涉及胼胝质介导的拟南芥防御的新分子成分沙门氏菌血清和大肠杆菌O157: H7

背景

食物污染沙门氏菌血清和肠出血性大肠杆菌是世界范围内食源性疾病的主要原因之一，作物与50%以上的疾病暴发有关。然而，这些人类病原体与植物相互作用的机制仍然难以捉摸。在这项研究中，我们探讨了植物对这些肠杆菌和植物病原体的抗性机制两pv。番茄（太平洋标准时间) DC3118，作为提高食品安全的机会。

结果

我们发现美国血清血清型鼠伤寒杆菌(STm)转录调节拟南芥叶片的胁迫反应，包括诱导植物防御的两个标志过程:ROS爆发和细胞壁修饰。具有潜在stm诱导基因突变的植物分析EXO70H4其编码的蛋白是气孔防御STm和STm所必需的大肠杆菌[157] H7，但不反对太平洋标准时间DC3118。然而，在外质体中，EXO70H4是防御STm和太平洋标准时间DC3118，但不反对大肠杆菌O157: H7。此外，EXO70H4是胼胝质沉积所必需的，但在这三种细菌引发的ROS爆发中没有作用。水杨酸(SA)信号和生物合成蛋白NPR1和ICS1分别参与气孔和外体防御以及胼胝质沉积，以抵御人类和植物病原体。

结论

结果表明，EXO70H4参与拟南芥气孔和外胞体防御，提示EXO70H4介导的防御以细菌依赖的方式在保卫细胞和叶肉细胞中发挥明显作用。尽管如此，EXO70H4对人类和植物病原体的反应都有助于胼胝质沉积。NPR1和ICS1是参与SA信号通路的两种蛋白，在抑制肠杆菌的叶片内化和外胞体持久性以及植物病原体的增殖中起重要作用。这些发现强调了独特和共享的植物遗传成分的存在，以抵抗各种细菌病原体，为预防食源性疾病提供了特定的靶点。

由人类病原体引起的食源性疾病具有深远的社会和经济影响。尽管采取了一些安全措施来防止疾病爆发，但据估计，全世界每年有6亿人(十分之一)受到影响[1]。根据美国食源性疾病爆发监测系统(FDOSS)的数据，1998年至2013年期间，美国发生了972起与生食有关的疫情，导致34,674人患病，2315人住院，72人死亡。2]。在这些食源性疾病暴发中发现的最常见病原是诺如病毒(54%);沙门氏菌血清(21%)和志贺毒素产生大肠杆菌(10%) (2]。因此，美国食品安全现代化法案(FSMA)于2011年制定，旨在通过将重点从食源性疾病应对转移到疾病预防来改变食品安全体系。因此，有必要了解人类细菌病原体与植物相互作用的生物学过程，以防止或至少减少新鲜农产品中肠道病原体的定植。

以前人们认为植物可能是人类病原体的被动载体。然而，最近的研究支持这一假设美国血清和肠出血性大肠杆菌能够在植物组织中定植，而植物可在细菌定植时激活免疫反应[3.，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20.，21，22，23]。这些细菌能够在许多植物的叶外质体中生存，包括香菜(Coriandrum一)、生菜(摘要以l .)拟南芥、番茄(茄属植物lycopersicum)、菠菜(菠菜oleracea)，烟草benthamiana，罗勒(罗勒属basilicum） [6，11，22，24，25，26，27，28，29]。一旦进入叶外质体，这些细菌就会受到保护，不受可食用叶子的普通卫生处理的影响[30.，31]，有可能到达人类宿主。

人类细菌病原体的内生生存似乎受到植物免疫系统的调节[32，33，34]。微生物相关分子模式(MAMPs)，如细菌中的运动蛋白鞭毛蛋白[35]，可以诱导植物基础防御，称为mamp触发免疫(MTI) [36]。例如，Seflg22，一种由22个氨基酸组成的肽美国血清血清型鼠伤寒菌(STm)鞭毛蛋白，被拟南芥、烟草benthamiana西红柿，还有Medicago truncatula［23，37，38]，而大肠杆菌鞭毛蛋白衍生肽flg15^。杆菌在番茄、菠菜和拟南芥中具有生物活性[15，18，39，40，41]。此外，STm和大肠杆菌O157:H7诱导气孔关闭，这是一种众所周知的MTI反应，在几种植物中[17，22，42]并导致植物中与mti相关的转录变化[15，32，38，43，44，45]。事实上，大量的拟南芥基因是由大肠杆菌O157:H7在鞭毛蛋白依赖性的方式，证明了比较转录组分析的野生型和afls2突变体(缺乏鞭毛蛋白感知)接种大肠杆菌O157:H7或大肠杆菌鞭毛蛋白缺乏突变体TUV86-2警察［43，45]。总的来说，这些研究表明STm和大肠杆菌在植物中诱导MTI，尽管肠杆菌感知的下游机制仍然难以捉摸。

在本研究中，我们探索了STm介导的植物转录调控，并利用拟南芥遗传资源，再次了解了STm和STm在植物定植过程中激活的分子机制大肠杆菌O157: H7。此外，我们试图建立与模型系统拟南芥-的相关性两光伏。番茄（太平洋标准时间）.研究表明，EXO70H4 (exoocyst亚基EXO70 FAMILY PROTEIN H4)参与了对这两种肠杆菌的气孔防御，而在叶外质体中，它只参与对STm和STm的免疫应答Pst。因此，EXO70H4似乎以细菌特异性的方式发挥作用，这取决于植物细胞类型。此外，我们还研究了植物对STm 14028s的基础防御;大肠杆菌O157: H7,太平洋标准时间DC3118分别需要水杨酸(SA)的生物合成和信号蛋白ICS1 (ISOCHORISMATE SYNTHASE 1)和NPR1 (NON-EXPRESSER OF致病相关基因1)。有趣的是，EXO70H4、ICS1和NPR1在所有这些细菌的作用下促进了叶片胼胝质沉积。我们的研究结果表明，EXO70H4是植物防御病原体的新成分。此外，我们证明了sa介导的免疫是一种常见的植物防御反应，包括通过EXO70H4诱导胼胝质沉积。这些发现代表了我们目前对最终保护叶片免受细菌定植的植物遗传机制的理解的进步。

全球基因表达分析揭示了STm在拟南芥中调控的植物过程

为了确定拟南芥抵御STm持久性的特定遗传机制，我们使用Affymetrix基因芯片ATH1 (Thermo Scientific, Rockford, IL)对接种STm菌株SL1344的叶片进行了转录组学分析。阵列强度数据的z比值归一化[46]显示了相对基因表达的正态分布(STm与模拟处理的样本)，并在钟形曲线的2%极端范围内揭示了显著差异表达的基因(附加文件1）.基因表达量以Z-ratio与Log计算线性回归₂折叠变化呈高相关性(R²= 0.9676)(附加文件1)，其中两个极端z比率值都与两个极端Log值相吻合₂折叠改变值。利用这两种方法计算相对基因表达量，我们鉴定出585个差异表达基因，其中接种STm SL1344后，310个基因表达上调，275个基因表达下调(另附文件)2;ID nascarrays - 674)。为了提高鉴定差异表达基因的可信度，我们使用逆转录定量PCR (RT-qPCR)验证了微阵列分析。从微阵列数据集中随机选择的9个基因(4个上调，3个不上调，2个下调)的相对表达水平;额外的文件2)显示出与RT-qPCR计算的表达模式相同(附加文件)3.)，这表明微阵列分析足够强大，可以调用差异表达基因。

STm SL1344差异调控基因的基因本体(GO)单富集分析(SEA)可以鉴定细菌接种样品中调节的代谢过程。我们发现144个和25个GO术语明显更丰富(FDR)p< 0.05)，与TAIR10的拟南芥内参基因模型(Arabidopsis.org)(附加文件4）.11个氧化石墨烯项在上调和下调的基因集中均显著富集(图2)。1a).其中2个为亲本术语，即“多生物过程”和“对刺激的反应”，其余9个为后者的子术语(附加文件)5）.这表明STm SL1344调控了植物的胁迫反应。

仅与上调基因相关的GO术语支持拟南芥叶片中STm SL1344激活防御反应的假设(附加文件)4）.其中，氧化石墨烯术语“对氧化应激的反应”和“对过氧化氢的反应”表明STm SL1344可以诱导活性氧(ROS)爆发，这是植物中众所周知的免疫反应。此外，氧化石墨烯术语“细胞外围”、“质膜”、“外部包覆结构”和“细胞壁”是STm sl1344诱导基因数据集中唯一存在的富集类别，这表明这种细菌引发了拟南芥细胞壁的修饰。有趣的是，“对热的反应”和“对温度刺激的反应”也在上调的富集氧化石墨烯术语之列，其中包括几种热休克蛋白(图2)。1b;额外的文件4）.这些蛋白作为分子伴侣，在植物与微生物相互作用过程中对质膜蛋白受体的质量控制起着重要作用[47]。

我们还确定了在STm SL1344下调基因数据集中完全过度代表的GO术语(附加文件)4）.其中，“β -葡萄糖苷酶活性”和“葡萄糖苷酶活性”类别(图2)。1c)表明STm SL1344下调葡萄糖基化合物的水解。此外，氧化石墨烯术语“对水分的反应”、“对缺水的反应”、“对盐胁迫的反应”和“对渗透胁迫的反应”表明，STm SL1344抑制拟南芥的干旱和盐胁迫反应。GO术语“对冷的反应”(图2)。1c)涵盖了主要与糖基水解和干旱/盐胁迫反应相关的基因(附加文件)4)，强化了STm SL1344对这些植物反应的下调。此外，与信号转导相关的两个GO术语“跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路”和“酶联受体蛋白信号通路”在下调的基因中被富集，涵盖了与植物发育相关的六种富含亮氨酸的重复蛋白激酶。

综上所述，我们可以得出结论，STm SL1344主要通过诱导ROS爆发和细胞壁修饰，以及抑制葡萄糖基化合物水解、干旱和盐胁迫反应以及发育相关受体介导的信号传导反应，引起拟南芥叶片的转录调节，影响植物先天免疫反应和细胞生长。

EXO70H4是一种新型蛋白，以细菌特异性的方式参与基于气孔和外胞体的防御

转录组分析显示，STm SL1344诱导了EXO70H4基因(附加文件)2）.因此，我们评估了EXO70H4在拟南芥与STm的相互作用中可能的作用，以及与大肠杆菌O157: H7和太平洋标准时间DC3118。在这些实验中，我们使用exo70h4-3突变体在T-DNA的编码序列中插入EXO70H4导致截断mRNA合成的基因(附加文件)6） [48);。该突变株只有在接种了人类病原菌STm 14,028s和STm后才出现气孔关闭缺陷大肠杆菌O157: H7(无花果。2a). 3种细菌均显著降低了Col-0和Col-0的平均气孔宽度exo70h4-3植物(附加文件)7）.我们还评估了紫花苜蓿叶片中的细菌种群动态exo70h4-3突变并观察到太平洋标准时间DC3118群体仅在接种后第1天(DAI)高于Col-0，而STm 14028s群体在接种后第3天(DAI)仍保持较高水平(图2)。2b). exo70h4介导的外胞体防御似乎是细菌特异性的大肠杆菌O157:H7在内部表现出相同的存活率exo70h4-3叶片与Col-0的对比(图2)2b).因此，EXO70H4可能在保护细胞对肠杆菌的特异性反应中起作用，而在叶肉中，EXO70H4的活性可能对防御很重要太平洋标准时间DC3118和STm 14028 s，但不反对大肠杆菌O157: H7。

EXO70H4有助于细菌诱导的胼胝质沉积，而不是ROS爆发

我们发现STm SL1344转录调节拟南芥叶片的“细胞壁”过程。1b)和EXO70H4先前被证明参与叶片毛状体的胼胝质沉积[48]。由于胼胝质沉积是植物对病原体的基础免疫反应的标志[49]，我们评估了胼胝质的生产程度exo70h4-3细菌接种后的突变体。胼胝质沉积减少exo70h4-3与接种三种细菌中的任何一种后的Col-0相比(图2)。3.a)，表明EXO70H4参与了生物胁迫下叶片胼胝质的形成。

ROS爆发是植物基础防御反应的另一个标志[50]，我们的转录组分析显示，STm调节植物“对含氧化合物的反应”，诱导“对氧化应激的反应”和“对过氧化氢的反应”(图2)。1）.因此，我们在Col-0和Col-0叶片中测量了细菌诱导的ROS生成exo70h4-3来验证活性氧是否有助于在exo70h4-3植物(图。2b).模拟处理的叶片没有出现ROS爆发(图2)。3.b)，而这三种细菌在Col-0和exo70h4-3(无花果。3.b).这些研究结果表明，虽然肠道和植物病原体都激活了这种植物防御，但EXO70H4在这一过程中没有作用。

与植物病原体一样，人类病原体的防御也需要SA信号成分ICS1和NPR1

植物对细菌的防御，包括胼胝质的生物合成，已知需要一个功能性的SA途径。49]。因此，我们通过基因突变来评估SA生物合成受损的植物ICS1的基因,sid2-2［51]，以及SA信号通过基因突变NPR1的基因,npr1-1［52]。纯合性sid2-2和npr1-1植物系经PCR鉴定(附加文件)6）.太平洋标准时间DC3118,大肠杆菌O157:H7和STm 14028s不诱导气孔关闭sid2-2和npr1-1与在col0植物中相同程度的突变(图2)。4一个);尽管这三种细菌都在Col-0中诱导了显著的气孔关闭，sid2-2,npr1-1与水控制(附加文件)相比7)，表明在这些突变体中气孔免疫并没有完全消失。有趣的是，与Col-0叶片相比，经水处理的突变叶片气孔孔径宽度显著变宽(图2)。4a)，表明在没有生物胁迫(即细菌接种)的情况下，SA的合成和信号传导也控制气孔孔径。这三种细菌都保持了较大的胞外体数量npr1-1和sid2-2突变体比Col-0中多，那里的植物病原体数量多太平洋标准时间DC3118增加，人口为大肠杆菌在整个实验期间，这些突变体中O157:H7和STm 14028 s的持续水平高于野生型植物。4b).这些结果表明，SA的生物合成和通过蛋白ICS1和NPR1的信号传导不仅有助于拟南芥防御太平洋标准时间如前所述[42，51，53]，而且还与叶片气孔和外胞体防御人类细菌病原体有关大肠杆菌O157:H7和STm 14028 s。

当保卫细胞中的跨膜受体检测到MAMPs时，例如FLS2 (FLAGELLIN SENSING 2)可以从细菌中感知鞭毛蛋白，从而触发sa介导的免疫[36，42，54，55]。因此，我们测试了FLS2对鞭毛蛋白的感知是否在拟南芥对STm 14028 s和STm 14028 s的防御中起作用大肠杆菌[157] H7也是。如前所述[42，55),fls2_SAIL突变体(附加文件)6） [56];气孔关闭受损是对太平洋标准时间DC3118(无花果。4a)。有趣的是,大肠杆菌O157:H7触发气孔免疫增强fls2_SAIL，而STm 14028 s未能诱导气孔关闭fls2_SAIL突变程度与Col-0相同(图2)。4a).这些发现表明FLS2足以让拟南芥识别太平洋标准时间DC3118和STm 14028 s激活气孔关闭;然而，其他MAMPs可能会冗余地贡献大肠杆菌O157: h7触发的气孔关闭。有趣的是,太平洋标准时间但不包括STm 14028 s和大肠杆菌O157:H7，诱导气孔关闭失败fls2-SAIL(附加文件7）.此外，细胞的外泌体防御fls2_SAIL突变体对所有三种细菌的反应都受到损害，因为与Col-0相比，该突变体叶片内观察到更高的细菌数量(图2)。4b).这一发现表明FLS2受体在感知太平洋标准时间， STm 14028 s，和大肠杆菌O157:H7被叶肉细胞，至少在前三天的相互作用。

综上所述，这些结果表明，SA信号成分ICS1和NPR1以及MAMP受体FLS2在植物防御人类病原体中的作用与抵抗植物病原体的作用相似太平洋标准时间。

ICS1和NPR1参与肠杆菌诱导的胼胝质生成

已知细菌感染可通过胼胝质沉积诱导拟南芥细胞壁增厚[57]，一个与SA信号有关的过程[58]。我们验证过了太平洋标准时间DC3118,大肠杆菌O157:H7和STm 14028s诱导野生型植物Col-0的胼胝质沉积(图2)。3.a)。此外,sid2-2和npr1-1突变体对STm 14028s和大肠杆菌O157: H7(无花果。4b).因此，我们通过评估各自突变叶片中产生的胼胝质沉积面积来测试ICS1和NPR1是否也与这些人类病原体引发的胼胝质沉积有关。两种突变体的胼胝质沉积均显著减少。sid2-2和npr1-1，对所有细菌作出反应(图2)。5表明拟南芥通过ICS1合成SA和通过胼胝质产生的NPR1信号传导是抵御肠杆菌和植物病原体的共同机制太平洋标准时间。

众所周知，植物可以通过激活先天免疫反应来保护自己免受多种微生物的侵害。植物对植物病原体的防御已经被广泛报道，并且这种防御的强大标记被广泛接受来跟踪这些反应。例如，宿主跨膜受体对MAMPs和DAMPs的感知、ROS的产生、胼胝质沉积和激素串声是植物广泛研究和重要的防御机制。59]。虽然植物能够对人类致病菌的定植做出反应，但植物与肠杆菌相互作用的分子机制是一个尚未探索的主要研究领域。我们的研究通过评估植物抗性的新分子成分，并确定这些分子是否与标志性的植物防御机制相关，从而降低STm的持久性，从而为这一领域做出贡献大肠杆菌O157:拟南芥叶中的H7。

气孔防御是植物抵御病原菌攻击的先天免疫的重要组成部分，它可以减少细菌进入叶片外质体。众所周知，气孔运动需要一个动态的保护细胞壁，其中保护细胞中胼胝质的合成被证明可以调节蕨类植物的气孔运动Asplenium病灶［60]。因此，EXO70H4介导的保护细胞壁强化可能是一个在植物与肠杆菌相互作用下被激活的动态过程exo70h4-3仅在接种人病原体STm 14,028s和STm后，保护细胞的气孔关闭功能受损大肠杆菌O157: H7(无花果。2）.此外，EXO70H4是细胞质膜外囊复合体的一部分，其中包含在所有真核生物中保守的蛋白质[61，62，63]，提示强化细胞屏障是STm和肠出血性激活的共同防御机制大肠杆菌在植物和动物中。因此，保护细胞对人和植物病原体的反应可能是不同的，其中胼胝质沉积是一种植物防御机制，在人类病原体触发的气孔防御中可能比在植物病原体触发的气孔防御中更重要太平洋标准时间DC3118。进一步研究这种特殊的保护细胞对细菌反应的分子成分将有助于开发新的策略来减少STm和STm对新鲜农产品的污染大肠杆菌。

有趣的是,大肠杆菌O157:H7诱导了较强的气孔防御fls2_SAIL突变体与Col-0相比(图2)。4）.这证实了其他MAMPs(如脂多糖)也参与气孔免疫的观点[42];)，可能在植物的感知中有更突出的作用大肠杆菌H7比它的鞭毛蛋白高。然而，在MAMP感知的下游，气孔防御需要一个完整的SA响应途径大肠杆菌O157:H7，以及针对STm 14028 s和太平洋标准时间DC3118(无花果。4）.这一结果表明，通过ICS1合成SA和通过NPR1信号传导是气孔防御植物病原体的共同机制[55]和肠杆菌(图2)。4）.

先前的研究已经确定了大量的拟南芥基因大肠杆菌O157:H7以鞭毛蛋白依赖的方式[43，45]，表明这种人类病原体激活了植物外质体的基础防御机制。同样，我们发现STm SL1344调节拟南芥成虫叶片的植物免疫应答(图2)。1)，与拟南芥幼苗的STm 14,028 s相似[32，38]。在被激活的过程中，与ROS爆发和细胞壁修饰相关的基因被接种STm SL1344后诱导的基因过多，表明这些过程在植物对这种人类病原体的基础防御中发挥了作用。微生物诱导植物细胞壁的一种常见修饰是胼胝质在感染区域的沉积[49];由SA和鞭毛蛋白共同诱导的抑制细菌生长的过程[64，65]。

有趣的是，鞭毛蛋白诱导EXO70H4，NPR1和ICS1［66]。此外，EXO70H4对于胁迫诱导的胼胝质合成酶CalS12的分泌至关重要，CalS12也被称为白粉病抗性4 (PMR4)，它有助于叶片毛状体细胞壁的强化[48，66]。的表达PMR4以依赖npr1的方式被SA强烈诱导[58]。这些发现表明EXO7H4可以依赖于NPR1发挥作用。事实上，我们观察到EXO70H4、NPR1和ICS1都参与了STm 14028 s的胼胝质沉积。大肠杆菌O157: H7,太平洋标准时间DC3118(无花果。3.和无花果。5）.此外，胼胝质沉积减少exo70h4-3突变体与其对STm 14028s和STm 14028s的外细胞免疫受损有关太平洋标准时间DC3118(无花果。2）.我们没有观察到增加大肠杆菌H7滴度exo70h4-3突变体。然而，有可能EXO70H4在抗大肠杆菌O157:H7或这种细菌在拟南芥叶片中诱导多余的外胞体免疫反应。尽管如此，这些结果支持了EXO70H4、NPR1和ICS1在感染入侵前和/或入侵后控制人类病原体在叶片中持续存在的作用(图2)。2和4)，并表明这些蛋白质介导的植物防御涉及胼胝质的产生。

气孔防御STm和大肠杆菌O157:H7具有共同的机制，需要EXO70H4、SA信号组分NPR1和ICS1以及MAMP受体FLS2，不同于气孔防御太平洋标准时间不涉及EXO70H4的DC3118。相比之下，STm 14,028和太平洋标准时间DC3118在叶肉中也会产生类似的反应，因为EXO70H4、NPR1、ICS1和FLS2参与了拟南芥叶片内细菌数量的减少。此外，EXO70H4、NPR1和ICS1通过胼胝质沉积介导的基础防御是植物对人类和植物病原体的共同反应。虽然，EXO70H4不足以抑制大肠杆菌O157:叶外质体的H7定殖。

该研究为植物防御两种与公众健康相关的肠杆菌的遗传机制提供了新的见解。了解细菌在可食用叶片中持续存在的机制有助于实施预防措施，以控制食源性疾病，并最终提高新鲜农产品的质量、安全性和适销性。

植物材料和生长条件

的种子拟南芥(L. Heyhn.)野生型生态型哥伦比亚(Col-0, ABRC stock CS60000)及其衍生突变体(附加文件)6;额外的文件8)播种于1:1:1 v:v:v的生长介质(雷迪土塞和幼苗混合物，Sun Gro)，细蛭石和珍珠岩的混合物中，在22±2°C, 60±10%相对湿度的受控环境室中生长，光周期为12 h，光强为100 μmol.m⁻²。s⁻¹。在所有的实验中，都使用了四到五周的植物。

细菌菌株和培养条件

两pv。番茄（太平洋标准时间DC3118(一种冠状蛋白缺陷突变体)太平洋标准时间DC3000野生型[67),),大肠杆菌血清型O157:H7菌株86-24 [68),肠道沙门氏菌亚种血清血清型鼠伤寒杆菌菌株SL1344和14028s [69在这项研究中使用了。细菌培养物在低盐Luria-Bertani培养基(LSLB;10 g/L色氨酸，5 g/L酵母浸膏，5 g/L NaCl, pH = 7.0)， 28℃。在接种准备之前，将细胞从冷冻甘油原液中新鲜地在固体培养基上染色。在培养基中添加链霉素(50 μg/mL)培养大肠杆菌O157:H7，大观霉素(100 μg/ml)生长STm SL1344，或利福平(100 μg/ml)和卡那霉素(50 μg/ml)生长太平洋标准时间DC3118。STm 14028s对抗生素没有耐药性。

阵列杂交试验

按上述方法种植30株col0拟南芥植株。STm SL1344在LSLB液体培养基中培养，在30°C的轨道振动器中孵育过夜。当培养达到OD时，通过收集细菌细胞制备接种物₆₀₀0.8 - -0.9。接种物终浓度为1 × 10⁸CFU.mL⁻¹，添加0.004%的银湿，真空渗透到15株植物的叶片细胞间隙，如前所述[70]。以0.004% Silwet L-77水分真空浸润15株作为模拟对照。接种后，将植株在25°C下保存7小时，直到收集叶片，根据制造商的说明使用TRizol®试剂(Life Technologies, Grand Island, NY)提取RNA。总RNA通过NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific, Rockford, IL)进行定量。使用Agilent 2010生物分析仪评估RNA质量。

拟南芥Affymetrix GeneChip ATH1 (Thermo Scientific, Rockford, IL)阵列杂交在密歇根州立大学研究技术支持设施进行了三个生物重复(即整个实验的独立重复，每个处理由5个植株组成)，完全按照43所述。生物复制的原始数据可在诺丁汉拟南芥库存中心(NASC;http://nasc.cott.ac.uk/)，实验编号NASCARRAYS-674。

差异基因表达分析

使用“affylmgui”软件包(版本1.10.4)，基因表达数据在所有生物重复中使用鲁棒多芯片平均(RMA)归一化进行归一化，该软件包可作为Bioconductor软件包的一部分提供。71]。成对的日志₂利用Microsoft Excel (Version 2010)软件，根据rma归一化相对表达值计算模拟叶片与STm sl1344接种叶片间的折叠变化值(3个生物重复的平均值)。此外，根据46中概述的方法，采用基于z比率的方法鉴定差异表达基因。z比率方法确定哪些基因的折叠变化明显高于数据集中的其他基因。Z-ratio截止值为2.33(附加文件1)被用来将每个数据集中大约2%的基因称为差异表达。

使用agriGO v2.0 (http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php;［72])。利用参考数据集基因模型TAIR10(28,362个基因组位点)和完整的氧化石墨烯基因本体类型获得氧化石墨烯富集。采用Fisher精确检验和Yekutieli-False Discovery Rate多重检验校正(FDR < 0.05)，发现差异有统计学意义。

RT-qPCR验证微阵列数据

使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Inc.， Valencia, CA)从叶片中提取总RNA，并使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific, Rockford, IL)进行定量。利用Takara RNA PCR试剂盒(AMV) (Clontech, mountain View, CA)将总RNA (1 μg)合成cDNA，并稀释至终浓度为50 ng.μL⁻¹。采用10 μL的iTaq Fast SYBR Green Supermix (BioRad, Hercules, CA)、2 μL的上述逆转录酶反应cDNA模板和200 nM的反向和正向基因特异性引物进行反转录定量PCR (RT-qPCR)反应(20 μL)。反应在Applied Biosystems 7300热循环器(Applied Biosystems, Foster City, CA)中进行，循环参数如下:1个循环95°C 5分钟，40个循环95°C 10秒，60°C 30秒。测定每个反应的解离曲线，以确认单个扩增子的存在，表明缺乏引物二聚体和非特异性产物，并且RNA样品没有DNA污染。采用ΔΔCt方法计算相对于模拟接种对照的基因表达水平[73考虑到管家基因的表达ACT8将模拟处理样本的内控和表达值设为1。进行了两个生物重复(每个重复由一种植物的三片叶子组成)和三个技术重复，并用Student 's计算平均数之间的统计学显著性t以及。

使用IDT-SciTools的引物搜索软件设计了跨内含子区域的基因特异性引物集(http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index）.通过计算cDNA池的5倍连续稀释倍数与循环阈值(CT)之间的线性回归来评估每对引物的效率。只有引物集具有相关系数(R)²) > 0.97。基因特异性引物序列在附加文件中描述9。进行了2次生物重复和3次技术重复。

拟南芥突变体的基因分型

确定每个拟南芥突变体的T-DNA插入或点突变(附加文件)8)，将每个基因型各一株植株的5毫克左右的新鲜叶片组织在200 μL的Edwards溶液中研磨[74]进行DNA提取。PCR反应(25 μL)采用1 U DNA聚合酶Gotaq®(Promega, WI, USA)， 1x酶缓冲液，1.5 mM MgCl₂， 200 μM dNTP, 1 μL gDNA模板，400 nM反向和正向特异性引物(附加文件)8）.使用以下循环参数进行反应:1个循环95°C 5分钟，40个循环95°C 30秒，52°C 30秒，72°C 1分钟，最终延长72°C 10分钟。突变体sid2-2和npr1-1是以前分别用快中子和乙基甲烷磺酸盐方法得到的。因此，这些植物中的重排和点突变可以通过存在或不存在的扩增子来验证sid2-2［51或通过限制性内切酶消化的附加步骤国民III (New England Biolabs, Ipswich, MA)npr1-1［52]。在C300成像系统(Azure Biosystems, CA, USA)上使用紫外灯凝胶电泳后，扩增子可见。

气孔生物测定

目的:研究突变体植物的气孔免疫太平洋标准时间DC3118,大肠杆菌O157:H7和STm 14028 s，按照前面的描述进行气孔生物测定[75]。简单地说，将四至五周大的植物的三片叶子漂浮在水中(模拟对照)或1 × 10⁸CFU.mL⁻¹的太平洋标准时间DC3118,大肠杆菌O157:H7，或STm 14028 s。黎明后3 h开始实验，以确保气孔打开。浮叶在25℃、100 μmol.m光照条件下保存⁻²。s⁻¹在实验期间。使用配备远程物镜的Nikon Eclipse 80i荧光显微镜(Nikon corporation, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan)获得气孔图像和孔径宽度测量。数据点代表两个独立生物重复的平均值，每个处理由一株植物三片叶子的60个气孔组成(n= 120)±标准差(SE)。每个细菌(或水)处理的统计分析，在每个突变体中，与野生型Col-0相关，使用学生的t -测试。

细菌致病机理测定

菌株在28°C的LSLB培养基中添加适当的抗生素培养至OD₆₀₀达到了0.8到1.0之间。制备接种菌，离心收集细菌，悬浮于水中至终浓度为1 × 10⁶CFU.mL⁻¹添加0.008% Silwet L-77 (Lehle Seeds Co.， Round Rock, TX)。用相同的接种剂真空浸润植物，以确保在所测试的植物基因型中接种均匀。接种植株立即在25℃，80±10%相对湿度，12 h光周期(100 μmol.m .)条件下培养⁻².sec⁻¹)进行实验。植物外质体中的细菌数量按先前描述的方法确定[70，76]。数据点代表两个独立实验中每个数据点的一株植物三片叶子(每片叶子有两个技术重复)的平均值(n = 12)±SE。统计分析是通过将每个突变体的细菌滴度与野生型Col-0的细菌滴度进行比较t -测试。

胼胝质沉积测量

如前所述进行胼胝质染色[77]。简单地说，用1 × 10浸渍4 - 5周龄植物的完全展开的叶片⁸CFU.mL⁻¹的太平洋标准时间DC3118, STm 14028 s，大肠杆菌O157:H7，或水(模拟对照)。浸润后的叶片每隔7 hpi收获，用95%乙醇清洗过夜，用50%乙醇和150 mM K复水₂HPO₄，用150mm K溶解的0.01%苯胺蓝染色₂HPO₄。将染色材料置于40%甘油中，使用Nikon Eclipse 80i荧光显微镜(Nikon corporation, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan)检查，配备DAPI滤光片(358 nm激发，461 nm发射)和数码相机。胼胝质沉积面积(mm²/厘米²利用尼康NIS-Elements AR 4.13版软件的二进制面积测量工具和ROI统计分析数字图像，对叶片的叶片面积进行量化。数据点代表了两个独立进行的实验，结果相似。每个试验进行3 ~ 4个生物重复(每个处理每个生物重复1株植物)，每个生物重复平均拍摄8 ~ 10张照片(n= 18 ~ 37)±SE。统计分析使用学生的t -将各突变株的平均胼胝质面积与野生型株Col-0进行比较。

活性氧生成测量

以鲁米诺为基础的测定法监测ROS的检测[78]。四到五周大的植物的幼嫩、完全展开的叶子被用于这项试验。每个基因型/处理的三株植物至少8个叶片(直径4mm)，用软木钻孔机切割，在150 μL无菌水中单独孵育过夜，放置在不透明的96孔白色板上(Thermo Scientific, Rockford, IL)。第二天，用含有34 μg/mL鲁米诺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)， 20 μg/mL辣根过氧化物酶VI型(HRP, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和1 × 10的溶液代替水⁸CFU.mL⁻¹煮熟的太平洋标准时间DC3118, STm 14028 s，或大肠杆菌O157:H7，或水作为模拟对照物。使用Synergy™H1微孔板读卡器(Biotek, Winooski, VT, USA)记录60分钟以上的发光，并使用Biotek Gen5读卡器软件(Biotek, Winooski, VT, USA)进行分析。数据点是三个独立生物重复的平均值(n= 21 ~ 37)±SE。

微阵列数据可在诺丁汉拟南芥库存中心获得符合miame格式的数据。原始数据可从http://bar.utoronto.ca/NASCArrays/index.php?ExpID=674实验编号为NASCARRAYS-674。

ACT2:

肌动蛋白2

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

CT:

循环阈值

戴:

接种后的天数

背景:

脱氧核糖核酸

核苷酸:

Deoxynucleotide三磷酸

EXO70H4:

囊胞亚基exo70家族蛋白h4

FDOSS:

食源性疾病暴发监测系统

罗斯福:

错误发现率

Flg15^大肠杆菌：

15个氨基酸肽衍生自大肠杆菌鞭毛蛋白

FLS2:

鞭毛感应2

FSMA:通过之前

食品安全现代化法案

gDNA:

基因组DNA

走:

基因本体论

现病史:

接种后小时

ICS1:

异氯酸酯合成酶1

LSLB:

低盐Luria-Bertani

MAMP:

微生物相关分子模式

结核杆菌感染:

MAMP-Triggered免疫力

NPR1:

发病相关基因不表达者

OD:

光密度

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

太平洋标准时间:

两pv。番茄

R²：

相关系数

RMA:

鲁棒多芯片平均

RNA:

核糖核酸

ROS:

活性氧

RT-qPCR:

逆转录-定量PCR

山:

水杨酸

SE:

标准错误

海:

单次富集分析

Seflg22:

22个氨基酸肽衍生自沙门氏菌血清鞭毛蛋白

STm:

美国血清型沙门氏菌感染

TAIR:

拟南芥信息资源

紫外线:

紫外线

我们要感谢Shweta Panchal、Bruce Rosa、Giselle de Carvalho和Mariana Vaz Bisneta分别在植物RNA提取、Z-ratio分析、RT-qPCR实验和植物突变基因分型方面提供的技术支持。

这项工作得到了美国国家过敏和传染病研究所(5R01AI068718)、美国农业部-国家食品和农业研究所(NIFA;2015-67017-23360和2017-67017-26180)和NIFA Hatch (ca - d - pl -2327- h)到M.M.。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿中没有任何作用。

从属关系

1. 加州大学植物科学系，1 Shields Avenue, Davis, CA, 95616, USA

   Paula Rodrigues Oblessuc, Cleverson Carlos Matiolli & Maeli Melotto

贡献

MM构思研究;PRO和MM负责研究设计和实验监督;PRO和CCM进行了研究;MM提供的材料/分析工具;PRO、CCM、MM分析数据;PRO和MM写了这篇文章。所有作者已阅读并同意稿件。

相应的作者

对应到Maeli Melotto。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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