N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯介导的抗药性启动两需要水杨酸信号通路拟南芥

背景

许多革兰氏阴性菌使用N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）相互交流并协调他们的集体行为。最近，越来越多的证据表明，寄主植物能够感知并响应细菌AHL。一旦启动，植物处于一种改变的状态，使植物细胞能够更快和/或更强烈地响应随后的病原体感染或非生物胁迫。

结果

在本研究中，我们报道了用N-3-氧-辛酰-高丝氨酸内酯(3OC8-HSL)对病原菌具有抗性两pv。番茄DC3000 (太平洋标准时间在拟南芥DC3000)。3OC8-HSL预处理及随后的病原菌入侵导致过氧化氢爆发性增加，水杨酸积累，致病相关基因表达强化PR1和PR5．在太平洋标准时间DC3000胁迫下，3OC8-HSL处理植株的过氧化物酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶等防御相关酶活性升高。此外，3oc8 - hsl引物抗太平洋标准时间DC3000在表达细菌的植物中受损NahG基因和npr1突变体。此外，异染色质合酶(ICS1)，一种关键的水杨酸生物合成酶，以及其表达的两个调节因子，SARD1和CBP60g，经3OC8-HSL预处理增强，然后接种病原菌。

结论

我们的数据表明，3OC8-HSL介导了拟南芥对半生物营养细菌感染的防御反应，并且3OC8-HSL介导的抗性依赖于SA信号通路。这些发现可能有助于建立一种新的植物病害控制策略。

植物和微生物的共同进化使植物发展出复杂的病原体防御机制。植物中的病原检测包括对病原或微生物相关分子模式(PAMPs或MAMPs)的识别[1，2通过模式识别受体(PRRs)和模式触发免疫(PTI)的激活。虽然病原体可能通过III型分泌系统(TTSS)分泌pti抑制效应物进入植物细胞，但反过来，植物激活第二层防御，称为效应触发免疫(ETI)，这是在宿主细胞质或质外体中识别病原体效应蛋白后激活的[3.，4］．除了PTI和ETI的局部防御机制外，感染部位远端的植物组织也可以诱导系统性抗性。系统抗性有诱导系统抗性(ISR)和系统获得性系统抗性(SAR)两种机制;前者对有益的土壤微生物有反应，而后者则与病原体的攻击有关[5，6，7，8］．化学处理也可刺激抗性机制，包括2.6-二氯异烟酸(INA)、苯并-(1,2,3)-噻二唑-7-羧酸s -甲酯(BTH)和ß-氨基丁酸(BABA) [9，10］．INA和BTH是植物激素SA的类似物。若干诱导抗性过程与启动现象有关，启动是在病原体攻击时表达特定防御反应的增强能力[9］．与未启动的细胞相比，启动使细胞能够以更快、更强的方式对更低水平的刺激做出反应[9，11］．因此，准备就绪的植物处于一种生理状态，在最初的刺激后迅速和强烈地抵御病原体的挑战;只要启动机制本身的代谢需求相对较低，这种状态就可能将相关的代谢成本降至最低[11，12，13，14］．这个启动现象是由Kauss和他的同事们首先报道的[15]，从那时起，就有一些引信被记录下来。baba通过水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)依赖途径诱导启动功能，诱导胼胝质沉积增强和盐胁迫耐受性[16]BABA诱导的耐药性也会干扰病原体产生的细菌毒素冠状腺素的作用两［17］．杜鹃花酸是一种可移动的代谢物，它可以在局部和系统组织中积累，通过合成活性氧(SAR)到原生植物中，增加SA的产生，并提供抗性p .两［18］．除了病原体衍生的激发子外，一些低分子量的代谢物，包括水杨酸甲酯(MeSA)、脱氢松香酸、壬二酸、哌果酸和β-氨基丁酸可能参与了植物系统抗性的诱导[18，19，20.］．此外，研究表明，低浓度SA或其商业衍生物BTH处理可调节防御反应，导致植物对病原体攻击的反应更快[21］．这些数据表明，启动诱导剂引发的抗病性可以作为新的疾病控制策略的基础，并有助于可持续农业的发展。

N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)是细菌群体感应(QS)信号的一种，用于细菌细胞间的通讯。许多有益和致病的革兰氏阴性细菌产生AHLs，并利用它们来协调种群中单个细胞的行为。一些报告表明，AHLs可以在广泛的哺乳动物细胞系中引发免疫调节反应;根据AHL浓度和细胞类型，可以观察到刺激和抑制免疫效应[22，23，24，25］．Jahoor等(2008)证实核激素受体(NHR)家族的过氧化物酶体增殖物激活受体ppar和PPARβ可能是动物AHL的候选受体。已知，ahl可被植物细胞感知，而植物细胞又会对这些细菌信号做出特定的反应[25］．蛋白质组学和转录组分析表明，植物根对AHLs的表达水平有显著变化[26，27，28，29］．其他研究表明AHLs可以以一种结构和剂量依赖的方式调节植物的根结构[27，30.]G蛋白和钙信号也与植物对细菌AHL的反应有关[31，32，33］．之前，我们报道了AtMYB44正调控拟南芥初生根伸长的诱导N-3-氧-己基-高丝氨酸内酯(3OC6-HSL) [34］．在番茄中，根表面的定殖具有沙雷氏菌属liquefaciensMG1,生产N-丁基高丝氨酸内酯(C4-HSL)和N-己酰高丝氨酸内酯(C6-HSL)诱导对叶病原真菌的系统抗性主产，而ahl阴性美国liquefaciens突变体MG44未能诱导这种抗性[29］．同样,接种与沙雷氏菌属plymuthicaHRO-48产生C4−/C6-HSL，N3-hydroxy-butyl-homoserine内酯,N-3-羟基己醇基高丝氨酸内酯对黄瓜有一定的保护作用瓜果腐霉西红柿和豆子来自葡萄孢菌感染;相比之下,一个美国plymuthicaAHL产生缺陷的突变体不能保护这些病原体[35］．Zarkani et al.(2013)研究表明，抗两引起的Ensifer meliloti（Sinorhizobium meliloti)在拟南芥植株中的积累N-3-氧-十四烷酰-高丝氨酸内酯(3OC14-HSL)，而ahl阴性接种草木犀或产生3oc8 - hsl的菌株根瘤菌etli菌株对抗性无影响p .两［36］．另一篇报道描述了诱导抗性的作用草木犀大麦、小麦和番茄等农作物[37］．纯AHLs的应用也影响植物的防御反应。在拟南芥中，3OC14-HSL和N-3-氧-十二烷基-高丝氨酸内酯(3OC12-HSL)处理增强了对生物营养和半生物营养病原体的抗性，这些效果依赖于MPK6的强烈和长期激活[38］．作者进一步证明，3OC14-HSL处理后，病原菌的攻击增加了植物细胞壁中酚类化合物的积累、木质素和胼胝质的沉积。此外，oxylipin在远端组织中积累，促进气孔关闭，增强植物抗性[28，39］．Schenk等人[39发现侧链长度较短和中等的AHLs影响根构型发育，而侧链长度较长的AHLs诱导拟南芥的系统抗性。与这一假设一致的是，C4-HSL和C6-HSL处理拟南芥根时没有诱导系统抗性反应;相反，植物激素调控基因的表达和生长素/细胞分裂素的含量发生了改变[27］．而在番茄中，C6-HSL和C4-HSL在较小程度上提高了SA-和乙烯依赖防御基因的表达量和SA水平[29］．这些相互矛盾的发现反映了AHLs介导的植物和细菌之间相互作用的复杂性。然而，这些结果表明，细菌AHLs可以诱导植物的启动状态。在此背景下，植物对不同AHLs的反应以及不同AHLs在启动诱导中的作用值得进一步研究。

本研究旨在探讨3OC8-HSL是否诱导植物的防御反应启动。用3OC8-HSL预处理的拟南芥植株接种病原菌，细菌滴度H₂O₂随后分析防御相关基因的表达。并对3oc8 - hsl介导的引物的分子机制进行了评价。结果表明，3OC8-HSL通过启动拟南芥的防御反应来保护拟南芥免受半生物营养病原体的侵袭，并且3OC8-HSL介导的启动需要SA信号通路。

3OC8-HSL保护拟南芥免受两pv。番茄感染

3OC14-HSL和3OC12-HSL以前被发现在拟南芥和大麦中启动病原体特异性防御反应[38]相反，短链AHL C6-HSL处理后，在拟南芥中未观察到抗性诱导[27］．因此，用中间ahl进行电阻感应试验，如N-辛酰高丝氨酸内酯(C8-HSL)和N-癸酰-高丝氨酸内酯(C10-HSL)及其衍生物可以帮助阐明该反应是否与长链ahl特异性相关，以及C3原子上的氧基取代是否为该活性所必需。用不同的AHL化合物(10 μM)对离体拟南芥叶片进行预处理2 d，然后喷施太平洋标准时间DC3000 (OD₆₀₀= 0.1)。接种后3 d记录发病症状。3OC8-HSL、3OC6-HSL、3OC12-HSL和3OC14-HSL预处理后叶片无明显变化太平洋标准时间DC3000症状，而经其他AHLs预处理的叶片变黄或出现水浸病变(图。1a).我们还在10 μM 3OC8-HSL和其他8个ahl(在C3位置有不同的酰基链长度和修饰)的不育水培系统中对拟南芥根进行了2天的预处理。这种植物的叶子被接种了太平洋标准时间DC3000用细菌悬浮液喷洒。在接种后72 h，对叶片组织中的菌落形成单位(cfu)进行计数。在乙醇中制备了尾部10个碳以上的AHLs原液，以乙醇预处理作为长链AHLs的对照。本研究中其他AHLs测试采用水处理对照。我们发现AHL对植物防御反应的启动效应取决于AHL的结构。3OC8-HSL预处理对病原菌增殖抑制作用最强，3OC6-HSL、3OC12-HSL和3OC14-HSL对细菌生长抑制作用中等在足底．与对照相比，C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和C12-HSL预处理植株的病原菌繁殖无显著差异(图2)。1b、c).前2天施用不同浓度的3OC8-HSL太平洋标准时间DC3000叶面接种评价剂量依赖性诱导效果。在浓度小于0.5 μM时，3OC8-HSL没有降低病原菌滴度，但降低了细菌的生长在足底当浓度大于0.5 μM时，显著降低(图4)。1d).为了监测3oc8 - hsl预处理植株叶片上的病害进展情况，我们在病原菌侵染后对cfu进行了120 h的监测。而未经过3OC8-HSL预处理的拟南芥叶片中细菌滴度逐渐升高，病原菌在3OC8-HSL预处理的拟南芥叶片中增殖受到显著抑制(图2)。1e)。

3OC8-HSL对褐飞虱生长和毒力的影响太平洋标准时间DC3000也在体外进行了评估。在添加3oc8 - hsl的培养基中培养至10 μM时，病原菌无抑制作用太平洋标准时间DC3000增长或影响其毒性(附加文件3.:图S2A和S2B)。发现3OC8-HSL不直接影响半生物营养病原体的适应度和毒力太平洋标准时间尽管DC3000增强了疾病扰动在足底表明3OC8-HSL具有植物防御激活剂的功能。

3OC8-HSL预处理增强H₂O₂病原体感染积累

当植物遭遇生物或非生物胁迫时，会触发活性氧的爆发，进而激活防御反应[40］．3OC8-HSL对H₂O₂用二氨基联苯胺(DAB)染色法分析了叶片的产量。在水培培养基中加入10 μM 3OC8-HSL处理后，采集拟南芥Col-0植株离体叶片，供根系吸收太平洋标准时间DC3000接种。未处理对照的染色结果显示含有H₂O₂在显微镜下观察，未处理的叶片中只有几个细胞呈深棕色。2a).相反，H₂O₂后被观察到太平洋标准时间DC3000接种3oc8 - hsl预处理叶片(图。2a).然而，单独使用3OC8-HSL对H无影响₂O₂生产(图。2a).我们也测量了H₂O₂10 μM 3OC8-HSL处理后离体叶片中含量的变化太平洋标准时间DC3000感染(无花果。2b H)。₂O₂经3oc8 - hsl预处理的叶片在不接病原菌的情况下，未检测到形成太平洋标准时间DC3000喷接种不经3OC8-HSL预处理的对照叶片产生显著的H₂O₂24 hpi时的产量(图。2b） 。一种非常迅速和强烈的H积累₂O₂在经3oc8 - hsl预处理的叶片中检测到病原菌(图。2b).在这些预先处理过的植物的接种叶中，H₂O₂累积量在6 hpi时达到峰值，并持续升高至12 hpi，提示3OC8-HSL预处理联合太平洋标准时间DC3000挑战诱导增强H₂O₂积累。

拟南芥中3OC8-HSL引物增强PR基因表达和防御相关酶活性

致病相关基因，包括PR1和PR5（thaumatin-like protein），常被用作防御疾病的分子指标太平洋标准时间DC3000。为了研究3OC8-HSL的作用动力学，PR1和PR5监测表达水平。在未接种病原菌的3oc8 - hsl预处理叶片中，PR1和PR5转录产物没有积累，而两个基因的转录在12小时后被观察到太平洋标准时间DC3000在未经过3OC8-HSL预处理的拟南芥植株上接种(图。3.)．在3oc8 - hsl预处理的植物太平洋标准时间接种DC3000后，在6 hpi时已经检测到两个基因的显著转录积累，在12 hpi时，这两个基因的水平比没有3OC8-HSL预处理的植株要高得多(图3)。3.)．

过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)等防御相关酶是植物诱导防御反应的关键组分。为了研究3OC8-HSL对植物防御反应的影响是否由防御相关酶介导，分别对3OC8-HSL处理和未处理的植物进行了研究太平洋标准时间DC3000处理后，测定POD、CAT、PAL和SOD活性(图2)。4)．在不感染的情况下，3OC8-HSL处理的根与未处理的植物相比，没有诱导植物叶片中四种酶中的任何一种的活性(图2)。4)．另一方面，未经处理的植物太平洋标准时间与对照相比，DC3000侵染株的四种酶水平均略有升高。在经过3oc8 - hsl预处理的植物叶片中，随后接种病原菌后，这四种酶的活性水平都明显升高。4)．综上所述，这些结果表明，3OC8-HSL预处理启动增强公共关系病原菌感染后防御相关酶的基因表达及活性。

3OC8-HSL预处理增强病原体感染时SA的积累

研究了3OC8-HSL对大鼠肝细胞凋亡的影响公共关系这些基因通常受SA调控，表明SA信号可能参与了3oc8 - hsl诱导的拟南芥启动。然而，3OC8-HSL预处理是否影响病原菌接种后SA的合成和积累尚不清楚。为了解决这个问题，我们用3OC8-HSL预处理根2天，测定了植物叶片中SA的水平和SA生物合成基因的表达太平洋标准时间DC3000接种。在3OC8 HSL未经处理的植物中太平洋标准时间DC3000感染后，12hpi ~ 24hpi处游离SA含量增加;在感染前处理的植株中，游离SA的积累更多，且在12 hpi时积累更多(图2)。5a).在这两种情况下，游离SA的浓度都保持在24 hpi的高水平。5a).这些结果表明，3OC8-HSL诱导植物增强SA在系统组织中的积累，以应对病原菌的攻击。

异chorismate (IC)途径是植物中SA生物合成的主要途径，IC合成酶(ICS)由该基因编码ICS1是这一途径中的一种关键酶。此外，CBP60g及其同源基因SARD1(两种钙调素(CaM)结合转录因子)可作为对照ICS1转录(41，42，43为了进一步研究3OC8-HSL对SA生物合成调控的影响，我们采用qRT-PCR进行定量ICS1，CBP60g,SARD13OC8-HSL预处理2天的野生型拟南芥叶片转录水平太平洋标准时间DC3000叶片接种。3 oc8-hsl-pretreated植物,ICS1和SARD1转录水平在6 hpi和12 hpi时升高，而CBP60g转录本在6 hpi时被强烈诱导(图。5b).在水处理控制装置中，太平洋标准时间DC3000接种后，这三个基因的转录水平在12 hpi水平上适度增加。这些数据表明，3OC8-HSL增强了SA生物合成基因在病原菌攻击时的表达。

3oc8 - hsl诱导的启动依赖于SA信号通路

结果表明，感染半生物营养性病原体后，3OC8-HSL启动了SA反应基因的表达太平洋标准时间DC3000(无花果。3.)．为了进一步研究3OC8-HSL增强的抗性对SA信号的依赖，我们将3OC8-HSL应用于以下不育系统水培系统的植物的底层培养基上太平洋标准时间DC3000侵染:野生型拟南芥Col-0NPR1有缺陷的突变体npr1-1,NahG转基因植物(NahG).所有植物均生长了2年 水培培养周，然后在根部用3OC8-HSL预处理2周 前几天太平洋标准时间DC3000叶片接种。在野生型植株接种3天后，3OC8-HSL预处理显著降低了细菌滴度在足底与水处理对照组相比(图。6).相反，3OC8 HSL增强了对太平洋标准时间DC3000在npr1-1和NahG植物(图。6)，提示拟南芥中3OC8-HSL诱导抗性反应需要sa依赖途径。

在这项关于3OC8-HSL对植物免疫系统影响的研究中，我们证明了3OC8-HSL可以促进主根伸长[32，44也能启动植物对半生物营养细菌的防御反应。3OC8-HSL预处理增强H₂O₂植物防御相关基因的表达和防御相关酶的活性增强。此外，我们的数据表明，由3oc8 - hsl介导的耐药需要sa相关信号通路。

AHLs在酰基链长度(4到18个碳)和脂肪酸链γ位羟基(OH)或羰基(O)取代上有所不同，在70多种革兰氏阴性细菌中已鉴定出大量AHLs [45］．植物对不同的AHLs有不同的反应方式。一般而言，侧链短(4 ~ 6个碳)的ahl调节根的生长发育，而长链ahl如C12-和C14-HSL诱导植物抗性[27，28，30.，32，38，39，44，46，47，48].缺乏直接证据表明中间AHL（如C8-HSL和C10-HSL）的参与，以及它们在植物防御反应中脂肪酸链C3位置被氧基取代。在本研究中，我们表明3OC8-HSL预处理增强了对太平洋标准时间在拟南芥DC3000。体外分析表明，3OC8-HSL并不直接抑制病原菌的生长，也不影响其毒力。因此，3OC8-HSL对病原无直接作用，但增强了抗病能力在足底这表明3OC8-HSL实际上是一种植物防御激活剂。我们之前报道3OC8-HSL可以促进拟南芥主根的生长[32］．有报道称3OC8-HSL是自然栖息地中常见的群体感应信号[49］．根际土壤中几种植物致病菌包括两，果胶杆菌和泛菌生产3OC8-HSL作为细胞间通讯的信号分子[50］．植物可能在与微生物的长期相互作用过程中进化出感知AHL的机制，从而识别周围环境中入侵细菌的存在并采取防御措施。结合目前的研究结果，我们认为3OC8-HSL促进了植物根系的生长，并在植物中起到了激发剂的作用。此外，我们的数据表明，在AHLs的C3位置被羰基取代与更有效的抗性诱导有关，因为3OC8-HSL和3OC6-HSL启动了拟南芥的防御反应，而C8-HSL和C6-HSL没有启动防御反应(图2)。1)．类似地，Schikora等人[38]对抗性诱导效果最强的是3OC14-HSL和3OC12-HSL预处理植株。

活性氧的产生，如H₂O₂产生，是植物对病原菌攻击的最早防御反应之一。病原体侵入前3OC8-HSL预处理增强H₂O₂相比之下，太平洋标准时间未经预处理的DC3000接种可导致H变缓且适中₂O₂拟南芥叶片(图。2)．因此，快速而强的H₂O₂合成是由3OC8-HSL引发的防御机制之一，与之前的报告一致，发现增强的H₂O₂病原菌接种后的积累是诱变植物的典型反应之一[51，52］．此外，与未处理对照相比，3OC8-HSL处理后的病原菌攻击导致POD、SOD和CAT活性增强(图2)。4)．这些酶在H₂O₂因此，本研究结果提示H₂O₂体内平衡也由3OC8-HSL启动。综上所述，这些数据清楚地表明H₂O₂积累是3oc8 - hsl诱导引物的组成部分。

SA在拟南芥抗病性中起关键作用p .两［7］．我们证明了SA信号通路参与了3oc8 - hsl诱导的抗性启动太平洋标准时间DC3000通过几行证据。也就是说,太平洋标准时间3OC8-HSL预处理后的DC3000感染导致:1)叶片中游离SA积累增加;2) SA生物合成基因的强而快速表达诱导ICS1随着CBP60g和SARD1，两个转录因子基因ICS1；(3)增强表达PR1和PR5这两个基因通常受病原菌感染时SA途径的调控。除此之外，3oc8 - hsl介导的抗太平洋标准时间DC3000在npr1-1突变体,NahG转基因植物。经3OC8-HSL预处理而不经后续病原菌攻击，不能诱导SA的积累或表达ICS1，CBP60g，SARD1，PR1,或PR5．虽然太平洋标准时间未经预处理的DC3000接种触发了SA的生物合成PR1和PR5与经3oc8 - hsl预处理的植物相比，其诱导时间、诱导峰出现时间和诱导幅度均明显推迟和降低。这些结果表明，3OC8-HSL预处理诱导植物对病原菌的极端敏感状态，使植物能够快速、强烈地启动SA信号，以防止或减轻病原菌的攻击。在baba处理过的烟草中也发现了类似的SA依赖性[53]和拟南芥[54］．类似地，3oc14 - hsl诱导的抗性依赖于oxylipin和SA信号通路[28，47］．oxylipin，包括JA和相关代谢物，是脂源性信号化合物，在对病原体感染的反应中积累。然而，3oc14 - hsl诱导的抗性被发现与ja无关[28］．还需要进一步的研究来确定除SA以外的其他植物激素，如JA，是否参与了3oc8 - hsl诱导的抗性。

Joshi等人[55肉桂酸(CA)和水杨酸(SA)等植物酚酸影响毒力Pectobacterium aroidearum和巴西亚种通过群体感应(QS)规例[55］．将细菌暴露于非致死剂量的SA可抑制QS基因的表达，包括expI，expR,pc1 - 1142（luxR并下调毒力因子的表达，如胸大肌，图像的基本单位，peh,yheO，由QS系统管理。因此，SA治疗降低了毒力Pectobacterium spp。土豆和马蹄莲。从目前的结果来看，3OC8-HSL可以触发SA级联反应，从而可能影响病原菌。

在病原体攻击时加强细胞壁提供了一个防止病原体入侵的额外结构屏障[56，57］．胼胝质沉积增加，酚类化合物和木质素显示在flg22挑战，ahl引发的拟南芥[28］．在c10 - hsl处理的大麦芽中，Götz-Rösch等[57]发现，C6-HSL处理后，大麦脱氢抗坏血酸还原酶活性较对照植株提高384%，而根系SOD活性则下降至对照植株的23%。大麦和山药豆的植物生长和色素含量对三种不同的AHL (C6-HSL、C8-HSL和C10-HSL)的响应较小，表明AHL处理引发了重要解毒酶活性的组织和化合物特异性变化。PAL是合成木质化和细胞壁强化所需前体的关键酶[58］．PAL活性是应激条件的一个极其敏感的指标，通常与防御反应有关[59］．在本研究中，我们观察到在根上施用3OC8-HSL和叶面接种病原菌后PAL活性的提高。POD和SOD是参与拟南芥造壁过程的氧化还原酶，在病原菌侵染前，3OC8-HSL预处理可显著增强这两种酶的活性。综上所述，我们的研究结果表明，3OC8-HSL与3OC14-HSL的作用类似，通过增强细胞壁来诱导植物对病原菌的抗性。

我们的研究结果表明，3OC8-HSL具有一种新的生物学功能:它通过启动植物防御反应来实现抗病，从而限制病原菌的生长在足底抑制接种物的繁殖。3OC8-HSL将植物转变为一种高能力状态，并在随后的病原体挑战下触发强化的分子和细胞防御反应。植物中AHLs的启动机制本身的代谢需求相对较低，因此可能是一种有效且经济的病原体响应策略，其代谢成本最低。在传统的疾病防治方法中，3OC8-HSL可以作为一种满足环境法规要求的新型起爆剂。

植物生长、AHL预处理及病原菌接种

的种子拟南芥ecotype Columbia-0 (Col-0)， Col-0表达细菌NahGT-DNA插入缺失突变体npr1-1(CS3726)从拟南芥信息资源(TAIR，https://www.arabidopsis.org)种子表面用75%（v/v）乙醇灭菌1小时 最低浓度和30%（v/v）次氯酸钠，持续5小时 用无菌蒸馏水冲洗5分钟后，种子发芽并在含有MS培养基（pH）的琼脂平板上生长 5.8）.将这些植物放置在一个带有16 h灯/8 h暗光周期，100 μmol M⁻²年代⁻¹温度为22±2℃。对于病原体增殖，H₂O₂植物在无菌系统水培系统中培养，以消除未知微生物对植物的影响(附加文件2:图S1)。这个系统从物理上把植物的根和芽分开。在MS琼脂培养基上萌发10天后，将根长2cm的两片叶子的幼苗移栽于装有450ml Hoagland无菌培养基的塑料无菌容器(18 cm × 11 cm的Eppendorf容器，用Parafilm薄膜覆盖)中，培养2周。在此期间后，底层培养基与新鲜培养基交换。直接在培养基中加入AHL进行预处理。两天后，对叶子进行喷雾接种太平洋标准时间DC3000。以下为疾病症状分析太平洋标准时间DC3000感染，离体叶片从土壤生长的拟南芥。将上述10日龄平板育苗移栽到蒸汽灭菌的商用盆栽土/珍珠岩(3:1)混合土壤中，然后在生长室中培养4周。离体叶片在无菌半强MS培养基上漂浮，用AHLs处理2 d，然后喷雾接种太平洋标准时间DC3000。

本研究用于预处理的9种ahl (C4-HSL、C6-HSL、6-HSL、C8-HSL、3OC8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3OC12-HSL、3OC14-HSL)均购自Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)。C4-HSL、C6-HSL、6-HSL、C8-HSL、3OC8-HSL为水溶性;C10-HSL、C12-HSL、3OC12-HSL和3OC14-HSL均可溶于乙醇。因此，以水处理(未预处理)植物为对照，以乙醇处理植物为对照。将AHLs溶解在各自的溶剂中，作为10 mM的原液，并在10 μM或指示的工作浓度下使用。所有复合溶液通过0.22 μm过滤器进行灭菌。将ahl直接加入霍格兰培养基中，搅拌均匀。太平洋标准时间DC3000在King’s B培养基中培养过夜，加入利福平(50 μg/ml)，使OD600 = 0.6-1.0。离心收集细菌细胞，用10 mM氯化镁洗涤₂，用10毫米氯化镁重悬₂．用…接种拟南芥太平洋标准时间DC3000，将菌悬液调整至OD值₆₀₀= 0.1 in 10 mM MgCl₂含0.02% Silwet 77。在AHL处理两天后，用细菌悬浮液喷接种植株，直到所有叶片上都覆盖着细小的液滴。在接种病原菌后的指定时间点，收获100 mg叶片组织，用10 mM MgCl匀浆₂．将连续稀释的匀浆用50 μg/mL利福平涂于含有选择性菌落形成单位(CFU)抗生素的King’s B培养基板上。所有实验都是在未经处理的对照植物上进行的。进行了3个独立的生物学实验，每个实验有3个技术重复。

分析H₂O₂积累

确定H₂O₂用3OC8-HSL引物积累拟南芥植株，在含10 μM 3OC8-HSL或不含3OC8-HSL(对照)的Hoagland培养基中预处理2 d。树叶被喷上了太平洋标准时间DC3000 (OD₆₀₀= 0.1)的解决方案。在接种后6小时(hpi)，用DAB (Sigma-Aldrich, Germany)染色法检测ROS的形成。叶片样品在DAB溶液(1 mg/ml 3,3-二氨基联苯胺水溶液)中22℃过夜，用乙醇/氯仿/三氯乙酸(4:1:15)去染24 h。用徕卡DM4000B显微镜(德国徕卡公司)拍摄叶片。实验共进行3次，每次6片叶子。H₂O₂采用铁氧化法测定铁的含量^2＋在有木醇橙存在的情况下，它会产生与铁的有色络合物^３＋在A56060］．H₂O₂通过与标准曲线比较测定样品中的含量。进行了3个独立的生物学实验，每个实验有3个技术重复。

转录分析

综上所述，在喷施3OC8-HSL或不加3OC8-HSL处理的水培拟南芥地上部苗期，分别在喷施3OC8-HSL处理后0、6、12和24 h采集太平洋标准时间DC3000 (OD₆₀₀ = 0.1）。使用TaKaRa RNA Plus试剂（中国大连）提取均质植物组织的总RNA，用于基因表达的相对定量，比较CT方法[61]和7500 Real Time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。目的基因水平归一化为内参基因β肌动蛋白．每个数据点代表三个独立实验的平均值。作为技术对照，每个qRT-PCR实验在同一96孔板上重复4次。采用附加文件中所列引物进行qRT-PCR1S1:表。

水杨酸测量

采用3oc8 - hsl预处理的拟南芥水培苗，分别在0、6、12、24 h后提取并定量测定游离水杨酸(SA)太平洋标准时间DC3000叶片接种。将植物组织在液态氮中冷冻并粉碎₂．取冷冻组织(0.5 mg)进行SA提取和HPLC定量。采用Waters 1525高效液相色谱(Waters Technologies)进行色谱分析。分离是通过Inertsil ODS C实现的₁₈柱(50 3 4.6 mm, 2.5 mm;GL科学)。乙酸钠(90%)和甲醇(10%)分别作为流动相A和B。荧光强度检测，激发波长为313 nm，发射波长为405 nm [62］．流速为0.5 ml/min，进样量为10 μl。柱温保持在25℃。

酶活性测定

经3oc8 - hsl预处理的水培拟南芥幼苗24 h后采集叶片太平洋标准时间DC3000接种（OD₆₀₀= 0.1)。用冷冻组织(100 mg)检测酶活性。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用Beauchamp法和Fridovich法[63］．基于CAT分解的H₂O₂可通过添加钼酸铵快速终止。剩下的H₂O₂与钼酸铵反应生成一种黄色络合物。H₂O₂加到提取的上清液中作为底物，在240 nm处测量产量，计算CAT活性[64］．POD活性测定依据Wang等人[65，基于pod催化H₂O₂的反应。酶活性测定的吸光度波长为420 nm。PAL酶活性的测定如前所述[66]根据PAL催化反式肉桂酸苯丙氨酸氨生成的原理，通过测量290处的吸光度来测定酶的活性 进行了三个独立的生物学实验，每个实验有三个技术重复。

统计分析

所有实验数据均采用DPS v7.05程序进行统计分析。图中使用了学生的测试。1．图中使用了单变量和多变量分析(ANOVA)和邓肯的新多范围测试。2，3.，4，5，6．所有数据用3 - 4个独立实验的平均值±SD表示。

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

3 oc8-hsl:

N3-oxo-octanoyl-homoserine内酯

阿坝:

脱落酸

AHL:

N-acyl-homoserine

蓝芽:

Benzothiadiazole

猫:

过氧化氢酶

菌落:

克隆形成单位

ETI：

Effector-triggered免疫力

谷胱甘肽:

谷胱甘肽

H₂O₂：

过氧化氢

人力资源:

过敏的反应

在:

2.6 -dichloro-isonicotinic酸

ISR:

诱导系统抗性

MAMP:

Micro-associated分子模式

惩罚:

甲基Jasmonate

朋友:

苯丙氨酸氨裂解酶

PAMP时:

其分子模式

圆荚体:

过氧化物酶

公关:

Pathogenesis-related基因

PRRs:

模式识别受体

太平洋标准时间DC3000:

两pv。番茄DC3000

公共交通信息：

Pattern-Triggered免疫力

QS:

群体感应

ROS:

活性氧

RT-qPCR:

实时定量聚合酶链反应

山:

水杨酸

SOD:

超氧化物阴离子自由基

特别行政区:

系统获得性耐药

tts:

III型分泌系统

我们感谢Adam Schikora教授为改进本手稿所作的宝贵讨论和建议。

基金资助:国家重点基础研究发展计划项目(No. 2015CB150600);国家自然科学基金项目(No. 31270880);河北省自然科学基金项目(No. C2015302020)。每个资助机构都是根据一项研究提案批准这些资金的。这些机构对实验设计，数据分析和解释，或手稿的写作没有影响。

从属关系

1. 2 .河北省科学院生物研究所，友谊南街46号，石家庄050051

   刘芳，赵倩，贾振华，宋聪，黄亚丽，马红，宋水山

2. 2 .河北省农作物主要病害微生物防治工程技术中心，石家庄友谊南街46号，050051

   刘芳，赵倩，贾振华，宋聪，黄亚丽，马红，宋水山

贡献

FL和SSS设计了项目;FL, ZHJ, CS, YLH和HM进行了实验;FL、QZ和SSS对数据进行分析;FL和SSS撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到振华贾或宋水山．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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