水稻内部铵态氮过量引起ros介导的反应，导致碳缺乏GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

过度使用氮肥往往是确保高产水稻对氮需求充足的主要做法，导致NH持续存在GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量的植物。然而，这种过量的氮养分并不对应于粮食产量的进一步增加。为了找出与这一现象相关的主要制约因素，NH的性能GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水稻植株中的过量需要在明确的根生长调整之外加以明确处理。目前的工作分离急性NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba并分析了这种内部NH的初始表现GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们表明，急性内部NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水稻植物过量伴随着一种反应性氧物质（ROS）的爆发，并引发下游反应。在碳生产，光子标题基因和初级有限公司的活动的头部GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba固定酶(Rubisco)明显受到抑制，表明光合碳收入减少。其次，随着谷胱甘肽(GSH)产量的增加，谷胱甘肽转移酶(GST)基因和酶活性的强烈诱导表明GSH循环被激活，ROS被切割。第三，由于芽中糖酵解/糖原分解相关基因的强烈诱导，碳水化合物代谢被重新定向，以提高清除ROS所需的能量和碳骨架的产生。由于这些防御反应的发展，碳稀缺性将累积发生，并导致生长抑制。最后，蔗糖可以消除活性氧的爆发，恢复Rubisco的活性，缓解GSH循环的激活需求。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明，急性NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量伴随着活性氧的自发爆发，导致水稻植株的碳缺乏。因此，在过量施用氮肥的情况下，碳的稀缺性可能是限制水稻氮素发挥的主要制约因素。GydF4y2Ba

氮素限制是水稻籽粒产量的主要限制因素[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．叶子n帐户为米植物，加州最大的n水槽。其中80％分布在叶绿体中并储存为氢皂糖-1,5-双磷酸羧酶/氧酶（Rubisco），C的初级碳固定酶GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba植物 [GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．光合作用与叶片氮含量密切相关[GydF4y2Ba4GydF4y2Ba，超过80%的谷物氮来自水稻的叶片[GydF4y2Ba5GydF4y2Ba］．因此，叶片氮素储存不足将导致光合固碳效率降低，因此被认为是制约谷类生态系统生物量和粮食产量的主要因素[GydF4y2Ba6GydF4y2Ba，GydF4y2Ba7GydF4y2Ba，GydF4y2Ba8GydF4y2Ba，GydF4y2Ba9GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

为维持水稻(6.4 t hm - 2)高产量所需的强而持久的氮肥需求GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}或以上），平均n个输入通常超过180千克HAGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}在中国 [GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．在高产水稻农业区，N个输入甚至可以达到300公斤GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}特别是最近的超级杂交水稻品种，其产量高达10吨公顷GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}谷物产量[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．在土壤中，施用的氮肥(例如，当前氮肥主要以尿素形式存在)通过尿素的有效反应迅速转化为铵态氮。在水稻土中，约70-80%的生育期被水淹，造成厌氧环境，在很大程度上阻碍了硝化过程。因此,NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba是水稻植株可用氮的主要形式。这样就能有效地处理氨氮GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba这是大米最重要的问题。然而，最近的研究结果表明，氮肥的过度使用加剧了NH的过量GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba不符合粮食产量进一步增加的水稻植株的积累[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．因此，氮素利用效率低下及其农艺效益是水稻氮素过度利用的主要问题。NH冗余部分的性能GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba因此，这是一个有意义的调查问题。GydF4y2Ba

最直接的观测结果是由高NH引起的GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供过于求是根生长的强烈减弱。在这方面，围绕调控根系形态的分子机制或途径已经取得了重大进展。在拟南芥中，根尖接触到高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba是触发主根抑制性生长所必需的[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．而叶接触和有毒nhh的积累GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba削弱aux1介导的IAA向根的初级极性运输，从而抑制侧根的出现[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．在大米中，连续几天暴露于高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba强烈抑制种子根的伸长，从而导致植物生长减少[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba，GydF4y2Ba16GydF4y2Ba，GydF4y2Ba17GydF4y2Ba，GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．此外，还探讨了NH的作用机理GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba对植物的毒性被认为是由离子失衡、细胞内pH值紊乱、碳限制、电荷/激素失衡或氧化应激等不同挫折的累积结果引起的[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．此外，对拟南芥进行了分析GydF4y2Ba小企业GydF4y2Ba/GydF4y2Ba职业训练局GydF4y2Ba突变体表明，gdp -甘露糖焦磷酸化酶介导的蛋白n -糖基化也参与了NH对根伸长的调控GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba应力[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．此外，据报道，植物激素信号与NH相互作用GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供应和调节植物代谢，生长发育[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba，GydF4y2Ba14GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．此外，许多转录组分析推测碳水化合物代谢、氨基酸代谢的重定向[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]是过量的NH毒性的罪魁祸首GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba．在相反的方向上，还努力从NH的严重应激中取回植物GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba毒性。例如，γ -氨基丁酸(GABA)的应用缓解了NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过降低nhh毒性GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba节约能源的积累和吸收能力[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．OsPTR6通过提高OsAMT1表达和GS活性促进水稻根系生长，但以降低氮利用效率为代价[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba];编码血红素加氧酶1的OsSE5致力于缓解NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过加强抗氧化防御系统而产生毒性[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

总的来说，目前关于植物对NH的反应的知识GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba毒性专注于高NH的影响GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba供给根外，依赖于可测量表现型的发生而积累相对较长的时间过程。在这方面，特定的NH之间的“混合”影响GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在植物生长发育过程中，胁迫反应和内源变化似乎是不可避免的。因此，一方面，引发高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba需要特别孤立的应力响应;另一方面，NH的生理和或分子表演GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba残留在水稻植株内部的多余部分仍然是独立于根表型处理的。GydF4y2Ba

之前的研究意味着碳水化合物代谢的调节可能是响应NH的显着特征GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在短时间内稻米的状况[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．环境胁迫刺激，如盐度或干旱胁迫，诱导活性氧(ROS)的过量产生，并迅速触发氧化防御反应[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．结果，光合作用的减少GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba碳水化合物代谢的固定效率和重定向可能是导致碳吸收减少和生长迟缓的主要原因[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．因此，来自经典应激反应的发现或推测为揭示体内NH毒性的本质提供了有用的链接GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba没有被明确证明的过度。GydF4y2Ba

在此基础上，本研究旨在分离水稻植株对体内NH的初始反应和(分子)生理反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在形成可见表现型之前的过度压力。为此目的，建立了允许剧烈NH的急性方法GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba几小时内过量。预计这一点解决了解决方向的作品，实际上可以进一步了解超出NH的性能GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量施用氮肥对水稻生长的影响。通过生理观察、转录组基因表达分析和酶活性分析，我们证明了急性NH的毒性作用的激活GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量很容易由活性氧(ROS)的爆发引发，随后导致光合成分的破坏，并导致初级CO活性的源头降低GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba固定。与此同时，植物中升高的ROS会激活谷胱甘肽循环来清除自由基，这需要碳水化合物代谢的重新定向来提供能量和碳骨架。这些下游反应加剧了水稻植株的碳缺乏。最后，蔗糖饲喂有效地缓解了ros诱导的挫折，支持碳短缺是水稻植株处理内部NH的主要限制GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度。GydF4y2Ba

高浓度下生长抑制GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba关联到一个NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量诱导水稻幼苗活性氧爆发GydF4y2Ba

持续使用高氨氮治疗GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba（20 mM) for 14d, a significant growth inhibition was observed compared to the control condition (1 mM NH_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa).对根系的抑制作用更大，生物量减少高达67%(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa)，根/茎比从0.5左右显著降低至0.2(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。同时，7和5折较高的自由浓度NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba分别在根和芽中测量（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。然而，高NH下根生长的强烈抑制GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba补编是一个明确的问题，引起了许多调查。人们在阐明根构型调整的分子机制方面做出了广泛的努力，以应对高氨氮引起的相对长期(几天或更长的)胁迫效应的积累GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba治疗。在这里揭示可能是累计反应的触发（生长修改）的早期敏感反应，内部NH的迅速状态GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量是必须建立在不引起植物生长的可见变化(特别是根)。因此，l -蛋氨酸- d, l -亚砜亚胺(MSX)是一种有效的初级NH抑制剂GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba谷氨酰胺合成酶活性介导的同化途径[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba] was applied (1 mM) for 4 h in the presence of high NH_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba(20毫米)。考虑到MSX的强毒性，预先测试了适当的使用条件，以避免导致细胞成分凋亡溶解的致死效应。在我们的水培中，1 mM MSX孵育4小时可以有效地导致急性NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba对水稻幼苗没有任何明显损害的情况下，根系和地上部的过量量是对照条件的5-6倍。GydF4y2Ba1DGydF4y2Ba)．因此，该方法允许在4小时内模拟出“饱和”的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在根系中的过度情况并射击到相似水平的长期处理（比较图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC＆D）。GydF4y2Ba

与游离nhh的积累一致GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba，观察到活性氧簇(ROS)爆发(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bae)，提示内nhh可能触发ros诱导反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度。GydF4y2Ba

进一步证明自由基参与对NH的早期反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量时，我们分别进行DAB(3,3’-二氨基联苯胺)和NBT(硝基蓝四唑)组织化学染色以追踪HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba在上述处理水稻植株的新生根和第2叶中。结果表明，急性暴露于高氨氮环境中GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba， HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在叶和根中均有较强的染色(附文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba(图S1, a和b)。饲喂1%蔗糖后，染色很容易褪色，接近对照水平(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，图S1中，A和B），表明H的回退GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba达到正常水平。与H的观察结果一致GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， NBT染色的OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba显示了非常相似的更改(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba这组数据提出了一个问题，即ROS的爆发(可能与它们的组成物种无关)是NH介导的毒性的起始步骤GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度。因此，一系列ros触发的反应或反应将会像广泛描述的非生物应激反应一样发生。确实，根据游离氨基酸含量的测量(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba，图S3)，高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba也引起了根和叶中游离氨基酸的大量积累，类似于干旱或盐胁迫的共同保护反应。GydF4y2Ba

RNA-Seq分析初步鉴定NH调控基因GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量的GydF4y2Ba

根据以上描述，用高nhh处理水稻幼苗GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在1mm MSX存在4 h建立一个nhh的内部环境GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度。然后进行RNA-Seq分析，寻找与此情况相关的分子反应。从根和芽中分别获得1077和1040个差异表达基因(DEGs)，其中>的转录水平变化为原来的2倍(附加文件)GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)．基于GO分类，这些基因主要属于“代谢过程”，“分子功能”，“绑定”和“生物过程”（附加文件GydF4y2Ba5GydF4y2Ba)．进一步的KEGG通路分析表明，响应基因(DEGs)可能参与胁迫反应、光合调节、碳水化合物和氨基酸代谢、激素信号通路的制备和NH的再调节GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba运输（附加文件GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)．下面根据参与的主要过程对显著调控的基因进行进一步总结。GydF4y2Ba

激活谷胱甘肽循环清除ROSGydF4y2Ba

急性NH之后GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量和ROS爆发(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac, d, e)，最显著的反应是谷胱甘肽s -转移酶(GST)基因的强烈诱导(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．在根和芽中，>的11个GST基因通常上调了7倍，甚至几十倍到数百倍。GydF4y2Ba2AGydF4y2Bab基因# 1 - 11)。其中，一台OsGSTU4 (Os10g0528300，图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种，GE.ne#11) was the most severely induced by > 300 and > 600 fold in roots and shoots respectively, followed by 2 putative GST genes (Os10g0481300 and Os10g0527800) that were upregulated by 50–100 fold in both parts. Whereas Os10g0525500 (77 fold) and Os03g0785900 (90 fold) showed strong induction in roots and shoots respectively (Fig.2GydF4y2Baa，b）。由于GSTS催化超氧化物自由基的转移来减少谷胱甘肽（GSH），导致氧化剂的排毒，GST基因表达的这些变化为GSH循环在清除NH的临界累积提供了指示GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba诱导活性氧过剩。GydF4y2Ba

随着对还原力需求的增强，负责募集GSH的谷胱甘肽还原酶基因(Os10g0415300)在根中被适度上调(~ 8倍)，在茎中被强烈上调70倍(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).同时，一个NADH脱氢酶基因(Os07g0564500)在芽内受到127倍的刺激，部分反映了激活和还原力与GSH循环运行的耦合(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一个)。GydF4y2Ba

除了与GSH循环相关的深度变化之外，在根中抑制了7个过氧化物酶基因，而在根部（19倍）和芽（179倍）中，将诱导的1-Cys过氧化毒素B基因（OS07G0638400）显着诱导（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa)，对应于过氧化物酶在ROS裂解/稳态维持中的矛盾作用[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

光合作用成分的抑制和生产碳水化合物代谢能量的对比调节GydF4y2Ba

光收集复合物(lhc)的叶绿素a/b结合蛋白，也称为天线蛋白，参与光合作用的主要反应中收集光能(光子)[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba］．然后将被困的光子和电子被运输到反应中心以进行进一步的光化学反应。通过光透压，除草剂或高度活跃的自由基积累破坏这些过程显然会阻碍光合作用的进展。在提示（4小时）NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量处理后，6个编码LHC天线蛋白的基因(分别为4个LHC II和2个LHC I)、一个PS I和一个PS II反应中心基因几乎被平均抑制约5倍(图5)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），表明光子收集和传输的效率的降低的发作。这将是容易想到的是光合作用明显抑制将沿着NH的进步积累GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba因此就会发生过度应激和生长抑制。同时，编码Rubisco小链的Os12G0292400是催化CO固定/同化的关键酶GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，下调约5倍(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)，进一步表明光合作用碳的产生受到了损害。因此,植物NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量会通过干扰初级反应和卡尔文循环而引发并可能发展光合作用的破坏。GydF4y2Ba

通过包括糖酵解和TCA途径的ATP生产方法激活和激活自由基清除酶。然而，糖酵解中涉及的几个基因和TCA循环在根和芽中截然不同（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)．在根中，编码糖酵解、异柠檬酸脱氢酶(Os05g0573200，基因#36)和苹果酸脱氢酶(Os05g0574400，基因#33)的2,3-二磷酸甘油酸独立磷酸甘油酸突变酶(Os05g0482700，基因#33)和果糖二磷酸醛糖酶(Os08g0120600，基因#34和Os01g0905800，基因#35)的基因NH处理4 h后，TCA周期基因#37的表达下调6-10倍GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba多余的治疗(图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba一个)。与糖原崩溃有关的同时，在根中抑制了糖原崩溃的基因（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba):磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (Os10g0204400基因# 32岁−19褶皱),beta-glucosidase (Os09g0491100、基因# 40,−11倍),beta-glucosidase (Os02g0131400, foldgene # 41岁的-15倍),beta-D-xylosidase 4 (Os04g0640700,基因# 42岁−7折),蔗糖合酶(Os03g0401300,基因# 43岁−8折),beta-fructofuranosidase (Os02g0106100,基因# 44岁−11倍)。相反，糖酵解/糖原分解的增强可能是通过相关基因的上调表现出来的(图。GydF4y2Ba4GydF4y2Bab): glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase (Os02g0600400基因# 39 + 5折),无机焦磷酸酶(Os05g0438500、基因# 49 + 18倍),磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase (Os10g0204400、基因# 32 + 34褶皱),beta-glucosidase (Os05g0366600、基因# 47 + 12倍),beta-glucosidase (Os09g0511600、基因# 48 + 20倍)。值得注意的是，一个糖酵解的丙酮酸脱羧酶基因(Os05g0469600，基因#38)在芽中被特异性诱导(图。GydF4y2Ba4GydF4y2Bab).此外，编码海藻糖6-磷酸合成酶/磷酸酶的两个基因Os06g0222100和Os08g0445700在根中分别被15倍和13倍诱导(图)。GydF4y2Ba4GydF4y2BaA，基因#45,46)，表明“生存物质”的生物合成增强[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]海藻糖由NH诱导GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过多的压力。GydF4y2Ba

蔗糖喂养减轻NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度应激反应GydF4y2Ba

上述分析揭示了对NH相当令人沮丧的反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在水稻植株过度强调碳水化合物的能源需求的消费密切相关。因此，一个糖缺乏可能累积（以较长的时间过程）导致生长抑制。为了检验这一假设，我们供给蔗糖的1％作为糖补偿的高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba(20 mM)水培24 h。这种处理在高氨氮条件下补偿了蔗糖的消耗GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba并允许蔗糖内容物在根部并射击以恢复到对照的等效水平（1毫米NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba(图)条件。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba一个)。蔗糖喂养治疗进一步增加了自由NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba但显著降低了NH的含量GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba积累到枝条(图。GydF4y2Ba5GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

在高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba条件下，3个AMT1基因(GydF4y2BaOsAMT1; 1GydF4y2Ba-os04g0509600，GydF4y2BaOsAMT1; 2GydF4y2Ba-Os02G0620500和GydF4y2BaOsAMT1; 3GydF4y2Ba-Os02G0620600)在根中分别被抑制3倍、67倍和6倍，表明NH降低GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba吸收的活动。与蔗糖(1%)的补充高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水培法(无花果。GydF4y2Ba5GydF4y2Bac），它们的表达水平恢复为靠近“正常”水平（1毫米NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba) . .这表明nhh抑制了铵态氮的转运活性GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量，从而促进了NH的增强GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在高NH下的根部积累GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba+蔗糖条件。而还原的游离nhhGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在芽中相同条件下的内容可能是NH的有效利用率GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba当加入蔗糖（图GydF4y2Ba5GydF4y2Bab）。同时GS（图。GydF4y2Ba5GydF4y2Bad)和GOGAT(图。GydF4y2Ba5GydF4y2Bae)蔗糖处理后，根系活性分别提高了17% (GS)和29% (GOGAT)，表明NH恢复GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2BaNH最初抑制同化活动GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度。GydF4y2Ba

蔗糖源补偿后，根系和地上部总ROS含量降低20-30%，接近对照(1 mM nhh)的水平GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba(图)条件。GydF4y2Ba6GydF4y2Baa).相应地，GSH含量和GST活性显著降低到初始水平(1 mM nhh)GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)，不再表现出强烈的NH诱导GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量（图。GydF4y2Ba6GydF4y2Bab，c）。出乎意料的是，在任何一种治疗中都没有观察到古典防御酶CAT，POD和SOD的活动的显着变化（图。GydF4y2Ba6GydF4y2Bad, e, f)。连同基因表达分析(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，我们的研究结果表明，GSH还原途径的激活可能是水稻处理NH的一种特征性反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量和活性氧积累。最后，与ROS水平下降相一致的是，Rubisco活性升高了24%(与高nhh相比)GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)，在蔗糖摄食的情况下(图。GydF4y2Ba6GydF4y2Bag)，表明初级CO效率提高GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba固定的活动。GydF4y2Ba

连同，这套实验表明，蔗糖喂养可以有效缓解内部NH施加的碳稀缺性的水稻植物GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量和活性氧胁迫。GydF4y2Ba

内部nhh的性能GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量是一个具有生理和现实意义的问题GydF4y2Ba

由于特殊的水驱和厌氧环境，NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba仍是水稻有效氮养分的主要形式。在中国目前的高产水稻生产中，为了满足提高粮食产量对氮肥的需求，氮肥用量通常高达300公斤/公顷GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}一般情况下，苗期氮素总量为基础氮的40%，分蘖期和灌浆期氮素总量为追施氮的30%，以保证根系和光合叶片中有足够高的氮素含量。这种量的氮被认为是过度使用的，因为谷物产量已经饱和;但对农场实现粮食高产的目标是必要的[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba，GydF4y2Ba11GydF4y2Ba，GydF4y2Ba12GydF4y2Ba，GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．由于N过度使用的后果，持续内部NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水稻植株存在过剩的环境需要应对。因此，对这种特殊情况的研究将有助于发现水稻氮素表现的(分子)生理和农艺方面的“瓶颈”制约因素和适应策略。那么问题就来了:过量的氮对水稻有什么作用?什么是限制从转换到进一步生产力的过剩N的主要约束?GydF4y2Ba

在N过度使用的现场条件（说300公斤公顷GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}N)，假设氮肥完全以NH的形式存在GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba离子，主要分布在30 cm(含水体)深度内，总N (NH)占比为4:3:3GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)将大致导致2.2、1.7和1.7毫米的nhhGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba浓度，由于土壤的缓冲能力（NH），这种浓度将进一步损害（NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba附着在土壤颗粒上)，最后游离nhhGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba根周围的离子可能处于“安全”范围，不会对根造成压力。因此，稻田氮素的过度利用并不完全是一种外部高氮素GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba一般情况下，追肥在水淹田的地表几乎是均匀的，而不是局部追肥，这样会带来高的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba的根源。在这种情况下，N的过度使用问题可以简化为NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量在植物内部。GydF4y2Ba

我们就是根据这一点设计实验的。尽管像其他许多人一样，为了更好地控制实验条件，我们使用水培来解决这个问题。在整个实验过程中，特别注意避免生长分化。分离由内nhh引起的特定反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量，我们建立了一种急性方法来产生足够水平的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过MSX存在于4小时内超过（针对GS）NH的同化GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba被吸收进植物中。对于MSX的使用，我们清楚地注意到它对植物的强烈毒性，并采取了严重的预防措施，通过预先测试其对显著的NH的诱导作用，以找到一个“安全”的条件GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba笋的积累及其对幼苗的毒性影响。当MSX以0.1 mM浓度供应时，NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在4小时内拍摄的积聚远低于1 mm（5-6倍）的深刻（1-2倍）。在与1mm的MSX孵育的前4小时内，水稻幼苗仍然明显不受影响，表明在此时间段内没有发生伤害;延长孵育至12小时，叶片变黄，含有一些卷曲，最后最多24小时，幼苗开始死亡。此外，我们之前的任选基因表达观察的工作[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]，我们最后使用4小时高nhh处理GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba以及1 mM MSX的存在。GydF4y2Ba

内部nhh的毒性GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量的ROS会爆发GydF4y2Ba

高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba胁迫和毒性是人类对植物造成的主要环境危害，引起了广泛的研究兴趣。这些课题的研究主要集中在识别主要调节根系结构生物修饰的机制或途径[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］．坚实的证据表明植物根系形态的重新配置，响应于NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过与植物激素信号传导途径的相互作用紧密控制应力[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba，GydF4y2Ba14GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．而NH.GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba毒性可归因于离子不平衡[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]、细胞内pH值紊乱[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba，因NH无效而消耗的能源GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba根的循环[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba，GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．对北半球的评估GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba植物根系的胁迫反应及其生物毒性在很大程度上依赖于可测量的生长表型的建立，而这些生长表型需要效应或反应在预期的时间过程中积累。这些分析在阐明生理效应的作用模式或治疗过程中发展的过程中显然是重要的。另一方面，由于植物在实验期间不断生长和发育，这些累积的观察可能不能令人满意的捕捉最初的反应或NH的性质GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba承受过大压力。因此，似乎不可避免地需要分离由内部触发NH初始反应GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过度源于相当混合的累积效应。GydF4y2Ba

我们的结果与生理测量和组织化学观察清楚地表明，ROS自由基的爆发是一个最直接的后果，很容易沿着急性内部NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bac - e;附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．然后我们得到了一整套的证据来支持NH毒性的本质GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水稻植株中过量的活性氧可能是由诱导ROS爆发和下游反应引起的:1)由于光合成分对自由基损伤敏感，我们观察到参与光子标题和初级CO的基因丰度降低GydF4y2Ba_2GydF4y2BaRubisco酶的固定活性（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba6GydF4y2Bag);2)在ROS爆发的下游，我们利用GST基因的转录和酶活性变化作为指标，发现GSH循环似乎是一种清除ROS的特定防御机制(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）;3)为了激活高能量消耗的ROS裂解反应，我们观察到基因表达指示，在芽中还原复杂糖的合成和活性单糖的强烈分解(图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba），这种碳代谢的这种转变指向加强碳骨架的生产。相反，能量和碳骨架生产的增强似乎不在根中进行（图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)，意味着牺牲根的生长来逃避压力。GydF4y2Ba

为此，NH的毒性本质GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水稻植物中的过量很大程度上是对非生物胁迫明显的，例如在其他植物物种中描述的干旱或盐度应力[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba，它们有着相同的起源——氧化损伤和ROS诱导的能量和碳骨架消耗。有充分的理由推测在高nhh条件下诱导ROSGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba压力。在烟草和葡萄悬浮细胞中，用高NH处理24GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba或氯化钠导致活性氧的产生，活性氧是氨基酸合成和代谢重定向的信号[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba[Skopelitis et al.， 2006 PC]。在水培中GydF4y2BaMyriophyllum mattogrossenseGydF4y2Ba通过过量的氨(NH)诱导氧化应激反应GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba和NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)是由抗氧化保护酶活性增加而推断的[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba(Nimptsch et al.， 2007, Chemosphere)。在耗尽氮26 h后，再补充1 mM的nhhGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba到GydF4y2BaArabidosisGydF4y2Ba被怀疑会诱发氧化应激反应，这是由抗氧化清除剂的活性升高而推断出来的[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba(Patterson 2010 PEC)。低于25毫米NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba，中可检测到H2O2升高GydF4y2BaArabidosisGydF4y2Ba并参与AMOS1/ egy1依赖性ABA信号的调控28]。在水稻中，连续接触极高浓度的nhh 6天GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba（80 mm）导致ROS的显着积累，并激活血红素氧酶1的累积在减轻NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba毒性[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba(Xie et al.， 2015 PCE)。一般来说，在大多数表型相关的评估中，植物遭受持续的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba应力使固体表型发育，并且在这些情况下，升高的ROS水平被认为是用于激活特定分子途径的基本信号或触发器。用于鉴定在形成生长表型之前的“早期”反应，转录组研究重点关注基因表达调节，以形成对ROS植物和下游反应中的血液对高NH的反应的簇GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba应力[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．然而，ROS的归纳仍有与自由NH的积累有关清楚地定量的GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在植物内和NH的内部效果GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量也需要从外部施加到根部的应激反应中分离出来。在这篇报告中，我们通过生理和组织化学观察发现，活性氧的急性诱导容易伴随着体内NH的形成GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba这就有力地证明了体内NH令人沮丧的表现GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量整合，可能也源于ROS的爆发。GydF4y2Ba

碳稀缺性是制约内部NH有效性的主要因素GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量的GydF4y2Ba

我们的整组数据支持预测碳稀缺与内部NH发生GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量，包括光合碳同化的源头减少(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)和碳水化合物代谢的重定向，以增强能量和C骨架的生成(图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)．通过蔗糖喂养实验进一步证明预测，最终取消与NH相关的负面影响GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量（图。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba和GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)．选择蔗糖作为碳缺乏的补充，因为这种糖是韧皮部中活性碳来源的主要形式，可以在植物组织和器官中运输和分配[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

然而，“碳稀缺性”的问题是一个相当普遍的观点，作为压力反应的结果，因为许多报告提出了这样的猜测[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．在这份报告中，我们提供了一些数据集，这些数据集指向了碳稀缺性的开始和发展。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba4GydF4y2Ba)．因此，碳稀缺性的发生及其与NH的关系GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba超额和/或n过度使用不再是假设，而是具有实体数据支持的结论性概念。在这方面，NH的性质GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba毒性作为发展和碳稀缺的积累，最终导致生长抑制或死亡的植物来解释。GydF4y2Ba

作为由本工作的蔗糖饲养试验（图证实。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba和GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)和高NH条件下拟南芥的报道GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]盐度应力[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]（Qiu等，Biologia plantarum）或鸡眼的盐度应力[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba[Khan et al.， 2016 JXB]，提高活性糖收入将是克服碳源短缺的有效途径。而在野外，补充高浓度的COGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba是一个简单的调节，以提高谷物光合碳生产和谷物产量[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba50GydF4y2Ba，GydF4y2Ba51GydF4y2Ba，GydF4y2Ba52GydF4y2Ba)(安斯沃思2005;李基2009;贝克尔2016;Kimball 2016年当前观点)。然而，报告显示，持续接触高一氧化碳GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba3-5个生长期后，气孔导度显著降低，氮素养分限度显著降低，出现驯化现象[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba53GydF4y2Ba(Seneweera et al.， 2002 Funct.)植物生物学;安斯沃思2005)。这种对一氧化碳升高的适应GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可以部分地被补充足够的氮所阻碍[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba] (Stitt, 1999)，提示该方法在当前水稻氮素过度使用情况下可能更有效。此外，有报告表明，添加碳酸钙GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba根源减轻了高NH的黄瓜生长抑制GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba压力(GydF4y2Ba55GydF4y2Ba] (Roosta, 2008)。这种碳补给方式预计对中国水稻种植具有实际意义，因为水稻生产的大部分地区位于pH值较低的红壤，石灰通常用作土壤调节剂，以中和pH值。GydF4y2Ba

高效NH.GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba通过AMT转运体的摄取与gs介导的同化过程对底物的去除、NH的无效去除或积累密切相关GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba会阻碍离子的吸收 - 所谓的反馈抑制现象[[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba，GydF4y2Ba56GydF4y2Ba，GydF4y2Ba57GydF4y2Ba，GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．根特有AMT基因的强力压制，GydF4y2BaOsAMT1; 2GydF4y2Ba和GydF4y2BaOsAMT1; 3GydF4y2Ba在快速NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba多余的条件(图GydF4y2Ba5GydF4y2Bac)和降低GS和GOGAT活性(图。GydF4y2Ba5GydF4y2BaD, e)提供水稻中这种反馈调节的进一步证据。这里，通过蔗糖喂养的碳补偿，NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba同化活动恢复到正常利率（正常NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba， 1 mM)， AMT表达水平相应增强(图1)。GydF4y2Ba5GydF4y2Bac, d, e)，支持认为碳稀缺性可能是导致NH反馈抑制的主要原因GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba吸收。GydF4y2Ba

总之，目前的工作揭示了内部NH的本质GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba水稻植株的过度胁迫与其伴随的ROS爆发密切相关。升高的氧化自由基损害光合成分，导致初级碳产量减少。活性氧清除过程的激活改变了碳水化合物代谢的方向，增强了能量和碳骨架的生产，并加强了水稻植株的碳缺乏。蔗糖能有效地缓解令人沮丧的应激反应。因此，碳稀缺性可能是制约内部nhh有效性的主要因素GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba施氮肥过量高产水稻的过度使用。GydF4y2Ba

植物生长和治疗GydF4y2Ba

水稻的种子GydF4y2Ba选用。漂白亚麻纤维卷GydF4y2Bassp。粳稻GydF4y2Banipponbare.GydF4y2Ba由武汉大学生命科学学院朱英国教授团队提供。种子表面消毒，发芽和幼苗生长在一个生长室根据前面描述[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．生长室设置昼/夜16/8 h, 27/25℃，昼/夜;光强为400 μmol mGydF4y2Ba^{- 2GydF4y2Ba}年代GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}，相对湿度设定为70％。幼苗在Irri溶液中生长[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]直到所需的年龄。用10mm MES缓冲水培素的pH为5.7，并每48小时再次更新。对于治疗均匀尺寸的幼苗被转移到填充有1.0L型营养溶液的气缸聚氯乙烯培养罐（10cm内径和15.5cm高度），其供应的所需浓度的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba．将8株幼苗分成4个孔，放置在每个培养槽的盖子上。在收获的时候，每个容器的幼苗被汇集在一起，作为每个处理的一个副本。在3个单独的培养槽中重复处理。对于长期生长试验，7 d的均匀幼苗分别用1 mM(对照)或20 mM(高NH)处理GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2BaCl补充到无氮IRRI溶液中继续14天，每天更新培养溶液。实现快速的NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在不引起生长差异的情况下，NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量反应性基因可以在10-d老幼苗及时用“控制”或“高NH治疗的响应，早期阶段被分析GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba'（见上文）在1mM甲硫氨酸磺酰胺（MSX，谷氨酰胺合成酶的强效抑制酶）存在下4小时，以阻止NH的主要同化GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba．在蔗糖饲喂试验中，14日龄幼苗处理对照(1 mM nhh)GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)或高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2BaNH(20毫米GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba)，在1% (w/v)蔗糖存在的IRRI溶液中孵育24 h。为了避免与含蔗糖的水培相关的微生物爆发，抗生素青霉素(50 mg LGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}）和Chloramphenicol (25 mg L^{- 1GydF4y2Ba}）根据Lejay的描述包括在培养方案中[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．在对照苗中加入相同剂量的抗生素(对照NH)GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba和高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba植物)治疗。另外，为了防止可能出现的不良影响，治疗时间限制在24小时内。GydF4y2Ba

RNA-Seq的和定量实时PCR分析GydF4y2Ba

根据制造商的协议，提取来自经处理的根或芽样品的RNA总量来自治疗的根或芽样品的RNA萃取试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）。对于RNA-SEQ分析，来自控制的RNA（1毫米NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba）或高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2BaP.lus 1 mM MSX treated (4 h) tissue samples were used for library construction and sequencing. Data extraction, identification of differentially expressed genes (DEGs) and functional annotation were analyzed according to our previous work [29.GydF4y2Ba］．表达倍数变化大于2 (GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba积累（高NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba+ MSX)和控制条件。GydF4y2Ba

进行定量实时PCR（QRT-PCR）分析，以揭示与特殊条件相关的基因表达水平的可能反应，如NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量的压力或蔗糖喂养治疗方法。根据制造商的描述，使用约1μg总RNA合成第一链CDNA（PrimeScript TM RT主混合物（完全实时，Takara，Japan）。用于QRT-PCR的引物序列在附加文件中列出GydF4y2Ba7GydF4y2Ba．根据制造商的协议，使用SYBR预混料Ex Taq (TaKaRa，日本)，使用C1000 Thermal Cycler CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)进行热循环和荧光检测。反应条件为:95℃30 s, 95℃10 s, 60℃15 s, 72℃15 s，共44个循环。在fold change分析中，基因表达丰度量化为-2GydF4y2Ba^{ΔΔCTGydF4y2Ba}和归一化对内部OsActin基因。PCR扩增使用重复来自三个独立植物样品合成cDNA模板三次。GydF4y2Ba

组织免费NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba、游离氨基酸、谷胱甘肽、蔗糖含量测定GydF4y2Ba

将新鲜的根或芽样品（0.2g）研磨成液体n的细粉GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba并在5ml 0.3 mM硫酸中均质。取上清液20000 g, 4℃离心20 min。免费NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba取适量的上清液(200 μL)与4.9 mL硝基硝普酚钠溶液和碱性盐酸溶液按Weatherbur [GydF4y2Ba60GydF4y2Ba］．The color reaction was allowed to develop at room temperature for 1hbefore the colorimetric absorbance been measured at 625 nm. The content of free amino acids was determined by a T–free AA assay kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) using glycine as the standard [61GydF4y2Ba］．根据Cheng的方法测量组织GSH含量[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba］．组织蔗糖提取按照Sonnewald的方法进行[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba]，和组织蔗糖含量的测定是基于斯蒂特的描述测定[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba，GydF4y2Ba64GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

总ROS测定、组织化学染色、活性氧清除酶活性测定GydF4y2Ba

体内NH诱导的总活性氧(ROS)含量GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba过量由2评估'，7'- Dichlorofluoresceindiacetate（HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA)方法(GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］．首先在用纤维素酶和果蝇中除去细胞壁后，首先用单细胞悬浮液中的单细胞悬浮液制成新鲜根或芽样品。然后H.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在200 μL单细胞悬液中加入DCF-DA，最终浓度为10 μM，混合后37℃孵育30 min。细胞经1000 g离心成球10 min, PBS洗涤2次，PBS稀释后进行荧光检测。根据Karlsson和Sun的描述，在激发波长为500 nm和发射波长为530 nm的荧光微板阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT)上测定吸光度[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba，GydF4y2Ba67GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

用相对均匀的水稻幼苗新生长的根和第二叶进行组织化学染色[GydF4y2Ba68GydF4y2Ba］．过氧化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)或超氧化物(OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba)，分别用3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB)或硝基蓝四唑(NBT)染色检测[GydF4y2Ba68GydF4y2Ba，GydF4y2Ba69GydF4y2Ba］．使用荧光显微镜(尼康80i)对样品进行分析和拍照。在这些实验中，至少有三片叶子或根被单独染色。GydF4y2Ba

对于抗氧化酶活性分析，在液体n下研磨0.2g新鲜根或芽样品GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，均质和粗提物用于测定CAT、POD和SOD活性，如前所述[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．根据制造商说明(CS0410, Sigma，美国)，使用GST检测试剂盒，在340 nm处根据吸光度的增加，测定上清液中GST的比活性。活性单位定义为在30°C条件下每分钟形成1 μM产物所需的酶量。酶活性以U. mg表示GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯。GydF4y2Ba

GS、GOGAT和Rubisco活性测定GydF4y2Ba

为了制备粗制酶提取物，根或每个样本的枝条磨成细粉与液氮GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和homogenized with 50 mM Tris–HCl buffer (pH 7.6, containing 10 mM MgCl_2GydF4y2Ba使用冷却的杵和砂浆，1mM EDTA，1mMβ-巯基乙醇和4％（W / V）聚乙烯醇吡咯烷酮-40）。将匀浆在4℃下以15000g离心30分钟，使用上清液用于测定酶活性。根据Sakurai的描述测量谷氨酰胺合成酶（GS）活性[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba］．GS活性的一个单元表示为催化在37℃下每分钟形成1μmolγ-谷氨酰胺的形成量[GydF4y2Ba71GydF4y2Ba］．上清液中的谷氨酸合成酶（Gogat）活性通过将2-酮戊酸酯转化为含有200mm Kh的反应混合物中的2-酮戊酸酯。GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba_4GydF4y2Ba-KOH pH 7.5, 10mm谷氨酰胺(Gln)， 10mm 2 -酮戊二酸，0.14 mM NADHGydF4y2Ba72GydF4y2Ba]， GOGAT活性的一个单位定义为30°C下1nmol NADH / min的氧化速率。Rubisco的活性根据Li [GydF4y2Ba73GydF4y2Ba］．Rubisco活性的一个单位定义为25°C下1nmol NADH / min的氧化速率。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

实验数据表示为平均值±S.E.M.3个独立的重复。通过Duncan或T检验评估统计差异，具有SPSS 13.0，统计学上显着差异的水平设定为P <0.05。GydF4y2Ba

本文(及其附加文件)提供了支持本文结论的所有数据。GydF4y2Ba

AMT:GydF4y2Ba

铵转运蛋白GydF4y2Ba

猫:GydF4y2Ba

过氧化氢酶GydF4y2Ba

CO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

二氧化碳GydF4y2Ba

DAB：GydF4y2Ba

3,3' - 铝硝基苯胺GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

GABA:GydF4y2Ba

γ-氨基丁酸GydF4y2Ba

走:GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

KEGG:GydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书GydF4y2Ba

GOGAT:GydF4y2Ba

谷氨酸合酶GydF4y2Ba

g:GydF4y2Ba

谷氨酰胺合成酶GydF4y2Ba

谷胱甘肽:GydF4y2Ba

谷胱甘肽GydF4y2Ba

GST：GydF4y2Ba

谷胱甘肽S-转移酶GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA:GydF4y2Ba

2 ', 7 ' -DichlorofluoresceindiacetateGydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

过氧化氢GydF4y2Ba

大型强子对撞机:GydF4y2Ba

聚光复合物GydF4y2Ba

MSX:GydF4y2Ba

L-甲硫氨酸-D，L-磺酰胺GydF4y2Ba

护士:GydF4y2Ba

氮GydF4y2Ba

电视台:GydF4y2Ba

氮蓝四唑GydF4y2Ba

NHGydF4y2Ba_4GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

铵GydF4y2Ba

存在:GydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应GydF4y2Ba

O.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

超氧化物GydF4y2Ba

荚：GydF4y2Ba

过氧化物酶GydF4y2Ba

ROS:GydF4y2Ba

活性氧GydF4y2Ba

RNA-Seq:GydF4y2Ba

RNA测序GydF4y2Ba

SOD:GydF4y2Ba

超氧化物歧化酶GydF4y2Ba

二磷酸核酮糖羧化酶:GydF4y2Ba

核酮糖1 5 5-bisphosphate,羧化酶/加氧酶GydF4y2Ba

三羧酸循环:GydF4y2Ba

三羧酸循环GydF4y2Ba

我们感谢Rong Huang女士和Zuohao MA先生，中国科学院土壤科学研究所（南京），善良帮助和技术助理。GydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2017YFD0200100, no . 2017YFD0200103);国家自然科学基金项目(no . 31501826, no . 31701991);国家自然科学基金重点项目(no . issscas)资助项目(no . ISSASIP1609)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟资助方没有在研究的设计、收集、分析和解释相关数据以及撰写手稿中发挥任何作用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 中国科学院南京北京东路71号土壤与农业可持续发展国家重点实验室，江苏南京210008GydF4y2Ba

   顺英杨，东利浩，男子金，易力，曾泰刘，延安黄，天翔陈和延华苏GydF4y2Ba

2. 2 .中国科学院大学，北京100049GydF4y2Ba

   男子金，易力，曾泰刘，延安黄天翔陈GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

ys和sy构思和设计了研究。SY，DH，MJ为RNA-SEQ分析制备样品，进行了定量PCR验证和分析数据。SY，DH，MJ，YL，ZL，YH和TC进行了生理/生物化学测定和数据分析。sy和ys写了稿件。所有作者均阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba烟花苏GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。GydF4y2Ba

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再版和权限GydF4y2Ba