铜诱导的光合作用、呼吸作用和C、N、S同化的增加石莼泥蜂(绿藻门)

背景

海藻石莼泥蜂是智利北部铜污染沿海地区的优势物种。已经证明，藻类耐受微摩尔浓度的铜，并在细胞内水平积累铜。利用RNA-seq技术对10 μ M铜培养0、1、3和5天的海藻进行转录组学分析，以确定铜耐受的相关过程。

结果

在铜培养的藻类中，编码光收集复合体II (LHCII)、光系统II (PSII)、细胞色素b6f、PSI、LHCI、ATP合酶以及参与PSII修复和PSI保护的蛋白质的转录本水平增加。此外，线粒体电子传递链蛋白、ATP合酶和参与C、N、S同化的酶的转录本水平也有所提高。转录本水平增加的百分比主要出现在第3天和第5天。相反，涉及蛋白质合成和降解、信号转导、复制和DNA修复的转录本减少。此外，铜培养的藻类的净光合作用和呼吸作用增加，主要在第1 ~ 3天。C、N、S同化酶、rubisco、谷氨酰胺合成酶和半胱氨酸合成酶活性也分别升高，主要在第1天和第3天。

结论

海藻美国泥蜂通过增加参与光合作用、呼吸和C、N、S同化的蛋白质表达来耐受过量的铜，这是一种特殊的铜耐受机制。

在光合生物中，铜是一种必需的重金属，它是几种蛋白质和酶的活性所必需的，如质体青素、细胞色素c氧化酶、铜锌超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶、漆酶和抗坏血酸氧化酶等[1，2]。人体只需要微量的铜，因为过量的铜会产生氧化应激状态，对细胞大分子有害。2]。在光合生物中，铜过量可能导致叶绿素中镁的替代，在弱光条件下抑制叶绿素向PSII释放能量，或者在强光条件下直接抑制PSII中的反应中心[3.，4]。过量的铜还可以通过取代锌或其他重金属而使酶失活[5]。

海洋绿色巨藻石莼pertusa和美国armoricana随着铜浓度的增加，从0到250 μ L⁻¹(3.9 μM)处理3 d，在光合作用和氮同化方面表现出不同的行为[6]。美国pertusa在100 μ L前对光合参数无抑制作用⁻¹(1.5 μM)和硝酸盐还原酶(一种参与氮同化的酶)活性的增加[6]。相比之下,美国armoricana在50 ~ 100 μ L浓度下对光合参数有抑制作用⁻¹铜和硝酸还原酶活性的抑制作用[6]。绿色的大藻美国flexuosa在0.8、4和8 μM的铜浓度下培养5 d, 4和8 μM的铜浓度对光合作用有抑制作用[7]。美国泥蜂l . Grev。在10 μM的铜溶液中培养0 ~ 24 h，叶绿素的光合作用有所增加。8]。因此，同一属的绿藻对铜胁迫表现出不同的反应，并且在绿藻科中，美国泥蜂是最耐铜胁迫的品种。红色大藻Gracilaria tenuistipitata用16 nM的铜培养1 ~ 6天，从第1天开始，光合作用受到抑制[9]。红色大藻Porphyra haitiensis在0.1 ~ 50 μM铜浓度下培养3 d，在0.1 ~ 1 μM铜浓度下，光合作用增加，在0.1 ~ 50 μM铜浓度下，呼吸作用增加，说明呼吸作用对铜胁迫的敏感性较低[10]。棕色巨藻Ectocarpus siliculosus在1.8 μM的铜浓度下培养8 h，光合作用增加，而在3.7 μM的铜浓度下，光合作用降低[11]。因此，海洋大型藻类在铜胁迫下表现出不同的光合和呼吸行为。

海藻美国泥蜂在50 μM铜环境下培养7天的藻类显示出细胞活力，因此对铜过量具有高度耐受性[12]。暴露于亚致死浓度铜(10 μM)的藻类，超氧阴离子的积累从第3天开始，一直持续到第7天，超氧阴离子的产生主要发生在叶绿体和线粒体中[j]。12]。此外，用铜培养的藻类显示出超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶等抗氧化酶的活化，以及抗坏血酸(ASC)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化化合物的合成[12，13，14]。此外,美国泥蜂铜在组织中蓄积，可达620 μg⁻¹用10 μM铜培养12天[15]。铜的积累与GSH和植物螯合素(PCs)的合成有关，PCs是通过GSH单位缩合产生的肽，并且与金属硫蛋白(MTs)表达的增加有关，金属硫蛋白是结合一价和二价金属离子的小尺寸富含半胱氨酸的蛋白质[16]。使用RNAseq进行初始转录组学分析美国泥蜂用10 μM铜培养0和24 h，鉴定出7个潜在的MTs和编码抗氧化酶的转录物，以及参与ASC和GSH合成的酶[16]。在暴露于过量铜的藻类中，编码MTs、抗氧化酶以及参与ASC和GSH合成的酶的转录本水平升高[16]。最后，克隆了3个MT1、MT2和MT3的转录本美国泥蜂它们在细菌中的过度表达允许体内铜和锌的积累[17]。因此,美国泥蜂可能通过铜离子与GSH、pc和MTs的结合在其组织中积累铜，该藻类可能是重金属污染海水藻修复的有用工具。

光合作用增加的光合生物体可能产生更高水平的NADPH，从而增加C、N和S的同化，因为后者是需要NADPH的还原过程[18，19，20.]。海洋巨藻美国泥蜂在10 μM铜中培养0 ~ 24 h，光合作用和编码Calvin-Benson循环酶的转录本水平均有所增加，表明C同化可能增加[8]。在这项工作中，我们研究了光合作用的初始增加是否会持续数天，以及呼吸和碳、氮、硫同化是否会随之增加。为此，海藻美国泥蜂在10 μM铜溶液中培养0、1、3和5 d，测定光合作用和呼吸作用相关蛋白的转录本水平，以及C、N和S同化相关酶的转录本水平。此外，还测定了分别反映光合作用和呼吸作用的产氧和耗氧水平。并对参与碳、氮和硫同化的关键酶rubisco、谷氨酰胺合成酶和半胱氨酸合成酶的活性进行了分析。结果表明，海藻通过增加参与光合作用、呼吸作用和C、N、S同化的蛋白质表达来耐受过量的铜，这是一种特殊的铜耐受机制。

转录本的汇编、注释和分类

对照培养条件(第0天)和铜处理1、3、5天的藻类样本文库中共含有785,500,000 M的reads，平均含有98,187,500个reads。对这些reads进行质量控制，并对其进行修剪和细菌序列的去除，平均得到96,577,500 M的reads，相当于初始reads的98.36%(另附文件)1:表1)。利用Trinity软件对转录本进行组装，得到长度为300 ~ 5140个核苷酸的140,840个转录本(contigs)，平均长度为1575个核苷酸。组装转录组的完整性为93.4%(附加文件)1:表1)。转录本被翻译成氨基酸和e值为1e的注释蛋白⁻³或更低，为65,494(附加文件)5表2)。后一种蛋白质参与不同的生物过程2:图S1)。在65,494个蛋白质中，23,692个(36%)与植物和绿藻(Plantae)蛋白质的氨基酸相似性较高;15073个(23%)与动物蛋白具有较高的相似性;26729个(41%)蛋白与其他生物(真菌、原生生物和原核生物)相似(附加文件)3.:图S2)。与动物蛋白相似的蛋白与人、小鼠、大鼠及其他动物蛋白具有同源性(附加文件)3.:图S2)。

对铜过量反应的转录本差异表达

之前提到的65,494个蛋白的差异表达转录本编码，考虑时间:0 vs. 1,0 vs. 3和0 vs. 5(附加文件)4:图S3)。在时间点0 vs. 1，差异表达转录本数量为28510个，上调转录本数量为13855个，下调转录本数量为14655个，分别占48.6%和51.4%。在时间点0和时间点3，差异表达转录本的数量分别为8174个，上调6047个和下调2127个，分别占74%和26%。在时间点0和时间点5，差异表达转录本的数量分别为30.589个、上调17218个和下调13371个，分别占56.3%和43.7%。因此，在暴露于过量铜的藻类中，在第3天和第5天观察到较高百分比的上调转录本。

参与光合作用和呼吸作用的编码蛋白水平增加的转录本

在光合作用方面，铜胁迫下PSII编码亚基PsbA、PsbB、PsbC、PsbE、PsbH、PsbN、PsbO、PsbP、PsbR、PsbS、PsbW、PsbY和PsbZ的转录本水平上调(表1)1）.此外，光收获复合物II (LHCII)亚基、叶绿素a/b结合蛋白LhcB1、LhcB4、LhcB5和Cab1以及岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白FcpA和FcpB的转录本水平也有所增加。此外，参与叶绿素合成的镁螯合酶亚基ChlD和ChlI也上调(表2)1）.编码细胞色素b6f亚基(对应于细胞色素b6 (petB))，铁硫Rieske亚基(PetC)， cytb6f组装的必需蛋白(PetG)，以及cytb6f到PSI的电子载体(PetJ))的转录本水平也有所增加(表1)1）.编码PSI亚基的PsaA、PsaB、PsaD、PsaF、PsaG和PsaL的转录本水平也上调(表1)1）.最后，编码LHCI亚基、LhcA亚基和ATP合成酶亚基α、β、γ、δ、ε和γ亚基的转录物水平也增加(表2)1）.

另一方面，参与PSII中PsbA (D1)插入的伴侣蛋白MET1的转录本水平;参与受损PsbA降解的不依赖atp的丝氨酸蛋白酶Deg 1、2和9以及依赖atp的金属蛋白酶FtsH 1、2和11增加(表2)2）.编码bc1复合体激酶1 (ABC1K1)的转录本水平，参与醌和生育酚(维生素E)的合成以及保护PSII免受氧化损伤的叶黄素叶黄素;参与PSI所需叶绿醌(维生素K)合成的2-羧基-1,4-萘醌叶基转移酶(ABC4)上调(表4)1）.此外，编码PGR5-1A的转录本，PGR5-1A是一种参与控制PSI周围电子流的蛋白质，可保护PSI免受光氧化;参与PSI组装和稳定的蛋白YCF12;丝氨酸-苏氨酸激酶STN8，参与LHCII的磷酸化，使PSII的亚基迁移到PSI;ATAB2，一种参与光系统蛋白合成增加的光调节蛋白，也增加了(表2)1）.因此，参与光合作用和光系统修复和保护的大量蛋白质的表达增加美国泥蜂暴露于过量铜(附加文件)6:图S4A)。

在呼吸方面，NADH脱氢酶(复合体I)亚基1和2、细胞色素bc1复合体(复合体III)亚基IV和V以及线粒体atp酶亚基γ的转录物水平升高(表1)1）.因此，参与呼吸的少数蛋白质的表达增加美国泥蜂与参与光合作用的植物相比(附加文件)6:图S4B)。

与C、N和S同化相关的编码酶水平升高的转录本

与C同化、红细胞和RbcL相关的Calvin-Benson循环酶的转录本水平对应rubisco的大小亚基;磷酸甘油酸激酶;甘油醛3-P脱氢酶(G3PDH);果糖二磷酸醛缩酶(FBPA);果糖1,6双磷酸酶(FBP)，转酮醇酶(TK);核糖5-P异构酶(R5PI)和磷酸核酮糖激酶(PRK)升高(表2)2）.因此，在Calvin-Benson循环的11种酶中，有9种酶的表达增加美国泥蜂暴露在过量的铜中。

与氮同化有关的硝酸盐还原酶和谷氨酰胺合成酶的转录本水平升高(表2)2）.此外，尿素循环中允许过量铵解毒的酶(如精氨酸-琥珀酸裂解酶和富马酸水合酶)的转录本水平上调(表2)2）.因此，参与氮同化的三种酶中有两种的表达增加美国泥蜂暴露在过量的铜中。

S同化、硫酸腺苷转移酶(ATP硫酰化酶)相关酶的转录本水平;磷酸硫酸腺苷还原酶(APS还原酶);亚硫酸盐还原酶和半胱氨酸合成酶(o -乙酰丝氨酸硫醇裂解酶)升高(表2)2）.此外，参与合成氨基酸蛋氨酸、丝氨酸和丙氨酸的酶也有所增加(数据未显示)。此外，编码谷胱甘肽合成的酶，谷氨酸半胱氨酸连接酶(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶)和谷胱甘肽合成酶的转录本水平也上调(表2)2）.因此，参与S同化的四种酶的表达增加美国泥蜂暴露在过量的铜中。

参与光合作用和呼吸作用的转录本归一化读取的动力学

与光合作用相关的转录本编码蛋白的标准化读值水平增加最多的是:cytb6f亚基PetC在第1天升高，第3天降低，第5天再次升高;PSII亚基PsbA在第1天升高，第3天降低，第5天略有升高;从第3天到第5天，蛋白酶FtsH1升高;蛋白酶Deg1在第1天升高，第3天降低，第5天再次升高;LHCII亚基LhB4和LhB5在第3天升高，并保持升高直至第5天;cytb6f的亚基PetJ和ABC1K1激酶在第1天升高，在第3天降低，在第5天保持降低(图2)。1一个)。

编码线粒体电子链亚基的标准化转录本水平增加最多的是:细胞色素c1(复合体III的亚基IV);ATP合成酶的γ亚基和NADH脱氢酶(复合体I)的1亚基在第3天升高，并一直升高到第5天;细胞色素c1(复合体III的亚基IV)和ATP合成酶的亚基γ在第3天升高，第5天降低;复合体III的亚基V和NADH脱氢酶的亚基2在第1天增加，在第3天下降，在第5天保持下降(图2)。1b)。

参与碳、氮和硫同化的转录本归一化reads动力学

编码C同化酶的转录本归一化读值水平增加最多的是:G3PDH，主要在第3天增加，并一直保持到第5天;rubisco小亚基rbc, rubisco大亚基RbcL和酶PRK和FBPA在第3天升高，并保持升高直到第5天(图2)。2一个)。

与氮同化有关的转录本标准化读值水平增加最多的是:硝酸盐还原酶，第1天升高，第3天降低，第5天再次升高;谷氨酰胺合成酶在第1天升高，第3天降低，第5天继续降低;富马酸水合酶和精氨酸琥珀酸裂解酶在第3天增加，并一直增加到第5天(图2)。2b)。

与S同化有关的转录本编码酶的归一化reads水平增加最多的是:ATP硫酰化酶，在第1天增加，第3天下降，第5天略有增加;APS还原酶在第3天升高，并持续升高至第5天;谷氨酰胺半胱氨酸连接酶和APR还原酶在第3天升高，并持续升高至第5天;亚硫酸盐还原酶在第1天升高，在第3天和第5天保持升高;和半胱氨酸合酶在第3天升高，并在第5天保持升高(图2)。2c).值得注意的是，编码c和S同化酶的转录本的归一化reads数(20 ~ 300 reads)高于参与N同化的酶(1 ~ 12 reads)。

转录本水平降低编码蛋白质，涉及蛋白质合成和降解，信号转导，复制和DNA修复

在时间点0 vs. 1、0 vs. 3和0 vs. 5下调最多的转录本涉及蛋白质合成和降解、信号转导和复制和DNA修复。编码参与蛋白质合成和降解的蛋白质的转录本有:核糖体蛋白L2、L15、L16、S12和S17、核糖体蛋白S6激酶、真核翻译因子5B、tRNA脱氢嘧啶合成酶、延伸因子2a激酶、半胱氨酸tRNA连接酶、葡萄糖-tRNA氨基转移酶、肽基脯氨酸反式异构酶CYP61、RING finger蛋白32、蛋白酶ESD4、神经胰蛋白酶、E3泛素蛋白连接酶、信号肽肽酶、前折叠蛋白亚基6、Hsp40 (DNAJ)和hsp70等(附加文件)5表2)。编码参与信号转导的蛋白的转录本有:钙网蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKWA、PRP4、SAPK8和SAPK38、MAPKKK11、myb相关蛋白1、酪氨酸蛋白激酶SRK3、蛋白磷酸酶1调节亚基7和双功能磷酸酶IMPL2等5表2)。参与复制和DNA修复的转录物有:组蛋白去乙酰化酶HD11、DNA聚合酶ε亚基B、DNA拓扑异构酶6亚基A、DNA解旋酶II、RNA解旋酶DExH10、RNA聚合酶I亚基RPA12、DNA修复蛋白RAD45和DNA错配修复蛋白MSH13等(附加文件)5表2)。

铜诱导净光合作用和呼吸作用增加

对照藻在光照下(光合作用下)产氧水平从8.5降低到6.1 nmol μL⁻¹最小值⁻¹而处理过的藻类则从8.5 nmol μL增加到9.6 nmol μL⁻¹最小值⁻¹在第2天，与对照相比增加了32%，然后下降到7.5 nmol μL⁻¹最小值⁻第5天，与对照组相比，增加了23%(图2)。3.a).对照藻暗耗氧(呼吸)水平为1.7 nmol μL⁻¹最小值⁻¹在第1天没有变化，但增加到3.8 nmol μL⁻¹最小值⁻¹在第5天，处理过的藻类从1.7 nmol μL增加到3.5 nmol μL⁻¹最小值⁻¹第1天(增加106%)，达到4.5 nmol μL⁻¹最小值⁻¹第5天(增加18%)。3.b).因此，净光合作用和呼吸作用增加美国泥蜂暴露在过量的铜中。值得一提的是，在强光下产生的氧气比在黑暗中消耗的氧气要高，这与动力学分析中观察到的归一化读数水平一致。

铜诱导参与碳、氮和硫同化的酶活性增加

对照藻rubisco酶活性为2 μmol min⁻¹毫克⁻¹在处理后的藻类中，蛋白质的含量增加到4 μmol / min⁻¹毫克⁻¹蛋白质含量在第3天降至3 μmol min⁻¹毫克⁻¹第5天蛋白质含量(图2)4a).对照藻谷氨酰胺合成酶活性从0.15 ~ 0.22 nmol min升高⁻¹毫克⁻¹在处理过的藻类中，蛋白质含量增加到0.61 nmol min⁻¹毫克⁻¹蛋白质含量在第3天降至0.1 nmol min⁻¹毫克⁻¹第5天蛋白质含量(图2)4b).对照藻半胱氨酸合成酶活性由1.8 μmol min提高到2.3 μmol min⁻¹毫克⁻¹而在处理过的藻类中，蛋白质含量增加到3.3 μmol min⁻¹毫克⁻¹并在第5天保持这一水平(图2)。4c).因此，参与c、N和S同化的关键酶活性在美国泥蜂为了应对铜的过剩。rubisco和半胱氨酸合成酶活性高于谷氨酰胺合成酶活性，这与归一化reads的水平一致。

铜诱导参与光合作用和光系统修复和保护的蛋白质表达增加

在这项工作中，我们展示了海洋藻类美国泥蜂10 μM铜培养5 d后，LHCII、PSII、cytb6f、LHCI、PSI和ATP合酶亚基转录物以及PSII修复和PSI保护相关蛋白的表达增加。值得一提的是，与10 μM铜培养0 ~ 24 h的藻类相比，编码PSII亚基、PSI和参与PS修复和保护的蛋白质的转录本水平有更高的增加[8]。从这个意义上说，在铜培养24 h的藻类中，编码PSII亚基的转录本水平增加了2 Log2 FC，而在铜培养5 d的藻类中，编码PSII亚基的转录本水平增加了5.3 Log2 FC [8]。特别是，在铜环境下培养24 h的藻类中，编码PsbB和PsbW亚基的转录物水平分别增加了2和3.3 Log2 FC，而在铜环境下培养5 d的藻类中，这些蛋白质的水平分别增加了4.5和5.3倍[8]。编码PSI亚基PsaA的转录物水平在铜培养24 h的藻类中增加了3.4 Log2 FC，而在铜培养5 d的藻类中增加了7.7 Log2 FC [8]。编码参与氧化PsbA替换的伴侣蛋白MET1的转录本水平在铜培养24 h的藻类中增加了3.4 Log2 FC，而在铜培养5 d的藻类中增加了5.6 Log2 FC [8]。因此，与铜培养数小时的藻类相比，铜培养数天的藻类中编码构成光系统和参与光系统修复和保护的蛋白质的基因表达量更高。

在10 μM铜浓度下培养1 ~ 5 d，藻的净光合作用增加。这与构成PS的编码蛋白以及参与PS修复和保护的转录本水平的增加是一致的。从这个意义上说，绿色大藻的光合作用也增加了美国pertusa用4 μM的铜培养3天美国flexuosa用0.8 μM的铜培养8天[6]。此外，在红藻中观察到光合作用的增加p . haitiensis用1 μM的铜培养3天，并在褐藻中培养大肠siliculosus用0.8 μM的铜培养8 h [9，10，11]。此外，还确定美国泥蜂50 μM铜培养7天未见细胞死亡迹象[12]。因此,美国泥蜂比其他绿色、红色和棕色海洋大型藻类更能耐受过量的铜。此外，研究表明美国泥蜂用10 μM铜培养0 ~ 7天，超氧阴离子水平从第3天开始增加，一直增加到第7天，并且超氧阴离子的产生发生在叶绿体和线粒体中[12]。因此，铜诱导的氧化应激可能会破坏光系统中存在的蛋白质，这些蛋白质可能会由于其表达的增加而被合成和替换。转录本水平的动力学分析表明，增加最多的转录本编码PSII的PsbA亚基，该亚基极易氧化[21，22]，蛋白酶MET1参与去除受损的PsbA亚基，atp依赖性蛋白酶FtsH1和atp非依赖性蛋白酶Deg1参与降解受损的PsbA。事实上，氧化PsbA的去除和降解需要FtsH和Deg蛋白酶以及Clp和SppA等其他蛋白酶的共同作用[23，24]。其他高表达蛋白有LHCII的LhcB4和LhcB2亚基、cytb6f的铁硫Rieske亚基PetC和ABC1K1。因此，PsbA亚基，PSII中的蛋白，cytb6f的一个亚基，以及ABC1K1激酶都是铜胁迫下高表达的蛋白，它们可能对应于对氧化损伤更敏感的蛋白，以及那些需要去除和替换氧化蛋白的蛋白。

铜诱导与呼吸有关的蛋白质表达增加

美国泥蜂过量铜培养后，线粒体复合体I和III亚基以及ATP合成酶亚基的转录物表达增加，呼吸也增加。这与红藻的研究结果一致p . haitiensis在0.1 ~ 50 μM铜浓度下培养3天，在0.1 ~ 50 μM铜浓度下呼吸增加，但在1 μM铜浓度下光合作用受到抑制[10]。过度表达的与呼吸有关的蛋白质的数量美国泥蜂比参与光合作用的低，这表明呼吸作用对铜诱导的氧化应激不像光合作用那么敏感。从这个意义上说，有报道说，呼吸对铜和铬诱导的氧化应激不太敏感，这是由于在细胞器中积累了超氧阴离子眼虫属股薄肌［25]。呼吸增加在…中观察到的呼吸增加美国泥蜂铜胁迫下可能会增加ATP的水平，而ATP依赖于蛋白质、脂肪酸和叶绿素的合成和降解，正如在非生物胁迫下的植物中所观察到的那样[26]。一些参与蛋白质、脂肪酸、叶绿素合成和降解的酶似乎在植物的转录组中过度表达美国泥蜂在10 μM铜环境中培养5天(数据未显示)，表明铜胁迫下蛋白质、脂肪酸和叶绿素的大量周转。

铜诱导参与碳、氮和硫同化的酶表达增加

编码C、N和S同化蛋白的转录本中表达量最高的是参与CO还原的酶₂硝酸盐和硫酸盐以及铵的解毒和谷胱甘肽的合成。众所周知，参与C、N和S同化的酶是通过硫氧还毒素调节的，而硫氧还毒素则受细胞氧化还原状态的调节[27]。在C同化方面，研究表明植物中Calvin-Benson循环中的G3PDH、PRK、FBP和sedoheptulose1,7 -双磷酸酶受硫氧还毒素的调控[28绿微藻中rubisco的大小亚基、PGK和R5PE受硫氧还毒素的调控Chamydomonas reinhardtii［29，30.]。在N和S同化方面，谷氨酰胺合成酶和腺苷-5′-硫酸磷还原酶可以结合硫氧还毒素，提示这些酶可能受到这些蛋白的调节[31]。另一方面，众所周知，Calvin-Benson循环酶和硫氧还毒素的酶可以被活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)如过氧化氢和超氧阴离子直接氧化[31]。如前所述，铜胁迫诱导了超氧阴离子的积累美国泥蜂，从第3天开始，增加到第7天[12]。这波超氧阴离子可以直接氧化和抑制参与C、N和S同化和/或硫氧还毒素的酶。为了恢复活性酶的水平，在海藻中观察到编码C、N和S同化和硫氧还毒素(数据未显示)的酶的基因表达增加美国泥蜂响应铜应力。

铜诱导参与蛋白质合成和降解、细胞信号、复制和DNA修复的基因表达减少

转录本水平下降最多的是那些编码蛋白质的转录本，这些蛋白质涉及蛋白质合成和降解、信号转导、复制和DNA修复。在蛋白质合成方面，编码核糖体蛋白L2、L15、L16、S12和S17的转录本水平降低。后者与10 μM培养3 d的藻类中对应核糖体L9、10、23、28、31、35和S12、15和20的转录本水平增加形成对比[32]。另外，用铜培养3 d后，藻体伴侣蛋白Hsp40和Hsp70水平降低，而Hsp14水平升高[32]。在蛋白质降解方面，用铜培养3天的藻类中，编码RING蛋白32的转录本水平下降，而编码RING蛋白RBX1的转录本水平上升[33]。在信号转导蛋白方面，在铜培养3天的藻类中，编码钙调蛋白、几种丝氨酸/苏氨酸激酶、MAPKKK和myb相关蛋白的转录本水平下降，而钙调蛋白、组氨酸激酶和磷脂酶a的水平上升[32]。因此，由于铜过量而减少的转录本编码的蛋白质不同于那些由于铜胁迫而增加的转录本。关于MAPKKK，已经证明美国泥蜂用10 μM铜和MAPK对应的ERK、JNK和p-38抑制剂培养6 h至6 d，主要显示编码抗氧化酶的转录物水平增加[34这表明MAPK途径主要抑制编码抗氧化酶的基因的表达。从这个意义上说，MAPKKK11转录本水平在铜胁迫下下降也表明MAPK途径主要抑制编码抗氧化酶的基因的表达。

S同化的重要性美国泥蜂响应铜应力

半胱氨酸合成酶的活性高于rubisco的活性，远高于谷氨酰胺合成酶的活性，这表明S同化在水稻中具有重要作用美国泥蜂．从这个意义上说，已经证明，藻类暴露于增加浓度的铜中0至12天，其谷胱甘肽(GSH)和植物螯合素(PCs)水平增加，这是一种含硫肽[15]。谷胱甘肽和植物螯合素中硫醇基团的纳米当量与细胞内积累铜的水平相关[15]。此外，编码MTs的转录本水平也随着铜浓度的增加而增加[16]。因此，富含半胱氨酸的肽和蛋白质参与了铜的积累，并可能参与了铜诱导的氧化应激的抑制美国泥蜂通过隔离铜离子[12]。因此，S同化的增加使得富硫醇肽的合成增强，以及参与铜离子隔离的富硫醇蛋白的表达增加，这可能是铜耐受性和铜积累的必要条件美国泥蜂．

海藻美国泥蜂在铜过量的情况下，净光合作用和呼吸作用以及参与C、N和S同化的酶的活性都有所增加，这些反应至少部分是由于参与这些过程的编码蛋白质的基因表达增强。这些反应的组合可能代表了光合生物中铜耐受的特殊机制。

藻类及海水取样

美国泥蜂于2018年春季在Cachagua(32°34S’)收集，这是一个没有金属污染历史的沿海地区，并在4°C的温度下将其放入冷却器中运送到实验室。藻类是根据其表型进行视觉鉴定的，以前已经根据18S cDNA序列进行了鉴定。藻类用在Quintay(33°12'S)一个原始地点收集的过滤海水冲洗三次。人工清洗藻类，并在超声浴(Branson, Danbury, CT, USA)中超声三分钟，以去除附生细菌和有机碎屑。

体外培养

美国泥蜂在不添加铜的海水中(对照，第0天)，10 μM CuCl培养100 mg新鲜组织₂在50 μmol m的辐照度下放置1、3、5天⁻²年代⁻¹光照12h，黑暗12h，每个样品一式两份。所有样品用2ml pH = 7.0的100 mM Tris-10 mM EDTA洗涤两次，洗涤10分钟，以消除与藻类细胞壁结合的铜。样品用纸干燥，液氮冷冻，- 80°C保存。

RNA的提取及cDNA文库的制备

使用EZNA总RNA试剂盒(Omega Biotek, GA, USA)从培养0、1、3和5天的样品中提取总RNA。为此，将藻类(100 mg)在液氮中冷冻，并在1 mL TRK缓冲液中加入20 μL β-巯基乙醇均质。匀浆以12,000 rpm离心15 min，回收上清。将上清液与70%乙醇混合，转移到HiBind RNA迷你柱上，用RNA洗涤液I和II洗涤。总RNA用50 μL经DEPC处理的蒸馏水洗脱。使用GenJet RNA cleanup and concentration micro kit (Thermo, MS, USA)清洗总RNA。将总RNA样本送到华大基因基因中心(中国深圳)，检查RNA质量，制备链和对端cDNA文库，使用Illumina 4000测序仪进行测序。

从头组装和注释

使用Illumina测序获得的Reads在华大基因基因组中心(深圳，中国)使用Trinity软件进行裁剪、清洗和组装。使用BlastX软件和UniprotKB数据库将转录本翻译成蛋白质，并用e值e进行注释⁻³或以下，使用OmicsBox软件(Biobam, VA, Spain)和e值为e的基因本体(GO)进行分类⁻³或者更低。

差异表达转录物的鉴定

使用Bowtie2软件将清洗后的reads与转录组进行比对，使用eXpress (version 1.5.1)对原始reads进行计数。然后在默认设置下使用Trinity的脚本丰度e_estimates_to_matrix.pl将读取归一化为CPM单位。EdgeR在FDR < 0.01时鉴定出差异表达的转录本，上调转录本的Fold of Change > 1，下调转录本的Fold of Change < - 1。差异表达的转录本在不同时间被鉴定:0天vs.1天，0天vs. 3天，0天vs. 5天。利用转录本和样本的Spearman相关系数和分层聚类，将差异表达的转录本可视化为热图4:图S3A)。所有生物重复之间的相似性大于其他样品(附加文件)4:图S3B)。为了鉴定下调转录本，我们在每个样本时间点鉴定了100多个下调转录本，并对它们在蛋白质合成与降解、脂肪酸合成与降解、DNA合成与降解、复制与DNA修复、转录、剪接、次生代谢、细胞生长等不同过程中进行了分类。

编码蛋白质的转录本动力学涉及光合作用、呼吸作用和C、N、S同化

根据注释和氧化石墨烯结构域(生物过程)选择了编码参与光合作用和呼吸作用的蛋白质和参与C、N和S同化的酶的转录本。所选转录本的Reads采用TMM归一化方法进行归一化，并使用MEV软件进行分析。创建具有相似时间表达模式的转录本组，并在这些组中选择表达增加的转录本。

光合作用和呼吸作用的量化

定量培养25 mg新鲜组织(FT)美国泥蜂在氧描记室(Hansatech, Norfolk, UK)中加入2ml海水。O₂在425 μmol m光强下检测10 min⁻²年代⁻¹在氧描记室中培养25 mg海藻(FT)于2 mL海水中，O₂在黑暗中检测消耗10分钟。

蛋白提取物的制备

一个美国泥蜂(FT)在液氮中冷冻，在砂浆中均质。加入pH = 7.0的100mm磷酸缓冲液3 mL，含5mm β-巯基乙醇，继续均质。匀浆以14000 rpm离心15分钟，回收上清。每mL提取物加入0.6 g硫酸铵沉淀上清中的蛋白质，并在15,000 rpm下离心30 min。蛋白球溶于200 μL pH = 7.0的磷酸盐缓冲液中，其中含有2mm的β-巯基乙醇和20%的甘油。最终提取物含有约3毫克毫升⁻¹保存于- 80°C。

C、N、S同化相关酶活性检测

Rubisco活性检测方法见[35]。反应混合物1 mL，含100 mM pH 8.0的Tris-HCl, 1 mM 1,5-二磷酸核酮糖，10 mM KHCO_3.， 20mm MgCl₂用5 mM磷酸肌酸、3 mM ATP、10 U磷酸甘油激酶、10 U甘油醛3-磷酸脱氢酶、10 U肌酸激酶、0.15 mM NADH和30 μg蛋白提取物检测rubisco活性。在340 nm处检测NADH消耗导致的吸光度下降3 min，并使用NADH消光系数(ε = 6.2 mM)计算活性⁻¹厘米⁻¹）.

谷氨酰胺合成酶(GlnS)活性检测方法见[36]。1 mL反应混合物，含200mm HEPES缓冲液pH 7.0, 50mm L-谷氨酸，5mm羟胺，5mm MgCl₂， 20 mM ATP和150 μg蛋白提取物检测GlnS活性。在37℃下孵育1 h，加入含有0.7 M三氯化铁、20% (w/v)三氯乙酸和0.3 M盐酸的混合物1 mL停止反应。7400g离心5min，回收上清液。测定上清液在540 nm处的吸光度，利用γ-谷氨酰-羟肟酸的消光系数(ε = 0.85 mM)计算活性⁻¹厘米⁻¹）.

半胱氨酸合成酶(CysS)活性检测方法见[37]。反应混合物1 mL，含50 mM pH = 7.5的磷酸盐缓冲液，10 mM o -乙酰丝氨酸，2 mM Na₂采用S、30 mM DTT和50 μg蛋白提取物检测CysS活性。37℃孵育1 h，加入0.5 mL 20% (w/v)三氯乙酸停止反应。用100 μL乙酸和200 μL茚三酮试剂检测半胱氨酸。加入550 μL 95% (v/v)乙醇，将混合物置于沸水中10 min，在冰中快速冷却。用消光系数(ε = 25 mM)测定了混合物在560nm处的吸光度和活性⁻¹厘米⁻¹）.

统计分析

在检测氧的产生和消耗以及参与C、N和S同化的酶的活性方面，采用95%置信区间的单因素方差分析确定了显著差异，随后使用统计软件Prism6 (Graphpad software Inc.， CA, USA)进行了Tukey的多重比较后检验。

全文已存入SRA数据库(NCBI)，检索号为PRJNA557176，将于2020年8月24日发布。实验数据可在在线存储库中获得:https://doi.org/10.6084/m9.figshare.9108491

APS还原酶:

5 ' -磷酸硫酸腺苷还原酶

半胱氨酸:

半胱氨酸合成酶

出口押汇:

果糖1,6双磷酸酶

FBPA:

果糖二磷酸醛缩酶

舰队指挥官:

变化的折叠

英国《金融时报》:

新鲜的组织

G3PDH:

甘油醛3-P脱氢酶

gln:

谷氨酰胺合成酶

谷胱甘肽:

谷胱甘肽

MTs:

金属硫蛋白

电脑:

转移

PGK:

磷酸甘油酸酯激酶

PRK:

Phosphoribulose激酶

R5PI:

核糖5-P异构酶

二磷酸核酮糖羧化酶:

核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶

TK:

转酮醇酶

不适用。

本工作由Fondecyt 1160013资助给a.m.， Fondecyt 3170511资助给d.l, Fondecyt 1160369资助给C.A.S.。资助机构不参与实验设计、结果分析或稿件撰写，但为稿件提供了资金支持。

从属关系

1. 智利圣地亚哥大学化学与生物学院海洋生物技术实验室，圣地亚哥阿拉米达3363

   丹尼尔·拉波特、费利佩Rodríguez、阿尔贝托González、安东尼奥Zúñiga和亚历杭德拉·莫恩

2. HUB AMBIENTAL UPLA, Vicerrectoría de Investigación, Postgrado e Innovación, Playa Ancha大学，Avenida Carvallo 270,2340000, Valparaíso，智利

   安东尼奥Zúñiga和克劳迪奥A. Sáez

3. 智利圣地亚哥安德雷萨梅斯贝洛大学生命科学学院生物信息学与综合生物学中心República 330

   爱德华多Castro-Nallar

4. Playa Ancha大学高等研究中心，水环境研究实验室，Traslaviña 450, Viña del Mar，智利

   克劳迪奥A. Sáez

贡献

DL进行了生物信息学工作，测定了与碳、氮、硫同化有关的酶的活性。AG分析了净光合作用和呼吸作用，并帮助准备了图表;FR和AZ制备了两份样品的总RNA，用RNA-seq测序。EC-N参与生物信息学分析，CAS协助讨论和修改稿件，AM撰写稿件。所有作者已阅读并同意稿件。

相应的作者

对应到Alejandra Moenne．

伦理批准并同意参与

藻类收集和实验程序按照智利圣地亚哥大学生物安全委员会的指导方针进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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转载及权限