大肠杆菌中NHX的鉴定Gossypium物种和积极作用GhNHX1盐耐受性

背景

植物Na⁺/H⁺反转运体(NHXs)是维持细胞内Na的膜定位蛋白⁺/ K.⁺和体内平衡pH值。大量证据强调了NHX家族在植物发育和盐反应中的关键作用;然而，对棉花中NHXs的研究却很少。

结果

对NHXs进行全面系统的比较研究Gossypium进行了物种鉴定。我们鉴定了12、12和23种推测的NHX蛋白g . arboreum,g . raimondii就,异源四倍体,分别。系统发育研究表明，该植物的重复多倍体化Gossypiumspp对NHX家族的扩张做出了贡献。基因结构分析表明NHXS.含有大量内含子，可导致选择性剪接，帮助植物适应土壤中的高盐浓度。的表达变化NHX.S表示在不同角色上可能存在的差异NHX.S在盐反应中。GhNHX1在棉花中，它位于液泡系统中，受到盐胁迫的强烈诱导。沉默的GhNHX1结果表明，棉花幼苗对高盐浓度的敏感性增强GhNHX1积极调节棉腐蚀胁迫。

结论

我们对其基因结构、系统发育关系、染色体定位和表达模式进行了研究NHX.基因来自g . arboreum,g . raimondii就,异源四倍体．我们的调查结果表明，棉花NHX.通过可能的替代剪接，在转录水平处精确地和不同地调节基因。植物对盐胁迫的耐受可能依赖于特定的表达水平NHX.，而不是数量NHXS.基因组中。本研究对植物的功能研究具有重要意义NHX.S，以及提出用于育种耐盐棉品种的有希望的候选基因。

气候变化和人类活动引起的土壤盐渍化是全球最严重的环境挑战之一。农田土壤中盐的高浓度主要来自含有毒性离子的海水和灌溉水（Na⁺和Cl^-）.过量的盐会降低植物的水分吸收能力，阻碍营养物质的吸收，导致过量的ROS产生，扰乱细胞过程，最终抑制植物生长[1.]土壤盐渍化对农作物的产量和质量构成威胁，每年全球可耕地面积都会减少。另一方面，随着世界人口的快速增长，现代农业面临着以更少可用耕地生产更多产品的挑战。培育耐盐品种一直是世界范围内作物改良的主要目标[2.]．

植物已经进化了精细的机制，以适应盐胁迫，包括来自细胞的离子流出并在液泡中螯合[3.]．运输离子的能力似乎是确定高盐环境中工厂适应的关键因素，以及K⁺/ na.⁺转运体在这一过程中起着基础性作用[4.].北美⁺/H⁺反转运体(NHXs)是交换Na的膜转运体⁺/ K.⁺对于H⁺．NHX蛋白广泛存在于真核生物中，包括酵母、植物和动物。在拟南芥，到目前为止，已确定八名NHX成员[5.]根据其序列和定位，ATNHX可分为三个不同的功能组：位于液泡中的I型（AtNHX1/2/3/4）、位于内体中的II型（AtNHX5/6）和位于质膜中的III型（AtNHX7/8）[5.]．越来越多的证据表明，NHXs在植物生长发育中发挥着重要的作用，尤其是在盐碱地。

AtNHX7，也被称为AtSOS1(盐敏感1)，是植物在盐碱地生存所必需的。它保持低水平的有毒钠⁺在原生质体。的sos1突变体对健康的敏感性是野生型的20倍[6.]．直接同源的AtSOS1在其他植物物种中，物种显示出类似的功能，包括OsSOS1在大米和SlSOS1在番茄7.,8.]SOS1与SOS2和SOS3一起，在植物对盐胁迫的反应中起着重要作用，这在植物中是保守的[9].当植物受到盐胁迫时，高浓度的钠⁺被诱导内源性钙离子瞬时增加的细胞感知²⁺．SOS3是一种CBL (calcineurin B-Like)蛋白，在高钙存在时激活SOS2 (CBL相互作用蛋白激酶)并形成SOS3-SOS2复合物²⁺[10.]．活性的SOS3-SOS2复合物进一步激活下游的SOS1, SOS1编码Na⁺/H⁺对血浆膜定位的抗纤维素，负责Na的挤出⁺[6.,10.]．

科学家操纵了特定NHX同种型的表达，以创造新的种质资源，盐渍土壤中的作物产量升高。ATNHX1是真菌局部的NHX蛋白，对渗透调节和植物发育很重要。ATNHX1的过度表达增加了植物物种的耐盐性[11.,12.,13.]。例如，两个NHX(HtNHX1和HtNHX2）从耐盐植物中分离出来Helianthus tuberosus。这些基因在水稻中的异源表达提高了耐盐性。HtNHX2在盐胁迫和营养缺乏环境下改善粮食产量以及水稻的收获指数[13.]．II型NHXs是核内体定位，通过维持细胞内pH值和离子平衡提供耐盐性[14.]．II型NHX蛋白的双突变体，nhx5/nhx6，显着提高盐敏感性拟南芥[15.]．

棉布(Gossypium spp。）是全球培养的作物，具有巨大的经济价值，提供纤维和油。与许多其他作物（米饭，小麦和玉米）相比，棉花对盐具有更高的自然抗性;然而，通过增加土壤盐渍化棉花的生产率严重威胁[16.,17.]基因工程是培育耐盐作物的有效途径，对耐盐分子机制的研究为不同物种的基因工程提供了候选基因[18.,19.]．而棉花耐盐性的研究还处于基因克隆、表型分析和功能预测的阶段[17.,20.,21.,22.]．因此，需要通过研究潜在基因进一步了解棉中的耐盐机制。

植物NHX家族在耐盐性中起着重要作用;然而，涉及NHXs的研究仍然是棉花仍然罕见。生物技术的快速发展加速了棉花中的分子育种过程，使我们能够在基因组 - 范围内研究棉NHX [23.,24.,25.,26.,27.].最近，GhSOS1，同源于AtSOS1，分离自耐盐基因型异源四倍体. 沉默GhSOS1显著降低棉花的耐盐性，而转基因拟南芥有不同的表达GhSOS1表现出对盐的耐受性增强以及与压力相关基因的表达增加[28.,29.]在这项研究中，我们从三个不同的棉花品种中鉴定了47个假定的NHX，包括两个二倍体棉花品种（A基因组物种）g . arboreum和D-genome物种g . raimondii就）和一种四倍体棉花品种（ad-基因组种类异源四倍体）.我们进一步通过生物信息学分析、表达谱分析和病毒诱导基因沉默(VIGS)研究棉花NHXs的功能。我们证明了GhNHX1，编码液泡定位的NHX蛋白，在棉花耐盐性中发挥积极作用。因此，GhNHX1可作为棉花盐胁迫反应的分子机制研究和棉花耐盐品种选育的候选基因。

耐盐性评价三Gossypiumspp。

三种苗Gossypiumspp。(g . arboreumL. Shixiya1，g . raimondii就,异源四倍体L.TM-1）受到盐胁迫。在这三种植物中都观察到了严重矮化、叶片萎蔫和黄化等形态学变化Gossypium用盐溶液灌溉后的spp（300 毫米（氯化钠）（图。1.a, b). Na⁺测定了受胁迫幼苗的地上部和根部的浓度。地上部和根部都积累了大量的钠⁺在盐胁迫下（图。1.C）。结果表明，在具有高盐浓度的土壤中生长时，三种棉花种类的幼苗都受到影响。

纯棉NHX的鉴定

NHX是进化和功能上保守的蛋白质。为了鉴定和比较棉花的NHX成员，我们对拟南芥，米，番茄，大豆和桑树[30.,31.,32.,33.,34.,35.]从NCBI下载，用于构建HMM，对棉花基因组数据库进行搜索[23.,36.,37.]所有假定的NHX均由InterPro和SMART进一步分析，以确认其特征序列和保守结构域⁺/H⁺交换域被认为是棉花NHX。我们确定了12 12 23个nhxg . arboreum,g . raimondii就,异源四倍体分别为(表1.）.已鉴定的NHX蛋白的详细信息列于表S1.，包括接入号、序列长度、预测等电点(π)和分子量（Mw）。三种化合物的NHXGossypiumspp编码的蛋白质与预测的大小从211到1193 AA不等π分子量范围为22.95 ~ 132.84 kD。

棉花NHXs系统发育树

目的:探讨氨态氮的演化关系g . arboreum,g . raimondii就,异源四倍体和其他植物物种，如水稻、桑树和拟南芥（表S）2.)，利用ClustalW和MEGA 6.0结合邻居连接(N-J)方法构建了一个无根系统发生树。与先前对其他植物的研究相似[30.,31.,32.,33.,34.， 47名NHX候选人Gossypium根据序列守恒分为三个不同的类(表1.,无花果。2.）.大多数NHXs (75%)Gossypiumsp .被分为I类(9 NHXsg . arboreum，9g . raimondii就，及异源四倍体).II类有2个GANHX、2个GRNHX和4个GHNHX。根据之前的研究，III类是最小的组，在我们的研究中，只有1个GaNHX、1个GrNHX和2个GHNHX被归类为该类。

所有NHXg . arboreum有直接同源g . raimondii就．例如，I类的Ga10585和Gr10021256具有高度同源性。他们在蛋白质序列上有99.26%的同源性，只观察到少数单核苷酸多态性(图S)1.)，并做出了类似的预测π和mw值（表s1.）.系统发育树和序列比对显示了常见的与染色体加倍相关的基因复制事件异源四倍体相比g . arboreum和g . raimondii就，也在先前的基因科学研究中发现异源四倍体[38.]．这些基因重复事件促成了NHX家族的扩展异源四倍体，其NHXs是二倍体棉花的两倍1.）.I类的唯一例外是I的GR10038122。在D次基因组中对应于GR10038122的NHX异源四倍体可能在进化过程中丢失异源四倍体队形。

进一步分析了棉花的基因组分布NHX.s。基因组序列NHX.使用BLAST进行查询，以评估其染色体位置。我们观察到NHXS.在异源四倍体是对称的，大部分成员在A亚基因组和D亚基因组之间平均分配，而NHX.二倍体棉的基因均匀地分布在基因组上（图S2.）.Circos循环表明了棉花和棉花之间的共线关系拟南芥(图3.)，这显示NHX.in.拟南芥与棉花的同线基因对同源。例如,AtNHX7位于At2染色体上拟南芥是高度同源的GhD02G1385和GhA03G0996在D02和A03的异源四倍体．

棉花结构分化NHX.基因

棉花的结构分析NHX.基因家族揭示了所有已识别的NHX.s含有几个内含子(图。3.).一般来说，第一类NHX.基因来自g . arboreum和g . raimondii就保守，含有13个内含子。相反，1 / 3的I类GhNHXs与同种异体相比进化出不同的结构g . arboreum或者g . raimondii就(如,Ga36304/GHA09G0594/Gr10009549/GhD09G0593）.Ga36304和Gr10009549具有保守的蛋白质序列和基因结构，包含14个外显子，其中最长的内含子为1 kb和0.85 分别为kb。另一方面GHA09G0594和GhD09G0593演化了几个非常长的内含子。最长的内含子GHA09G0594是3.8 kbGhD09G05935.2 kb。结果，这两种基因的序列GhNHX基因分别扩增至18 kB和16 kB，以及基因组序列Ga36304和Gr10009549他们都是7岁 kb。此外，这四个同源基因的预测蛋白质序列不同（图S）4.）.在III类中也观察到类似的进化事件。gh02g1385.在3'末端具有17.2 kB内含子，总基因组序列为31 kB。这些发现揭示了棉花基因结构的复杂性NHXS.这可能与NHX家族的生物学作用有关。

表达模式NHXS.在盐胁迫下的棉花

的表达模式NHX.基因异源四倍体利用先前发表的转录组数据对盐胁迫下的研究[23.]．的叶子中的RPKM(每千碱基读取每百万映射读取)值异源四倍体在NaCl处理下，在指定的时间点绘制了盐致热图GhNHX如图所示。4.，来自III类的2个基因，同源SOS1，在盐处理1小时内上调。来自II类的4个基因无显著差异。NHX.在盐胁迫下，7个基因被显著诱导，3个基因被显著抑制，6个基因被显著抑制NHX.这些发现表明NHX类在盐反应下的潜在作用存在差异。我们克隆了这对基因GHA11G2132/GhD11G2440从TM-1转录本进行进一步研究。

进行qPCR以再次确认GHA11G2132/GhD11G2440在不同的组织和对盐处理的反应。因为它们非常相似GHA11G2132/GhD11G2440基因对和对qPCR引物要求高，用基于qPCR的方法单独研究这两个基因的表达变化非常困难。基因特异性引物是用来扩增GHA11G2132和GhD11G2440在一起如图所示。5.,GHA11G2132/GhD11G2440基因对以根，茎和叶片表达，表达水平GHA11G2132/GhD11G2440叶和根的数量是茎的2倍。GHA11G2132/GhD11G2440300 mM NaCl显著诱导，与热图分析结果一致。

GHNHX1A / D蛋白质序列分析

研究了GhA11G2132/GhD11G2440的序列。2.)和序列比对(图。6.)揭示了gh11g2132 /GhD11G2440对与来自的NHX1和NHX2同源拟南芥亚基因组A中的Gh11G2132被表示为GhNHX1A，亚基因组D中的GhD11G2440被表示为GhNHX1D。预测方法强调了GhNHX1A和GhNHX1D的12个跨膜结构域，它们与GhNHX1D中444~448 AA处额外的5个氨基酸片段高度相似（96.17%）。推测的阿米洛利结合位点（LFFIYLLPPI）在跨膜结构域III中发现抑制真核生物NHX功能的基因。

植物NHX的生物学作用与其亚细胞定位密切相关。为了研究GHNHX1A / D在Upland棉中的可能作用，我们将GFP融为GHNHX1A / D的N末端。真空标记蛋白δ-tip [39.]与c端融合，RFP与GFP-NHX共转移到拟南芥原生质体。如图所示。7.其中，GFP在整个原生质体中都有表达，而红色荧光仅在GFP和δ-TIP-RFP载体转化的原生质体液泡膜上表达。GFP-GhNHX1A/D与δ-TIP- rfp在原生质体中共表达，红色和绿色荧光信号重叠，表明GhNHX1A/D大部分定位于δ-TIP蛋白所在的液泡系统。

GHNHX1A / D调节棉花的耐盐性

使用Vigs方法研究了GHNHX1A / D在棉花胁迫下的潜在作用。376 BP片段从3'结束GhNHX1A克隆并插入到VIGS载体中，使GhNHX1A/D沉默。3周后，利用qPCR检测棉花叶片的沉默效率。GhNHX1表达式GhNHX1- 与空载体转移控制（TRV：00）植物相比，植物减少至10％的植物（图。8.a） 。研究了TRV:00和TRV:NHX1的表型外观，在正常条件下未观察到显著差异。

棉花幼苗分别接受水和300 mM NaCl处理6 d。高盐浓度限制了棉花的生长和发育;盐处理导致植株变矮，叶片萎蔫和变黄症状。与TRV:00相比，TRV:NHX1对盐胁迫的耐受性降低，叶片萎蔫程度增加，根和叶片的生物量均减少(图1)。8.b, c)⁺测定TRV:00和TRV:NHX1植株在水或盐处理后根和茎中的含量(图。8.d） .六点以后 经过几天的盐处理后，Na⁺TRV:NHX1浓度较TRV:00升高。这些发现表明了积极的作用GhNHX1棉花对盐胁迫的反应。

据报道，全球超过20%的农田，包括50%的灌溉土地受到土壤盐碱化的威胁。大多数作物对高盐浓度很敏感，这表明迫切需要开发在盐碱地提高生产力的新品种[19.,40.].棉花is an economically important crop. Improving the yield and quality of cotton and enhancing the salt tolerance of cotton cultivars are priorities in cotton breeding [17.,41.]．NHX.基因在盐胁迫中起着重要作用。因此，研究棉花的功能NHXS.可以提供耐盐机制的理论基础，有助于鉴定培养耐盐棉的候选基因。

NHX家族在植物物种中相对较小且保守。在二倍体中，指数量NHX.基因是七个（表1.)，但大豆除外，它含有11NHX.基因。大豆是由古四倍体衍生而来的二倍体作物。这种带有重复、缺失、突变和DNA重排事件的典型进化过程导致75%的大豆基因具有两个或两个以上的拷贝[42.]．二倍体棉花在进化过程中也经历了复杂的多倍体。多倍体的重复多倍体化Gossypium导致了一个巨大而复杂的基因组[36.,37.,43.]．Wang等人揭示棉花祖先经历了更多的增殖事件(5次)，随后是广泛的全基因组重组和大规模的染色体丢失[44.]．从两个二倍体棉花品种中鉴定出12个NHXs。这表明NHX.一个植物物种的基因与其基因组的大小和复杂性相关。染色体多倍体化也有助于NHX家族的扩展。杂四倍体棉花是由A和D基因组杂交产生的，大约1~2 Myr ago [23.,24.,43.]．染色体加倍导致了两倍的数目NHX.基因异源四倍体相比G. Arboreumii.和g . raimondii就．的数量NHX.一种植物的基因与其耐盐性没有直接关系。有7NHXS.在大米和桑树;但在盐渍土壤中，它们表现出不同的耐受水平。水稻是对盐胁迫敏感的禾本科模范植物，而桑树是适应恶劣环境的多年生树种。四倍体棉是二倍体棉的两倍NHX.基因;然而，四倍体棉出现不存在耐盐性的绝对增加。

根据NHXs的序列相似性，将不同植物的NHXs分为三类。以往的研究强调了三种植物NHXs的不同功能作用和亚细胞定位[31.,34.]，这还表明物种中NHX矫正器的序列保存以及NHXS功能与其定位之间的密切相关性。I类NHX本地化为芳瓦膜，II类NHX本地化为内体，III类NHX本地化为血浆膜。75％的棉质NHX分为I级，而只有50％拟南芥成员属于第I类NHXs [34.]．这些结果表明，由于大量的二倍体棉花的NHX家族的扩展是由于大量的NHX.I类中的基因。表达NHXS.在异源四倍体在盐胁迫下观察到不同的表达模式(图。4.）.来自III类的2个基因，盐致直型SOS1。SOS1是盐渍土壤植物存活的关键[6.，这暗示了第三类的可能作用GhNHXS在盐反应中。4的表达式NHX.II级的S与盐处理不密切相关。根据先前的研究，内体局部局部的NHX参与囊泡pH稳态和子宫内膜贩运[5.,14.,45.]．的GhNHX类s在盐胁迫下表现出不同的表达模式。系统发育研究证实了这一结果，表明3类NHXs在转录水平上受到精细而不同的调控。

NHX.棉花基因中含有大量的长内含子。3.），也发现在其他植物物种中[30.,31.,32.,33.,34.]．内含子的数量与生物体适应不利环境条件的能力有关[46.,47.]内含子是选择性剪接的分子基础。一个基因中的内含子越多，通过选择性剪接产生的功能转录物就越多。选择性剪接被认为是进化适应中功能创新的有力来源。证据表明，至少有一半的人类基因存在选择性剪接[48.]．事实上，对植物NHX的研究证明了转录后调节中的替代剪接的高频率[30.]这项研究提供了关于NHXs多层次调节的信息。

NHXs与环境适应密切相关。目前对NHXs的研究在盐碱化作物育种中具有广阔的前景。在这项研究中，盐诱导基因对GhNHX1A和GhNHX1D安静下来研究它们的作用。这两个基因在盐处理后上调，它们的蛋白定位于液泡系统。沉默的GhNHX1A和GhNHX1D共同导致棉花幼苗对高盐浓度的耐受性降低，这表明GhNHX1对棉花耐盐性有积极作用。这些发现为棉花抗盐育种提供了候选基因。

为鉴定棉花耐盐基因和研究NHXs的进化，进行了生物信息学分析和分子表征。我们确定了47个NHXS.从三点开始GossypiumSPP ..棉花NHXS.含有许多内含子，基因结构的复杂性可能与棉花对盐胁迫的适应有关。的表达模式NHX.s表明不同NHX类在盐胁迫下的作用可能存在差异。此外，功能分析GhNHX1使用VIGS证明了这一点GhNHX1是棉花对盐胁迫反应的一个积极因素。这一发现有助于研究棉花对盐胁迫的响应，并为棉花耐盐品种的选育提供候选基因。

植物材料和盐处理

种子的拟南芥含有0.1％（w / v）琼脂糖溶液中的肠蛋白（Col-0），并播种填充有珍珠岩，蛭石和泥炭的生长培养基。将罐置于22/20°C，16小时光/ 8小时黑暗（日/夜）的生长室（Compiron CMP6010，加拿大），以进行萌发和生长。

三种不同棉花品种的种子，包括异源四倍体L. TM-1，g . arboreumL. Shixiya1，和g . raimondii就从中国棉花生物学国家重点实验室的种质银行收集。将种子浸泡在无菌水中4小时，并在25℃下在湿滤纸上发芽1-2天。将发芽的种子在生长室中种植在生长室中，在25/22℃和16小时/ 8小时黑暗（日/夜）。4周后，将种植良好的植物用水或盐处理。对于盐处理，将每个棉幼苗用50mL 300mM NaCl溶液浇水。用去离子水处理的棉花幼苗用作嘲笑。对于表型观察，在治疗12天后拍摄照片。拍摄后检测到盐离子浓度。

纯棉NHX的鉴定

从NCBI下载各种植物物种的NHX蛋白的序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）.将这些蛋白作为参考蛋白建立隐马尔可夫模型(HMM)。采用隐马尔科夫模型对蛋白质数据库进行查询异源四倍体,g . arboreum,g . raimondii就．的核苷酸和蛋白质序列异源四倍体,g . arboreum,g . raimondii就均来自CottonGen数据库(https://www.cottongen.org/）[49.]．每个候选序列的保守域用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/）和剧性（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）.分子量（MW）和等电点（π)，使用Compute pI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/).使用MEGA6中的邻居连接法，使用1000个引导重复，使用p距离模型和部分缺失，使用对齐的NHX蛋白质序列构建无根系统发育树。

基因结构分析

下载编码序列和相应的基因组DNA序列并提交给Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）基于Web的生物信息化工具，可视化有关内部外显子组织棉的基因特征NHX.基因。

基因分布NHX.基因

染色体位置和共线图如先前报道的那样生成[38.].棉花NHX.通过MapInspect程序(http://www.plantbreeding.wur.nl /英国/ software_mapinspect.html）绘制每个的染色体位置NHX.基因。显示基因组分布的同步分析NHX.s与棉花间的共线关系NHX.年代和拟南芥NHX.s是用Circos软件执行的[50]．

RNA隔离

从细胞中提取总RNA异源四倍体根据制造商的说明，使用EasySpin Plus植物RNA套件（AIDLAB，北京，中国）。使用M-MLV逆转录系统（Promega，USA）使用大约1μg的总RNA用于第一链cDNA合成。将cDNA样品稀释50次并储存在-20℃以进行进一步的实验。

热图和qPCR分析

我们获得了释放的转录组数据异源四倍体L.TM-1，并将原始数据转换为RPKM值，表示NHX.s。使用Genesis 1.8.1程序产生热图[51]．在ABI 7500Fast实时PCR系统（Applied Biosystems，USA）与Sybr Green Master Mix（中国vazyme Biotech，中国）进行了四次重复，如前所述的出版物[52]．利用2^——∆Ct方法，用棉花泛素7基因（UB7），扩增作为内部对照，以使每种反应中的cDNA扩增标准化。

基因克隆与载体构建

目标NHX.通过PCR扩增基因并将其连接到表达载体PK7FWG2与N-末端融合的GFP。标记蛋白δ-尖端融合到红色荧光蛋白（RFP）[39.].用于VIG的基因沉默载体如前所述构建并转移到农杆菌肿瘤术[53]．本研究使用Primer Premier 5软件设计引物，列于表S3.．

瞬态的转变拟南芥原生质体

年轻的叶子拟南芥如前所述，收集幼苗并用于原生质体分离[54,55]．瞬时转化时，15 μg质粒与100 μL的原生质体(10^5./mL)，室温孵育30分钟。使用共聚焦激光扫描显微镜(BioRad Radiance 2100, USA)观察绿色和红色荧光。

棉花剧烈

改变了农收集含有pTRV1、pTRV2和pTRV-NHX1的细胞并重悬于悬浮缓冲液中。将pTRV1与pTRV2、pTRV-NHX1等量混合，调整菌悬液浓度为0.6 ~ 0.8 (OD)₆₀₀)，室温培养3 h。的农通过注射器浸润将悬浮液渗透到1周龄棉幼苗的子叶中。将浸润的幼苗保持在黑暗中12小时并进入生长培养箱[56]．3周后，棉花幼苗进行基因沉默效率分析和盐处理。研究沉默效率NHX1.，收集TRV:00和TRV:NHX1的根和叶进行RNA提取和qPCR分析。为研究TRV:00和TRV:NHX1幼苗的耐盐性，分别对TRV:00和TRV:NHX1幼苗进行水分和300 mM NaCl处理6 d，定量测定植株生物量和Na含量⁺在拍摄水或NaCl处理的TRV:00和TRV:NHX1幼苗后进行含量测定。

测量钠⁺专注

棉花幼苗的根和叶被收获、干燥并磨成粉末。约为0.05 将g的组织粉溶解于5 mL浓硝酸，并用水将硝酸溶液稀释至5%。使用上清液使用原子吸收分光光度计检测离子浓度[57]．

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。

NHXs:

Na⁺/H⁺altiporters.

ROS:

活性氧

伟大的人：

病毒诱导基因沉默

π:

等电点

兆瓦:

分子量

“大酒店”:

陆地棉

遗传算法:

Gossypium Arboreum.

Gr:

Gossypium raimondii就

嗯:

隐马尔可夫模型

感谢棉花生物学国家重点实验室为我们提供的棉花种子g . arboreum,g . raimondii就和异源四倍体南京农业大学、华中农业大学和棉花生物学国家重点实验室发布了基因组和转录组数据。拟南芥(Col-0)，在整个工作中使用，可从拟南芥种群中心获得。

国家自然科学基金项目(no . 31701473, no . 31601344);国家作物育种重点研发计划项目(no . 2016YFD0101006);国家111计划项目(no . D16014)。关键词:土力学，边坡稳定性，边坡稳定性资助机构没有在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中发挥作用，而只是提供资金支持。

作者指出

1. 卢龙、赵景若对这一工作贡献相当。

从属关系

1. 河南大学生命科学学院棉花生物学国家重点实验室，河南开封

   卢龙、赵京若、郭丹丹、徐福春、杨文文、高维文

2. 河南大学作物逆境适应与改良国家重点实验室，河南开封

   卢龙、马晓楠、高伟

贡献

LL和JRZ进行数据分析并参与起草手稿；DDG和WWY构建向量并执行qPCR；XNM和FCX执行瞬态转换；WG指导实验。所有作者阅读并批准了最终手稿。

相应的作者

对应于魏高．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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