形态生理整合子、转录组和共表达网络分析揭示了菊花腋芽相关的新分子特征gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

腋芽是切花菊重要的农艺经济性状。芽的生长是一个复杂的过程，受复杂的分子调控网络、理化整合体和环境刺激的控制。温度是决定芽儿命运的关键因素之一。然而，在分子水平上对菊花腋芽的温度调控知之甚少。对菊花切花在常温和高温条件下的芽出芽情况进行了研究。研究了叶片形态、组织学和生理参数与芽形态、蔗糖和激素调控及分子调控的关系。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

温度导致芽沿芽位生长差异。高温使光合叶面积、生理指标和蔗糖利用发生了较大变化。比较转录组分析确定了芽位置特异性基因的显著比例。加权基因共表达网络分析（WGCNA）showed that axillary bud control can be delineated by modules of coexpressed genes; especially, MEtan3, MEgreen2 and MEantiquewhite presented group of genes specific to bud length. A comparative analysis between different bud positions in two temperatures revealed the morpho-physiological traits associated with specific modules. Moreover, the transcriptional regulatory networks were configured to identify key determinants of bud outgrowth. Cell division, organogenesis, accumulation of storage compounds and metabolic changes were prominent during the bud emergence.

结论gydF4y2Ba

RNA-seq数据与两种温度下三个芽位的形态生理整合子相结合，为了解菊花切花芽受高温影响的生长状况提供了可靠的数据来源。本研究结果为阐明温度对菊花腋芽生长的调控机制提供了有益信息。gydF4y2Ba

树枝除了是建筑的决定因素外，还为植物提供了丰富的形状和观赏价值。腋芽是影响切花美观的重要农艺性状之一;特别是在菊花中，腋枝的过度生长是切花市场成功的主要缺点。自古以来，在温度控制、人工发芽和腋窝生长的分子调控方面取得了长足的进步。然而，由于对这种作物复杂的基因组结构的接触有限，对研究人员来说，芽的控制仍然是一个谜。最近，全基因组测序[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]促进了腋芽调控在分子水平上的追踪。通过这一突破，对温度调控芽生长的分子调控机制进行综合评价，可以发现重要的腋芽热抑制剂。gydF4y2Ba

不同植物的高清晰度转录组学研究为了解分子途径和网络及其与芽生长不同方面的相互作用提供了有价值的见解[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。在一些植物中，芽生长背后的分子机制已经得到了一定程度的证实[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。芽形成过程中碳水化合物的分布、光同化物的供应和储存化合物的积累速率是芽生长的重要调节因子[j]。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外，表观遗传印迹和激素信号转导也被认为是芽动力学的关键调节因子[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。除了这些调节因素，温度在研究芽的开放和生长时也被认为是关键。gydF4y2Ba

然而，在浮士德和海因斯的报告之后[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，说明菊花(Powerhouse)在35°C时产生少量腋芽;菊花没有进一步的进展。温度升高超过一定水平会导致小穗不育[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba];据推测是由于高温[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。最近的研究表明，许多与小穗相关的基因对热胁迫敏感[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]和39°C的高温暴露抑制了小穗的育性[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。在40℃下生长的水稻穗的基因表达谱鉴定出主要参与转运、转录调控、胁迫响应和细胞稳态的基因[j]。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。此外，热胁迫下的基因表达模式以及基于活性氧(reactive oxygen species, ROS)和转录组的调控模型暗示了ROS平衡对穗生长的重要性[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。根据水稻基因组报告，在25°C条件下表达的基因占50.4%，在30°C条件下表达的基因占50.2%;此外，温度刺激了许多转录因子家族，包括WRKY、bZIP和MYB [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。到目前为止，关于切花菊花腋芽生长对高温响应的转录机制尚未见文献报道。gydF4y2Ba

极端温度会导致缺水，从而触发活性氧[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。ROS的过度积累会对脂质造成氧化伤害，导致丙二醛(MDA)的产生，这是植物氧化应激水平的指标[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。植物利用抗氧化防御系统来应对活性氧的积累。该系统使用水溶性还原剂(如谷胱甘肽和抗坏血酸)、脂溶性抗氧化剂(如胡萝卜素和α-生育酚)和超氧化物歧化酶(超氧化物歧化酶)[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。因此，破译SOD和MDA的积累可以揭示水分胁迫和/或温度胁迫造成的损害。SOD触发超氧自由基对H的催化作用gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过自发和极快的反应，以保护植物细胞免受超氧自由基反应的产物。这种潜在的有毒化合物通过酶的作用，如过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)，被还原成水[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。CAT转化氢每氧化物(H)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)到HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

菊花是世界花卉贸易中第二大花卉作物[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，占世界鲜切花总产量的30%。腋生分枝是切花菊花重要的终端用户品质指标。为了给切花提供较高的市场价格，腋芽生长减少是非常可取的。其基因组序列和转录组的可及性[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba结合rna测序技术，对揭示切花菊花芽形成和出芽的遗传调控具有重要意义。已经做了一些努力来了解芽发育的转录组学基础[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。然而，在菊花芽形成和生长背后的温度介导的分子机制方面，还没有取得这样的进展。gydF4y2Ba

据我们所知，尚未对切花菊花在不同位置、不同温度下的芽生长进行比较转录组分析。在这里，我们应用RNA-Seq技术分析了两种不同温度(即25°C和35°C)下的腋芽转录组。研究人员分析了这些数据，以确定与芽生长有关的转录组动力学和转录调控网络。在不同温度下，鉴定了不同芽位的共表达基因模块。此外，还研究了叶片对光同化物质的空间调控和化学稳态作为芽调控的间接调控机制。因此，本研究对腋芽生长的分子调控机制和关键因素提供了有价值的见解。gydF4y2Ba

高温引起植物形态生理变化[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]而去叶会阻碍芽的生长，说明叶源生理代谢因子在腋芽控制中的重要性[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。因此，将叶片动态与芽生长联系起来可以作为了解温度对叶片影响的有效工具。gydF4y2Ba

芽位在高温和常温下表现不同gydF4y2Ba

在伸长的株高(35-40厘米)时，植株的所有位置都显示出最大的腋芽。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在这个阶段，与高温相比，在常温下可以看到腋窝生长的高密度。在两种温度下，顶芽均保持了生长势。高温几乎完全抑制了上腋芽(TAB)的生长。25℃条件下，腋窝较低的位置生长较多，而高温条件下则受到限制，说明不同的芽位对温度变化的响应不同。gydF4y2Ba

温度通过叶片间接影响芽动力学gydF4y2Ba

叶片形态指标中，叶面积(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba0)，湿干质量比(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baq)和气孔密度(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaP)在移植后11天在不同温度下观察。与高温植株相比，常温植株叶面积略高。高温植株的干湿质量比较高，说明叶片中光同化物质的积累较多。顶芽叶气孔密度最高，为50.33 mmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)，而在24℃下，每mm气孔数仅为10.33个gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}表面积。gydF4y2Ba

与35°C相比，在25°C的植物中观察到更多的光合作用。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).蒸腾作用也是如此(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD)正常温度导致更多的气体交换。在水的电导情况下(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)与细胞间CO相比，在不同温度下观察到相当大的差异gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).叶绿素含量发生了显著变化(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaE-g)，说明光合色素与常温正相关。由于温度变化，类胡萝卜素在芽叶上部的波动也更大(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah)。gydF4y2Ba

叶片对温度的生理反应gydF4y2Ba

显著差异(gydF4y2BapgydF4y2Ba顶芽叶(TBL)粗蛋白质浓度< 0.01)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai). 25°C叶片的顶芽叶片MDA含量显著升高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaJ)而其他芽位的差异可以忽略不计。在SOD浓度情况下(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Bak)，常温下顶叶浓度较高，高温下芽叶(LBL)浓度较高。然而，与LBL相比，TBL的差异更为显著。POD(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Bam)， TBL在常温下显示的最大浓度大于高温。而TBL和LBL之间差异不显著，只是两个叶位的POD浓度都略高。过氧化氢酶活性在LBL条件下显著，CAT浓度在25°C时最大，而在35°C时最大。然而，在其他叶片位置，不同温度下叶片之间没有明显差异(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bal)。gydF4y2Ba

叶片和芽的超结构属性受温度变化的影响gydF4y2Ba

石蜡切片芽显示，高温对各个芽位的芽生长都有一定的抑制作用(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b)。与常温相比，顶芽在高温下的生长受到了一些限制(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;A1, B1)。然而，在顶部腋芽上发现了明显的差异，在对比温度下，在生长的第11天，高温完全抑制了芽的生长(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB2)。下腋芽在常温下生长较多(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba， A3)，与高温相比(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB3)。gydF4y2Ba

考虑到叶片的显微检查(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac、d)，常温叶片叶肉细胞的排列和形状更为明显(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;C1-C3)，与高温相比(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;D1-D3)，皮层出现轻度破坏。但对顶部腋生叶的影响更为明显(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;C1, D1)，因此高温会导致更多的生长中断(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba， D1)，比常温下(图3)高。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC1)。在观察气孔密度的同时，还可以通过指甲油观察外表面(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae, f)。细胞表面呈现出与正常相比的某种变化(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;E1-E3)和高(图3)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;TBL (E1, F1)、MBL (E2-F2)和LBL (E3-F3)的温度为F1- f3。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(g-h)为了解温度变化对细胞内叶绿体分布的影响，显示了顶部腋生叶片的透射电子显微图。gydF4y2Ba

温度导致芽生长和糖沿芽位分布的差异gydF4y2Ba

显著差异(gydF4y2BapgydF4y2Ba与高温相比，常温下腋芽处蔗糖积累量< 0.01)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.两种温度下，除高温下蔗糖含量略高外，上芽和上腋芽的蔗糖含量差异不显著。在两种温度下，温度对芽长都有显著的影响，高温抑制了芽的生长(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.与高温植物相比，常温植物的节间距离更大。gydF4y2Ba

芽不同位置的转录组分析gydF4y2Ba

对不同位置芽的转录组分析可以为了解芽形成和生长的分子调控机制提供重要的系统水平的见解。利用TopHat对所有花蕾样本共生成130亿个高质量reads(平均每个样本约6500万个reads)，并将其映射到菊花基因组(v2.0)中。通过cuffdiff处理映射读取，为每个转录本生成规范化的FPKM表达。不同组织中表达基因的数量在60% ~ 70%之间。约10 - 15%的基因高表达(FPKM≥10)(补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.总的来说，这些分析显示了菊花芽生长过程中转录组的足够覆盖。gydF4y2Ba

转录组学比较揭示了芽期之间的动态关系gydF4y2Ba

为了了解两种不同温度下芽生长的转录组学差异，我们对3个组织样本中至少一个组织中表达的所有基因的平均FPKM值进行了主成分分析(PCA)和基于spearman相关系数分析的分层聚类(Supplementary Fig. 1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

表现出高相关性的组织应该在转录组和活性上具有相似性。这些分析指出，在两种温度下，相似的芽发育阶段具有较高的相关性。可以看出，35°C下的芽转录组与25°C下的芽转录组聚类不同(补充图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.35°C TB和LAB比任何其他组织聚集得更紧密，这两个组织与25°C TB紧密放置，表明两种温度状态之间存在某种协调点(补充图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

芽生长过程中的优先基因表达gydF4y2Ba

采用阶段特异性(Stage specificity, SS)算法，SS评分≥0.05，指出在两种温度下特定芽位共同表达和特异性表达的基因。由于数据量大，只选取FPKM≥5的基因。在两种温度下，TB、TAB和LAB共有15,144、15,127和14,791个基因(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).然而，在25°C和35°C条件下，339个基因在TB中特异性表达;在25°C和35°C条件下，391和559对TAB有特异性;1043和336分别定义为25°C和35°C下的LAB特异性(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

热图显示了菊花腋芽中基因的阶段性表达，如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac.对所有特异性表达基因在两种不同温度下的基因本体(GO)富集分析显示，这些基因主要与代谢过程、应激反应、生长调节、运输、器官发生、细胞周期、细胞分裂和激素调节有关(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad).这些过程已被确定为芽生长和发育的完整调节器。gydF4y2Ba

25°C和35°C时不同芽位的差异表达基因集gydF4y2Ba

TB、TAB和LAB分别上调3366、3280和3291个基因;而TB、TAB和LAB中分别有4653、3714和6061个基因下调。大量转录因子也被检测到差异表达，在TB、TAB和LAB中分别有2244、2191和2140个转录因子上调;2857、2427和3949分别下调TB、TAB和LAB中的TFs(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).上腋窝位置提供不同温度下出现的初芽;因此，关注标签可以更好地了解高温的影响。对这一阶段的tf进行了专门分析(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).许多TF家族在TAB中表现出差异表达，表明在芽生长过程中具有不同的功能(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).主要TF家族包括:ARF、B3、ERF、GRAS、MIKC_MADS、MYB、NAC、WRK和TCP。这些家族的存在表明参与了多种活动，包括细胞分化(ARF)、激素信号通路(ARF)、细胞分裂素信号通路(ARR-B)。与25°C相比，这些家族在35°C时表现出上调。WRK是胁迫应答的重要转录因子家族，在TAB中，WRK对高温的响应显著上调。gydF4y2Ba

对不同芽位的deg的氧化石墨烯富集分析指出了许多在TB、TAB和LAB中被独特地过度代表的生物过程。与细胞分裂、细胞周期和细胞生长相关的不同术语在TAB上表达升高的基因中显著富集。同样，与细胞成分相关的GO术语也在Tab处显示高表达。在芽生长的所有阶段，包括器官发生、DNA复制、磷酸化、激素反应、蔗糖代谢、运输、芽发育调节、光合作用等，都明显存在广泛的氧化石墨烯术语。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

为了确定TAB期芽生长的代谢途径，使用MapMan工具将deg的表达谱叠加到已知的代谢途径上(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad). TAB在不同温度下某些代谢途径的活性存在差异。在这两种温度下，在负责淀粉生物合成的基因活性，特别是蔗糖代谢方面，可以看到相当大的差异。此外，激素通路在TAB的温度反应中也很明显，包括生长素、细胞分裂素和脱落酸的信号传导。控制淀粉代谢和光合作用的基因在高温下也在TAB中活跃(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad).常温下腋芽顶细胞壁相关基因的表达水平较高，这表明适宜环境下的细胞活性高于高温环境，温度波动超出正常范围会阻碍一系列细胞活性。gydF4y2Ba

激素网络也参与了芽动力学的温度感应gydF4y2Ba

许多参与生长素生物合成和信号传导的基因在25°C和35°C下的表达显著不同(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).一些已知的生长素控制的候选基因也通过测序数据被挖掘出来，包括PIN、IAA、YUCCA、SKP2A和CUL1。与35℃相比，大部分基因在25℃表现出高表达。在细胞分裂素的情况下也可以看到类似的结果，其中大多数基因在常温下比在高温下表现出高表达值(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

转录组分析还描述了这些激素在两种不同温度下腋芽中所起的作用(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa)。然而，独角麦内酯和ABA相关基因的作用与生长素和细胞分裂素相关基因的作用不同(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).与常温相比，ABA相关基因在高温样品中表现出相当高的表达(测量FPKM值)。与常温相比，高温下IAA和CK的TAB值波动明显(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba;IAA, CK)。而在最容易受到高温影响的上腋芽中，表达强度和差异显著。ABA相关基因在顶芽处表达强度显著增高，说明高温接收在顶芽处负表达，限制了芽的生长。然而，在其他芽位置，包括顶芽和下腋芽，差异是相当大的。高温下TB和TAB处ABA浓度高，说明芽通过ABA进行热调节(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaABA)。gydF4y2Ba

发现了一些与独角麦内酯相关的基因(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae).两个温度之间的差异不是很显著。然而，与25°C相比，两个候选基因(D27和MAX2)在35°C下的基因表达相对较高。gydF4y2Ba

叶芽形态性状共表达基因模块的鉴定gydF4y2Ba

为了了解芽生长过程中的基因调控网络，我们进行了与叶片特征(叶面积和光合速率)和芽特征(芽长和蔗糖浓度)相关的加权基因共表达网络分析(WGCNA)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.由于数据量大，本分析考虑FPKM≥1的基因。在不同温度下，共观察了24个模块的芽生长情况(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.在这些模块中，MEdarkorchid3是最突出的，它代表了与叶面积、芽蔗糖和长度操纵有关的高度上调基因。一些模块对芽长表现出强烈的响应，包括MEdarkorchid3、MEantiquewhite1、MEgreen2、merroyalblue 1、MEtan3和MEdarkgoldenrod(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.光合速率和叶面积分别仅在merroyalblue 1和MEdarkorchid3中表现突出。在蔗糖的情况下，高表达模块包括MEdarkorchid3、MEantiquewhite1、MErosybrown3和MEgreen2，这表明糖的内稳态参与了芽动力学。gydF4y2Ba

使用Cytoscape对MEantiquewhite1的枢纽基因(trpC和GRR1)进行鉴定(补充图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)和MEGreen2 (UBC12和CYP17)(补充图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.这些中心基因在不同温度下的芽位表现出差异。然而，在下腋芽处可以看到显著的差异(补充图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.trpC参与细胞壁合成，GRR1参与生长素生物合成途径。UBC12作为生长素生物合成途径中的一种酶，CYP17在类固醇激素的生物合成中起作用。gydF4y2Ba

菊花腋芽生长的分子调控尚不明确，切花菊的成功与否完全依赖于没有腋芽的单茎的活力。然而，到目前为止，由于缺乏一个深入的监管网络，禁止分支机构的努力尚未取得成功。我们使用叶片形态生理指标和腋芽RNA-seq方法来确定不同温度下三个芽位的转录组动力学。相当大比例的菊花基因至少在一个芽位上表达。高通量RNA-Seq有助于挖掘具有差异表达谱的新基因。主成分分析表明，三个芽位周围的表达信息在两种温度下具有显著的重复性，并且每个芽位之间存在显著的差异，表明基因表达在芽期之间存在显著的变化。对转录组数据和共表达网络的综合分析指出了一些与不同芽出生长阶段相关的特异性和共调控的转录计划。此外，蔗糖、激素含量和叶片形态生理指标也强化了温度对腋芽部位的深层影响。gydF4y2Ba

在温带地区，芽爆主要是由温度引起的[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。分蘖程度会影响叶面积、密度和截光量[j]。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。在我们的研究中，高温使叶面积缩小(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.芽的发育始于分生组织的形成[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，然后在某一过渡阶段，生长命运受到内在和外在因素的驱动[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。由于分生组织畸形或腋芽生长受到抑制，植物可能无法发育腋芽生长[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

环境波动可能触发某些mirna的差异表达，以与应激条件竞争[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。一些mirna已经在植物中被发现与胁迫有关，包括干旱[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]、营养缺乏[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，热[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]和冷的[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。大多数植物可以通过脯氨酸含量、丙二醛、过氧化氢和蔗糖含量的波动来调节其生化和生理过程，以应对温度变化[j]。gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。与25°C相比，35°C时叶片中活性氧和抗氧化剂的含量出现了有趣的波动。但在常温下，大多数下芽叶的含量高于上芽叶。叶绿体是应激反应和环境变化的有效传感器[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。在35℃下，叶片中叶绿体有轻微的运动(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag h)。gydF4y2Ba

温度升高超过一定限度会对植物生长产生不利影响，可能涉及多个基因单元[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。例如，温度胁迫会扰乱植物的营养平衡、激素和代谢稳态[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]，从而影响芽生长背后的调控机制。温度变化会改变植物体内的激素水平[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。arf是通过与ARPs(生长素响应启动子)结合来控制生长素诱导的基因表达的转录因子[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

研究表明，芽的生长状态受多种因素控制，主要包括生长促进剂，如糖、细胞分裂素和抑制剂，如生长素、ABA和独角麦内酯[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。顶部芽和顶部腋芽中ABA含量较高，表明ABA对腋芽的高温控制(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.然而，与常温相比，35°C TAB和LAB条件下较高的IAA浓度会导致生长素从顶芽向下芽位置移动更多(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.经过几十年的研究，一组在高粱芽中表达的基因(即gydF4y2BaGT1 / BRC1 TB1 / MAX2gydF4y2Ba)可以抑制芽的生长，直到环境因素、细胞分裂素和糖信号允许腋芽生长为止[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。单甾内酯是腋芽与DAD2/MAX2:D14复合物结合并贯通的关键调控因子gydF4y2BaGT1 / BRCI / TB1gydF4y2Ba通路(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2BaMAX2gydF4y2Ba通过编码F-box蛋白抑制芽生长[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2BaRwMAXgydF4y2Ba源自rose，受到蔗糖供应的抑制[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在茎中，细胞分裂素的水平通过生长素诱导的细胞分裂素生物合成基因的下调而降低，而脱落酸(ABA)则表达了一种不依赖生长素的对芽生长的抑制[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。在我们的研究中，高表达gydF4y2BaMAX2gydF4y2BaTAB在35℃下显示高温对腋窝部位的抑制作用(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

不同位置芽长增加的差异表明两种温度在细胞分裂中的作用不同。基因本体富集分析表明，在常温下，特别是TAB温度下，细胞周期和细胞分裂率较高(FPKM较高)。在常温下可以看到延长的有丝分裂。高有丝分裂活性导致更高的糖异生，导致种子大小增加[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。我们注意到，在细胞生长、细胞周期、热应激和氧化石墨烯富集方面，基因具有相当大的转录活性，在两种温度下表现出显著差异(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.此外，与细胞扩增、储存化合物和脂肪酸生物合成相关的几个基因在常温下显示出更高的转录活性(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).研究了多个TF家族参与器官发育[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba];然而，其中一些被认为与温度诱导的芽生长有关。我们的研究发现，在不同的温度下，大量的TFs参与了不同的芽生长，特别是在tab。在差异表达的TF中显示了一些已知的TF家族;然而，这些基因的确切功能仍不清楚。一些已知的TF家族，如NAC、ARF和WRKY，在两种温度下表达不同，它们在器官发育中的作用已经得到了很好的证实。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。同一家族成员在不同芽位和不同温度下的差异表达强度可能涉及不同的调控途径，从而决定了位置特异性芽发育。为了更好地理解这一点，我们使用共表达网络分析来挖掘与不同温度下芽生长相关的独特和常见基因群。gydF4y2Ba

确定转录模块可以揭示与芽和种子发育有关的生物过程的基因调控网络[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。因此，我们创建了转录模块(通过将转录因子与其各自的结合基序和共表达的靶基因连接起来)，用于研究温度影响的关键芽出芽阶段。虽然TAB在25°C和35°C时存在广泛的重叠，但有几个成分与特定的转录积累有关，这表明每种温度下转录模块的独特性。相反表达基因的模块主要与细胞周期、生长、细胞大小、组蛋白修饰和能量有关。这些模块的几个组成部分先前涉及芽和种子发育的不同方面[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。因此，我们的研究表明，转录模块的构建以及共表达网络可以帮助我们更好地理解控制芽生长农艺性状的内在机制。然而，需要进一步研究每个网络成员来阐明grn的整体图。gydF4y2Ba

腋芽受环境和激素信号的调节已被证实;然而，其内在机制在菊花中还不甚清楚。研究高温作为抑制生长的重要因素，可以更好地理解植物生长过程中如何控制粪便。在本研究中，RNA-Seq数据与两种温度下三个芽位的形态生理整合子相结合，为了解菊花切花芽受高温影响的生长状况提供了可靠的来源。结果表明，菊花不同芽位对温度变化的敏感性相对较高，尤其是上腋芽对高温的响应明显。结果表明，光合叶面积、生理指标、激素波动和蔗糖利用发生了显著变化，表明它们参与了高温抑制腋芽生长的过程。转录组学比较揭示了芽位置特异性表达基因集的数量。利用WGCNA，我们发现了与叶和芽形态性状高度相关的重要模块。本研究结果为阐明温度对菊花腋芽生长的调控机制提供了有益信息。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

插枝gydF4y2Ba菊花gydF4y2Ba品种“金巴”来自北京林业大学菊花种质资源保护苗圃。以母本为材料，在北京林业大学温室50h的滴落盘上培养，得到长度均匀、至少含两个芽的插穗。20天后，幼苗在花盆中生长。将2个月龄15腋芽期的幼苗移栽到均匀光(Philips T8 TLD36/33冷白管，120 μmol m)的控温室中gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}光密度)。其中一个室的昼夜温度分别设置为35/25°C，并被视为高温状态。另一个腔室设置为25/15°C，作为正常温度状态。两个腔室的光照强度相等，昼夜持续时间为16/8小时。在高温室和常温室中各保存了45株植物。gydF4y2Ba

抽样程序gydF4y2Ba

在不同温度条件下生长11 d后，分别对顶芽(TB)、上腋芽(TAB)和下腋芽(LAB)进行取样。采样部分为包含腋芽的矩形茎部分(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.顶芽周围的叶片分别称为顶芽叶(TBL)，顶芽和下腋芽周围的叶片分别称为中芽叶(MBL)和下芽叶(LBL)。同时采集叶片和芽的生理指标。单次重复取样15株，其中TBs 15株，tab 45株，lab 45株。因此，在每个温度条件下，从45株植物中收集了3个重复序列。采样在三个生物重复中完成。样品在液氮中收集，保存在- 80°C，直到RNA提取或生理分析。gydF4y2Ba

形态学参数gydF4y2Ba

花蕾长度gydF4y2Ba

芽长(mm)每周用数字游标卡尺测量。gydF4y2Ba

叶面积(cm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

在对比温度下生长11 d后，扫描上叶、上腋叶和下腋叶，并按适当比例进行扫描。利用扫描图片通过ImageJ软件测量叶面积[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

干湿质量比gydF4y2Ba

选取11 d龄植株的顶芽叶(TL)、中芽叶(MBL)和下芽叶(LBL)进行初步称重，记录湿重。叶子用纸包好，放在65°C的培养箱里过夜。将干裂的叶子再次称重，取干重。通过将每片叶子的湿重除以干重来计算干湿比。gydF4y2Ba

气体交换和光合色素gydF4y2Ba

净光合速率(Pn)，水电导(Cw)，细胞间COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用便携式测量系统(Ecotek，中国)测量浓度(Ci)和蒸腾速率(E)。环境参数为:叶温25℃，相对空气湿度80%，1200 μmol mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}光合光子通量密度(PPFD)和400±5 μmol molgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}环境CO浓度gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度。gydF4y2Ba

叶绿素色素的测定采用张[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba做了一些修改。简单地说，1 g叶片样品在80% (v/v)的丙酮溶液中均质，然后在4°C下，10000 g离心10分钟。收集上清液，测量663、645和470 nm处的吸光度，测量叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)、类胡萝卜素(Caro)和总叶绿素(Chl)，根据Lichtenthaler [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

生理指标gydF4y2Ba

蛋白质、丙二醛含量和抗氧化酶活性按照Chen和Zhang的方案进行测定[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

气孔密度gydF4y2Ba

气孔密度是按照Hopper等人描述的方法测量的。[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。使用ImajeJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)，使用细胞计数器插件确定气孔密度[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

腋芽在不同温度下的显微记录gydF4y2Ba

石蜡切片gydF4y2Ba

切除含有单个腋芽的茎插条，在微观水平上观察芽的活动。每隔24 h将芽固定在含70%乙醇、37%甲醛乙酸的FAA(福尔马林-乙酸-酒精)中，比例为18:1:1。然后用丁醇系列脱水芽，包埋石蜡。将包埋样品用旋转微音切成10 μm厚的条状，置于载玻片上。载玻片在40°C下保存过夜，用Safranin-O和快速绿色染色系列(Kebrom和Mullet, 2015年)染色，并用几滴Permount培养基(Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)装片。用玻璃罩覆盖载玻片，用明场显微镜观察。gydF4y2Ba

透射电子显微镜gydF4y2Ba

透射电镜对叶肉细胞进行解剖分析[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。2毫米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba叶片切片平行于中脉切开，浸泡在2.5% (v/v)的戊二醛溶液中。然后用新鲜的固定液替换溶液。适当洗涤后，将样品固定在1% OsO中gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(w/v)和KgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba铁(CN)gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba0.1 M碳水化合物钠缓冲液。连续使用乙醇系列干燥样品(包括在50%乙醇步骤中用2%醋酸铀酰染色)，然后包埋在斯珀尔树脂中。使用超微切片机(Leica EM UC6)切割极薄的切片。这些切片进一步用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。最后用高清晰度透射电子显微镜(Tecnai 12, Philips，荷兰)观察切片。gydF4y2Ba

蔗糖浓度的测定gydF4y2Ba

蔗糖的浓度是根据Yuan等人的方法估算的。[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba稍加修改。简而言之，芽在液氮中细磨，在80%的乙醇中提取三次(80°C)。将汇集的上清液用炭黑过滤，滤液中加入蒸馏水，最终体积为25 ml。反应液中加入100 μl的2n NaOH和900 μl的提取物。溶液在99°C水浴中煮沸10分钟，然后冷却5分钟。在此反应混合物中加入1 ml 0.1%间苯二酚和3 ml 10盐酸，在80℃下加热1 h。采用紫外-1700 PharmaSpec分光光度计(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)在480 nm处观察吸光度。以20 μg/ml蔗糖溶液为标准溶液，在适当的相关系数(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.998)。gydF4y2Ba

激素分析gydF4y2Ba

根据Pan等人的描述，用HPLC-MS/MS (Aglient)分析与芽生长相关的主要激素。[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

RNA-seq文库制备及测序gydF4y2Ba

使用MiniBESTplant RNA提取试剂盒(TaKaRa)从冷冻芽中提取总RNA，并去除DNA，最终获得无DNA的RNA。所有18个文库(6个样本，3个生物重复)在Illumina平台(HiSeq 2000)上测序，得到长度为150个核苷酸的成对末端序列。对原始数据进行分析以了解各种参数，并使用NGS QC Toolkit (v2.3)对高质量读数进行排序。质量读数被映射到gydF4y2Ba菊花nankingensegydF4y2Ba基因组(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba使用默认参数的TopHat (v2.0.0)。通过Cufflinks (v2.0.2)对每个样本中所有基因的映射数据进行处理，获得FPKM(每千碱基转录本长度每百万映射读取片段)值。采用Spearman相关系数(SCC)确定生物重复序列之间的相关性。主成分分析(PCA)和分层聚类使用R软件包的prcomp和corrplot实用程序[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。用Cuffdiff确定的样品和用校正后表达至少有两倍差异的基因之间的差异表达gydF4y2BaPgydF4y2Ba值(gydF4y2Ba问gydF4y2Ba-value)在调整错误发现率后< 0.05。分期特异性(SS)评分算法用于鉴定优先表达/分期特异性基因。SS评分算法通过比较该基因在某一特定阶段的表达量与其在其他阶段的最大表达值来识别阶段特异性基因，这在以往的研究中得到了解释[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]。基因在某一特定时期的SS分数越高，该基因在该时期的表达越显著。选取一组基因，利用R的pheatmap和ggplot2工具生成热图。gydF4y2Ba

基因本体与途径富集分析gydF4y2Ba

使用Cytoscape的BINGO插件对deg进行氧化石墨烯富集分析[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]。对于每一个GO项gydF4y2BaPgydF4y2Ba-value由Benjamini Hoschberg [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。GO与gydF4y2Ba问gydF4y2Ba-值≤0.05视为显著富集。利用MapMan (v3.6.0RC1)对拟南芥(TAIR10)同源性最佳的不同基因集进行路径富集分析。gydF4y2Ba

加权基因共表达网络分析gydF4y2Ba

共表达模块的构建使用WGCAN包[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]。使用日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(1 + FPKM)值，生成包含所有基因对之间成对SCCs的矩阵，然后使用以下公式转换为邻接矩阵:邻接值= |(1 +相关性)/2|gydF4y2Ba^βgydF4y2Ba。β为相关矩阵的软阈值，在保留基因间连通性的同时，赋予最强相关性更高的权重。β量级为12是基于先前描述的拓扑无标度准则[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。通过TOM相似度算法将得到的邻接矩阵转化为to(拓扑重叠)矩阵，然后根据to相似度对基因进行分层聚类。通过动态切树算法对分层聚类树形图进行裁剪，通过将分支组合为稳定数量的聚类来定义模块[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]。利用主成分分析法对每个模块计算一个称为模块特征基因(ME)的概要概要。与随机选择的基因模块相比，这些模块保留了更高的TO值。对每个模块进行氧化石墨烯富集分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用SPSS软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA;版本。16.0)。显著的变化显示在gydF4y2Bap < 0.05gydF4y2Ba或gydF4y2BapgydF4y2Ba0.01gydF4y2Ba的水平。gydF4y2Ba

数据集包含在本文及其附加文件中。本文报道的原始序列数据已存入NCBI, bioproject ID为PRJNA608820。原始序列数据也可在中国科学院北京基因组研究所大数据中心基因组序列档案中获得，登录号为CRA002314。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

卡罗:gydF4y2Ba

类胡萝卜素gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

排名:gydF4y2Ba

总叶绿素gydF4y2Ba

的背影,gydF4y2Ba

叶绿素agydF4y2Ba

的背影b:gydF4y2Ba

叶绿素bgydF4y2Ba

置信区间:gydF4y2Ba

细胞间有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度gydF4y2Ba

CK:gydF4y2Ba

细胞分裂素gydF4y2Ba

连续波:gydF4y2Ba

水的电导gydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

联邦航空总局:gydF4y2Ba

Formalin-acetic acid-alcoholgydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每百万次映射读取的转录物每千碱基片段数gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

主成分分析:gydF4y2Ba

主成分分析gydF4y2Ba

销:gydF4y2Ba

Pin-formedgydF4y2Ba

Pn:gydF4y2Ba

光合作用净速率gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

PPFD:gydF4y2Ba

光合光子通量密度gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

结核病:gydF4y2Ba

顶级味蕾gydF4y2Ba

标签:gydF4y2Ba

顶部腋芽gydF4y2Ba

实验室:gydF4y2Ba

下腋芽gydF4y2Ba

TFs:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

资源描述:gydF4y2Ba

顶芽叶gydF4y2Ba

MBL:gydF4y2Ba

中芽叶gydF4y2Ba

LBL:gydF4y2Ba

下芽叶gydF4y2Ba

WGCNA:gydF4y2Ba

加权基因共表达网络分析gydF4y2Ba

我们感谢Nadia Sucha(伦敦金斯顿大学)为我们的手稿推荐专业的英语母语人士。我们也感谢谢建波(北京林业大学)为我们的稿件分析RNA-seq数据提供的帮助。gydF4y2Ba

国家自然科学基金基本科研业务费专项基金(No. 31700621)和北京市公共建设专项基金资助。资助机构不参与研究的设计和数据收集、分析、数据解释以及撰写手稿。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 北京林业大学园林学院，观赏植物种质创新与分子育种北京市重点实验室，花卉栽培国家工程技术研究中心，城乡生态环境北京市重点实验室，林木与观赏植物遗传育种教育部重点实验室，北京，100083gydF4y2Ba

   Ahmad Sagheer，袁存全，杨青青，杨玉杰，程堂仁，王佳，潘惠堂，张其祥gydF4y2Ba

2. 北京林业大学北京分子设计林木育种先进创新中心，北京，100083gydF4y2Ba

   Qixiang张gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

SA, CY和QZ设计实验;SA、CY、YY、QY进行实验。SA写了手稿;CY修改了稿件。SA, CY, TC, JW和HP分析了数据。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaQixiang张gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

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