折叠变化在MA图中显示(图)。2d).用火山图显示两组基因表达水平的差异及其统计学意义(图2)。2e)。

deg的功能分类

为了进一步研究DEGs的功能，用GOseq对DEGs进行氧化石墨烯项富集分析。在本研究中，103个已识别的deg被GO术语注释，并分配到以下三个本体:生物过程、细胞成分和分子功能。CC和CC + SA之间的大多数deg被划分为代谢过程、细胞过程、单生物过程、对刺激的响应、生物调节和生物过程中的定位(图中红色)。3.一个额外的文件1:表S2);细胞、细胞部分、细胞器和细胞膜(图中绿色部分)。3.一个额外的文件1:表S2);以及催化活性和分子功能基团的结合(图中蓝色部分)。3.一个额外的文件1:表S2)。

具体来说，在上调和下调的DEGs中，对高富集的GO项(前20位)进行了校正分析p-value < 0.05，如图所示3.b, c.在上调的基因中，许多DEGs被分配到与营养转运相关的氧化石墨烯(GO)项，包括生物过程中的铵跨膜转运(GO:0072488)和钾离子出口(GO:0071435)以及钙依赖磷脂结合(GO:0005544)、铵跨膜转运活性(GO:0008519)、和营养库活性(GO:0045735)的分子功能(图。3.b,额外的文件1：表S3）。用营养传输相关的GO术语相关的基因示于表2，包括2个氨转运蛋白3、2个膜联蛋白样蛋白和2个胚芽样蛋白基因(表1)2）.其他上调的DEGs被分配到不同的氧化石墨烯项，如催化活性负调控(GO:0043086)、甘油-3-磷酸生物合成过程(GO:0046167)、叶黄素分解过程(GO:0016124)和胡萝卜素分解过程(GO:0016121);相同蛋白结合(GO:0042802)和丝氨酸型羧肽酶活性(GO:0004185)的分子功能;和细胞组分中的类囊体(GO:0009579)(图。3.b,额外的文件1：表S3）。有趣的是，三个GO术语，Xanthophyll分解过程（GO：0016124），胡萝卜素分解蛋白过程（GO：0016121）和紫花板（GO：0009579），在植物光合作用中起重要作用。，响应于高的光强度（GO：0009644），防御响应于细菌，不相容相互作用（GO：其中下调的基因，许多DEGS用防御相关的GO术语，诸如响应于过氧化氢（0042542 GO）相关联0009816（无花果。3.c,额外的文件1:表S4)。

使用KOBAS 2.0进行KEGG富集分析，以揭示共同和组织特异性的表达模式。所有DEGs的KEGG通路主要分为5类:细胞过程、环境信息加工、遗传信息加工、代谢和生物系统。在最具代表性的途径中，9个DEGs与内质网的蛋白质加工相关(ko04141);在遗传信息处理中，有5个基因被分配到剪接体(ko03040);4个DEGs与细胞过程中的内吞作用(ko04144)相关;代谢组中有4个DEGs与脂肪酸代谢相关(ko01212);在生物系统中，3个DEGs被分配到植物-病原互作(ko04626)(图。4）.

hsp家族基因与康复策略相关

我们分析了deg的Pfam蛋白结构域来预测它们的功能(图。5a).激酶、Hsp、转运蛋白和重复蛋白在DEGs中特别丰富。hsp家族蛋白在不同胁迫下的植物耐受机制中发挥着重要作用。在我们的研究中，在所有的deg中共发现9个Hsps。构建了9个Hsp结构域蛋白之间的基因树草莓×ananassa杜赫。和草莓属vesca．我们发现这九个Hsp基因属于HSP83（c120601.graph_c0，c112416.graph_c1），Hsp 90（c124547.graph_c1），热休克蛋白70（c118039.graph_c0），HspST1（c120543.graph_c0),Hsc70（c65539.graph_c0，c112581.graph_c1，c126335.graph_c0） （无花果。5b)。

我们分析了这9种基因的表达模式Hsp -家族基因预测响应SA它们的功能。9的热图Hsp -家族基因显示，在CC土壤上施用SA后，家族基因均显著下调(图2)。5c).这9个基因的KEGG富集分析表明，除c120543.graph_c0（HspST1)与内质网蛋白加工有关(图。6b,额外的文件1:表S1)。这三个Hsc70基因被分配到剪接体和内吞途径Hsp83/90基因与植物病原体相互作用相关联的（图5D，附加文件1:表S1)。

通过分析Hsps的相互作用网络，进一步了解其调控机制。其中5个蛋白(Hsp70、2个hsp83、Hsp90和HspST1)与其他蛋白存在相互作用(图1)。5e).该网络中的6个蛋白在内质网蛋白加工和植物-病原互作途径中均富集(图中红色和蓝色的圆圈表示)。5e)。

实时qPCR验证基因表达谱

为了验证RNA-Seq结果，我们选择5个Hsp-family deg进行qPCR检测，即:Hsp22（c112483.graph_c0），热休克蛋白70（c118039.graph_c0），HSP83（c120601.graph_c0），HSP90.（c124547.graph_c1),HspST1（c120543.graph_c0） （无花果。6）.在定量RT-PCR结果表明，所有五个这些HspCC + SA土壤根中基因显著下调。此外,热休克蛋白70和HSP对CC土壤根施用SA后均未检测到。qPCR数据结合测序结果表明，RNA-Seq数据是可靠的。

CC障碍是限制草莓生产的主要因素。经过多年的努力开发，我们的SA可以有效地促进草莓植株的生长(图。1）.SA含有多种营养物质，如糖、氨基酸等高能化合物，是作物重要的营养来源，可被草莓植物直接吸收利用[14.］.在连续轮作条件下，草莓长期单作也会导致土壤中自毒物质的积累，从而抑制植物生长[3.］.然而，SA治疗可以显着降低草莓根际土壤中自诱毒性物质的积累，并减轻这些自诱毒物质对草莓植物的不利影响[19.］.此外，SA可显著提高土壤脲酶、转化酶和多酚氧化酶的活性[14.］.综上所述，SA处理可改善CC土壤环境，使其更有利于植物生长。

植物已经进化了特定的防御策略，面对多种环境挑战[20.］.仍是一个未知数什么样的变化发生在SA处理的CC土草莓植株，但它是必须了解的SA的应用程序后的恢复机制，土壤通过育种，以提高CC的耐受性。本文提供的草莓植株恢复响应的全基因组转录组分析的SA应用于CC土壤后。

比较分析sa处理和对照草莓根的RNA-Seq数据，发现共188个基因有差异表达(图1)。2)，其中上调基因144个，下调基因44个。在上调和下调的GO基因中，富集最多的GO基因表明，许多上调的GO基因与营养转运相关和光合作用相关的GO基因相关(图1)。3.）.本研究鉴定了6个营养转运相关基因，包括铵态氮转运体3成员、膜联蛋白样蛋白和芽胞蛋白样蛋白(见表)2）.铵态氮是植物氮素的主要来源，铵态氮转运体在植物氮素代谢中起着重要作用[21.，22.］.膜联蛋白样蛋白是Ca²⁺-依赖的磷脂结合基因，它们可能参与对各种胁迫处理的反应[23.］.以往的研究表明，在不同的非生物应激刺激后，生殖细胞样蛋白参与细胞壁重组和渗透调节[24.，25.］.此外，SA处理后一些光合作用相关基因也上调(图。3.b).叶黄素、胡萝卜素和类囊体是植物光合作用所必需的，这些基因的上调有利于植物的生长。同时，许多下调的deg被分配到与国防相关的GO术语(图。3.c).这些植物基因表达的变化表明SA处理后植物从防御向生长转变。这种生长和防御之间的权衡是由于资源限制，需要优先考虑植物的生长或防御[26.］.当施用SA改善CC土壤条件时，植株的防御反应开始减弱。根可以重新分配资源，进行养分运输，以支持植物的生长。SA处理后草莓植株生物量的增加进一步说明了这一现象(图)。1）.

KEGG是用于基因功能系统分析的数据库资源[27.］.DEGS的KEGG途径浓缩分析揭示了基因组，化学和系统性功能信息之间的关系。在这项研究中，将72只DEG映射到KEGG途径。最高代表的途径是内吞作用，内质网，抗磷酸体，脂肪酸代谢和植物病原体相互作用中的蛋白质加工（图。4）.内吞作用在细胞和发育生物学的许多领域发挥重要作用，是细胞感知环境变化的主要途径[28.］.细胞内吞作用用于内化分子和外部营养物质，或介导入侵病原体进入宿主细胞[29.，30.］.外部物质可以通过网格蛋白依赖的内吞途径被内化;随后，外部物质被吞入核内体并被运送到溶酶体进行降解[28.，31，32］.此外，细胞还进化出蛋白质质量控制系统，以预防或延缓各种疾病。内质网相关蛋白降解(Endoplasmic reticul相关蛋白降解，ERAD)是内质网蛋白加工途径中最常见的途径。ERAD可确保错误折叠的蛋白质被检测和消除。超敏反应(hypersensitive response, HR)也是植物与病原菌相互作用中最重要的植物防御反应之一[33，34］.人力资源是第一报道柄锈菌dispersa作者:H.马歇尔·沃德[35];这个过程会导致试图入侵的部位的细胞快速死亡，抑制入侵的病原体，并向植物发送信号，从而激活额外的防御[34，36］.

植物已经进化了适应性机制以应对多重应力。在本文中，Hsp基因若干途径在DEGS高度富集，如胞吞作用，蛋白加工的内质网，剪接体，和植物 - 病原体相互作用（图中发现。4，5d和7）.所有的HSP-家族DEGS，除了HspST1，参与蛋白加工的内质网（图7）.在网格蛋白包被的囊泡向核内体移动的过程中，Hsc70参与了囊泡的脱包过程(图。7）.Hsp83/90，参与植物-病原互作，可能在植物HR中发挥相关作用(图。7）.在植物中，Hsp基因不仅在高温胁迫下表达，而且在许多发育过程和保护植物免受胁迫中发挥关键作用[37，38，39，40］.娜塔莉等人证明了这一点HSP22是由氧化应激引起的，说明FaHSP22可能是由于SA治疗后氧化应激降低所致[41］.热休克蛋白70家族，包括Hsc70，构成表示，和热休克蛋白70，这是由热休克和应激诱导的，在适当的折叠具有基本功能和正常和应激条件下在细胞中外来蛋白质的投放[40，42］.HSP83活跃在烟草benthamiana为了应对苦苣菜黄网病毒(SYNV)和凤仙花坏死斑病毒(INSV) [43］.HSP90.基因已经从许多植物物种中分离出来，它们的主要作用是管理蛋白质折叠，但它们也被诱导适应应激，如热、冷、盐和重金属胁迫[40，44，45，46，47］.以上所讨论的这些基因在植物的逆境适应中发挥着相关的作用。

我们以前的研究发现，草莓中的CC障碍可归因于植物养分可用性的不平衡和自身诱导物质，土壤传播病原体和植物 - 寄生线虫的积累，以及导致土壤健康下降的其他现象[2，3.，4，5］.本研究表明，SA处理可以缓解这些问题，使CC土壤生态恢复，从而减少对植物的胁迫。在草莓根中，外部胁迫的减少导致防御相关基因表达的整体下降，尤其是Hsp家族。然后，草莓植物可以重新分配资源，以制定根系的潜在变化，如增加养分运输，以促进植物生长。

本研究通过差异表达分析鉴定了草莓根中响应SA的基因。CC和CC + SA植物的根转录组存在显著差异。营养转运相关基因总体增加，防御相关基因总体减少，说明SA处理后草莓植株进行资源重新分配，有利于植株生长的增加。下调9Hsp主要参与植物防御途径的基因，例如在内质网，内吞作用和植物病原体相互作用中的蛋白质加工，建议在SA治疗的草莓根中提出了额外的回收策略。本文的结果有助于更深入地了解CC土壤中SA治疗后草莓根源的回收策略。

植物材料及RNA提取

实验使用了一个典型的草莓品种，草莓×ananassa杜赫。“Benihoppe”由北京市草莓工程研究中心提供，在北京市海淀区林业和果树科学研究院(40°1´21″N, 116°16´32″E)进行。专利号为SA。ZL200610112418.7，主要由昆虫体和昆虫代谢物组成，由我实验室自主生产。所有植物在22±1°C的温室中培养，光照16 h /暗8 h。大棚共设置长100 cm ×宽40 cm ×高40 cm的草莓苗床80个;用SA处理40个草莓苗床，另一半作为对照。草莓苗每畦栽两行。大棚采用一般的农业管理措施，基本肥料用量为:> 25%的有机肥29985 kg/ hm2, NPK肥料300 kg/ hm2, N + P2O4 + K2O≥45%。植物材料分为连作(CC)和连作加土壤改良剂(CC + SA)两组。 The CC strawberry plants were planted in CC soil, which was monocultivated with strawberry plants for 12 years. The CC + SA strawberry plants were cultivated in the same CC soil in which the SA was applied once during strawberry engraftment. The plant samples were collected randomly 15 days after the SA treatment, and the roots were rinsed with water. The fresh weight was recorded immediately, and the root samples of the two groups (CC and CC + SA) were used for further RNA-Seq analysis. Each sample group included 3 biological replicates (CC-1, CC-2, and CC-3; CC + SA-1, CC + SA-2, and CC + SA-3), and the roots of 3 seedlings per treatment were pooled as one biological replication [48］.共18株幼苗(3株× 3个生物复制× 2个处理)。所有样品在液氮中快速冷冻，保存在−80°C。

使用植物RNA试剂盒(BioTeke，北京，中国)，按照制造商的规格从100 mg根组织中提取总RNA。采用FastQuant RT试剂盒(天根，北京，中国)逆转录第一链cDNA。

RNA-Seq文库构建和测序

每个样品共1 μg RNA作为RNA样品制备的输入材料。测序库使用Illumina公司的NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit (NEB，美国)生成。为了优选240 bp长的cDNA文库片段，采用AMPure XP系统(Beckman Coulter, Beverly, USA)对片段进行纯化。然后，将3微升USER Enzyme (NEB, USA)与大小选定的片段混合。采用Phusion高保真DNA聚合酶、通用PCR引物和Index (X)引物进行PCR。最后，PCR产物纯化(AMPure XP系统)，并在安捷伦生物分析仪2100系统上对文库质量进行评估。使用TruSeq PE聚类试剂盒v4-cBot-HS (Illumina)在cBot聚类生成系统上对指标编码的样本进行聚类。聚类生成后，在北京生物标志物公司Illumina平台上对文库的制备进行测序。

数据分析

fastq格式的原始数据(原始读取)是通过内部Perl脚本处理的。从数据集中去除适配器序列、包含poly-N的读和低质量的序列读。经过数据处理后，将原始序列转换为干净读取。计算干净数据的Q30和GC含量。然后用TopHat2工具软件将干净的reads映射到参考基因组序列中。采用DESeq R包(1.10.1)对两组进行差异表达分析。的P-值使用Benjamini和Hochberg的方法来控制错误发现率(FDR)。基因的调整P-value < 0.01且根据DESeq |fold change (FC)|≥2认为差异表达。使用Genesis 1.8.1生成热图和层次聚类。基于Wallenius非中心超几何分布的GOseq R包实现了基因本体(GO)富集分析[49］.使用KOBAS软件对KEGG (http://www.genome.jp/kegg/或者http://www.kegg.jp/)途径27.，50］.由Mega 7.0构建的系统发育树，使用邻近加入（NJ）方法具有1000倍的自举重新采样[51，52］.聪明的(http://smart.embl.de/）被用来导出交互网络[53］.采用SPSS 20.0 (SPSS Inc.， USA)软件进行独立样本T检验。

基因表达分析

的Hsp被选定为使用QuantStudio™6的Flex实时PCR系统（Applied Biosystems，福斯特市，CA，USA）的实时定量PCR验证 - 家庭的基因。从qPrimerDB（获得的qRT-PCR的引物https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)，并在附加文件中列出1：表S1 [54］.Each reaction mixture included 10 μl of 2 × SYBR® Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 100 ng of diluted cDNA product, and 0.8 μl of each of the two primers (10 μM), and was adjusted to 20 μl with DNase/RNase-free water. Gene expression was presented as relative units after standardization to the strawberry housekeeping gene DNA-binding protein (DBP) EU727547 as an internal control using the 2^——ΔΔCT三种技术复制方法[55，56，57］.每个反应使用三个独立的生物和技术重复重复。

目前的研究过程中产生的原始转录数据可从上合理请求相应的作者。在这项研究中产生的或分析所有其他数据都包含此发表的文章及其补充信息文件英寸

CC：

连作

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

度:

差异表达基因

舰队指挥官:

褶皱变化

罗斯福:

错误发现率

走:

基因本体论

Hsc:

热休克同源蛋白

Hsp:

热休克蛋白

KEGG:

Kyoto基因和基因组的百科全书

SA：

土壤改良剂

不适用。

国家科技支撑项目(no . 2014BAD16B07)。资助方在本研究的设计、分析、解释或相关数据中没有发挥任何作用。

从属关系

1. 中国农业大学植物保护学院昆虫学与线虫学实验室，北京市圆明园西路2号，100193

   陈鹏，刘启志，李伟华，李鹤琴，李星月

2. 林业果树科学，农业科学院北京林业研究所，北京，100097，中国的北京研究院

   王玉柱，张云涛

3. 中国科学院生态环境科学研究中心饮用水科技重点实验室，北京100085

   魏华李

4. 青岛农业大学农学院，山东省旱地技术重点实验室，山东青岛266109

   He-qin李

5. 四川省农业科学院植物保护研究所，四川成都610066

   Xing-yue李

贡献

QZL、YZW和YTZ是本次研究的构思和设计。QZL对手稿进行了修改。PC、WHL、HQL和XYL进行实验。PC分析数据，制作数据，撰写初稿。YZW和YTZ提供了实验场地和植物材料。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应于刘志．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

开放访问本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条提供的数据，除非另有说明。

再版和权限