利用转录组测序技术开发和鉴定16个新的微卫星标记Angelica Dahurica以及跨物种扩增测试

背景

Angelica Dahurica（Apiaceae）是中药中的重要草药。由于其重要的药用和经济价值，其野生资源被过度利用，越来越减少。同时，品种的多样性白芷由于长期人工培养而减少。但是，没有人口遗传学研究白芷特别是利用微卫星标记(SSRs)研究该物种的群体遗传学。

结果

共分离到16个多态性EST-SSR位点白芷转录组测序技术(RNA-Seq)。每个多态性位点的等位基因数为2 ~ 15个，杂合度为0.000 ~ 1.000，杂合度为0.000 ~ 0.829。8个位点均偏离Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡检验显示，11个信息位点对在所有群体中均存在显著性差异。杂交扩增结果表明，16个SSR位点中有14个在品种-中具有可转移性白芷简历。“Hangbaizhi”和答:decursiva．

结论

具有RNA-SEQ的16个新开发的基因座微卫星引物对于进一步调查人群遗传学将是有用的白芷、栽培品种和其他属的成员。

Angelica Dahurica(Hoffm)。Benth。等困境。f .练习法语。和干腊肠。,is an important medicinal plant, whose roots (Angelicae Dahuricae Radix) have been used as the important traditional Chinese medicine “bai zhi” for thousands of years [1.]．白芷在华北广泛栽培，谁有两种品种，即白芷简历。“Hangbaizhi”和白芷简历。“Qibaizhi”。这些草药被认为有祛风寒湿、排脓止痛的功效[2.]．除了药用之外白芷它的品种也被用作化妆品和香料的原料[3.]．由于药物和经济价值，野生资源白芷由于过度开发和生境破坏，森林面积日益减少。同时，这两个品种白芷经过长期的人工选择，导致了遗传多样性和抗病虫害能力的下降[4.,5.]．来自不同产地的两个品种之间的基因流动可能会导致远系繁殖的衰退，然后这种衰退的基因流动进入相邻的自然群体白芷这可能会导致其对当地环境的适应性下降[6.]．野生资源通常具有较高的遗传变异，是有价值的种质资源。生物多样性保护的关键之一是保护物种，更具体地说，是保护物种的遗传多样性或进化潜力。因此，为了保证可持续利用Angelica Dahurica应加强资源保护遗传学研究，尽可能保护该物种的遗传多样性。遗传多样性和群体遗传结构的评价A. Dahruica有助于制定科学有效的保护策略。

微卫星标记是由1-6个核苷酸组成的简单重复序列(SSRs)，可在所有原核生物和真核生物的基因组中找到[7.]．在过去几十年中，微卫星标记，由于多态性，高丰度，共同统治，选择性中立和跨物种的可转移性8.,9,10,11,12[已广泛应用于各种生物研究，如人口遗传学，基因流动，系统发育和保护遗传学。最新研究报告了18个多晶型位点当归[13]. 然而，没有一个微卫星位点成功地应用于基因工程白芷，这可能是由于扩增的低成功率或无多态性。因此，有必要开发新型微卫星制造商进行人口遗传学白芷．

下一代测序技术是一种功能强大、成本低廉、可靠的工具，可以生成大量的序列数据，为我们开发SSR标记提供帮助[14,15,16,17]．特别是，与illumina测序的RNA-SEQ可以帮助研究人员在识别和开发大量SSR标记中，与传统的SSR开发过程相比，这与传统的SSR开发过程相比更快，更容易，更具成本效益。18]．本研究旨在使用RNA-SEQ技术开发新的微卫星标记，这对于评估遗传多样性和人口结构是有用的白芷．我们也希望利用这些新的SSR标记作为进一步研究植物保护的有效工具A. Dahruica．

评估RNA/DNA的质量和数量

浓度和纯度(OD_260/280）来自样品中提取的RNA（凭证NO.2007826-CD-X）分别为256.7 ng / UL和2.02，对Illumina测序的要求感到满意。从89个种群中提取的DNA也有资格，其浓度和纯度（OD_260/280)的范围分别为38.6 ~ 398.3 ng/ul和1.64 ~ 1.99。

SSR标记筛选及多态性评价

总的来说，RNA-Seq获得了85 000,882个长度至少为150 bp的干净的对端序列，通过与Trinity进行从头组装得到85 650个unigenes。MISA共鉴定出11,289个假定的SSRs。根据这一详细信息，利用primer 3程序设计了9436对(83.6%)引物，对含有二、三、四、五、六核苷酸重复基序的位点进行了评价。随机选取30个位点扩增4个群体中各5个样本。但30个位点中有14个未扩增或未进行非特异性扩增。其余16个位点(表1.)在四个群体中可以扩增并产生多态性扩增产物（表1）2.，附加文件：表S1）。

四个人群中，每个多晶型位点的等位基因数量范围为2至15（表2.)，观测杂合度和期望杂合度分别为0.000 ~ 1.000，平均为0.512和0.000 ~ 0.829，平均为0.488。8个位点与HWE有显著差异(表1)2.)．根据Micro-Checker分析，在68.8%的基因座中检测到与HWE的偏差可能导致无效等位基因。AD9与AD10、AD9与AD8、AD9与AD17、AD9与AD11、AD11与AD19、AD2与AD4、AD7与AD14、AD8与AD11、AD10与AD11、AD1与AD11、AD23与AD24 (P< 0.01)。经Bonferroni序列校正后，BX、AS、CD群体的信息位点对均不显著，而KS群体的信息位点对有5对显著(AD8/AD9;AD10 / AD9;AD11 / AD9;AD17 / AD9;AD11 / AD19)。这些结果表明，新开发的微卫星引物将为进一步研究水稻群体遗传学提供参考白芷和这个属的其他成员。

跨物种扩增

16个多态SSR位点从白芷在10个Angelica Dahurica简历。'杭巴西'和5个个人当归decursiva．结果表明，16个SSR位点中有14个(87.5%)在二者中具有可转移性白芷简历。“Hangbaizhi”和答:decursiva分别（表3.)．

植物SSR标记的建立方法

在过去的几十年里，出现了许多开发SSR标记的方法，如(1)从基因组DNA库中筛选SSR，(2)磁珠富集，(3)基于pcr的SSR阵列分离，(4)在GenBank、EBML或DDBJ中搜索SSR标记[18,19]．这些方法是劳动密集型，成本和耗时的，因为有些人必须为不同的SSR序列进行多次构建基因组DNA文库并筛查文库，并且阳性克隆的产率非常低;或者一些人必须知道设计引物的基因组信息;或者必须使用复杂的酶限制技术，或缺乏关于数据库中的目标物种的信息[20.,21]．

随着过去十年中排序技术的快速发展，下一代测序（NGS）技术使RNA-SEQ更有效和可靠[18]．RNA-SEQ可以生产一定量的序列数据，其将用于开发新的分子标记[16]. RNA-Seq方法省时省力，而且有效经济，几乎可以克服上述传统方法的缺点。另一方面，该方法特别适用于分子标记开发中无参考基因组的物种[22]．此外，技术复制之间的高稳定性使RNA-Seq数据更有用[23]．RNA-seq目前已应用于许多植物物种的EST-SSR开发，如罗莎罗克斯堡岛[24]，Neolitsea Sericea[25]，柳树[26]，老芒麦[27]，Xanthoceras Sorbifolia[28]本研究共鉴定出11289个推测的ssr。这些大数据集资源将有助于研究人类的遗传多样性和群体遗传学白芷. 我们也希望利用新的EST-SSR标记作为进一步研究植物资源保护的有效工具A. Dahruica．首先，利用EST-SSR标记对黄花苜蓿的遗传多样性进行评价白芷和品种大规模，尽可能地保护他们的种质资源。其次，组合SSRS和生态数据产生的遗传信息可能有助于了解对该野生资源的下降并实施该物种的有效保护措施及其遗传多样性的影响因素。我们还可以评估将核心收集区域确定为未来保护地点或范围等的人口遗传结构。

跨物种扩增的可转移性

SSR标记在不同种间，特别是近缘种间具有可移植性。可转移程度依赖于侧翼序列的保守程度和SSR的进化稳定性[29]．Xu和Li使用了66个多态基因座LiriDendron Tulipifera在放大鹅掌楸研究方面和白含笑[30.]. 他们发现转移率分别为85%和54%。Han等人随机筛选了10个SSR，以鉴定该属植物柳树和杨树．扩增结果表明，在两个属中，14个SSRS是普遍的[31]．郑等人。首先展示了双子叶蛋白的基因组SSR（属Gossypium.)可用于单子叶植物(穆萨娜娜)他们还发现EST-SSR的可转移性比基因组SSR强得多[32]．这些研究表明，SSR标记不仅在近缘种中具有可移植性，而且在不同属甚至不同科中也具有可移植性。在我们的研究之前，尽管一个同属物种(当归)已发表策略性物料表[13)，作者发现这些标记没有扩增或没有多态性Angelica Dahurica通过预先实验。新发达的EST-SSRS在这里显示了16个多态性基因座中的14个白芷在品种和近缘种之间具有可移动性(答:decursiva). 基于可转移性，获得的SSR标记将提高标记开发的效率，降低标记开发的成本，增加属内SSR的数量当归。特别是对于属的种类当归在基因组背景信息较少的情况下，利用近缘种的SSR标记开发SSR标记将是非常方便的。在本研究中，通过跨物种扩增试验，我们也发现了位点AD7的产物大小范围(131 ~ 143 bp)白芷(包括白芷“哈贝芝”与“201”有所区别 bp）的答:decursiva．AD7位点可作为分子鉴定的潜在诊断标记白芷和答:decursiva．

新开发的16个EST-SSR白芷，通过该研究的RNA-SEQ数据分析实现将可能在进一步调查人群遗传和遗传多样性方面有助于A.天竺葵，它的栽培品和基因物种。诊断标记（基因座AD7）可用于识别的应用白芷和答:decursiva．

植物材料

我们抽样Angelica Dahurica(Hoffm)。Benth。等困境。f .练习法语。和干腊肠。从其自然分布区的中部(河北承德)和东北部(辽宁安山、本溪)4个种群中采集;(标本采样信息及凭证编号详见表4.)．在群体中，将取样植物分离至少20μm以避免来自相同克隆的多个样品。在每种群体中，收集17至24个个体的新鲜叶片并保存在凝胶干燥的二氧化硅中，直至DNA提取。完全，选择89个个体以评估发育的微卫星标记的多态性。十个标本白芷简历。《杭百之志》和5个标本当归decursiva（MIQ）Franch。等等。用于跨物种扩增（表4.)．(凭证编号:(2017826-CD-X)采集自中国河北省承德地区的CD种群，然后立即在液氮中冷冻提取RNA。由于该植物不分布在自然保护区，且未列入国家重点保护植物名录，因此采集这些样品不需要经过许可。以上标本均经南方医科大学中医学院田恩威副教授形态学鉴定。凭单标本保存在新医大学植物标本室(见表1)4.)．我们的实地研究和实验研究符合当地立法、国家和国际准则。这些作者还遵守了《濒危野生动植物种贸易公约》。

RNA/DNA提取、cDNA文库构建及Illumina测序

标本(凭证号2017826-CD-X)，采用改良CTAB法提取总RNA [33]. 为了检测分离的微卫星位点的多态性，89个样本用于基因分型（表1）4.)．在此之前，这些标本的基因组DNA是用改良的CTAB方法提取的[34]．使用NanoDrop 1000紫外/可见分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)和1.5%琼脂糖凝胶电泳评估精确RNA/DNA的质量和数量。使用Illumina TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina, San Diego, California, USA)构建RNA- seq文库。利用中国深圳TGS公司在HiSeq 4000平台上构建cDNA文库并进行Illumina测序。

SSR标记开发、PCR扩增及多态性位点筛选

RNA-Seq产生的原始数据首先用Qiagen CLC Assembly Cell v.4.2.1进行过滤和质量控制，然后用Trinity v2.4.0进行从头组装[35,36]．为了挖掘和鉴定SSR位点，利用MicroSAtellite工具(MISA,v1.0)在获得的unigenes中寻找推定的微卫星基序[37]．对unigenes进行1-6个核苷酸重复基序的搜索。单核苷酸重复序列至少延伸10个重复，二核苷酸重复序列至少延伸6个重复，所有其他基序长度的重复序列至少延伸3个重复[38]. 从单基因出发，根据Tian等人的标准，用引物3设计SSR引物：（1）PCR扩增产物大小在80～300之间 英国石油公司(2） 引物长度为18-25个核苷酸；GC含量为40–55%(3） 退火温度5 °C低于Tm值（55–65 摄氏度）[39,40]．在引物设计之后，我们在80至250bp之间的靶向产品尺寸的条件下随机选择30对引物。二 - ，三 - ，四，五胞嘧啶和己核苷酸重复基因座分别具有至少9,6,5,4,3重复。该引物在Invitrogen Company（中国上海）合成。

随后，对这30对引物进行PCR扩增白芷使用总基因组DNA(每个群体中的5个样本进行PCR检测)。扩增反应采用2720个热循环(Applied Biosystems, Foster City, CA)， 20 μl体积，含20 ng基因组DNA，每个dNTP 0.2 mM，每个引物0.4 μM, 10 × PCR缓冲液(Mg^２＋免费），2.5 毫米毫克^２＋，1单位Taq-DNA聚合酶（Takara，大连，中国），条件如下：95℃初始变性 °C持续5分钟 最小，然后是35 94周 摄氏度，30 S50至55 摄氏度，60 S72 摄氏度，45 最后延长72秒 8°C PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳下可见。然后选择成功扩增的引物来评估多态性。在此之前，在前向引物（5′端）用荧光染料（TAMRA或FAM）标记引物对。为了研究这些微卫星标记的遗传多态性，我们对89例患者的基因组DNA进行了分析白芷使用来自四个自然种群的个体。PCR反应和循环条件如上所述。PCR产物的片段大小在ABI PRISM 3100遗传分析仪（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）上测定，使用基因型仪4.0和LIZ 500（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）作为内部大小标准。

SSR标记数据分析

用Micro-Checker 2.2.3版本检测到微卫星位点中可能存在的缺失等位基因、大的等位基因辍学和基因分型错误[41]．多样性指数，包括等位基因数量(Na）， 观察到的 （何)和期望杂合度(他)使用GENALEX版本6.1估计每个基因座和群体[42]．我们用Markov链方法对SSR位点偏离Hardy-Weinberg平衡进行了检验(设置:不记忆:1000;批次:100;每批迭代次数:1000)[43]．所有对所有基因座的连锁不平衡测试白芷还使用Genepop 4.0进行群体。P-使用Bonferroni校正调整数值[44]．

跨物种扩增

为了验证所开发的ssr位点的可移植性，从白芷在10个Angelica Dahurica简历。'杭巴西'和5个个人当归decursiva使用与上述相同的程序，不同之处在于为每个基因座重新优化退火温度。

原始序列信息可在国家生物技术信息中心(NCBI)序列读取档案(RNA序列信息，SRA: SRP162120 BioProject ID PRJNA490770)中获得。开发的EST-SSR引物序列信息已存入GenBank(登录号见表)1.)．支持本文结论的其他数据集包含在文章及其附加文件中。

EST-SSR:

表达序列标签 - 简单序列重复标记

RNA-SEQ：

RNA序列

对剧中:

微卫星

HWE：

哈代-温伯格平衡

门店:

下一代测序

CTAB:

Cetyltriethylammnonium溴化

Na:

等位基因数量

何:

观察到的杂合子

他:

预期的杂合性

不适用。

基金资助:国家自然科学基金资助项目(NO。81603226);广东省科技计划项目(批准号:);2016 a020226029)。这些资助机构没有进行研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写。

作者指出

1. Zhi Chao和Enwei Tian同样贡献了这项工作。

隶属关系

1. 广州医科大学附属肿瘤医院暨研究所，广东广州510095

   钱谦刘

2. 南方医科大学中医学院，广东广州515005

   卢祖玉，何伟，李芳，李婵，超智，田恩伟

3. 河北工程大学景观与生态工程学院，邯郸056038

   18陈

贡献

QL、ZC和ET构思和设计了作品；QL、ZL、WH、WC、FL和CL进行实验；QL和ET分析了这些数据并撰写了这篇手稿。WC和ZC审阅了这份手稿。所有作者都阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到智曹国伟或田恩伟．

道德认可和参与同意

作者遵守了所有有关的机构、国家和国际准则。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。

出版商的注意事项

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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