高原出的开发温度对面包小麦（Triticum aestivum L.)籽粒灌浆早期的转录组

背景

高花后温度降低小麦和其他谷物的成熟粒重。然而，这种减少的原因还不完全清楚。以前曾有人提出，通过母系来源的果皮来控制籽粒膨胀，但这种相互作用尚未在高pa温度下进行研究。在高p.a.温度下，调控细胞壁膨胀的果皮定位基因的下调可能会由于果皮的可塑性丧失而限制被封装的胚乳的膨胀，从而降低成熟粒重。本研究通过RNA-Seq技术研究了高温对小麦籽粒灌浆早期果皮和胚乳转录组的影响，并结合籽粒发育早期水分动态和成熟粒重进行了讨论。

结果

开花期6天至18daa的高温处理降低了籽粒的水分积累能力，14daa以后籽粒总水分和籽粒含水率显著降低。在另一项试验中，从6daa开始施用相同的高pa温度4天或更长时间也显著降低了成熟粒重。将我们从全谷物中获得的RNA-Seq数据与从分离的果皮和胚乳组织中获得的现有数据集进行比较，可以识别出基因亚群，这些基因的表达受高p.a.温度的显著影响，主要在两种组织中表达。通过层次聚类和基因本体论分析，我们鉴定出了一些与细胞壁扩张调控有关的基因，这些基因主要在果皮中表达，在高温下显著下调，包括内切葡聚糖酶、木葡聚糖内转糖基酶和β-扩张蛋白。此外，研究人员还发现，在果皮中表达的“角质层发育”功能通路相关基因被过度表达，这些基因受到高温的影响。

结论

高p.a.温度诱导涉及调节Pericarp细胞壁膨胀的基因的下调。这伴随着在相同治疗期间的总籽粒水分含量和谷物重量的降低，增加了对高p.a的理论的支持。随着PericaRP细胞壁膨胀减少的结果，温度可能导致成熟粒重的降低。

全球平均气温上升0.35-0.7 据预测，到2035年，极端高温事件（如热浪和异常炎热的天气）的频率和严重性将增加，并将随之增加[1.].高温（> ~ 28–30 摄氏度[2.]），当经验丰富的开发后（p.a.）可以显着降低小麦的成熟粒重，因此降低产量[3.,4.,5.,6.]．

一些生理反应已被确定为小麦籽粒重量下降的原因，这些反应主要与源限制因素有关，如叶绿素含量降低[7.]减少根生物量[8.]减少光刺动员[9]．然而，也有人认为，暴露在高年息温度可能引起显影麦粒内细胞壁修饰影响谷物的水槽容量和千粒重有助于所观察到的减少[10.,11.]．

Cereal grain growth requires both the endosperm and the maternally derived tissue that surrounds it, i.e. the pericarp, to expand during grain filling, and it has been suggested that the pericarp may exert physical control over the size of the wheat grain endosperm by allowing or containing its expansion [10.,12.,13.]．反过来，这种现象将受到果皮细胞壁扩增的潜力和能力的管制。在小麦籽粒中具有高度同源性的基因转录物的表达模式，α-膨胀蛋白（ptaexpa6），似乎证实了这一假设:这些基因在胚乳中表达之前，在果皮中的表达在2-6daa左右达到顶峰[10.]果皮对粒径潜力所起作用的进一步证据是在双单倍体小麦作图群体中鉴定了果皮细胞长度增加的稳健QTL，与更长的籽粒和6.9%的粒重增加相关[13.]．在最佳的生长条件下（对于小麦12-21°C [14.,15.])籽粒膨大过程在果皮和胚乳之间高度协调[16.,17.]，然而，这两个组织之间的相互作用尚未深入研究在高P.A.温度。以前的研究调查了高温对母体组织的作用在预开花期都集中在高温，因此，它们对母体心皮的大小的影响。观察到高的温度以引起所述心皮的尺寸的减小与心皮尺寸预开花期和最终粒重之间的相关性也具有被报告[18]．在谷物中已经鉴定了许多细胞壁改性蛋白质，如早期籽粒发育期间谷物的不同组织的膨胀，包括膨胀蛋白（Exps）[10.]和木瓜葡聚糖内甘油糖苷酶/水解酶（xths）[19]．然而，这些蛋白在不同小麦粒层中在高温下的表达模式尚不清楚。来自全粒小麦的RNA-Seq和微阵列分析的全球转录组数据集[20.]及个别组织规模[21,22,23]现已公开提供。其中一项转录组学研究包括对高温下生长的谷物的分析，结果表明，温度升高导致转录组表达的正常趋势加快[20.]，这与在高温制度下观察到的晶粒发育的总体加速度一致。为了调查是否高p.a.温度通过引起果皮细胞壁的能力过早降低在相对于胚乳期间扩张的能力过早降低，分析高p.a的效果。需要对这些组织的转录组的温度是必需的。

在这项研究中，我们比较了从经历P.A的全谷物获得的RNA-SEQ数据。来自单个果皮和胚乳组织的现有序列数据的高温处理，目的是鉴定主要在这些组织中表达的基因，其表达模式受到温度的显着影响。此外，高p.a的效果。由于晶粒水分含量与转录物表达的变化之间的紧密关联，还研究了成熟粒重的温度，以及晶粒水分含量动态。20.]，以及在最大谷物含水量和最终谷物重量之间[24]．

进行了两个单独的试验，第一个试验（试验1）旨在确定特定参数，即温度和该温度的施加时间，该参数在所用特定小麦品种中诱导热应激反应，可测量为成熟粒重的减少。第二个试验（试验2）目的研究高温对籽粒水分动态及果皮和胚乳转录组学的影响。

成熟颗粒干重和谷物产量

平均成熟粒重主要分蘖是显著降低在实验1中,暴露于高p.a.温度治疗时间至少4天或更多的基于比较的显著差异(lsd)意味着对总体的意思是每个治疗(f = 3.54,方差分析,df = 6日P= < 0.05）。然而，对照治疗组和接受2天高p.a.温度的治疗组之间没有显著差异（图。1.）。

在整个工厂的基础上（见“附加文件1.”)各处理成熟期粒数无显著差异;然而，4 d以上的高磷高温处理一般显著降低了平均成熟粒重(方差分析，df = 6, f = 6.89，P= < 0.001)，则籽粒产量较低(但处理12 d时，籽粒产量差异无统计学意义)。

籽粒水分含量和干物质积累动力学

平均谷物含水率^.受到高p.a的显着影响。温度处理（ANOVA，DF = 1，F = 1048.70，P= <0.001）除了平均全谷物水分含量（ANOVA，DF = 1，F = 224.80，P在实验2中= <0.001），两者中DAA的显着相互作用效果（ANOVA，DF = 6，F = 65.53^1。34.82^2.P= <0.001）。平均粒度粒度含量（图。2.（a））和平均总含水量（图2.(b)从14daa开始，在高pa温度处理的谷物中，lsd显著降低。两种处理籽粒灌浆速率无显著差异，但灌浆时间较处理短(图2)。2.（C））。

小麦籽粒转录组学数据分析

RNA-SEQ统计数据

获得RNA-SEQ转录om，用于在6DAA（2次代表），10daa和14daa（3次）的全晶粒中分离的RNA进行对照，以及在10daa和14daa（每个3次）以进行高p.a。温度处理的样品。14个测序样本的RNA-SEQ统计数据显示在“附加文件”中2.“。最低匹配率是79.1％，平均匹配率是89.68％。

主成分分析（PCA）

对14个样本的RNA-Seq数据集进行主成分分析（PCA）。数据显示，相同发育阶段和治疗组的复制样本明显分组，表明治疗组内样本之间的基因表达相似（图。3.）。第一个原理组分（PC1）占样品之间基因表达的78％，主要是由发育阶段（随着PC1的降低增加）。第二个原理成分（PC2）捕获了第二个最大变化（高p.a.温度处理的效果），并占样品之间基因表达的总差异的9％。对照样品的点具有较低的PC1值，后来的DAA阶段，并且处理的样品具有比对照更低的PC1值，表明PC1主要反映晶粒发育，并且温度处理正在加速发育。

高温处理下籽粒各层相关基因的差异表达

从Pearce等分离的组织中晶粒现有RNA测序数据集的可用性。[23]（从果皮的内层和外层分离的RNA和12daa谷物的胚乳）和佩尔尼（在线发布：Arrayexpress-E-MTAB-8397）（从17daa谷物的纯淀粉胚乳中分离的RNA）允许确定主要在果皮或胚乳中表达的基因。这些基因的表达模式随后在本实验从全谷物获得的RNA-Seq数据中进行分析。在上述两项组织特异性研究中，实验材料在相似的环境条件下生长与我们的一样（例如~ 18 °C）和Pearce等人的研究[23[谷物的取样阶段(~12daa)与我们的全谷物RNAseq实验中使用的阶段相似。

果皮和胚乳RNA-Seq参考数据集差异基因表达的初步分析[23,Pellny，在线发布Arrayexpress - E-MTAB-8397]揭示了39823个deg。经过交叉比较和筛选，463个基因主要表达于果皮，542个基因主要表达于胚乳(见“附加文件”)3.和4.“）。

然后将这些组织特异性基因与对照和高p.a之间鉴定的含量列表进行比较。在此同一实验中，10和14dAA（4981和3652次Degs的温度处理。这使得两组中存在的基因的鉴定，因此可能在PericaRP或胚乳中主要表达，其表达受到高p.a的显着影响。温度在测量的发育阶段。确定为在被果皮主要表达的463度的视角的，166个基因差异治疗之间在10daa并表示92在14daa差异表达的，具有48个基因被在两个10daa和14daa治疗之间的差异表达。在胚乳中主要表达的542℃下，仅7个基因在10daa和39处的治疗中差异表达，在两个阶段的2个基因差异表达。

然后测定在10至14AA之间显着差异表达的两种组织之间的次数，具有显着的热处理相互作用。在10和14AA的样品之间的DEG分析对没有经过任何组织特异性过滤的RNA-SEQ数据，显示115℃，这也呈现了高p.a之间的显着差异表达。温度处理和对照样品。与组织特异性果皮和胚乳基因列表进行比较时，这些115℃的12个基因主要在Pericarp中表达（图。4.），并包括编码脂质转移蛋白（LTP）和过氧化物酶的基因，同时发现具有主要胚乳表达基因的列表并对应于种子型真空加工酶系列的成员的1匹配。

聚类分析

利用k-means聚类算法对463个果皮优势基因和542个胚乳优势基因进行聚类，以确定这些基因在不同发育时间点以及对照和高温处理之间表达模式的相似性。因此，根据k-means算法将果皮和胚乳优势DEGS分别划分为5个聚类(图4)。5.A和B分别）。

从果皮和胚乳优势基因列表中收集每个基因以及不同发育阶段和处理的每个样本的CPM值。然后对这些值进行对数转换。在每个样本中计算果皮和胚乳优势基因的五个簇中每个簇的对数CPM值的中值nd这个值，而不是平均值，被用作基因簇的度量，以避免极端表达值的巨大影响。

果皮和胚乳优势基因群的表达

测试假设，发展在PericaRP和Endosperm中的影响不同，高p.a.进一步分析了温度，基因表达簇在阶段之间显着变化的平均表达。在高p.a之间比较每个集群的中位数log-cpm值。使用双向Anova处理温度处理和10和14DAA的对照样品。唯一的Pericarp集群在控制和高p.a之间表达表达值的显着差异。温度处理的样品（双向ANOVA，F = 26.159，P= < 0.001) and between 10 and 14daa (2-way ANOVA, df = 1, f = 24.20P= < 0.001)为果皮聚类2，该聚类内的基因在较高的p.a.温度(10和14daa)下表达下调。然而，治疗和发育阶段对聚类内的基因表达没有显著的交互作用(p= > 0.05)。6.(a))。

相反，胚乳簇3中基因的表达，唯一在高p.a下显着上调了治疗和发育阶段之间表达值显着差异的群体。温度处理（双向ANOVA，DF = 1，F = 6.98，P => 0.001）和10和14daa（2-LAY ANOVA，DF = 1，F = 42.35，P => 0.001）。然而，如用Pericarp簇2所观察到的，观察到发育阶段与基因表达模式的治疗之间没有显着的相互作用（p => 0.05）（图。6.（b））。对于这两个集群，高p.a的效果。温度可以解释为加速发展，因为它增加了具有趋势上升趋势的PericaRP集群2的表达，并降低了具有下降趋势的胚乳集群3。

重要果皮和胚乳簇的基因本体论

聚类2的果皮基因在knnetminer软件中与用户指定的搜索词“细胞壁”进行交叉引用。在聚类的157个基因中，120个基因在knnetminer知识库中注册了相关性评分，值从0.05到544.88不等。相关性得分最高的10个基因(与搜索词关联最高)包括3个GLU2家族内葡聚糖酶编码，2个木葡聚糖内转葡糖苷酶，1个β-EXP编码基因和1个水通道蛋白(见表)1.）。通过术语“细胞壁”群体3.末端群体3中的56个胚乳主要基因的交叉引用，返回相关性43种基因;然而，值范围为0.12至39.22，表明与PericaRP簇2基因相比，与搜索项的胚乳簇3之间的关联强度较低。

对果皮聚类2和胚乳聚类3进行基因本体论术语富集，通过与现有参考基因组中所有可用的潜在基因进行比较，可以统计确定样本集中基因的过度代表性。然后分析将样本列表中的基因与go术语数据库进行比对，go术语数据库代表了植物发育中的一些生物过程。在果皮簇2中，基因过度表达程度最高的生物过程是“角质层发育”(GO id: 0042335)，而在胚乳簇3中，涉及“杀死其他生物细胞”(GO id: 0031640)的基因是最显著的过度表达基因。

先前提出并由其他群体调查了母体晶粒组织的小麦粒重潜力调节[10.,13.,18]，但据我们所知，这项工作是在高p.a.温度下探索这种相互作用的第一个例子。使用RNA序列分析和与现有数据集的交叉引用[23，Pellny在线发布我们能够更好地表征高温对主要在果皮或胚乳中表达的基因表达谱的影响，并将这些基因与特定的细胞机制联系起来。我们特别关注基因参与细胞壁重组,因为我们驾驶假说是高温,当经历过年利。,将不成比例地加速果皮组织的发展速度相比于胚乳,导致过早减少果皮细胞壁扩张的能力。这反过来又会限制胚乳的膨胀，从而限制颗粒的大小。

高p.a.温度暴露降低了Cadenza品种的成熟粒重

早期籽粒灌浆阶段（6daa-10daa）是先前研究的重点，研究了高温对小麦的影响，据报道，在这一发育阶段，高温会导致成熟粒重降低[25,26,27,28,29]．实验1的结果，在本研究中显示出高p.a.在籽粒发育的培养基阶段（6DAA左右）施加的温度施加4天或更长的小麦的成熟粒重，而2天高p.a。温度处理不足以产生显着差异。这与Talukder等人的结果相反。[29]谁观察到4个商业澳大利亚面包品种的成熟粒重减少，经过一天的高p.a。温度处理（35°C）在7到10DAA之间，并突出小麦品种对高p.a的响应的基因型变异性。温度。

试验1的结果也表明，在高磷处理的持续时间和成熟粒重的减少之间没有成比例的影响:处理4 d与处理6、8、10和12 d的成熟期粒重下降无显著差异。这一结果支持Stone等人的建议。30当pa出现短暂的高温时，小麦的产量潜力或多或少会有一定程度的下降。这个实验的结果也支持了Nuttall等人的发现。31研究发现，从2daa开始，在35/15°C的高温处理下，每天6小时累积暴露4天，单粒重减少15%简历。yipti.并且这种减少从这一点达到了此时，并进一步持续治疗。因此，4天高p.a.温度处理，无论是连续应用还是分开的日子，都代表超过对高p.a的敏感性的阈值。温度下降，并且可能表明高温处理可以触发对晶粒的水槽容量的施加结构限制。

虽然母系组织对种子大小和胚乳储存量的控制已经得到了很好的研究[17.,32]，到目前为止还没有实现这一点的机制。高p.a.在此讨论的实验中报告的温度处理，介绍，诱导了在调节或改性细胞壁膨胀中的已知作用的终止作用的显着下调。在实验1中证明导致成熟粒重的相同治疗持续时间之后，这些基因的下降调节在实验1中的成熟粒重减少，增加了高p.a的假设的进一步支持。温度会诱导对Pericarp的扩张能力的修饰，这可能限制胚乳细胞膨胀并呈现对最终晶粒尺寸和重量的控制度。

pa的高温降低了籽粒积累水分的能力

水分积累是胚乳细胞膨胀的主要驱动力，因此籽粒含水量与小麦籽粒的发育阶段密切相关[20.,33]．此外，小麦籽粒的最大水分含量已被报告为最大谷物体积的可靠指标[34因此，最终谷物重量的[35]我们的研究表明，高p.a.温度影响谷物中水分积累的可能性：与对照谷物相比，高p.a.温度处理谷物的最大谷物含水量显著降低，该最大值在14daa时提前4天达到。果皮退化（可检测为绿色度损失）已被发现以前的研究表明，在小麦籽粒中快速净水分积累终止之前发生[36]．此外，在胚乳细胞分裂的结束和净水累积的结束密切一致的基础上，PericaRP的退化假设与最大小麦籽粒水槽容量的成就有关的因果关系。37]．

在转录组水平，在同一时间间隔（6-14 daa），高p.a。在稳定最大含水量之前，温度诱导主要在果皮中表达并参与细胞壁膨胀的基因的下调。支持这种观察，Lizana等人。[10.在稳定籽粒水分含量之前，还报告了在扩展蛋白转录物的表达中进行了下调。我们的效果表明，在高p.a下Pericarp中的细胞壁可塑性过早损失。温度可以基于在暴露于高p.a的小麦粒中观察到的减少的体积容量。温度。

高温下果皮基因的表达

Altenbach和Kothari的研究[38]和wan等人。[20.[表明高p.a.温度加速小麦籽粒内基因表达的正常模式。在我们的研究中，从6DAA施用治疗的情况下，我们观察到高p.a之间的最大次数。在10daa的温度处理和对照样品，仅在4天的治疗后，而不是在14daa的后续时间点。同意与上述作者的调查结果一致，PCA表明高p.a.温度加速与显影​​相关的基因转录模式，其通过降低PC1值（降低PC1值=增加的发育阶段）来实现高p.a。温度处理的样品比对照样品。此外，PC2分离控制和高p.a.沿Y轴的温度处理样品，表明温度可以通过仅仅加速显影而影响基因表达。热应力响应。

在这些基因中，我们鉴定了12个主要的果皮表达基因，它们的表达在10和14daa之间存在显著差异，且与热处理存在显著互作。其中5个LTP基因在10daa显著下调，3个随后在14daa上调，2个在两个取样阶段保持相似的表达水平。LTPs是一组高度分化的小碱性蛋白，参与角质发育、细胞防御、细胞膜水渗透性和细胞壁延伸[39,40,41.]．

在我们的数据中，编码LTPs的5个基因中，有3个基因编码非特异性LTPs (nsLTP)，以及nsLTP家族的成员已被证明对一种或多种非生物应激源有响应(Liu等人综述[42.]），包括干旱[43.,44.,45.,46.]， 盐 [44.,45.，低温[45.,47.]和高温[45.]。之前已经证明，小麦中NSLTP的转录水平从12daa左右增加到谷物发育后期[48.]在高p.a下。温度（37/28°C）。同样在我们的研究中，NSLTPS编码基因在发育阶段之间显着差异表达，并显示出与温度的显着相互作用。我们观察到在高p.a下的10daa下的三个nsltps的下调。温度与在6DAA和10DAA下的这些基因的表达相比，在控制温度下，然后在14dAA下进行上调。我们建议这种表达模式可以反映NSLTPS的多种功能：这些基因可能在高p.a下调下调。10DAA的温度条件，反映了终止细胞壁延伸的一般减少，这与NSLTPS作为细胞壁增塑剂的作用一致[40]，在14daa响应于高温下被上调之前，可能以促进角质层开发为谷物的早期成熟应答的一部分。

过氧化物酶

另一个在10和14daa之间差异表达且与温度处理存在显著互作的基因是PER2/PER42，这是一个编码非指定的haemb III类过氧化物酶的基因，在14daa高温处理的样品中该基因被下调。III类过氧化物酶是分泌的糖蛋白，已知参与广泛的生理过程，包括调节细胞伸长和细胞壁修饰[49.,50.]。它们能够通过氧化芳香族细胞壁化合物（如木质素）形成强大的细胞内键来促进细胞壁的刚性，但它们也可以生成自由基氧物种（ROS），从而打破细胞壁聚合物中的共价键，如羟基自由基（OH°）[51.,52.]．因此，它们在植物细胞壁内进行双重功能，调节细胞壁加强和松弛。在小麦的籽粒灌装阶段报道了高温下的脂质过氧化，高温随着膜损伤的增加和降低抗氧化水平[53.]．在小麦中还有证据证明在高温下发生过氧化物酶的抗氧化酶的活性的下调[54.]并加剧ROS的积累。在我们的研究中观察到的Per2 / Per42基因的下调可以与热应激的ROS积累相关联，也可以作为原因或反应。

基因本体论和功能分析

Knetminer分析

使用施用到PericaRP簇2内的下调基因的搜索术语“细胞壁”的Knetminer WebTool分析鉴定了内切糖酶，木糖葡聚糖酶，Aquaporin和β-Exp。内切氨基酶是一组膜结合酶，其在其链中与连续（1,4）-β-糖基残留物的细胞壁多糖水解多糖，并且在发育过程中涉及植物细胞壁的崩溃[55.]．Korrigan（Kor）基因是内切葡聚糖酶的专用成员，已显示在扩张的细胞壁中表达拟南芥[56.]与KOR家族的一个成员KOR3基因有关，该基因与细胞壁生物合成有关[57.]．在我们的研究中，我们在高p.a下报告了在Pericarp中的三个Kor3基因的调节。温度，这表明在晶粒的外层中的细胞壁组件减少，因此在其膨胀电位中。

在Pericarp群集2基因中，Knetminer分析WebTool还确定了Xth家族的成员。在大麦的AWNS的干旱条件下，一些曲线已被证明是下调[58.]然而，到目前为止，还没有关于高温下小麦籽粒中XTH基因表达的研究报告。我们的数据表明，在10-14daa之间，对照和处理样品的果皮中XTH表达下调，但在高温下，这些基因表达的降低幅度更大，这也表明EST表明果皮内细胞壁的扩展能力降低。最后，Knetminer webtool在搜索术语“细胞壁”时也从果皮簇2基因中识别出了EXPB5。EXPB5编码一种β-EXP，属于一类细胞壁蛋白，以前已证明其在调节通过破坏纤维素微纤维和交联聚糖之间的氢键来重构细胞壁，从而允许细胞在膨压驱动下膨胀[59.,60.]．

据报道，来自小麦果皮RNA的α- EXP基因的表达在8-12daa之间达到峰值[61.]和在25daa之后迅速下降[10.]．虽然这些研究表明α-Exp基因在小麦籽粒发育的早期阶段的重要性，但在更先进的发展阶段，小麦粒子中β-Exps的功能和存在的信息较少。

α和βExps构成了exp基因的两个大家庭，而它们仅占20％的氨基酸同一性[60.，这两个家族的成员似乎使植物细胞壁中纤维素微纤维之间的非共价承重键不稳定[62.]．

Osexpb5是大米β-Exp家族的成员，已经显示出涉及根发生长[63.]．虽然存在与小麦籽粒细胞壁中EXPB5的特定作用有关的信息，但其在Pericarp群体2中的存在表明该簇的表达模式可以代表Pericarp在高p.a下的细胞壁中的变化。温度：10至14dAa之间的ExpB5的下调在高p.a。与未处理的样品相比，温度处理的样品，表明这些晶粒的终食细胞壁的刚性较高。

长期分析

Pericarp集群2的富集富集揭示了最重要的比赛是“角质层开发”（去ID：0042335）。该角质层主要作为涉及调节水分损失和保护植物器官免受污垢，细菌和其他微生物的渗透性屏障[64.]在开花的早期阶段，发育中的小麦粒含有大量的渗透性角质层或角质膜，但其中大部分通过酶降解逐渐去除[65.因此，在谷物的发育过程中，只有两层角质层存留到成熟:一层位于谷物的最外层，即外表皮，另一层位于珠心表皮的表面。

基因的下调包含果皮簇2内在高P.A. 10daa与对照相比，样品温度处理的样品指示高P.A.效果清晰对参与角质层开发的基因的表达的温度处理。以前的研究已经表明，小麦叶片及其具体蜡组合物的角质层是在不同的品种调节耐旱性[重要66.]．小麦籽粒的外表皮角质层从约7daa形成，并达到其最大厚度17daa [65.[之后它在结构上保持不变，直到成熟，除了覆盖到内角芯片。因此，由于角质层结束其显影，因此预期涉及形成角质层的形成的基因。我们观察到渗流器2群中包含的基因的下调，并以高于10daa的“角质层开发”中参与的基因的调节。温度处理的样品，支持在高p.a下Pericarp发育中的加速度的假设。温度。Given the cuticle’s important role in regulating moisture loss in plant tissues, increased expression of genes involved in cuticle development might be expected in order to reduce water losses at high temperature, but in fact the opposite was observed in the form of a more rapid decrease of these transcripts. Possibly this reflects importance of cuticular transpiration in cooling tissues to maintain function.

源自胚乳主要簇3中含有的基因的最重要的术语是“杀死其他生物的细胞”（去ID：0031640）。胚乳主要簇3中含有的基因在高p.a下经历了增加的上调增加。温度与对照样品相比。以前的研究表明，在对生物和非生物防御机制响应的防御相关基因中的大量功能重叠[67.]．此外，在Yu等人报告的来自中国面包小麦品种（Jimai 20）的转录组微阵列分析。[68.]，表明生物和非生物胁迫防御相关基因在灌浆期均上调，尤其是在11-15daa之间;我们的实验结果表明，在高温处理下，小麦的防御相关基因在10 ~ 14daa之间高度上调，这与上述研究结果一致。因此，在10 - 14daa之间，高的p.a.温度加速了果皮中角质层发育相关基因(下调)和胚乳中防御基因(上调)的表达谱。

本研究进行的RNA-Seq分析结果表明，主要在胚乳或果皮中表达的基因的表达谱加速。在果皮中，参与角质层形成的基因以及相关的脂质结合和运输基因的表达显著地受到高磷处理样品中暴露于高磷处理温度下的影响，在高磷处理温度下，这些基因的表达被加速下调。表明小麦籽粒外层角质层形成较早。胚乳中参与防御的基因的上调表明，在小麦籽粒发育过程中，响应非生物和生物胁迫的基因可能存在功能重叠，这种上调可能与细胞壁的结构变化相一致。果皮的下调,在公共广播温度高的基因内切葡聚糖酶等xyloglucanases EXP和过氧化物酶表明过早失去可塑性果皮细胞壁,配合粮食水分含量的减少,因此体积容量的胚乳。这些果皮的重合了监管主要基因和早些时候达到最大谷物含水率下高温p.a. p.a.温度高贷款支持的理论可能过早地减少塑性的外层颗粒导致物理限制胚乳的增长,since moisture content and final grain weight are closely associated. Further transcriptomic analyses from individual grain layers under high p.a. temperature treatment and investigation into the levels of important cellular substrates such as ROS will shed further light on the effect of high p.a. temperature on the regulation of grain development and grain layer expansion.

植物材料生长条件与试验

triticum aestivum cv。在实验1和实验2中使用了CADANSA；这些实验的种子是从两个实验中的CPB TwityFrand有限公司购买的，在两个实验中，分别在1.5的Royston中生长幼苗。 L装有~ 950 g标准土壤混合物（75%中粒泥炭、12%消毒壤土、3%中粒蛭石、10%砂和3.5% 千克Osmocote plus™ 每米^3.）在玻璃池中，额外的镜头照明设置为16-H Photopheriod（5.00-21.00），冠层接收〜450 / m2 / s的光合作用辐射（PAR）。在实验1和67％的实验2中使用的植物的植物的平均相对湿度（RH）为73％。

两个实验均使用了四个受控环境生长箱(Weiss Technik™HGC 1514)，其中两个箱用于高pa温度处理，两个箱用于对照处理。所有四个机柜的光周期为16小时(5.00-21.00)，夜间湿度为70%，温度为15°C。在高p.a.温度处理柜中，光照期间，RH设置为50%，温度在5.00-9.00之间由夜间温度在4小时内升高至35℃(每分钟升高0.083℃)。各光周期结束时温度均呈上升趋势，在19.00 ~ 21.00 h，温度由35°C下降至15°C(每分钟下降0.166°C);因此，高pa温度处理(35°C)每天施加10小时。两个控制柜的光周期相对湿度与高p.a温度处理柜相同，但光周期温度为18℃，昼夜之间无升温现象。两组橱柜在冠层提供的平均光量为~ 550 /m2/s PAR。

在试验1和试验2中，对高磷高温处理的植株进行不同大小的分组，分组由当天全部开花的植株组成。这些组群在每个实验的实验设计中扮演着块的角色(解释实验设计的图表作为“附加文件”提供5.“）。假体被定义为植物初级耕作耳的中间三分之一的时刻有花药突出。在实验1中，使用随机嵌段设计与8个植物组成的8个嵌段和7种。每个块的7个植物在玻璃室中生长，直到6daa，之后将它们转移到受控环境的生长柜中。从每个块的一个植物转移到两个控制处理柜中的一个，其中剩余的6个植物从每个块作为组转移到两个高p.a中的一个。温度处理柜。在高温处理柜中的这6个植物每次被随机分配2,4,6,8,10或12天的治疗持续时间。遵循指定的高p.a.温度处理持续时间，然后将每种植物转移到控制处理柜中，直至最大12天的高温处理在块内完成。然后整个块被返回到玻璃厅，并生长直至成熟。 Once they had reached maturity, grains were collected for yield data determination.

在实验2中，采用了随机区组设计，4个区组共包括14株植物，其中7株植物用于高温处理，7株作为对照。总共有5个处理。在转移至高温处理柜或对照处理柜之前，每个区块内的所有植物均在温室中生长至6daa。该群体中的植物此前被随机分配到每年7个采集点（4、6、10、14、18、22、26daa）中的一个。分配给4和6daa收集的植物在温室中进行取样，然后再进行高温处理，以便获得谷物水分含量的早期发育测量值。每株植物接受一次处理和一次采集，以消除累积采集的任何潜在影响。使用4个队列为每个处理和采集时间提供4个单独的植物复制品。从主分蘖穗中央八个小穗上的外部2小花（第2小花和第4小花）收集谷物，从而从每株植物总共收集16个谷物。本报告中包含的所有实验研究均符合机构、国家和国际准则。

成熟粒重分析

为了确定试验1中成熟粒的平均重量，对初生穗收集的粒数进行统计和称重。然后，总重量除以每棵种子的粒数，得到每粒种子的平均重量。

开发谷物平均干重和晶粒水分含量分析

试验2中每株各阶段采集的16个发育籽粒称重后，用液氮冷冻，转移到−80°C冰箱中。将冷冻后的籽粒冷冻干燥4天后再称重，以确定籽粒总干重。平均籽粒含水率、平均籽粒干重和平均籽粒百分含水率也计算如下:mc% = （（样品fwt–样品dwt）/fwt）*100，哪里样品FWT是一粒谷物的平均鲜重样品DWT是干燥后相同样品的平均粒重。

RNA提取

实验2中分别在6、10和14daa处采集的冻干材料，即分别经过0、4和8天温度处理的样品，提取总RNA。在6daa采集的谷物样品上进行了两次提取，在两个采集点(10和14daa)分别对两个处理(高温/对照)进行了3次提取，共进行了14次RNA提取。总RNA是通过苯酚/氯仿萃取从样品中提取的，Singh等人详细介绍了[69.]．使用Qiagen™RNAse free DNase kit(79254)，在RNA颗粒重悬之前进行RNA纯化和DNA去除。

CDNA文库制备

根据其质量控制管道的RNA测序，RNA样本被送到厄汉研究所（英国诺维奇，英国），在那里，他们接受了额外的测试。使用Agilent BioAnalyzer 2100™分析14个RNA样品的完整性，然后在读取度量在2×125bp（配对末端读数）的读取度量上，并且预期输出13-每个样本读数1600万。在将库汇集在一起​​之前，从最受影响的库中删除适配器二聚体。然后通过Q-PCR验证汇集文库的浓度，所述Q-PCR符合通过QUBit获得的浓度。因此，总共14个样品进行测序（2×6DAA，3×10DAA（对照），3×10DAA（处理），3×14DAA（对照），3×14DAA（处理）。

RNA测序数据分析

从谷物样品中读取RNA-SEQ读数映射到T.Aestivum.基因组使用厄厄姆研究所生产的TGACV1基因组装[70]．读取数据经历fastqc [71.和trimmomatic [72.]，为了使用用于映射Hisat2的对齐程序，在进行基因对齐之前去除适配器，[73.].RNA-Seq数据来自Pearce等人的现有研究[23]和Pellny（在线发布: Arrayexpress - E-MTAB-8397)，并上传到星系平台作为参考数据集进行比较。

在对RNA-Seq分析获得的reads进行绘图后，使用特征计数程序计算与基因组中每个基因唯一对齐的reads的数量[74.]在R数据分析包中[75.]．然后将数据标准化以考虑使用Edger Biocumons软件包的测序深度的变化[76.[每百万（log-cpm）的日志计数用作基因表达的量度[77.]．

使用RSTUDIO统计软件包进行RNA-SEQ样本之间的比较分析[75.]使用高级线性模型功能来鉴定不同发育阶段处理和控制样品之间差异表达的基因。使用0.05的错误发现率（FDR）进行所有差异基因表达分析。在三种采样的发育阶段鉴定了差异表达基因（DEGS）的数量，与使用成对比较的处理无关.编辑统计程序[76.].使用DESeq2 Bioconductor软件包进行PCA分析[78.]．

组织的具体表达式

为了确定特异于单个颗粒组织的基因表达，将从全晶体中提取的RNA收集的RNA-SEQ数据与相对于特异性晶粒组织的数据集进行比较。最初在Pearce等人上进行过滤。[23]通过选择在最高表达的组织中表达值高于百万分之五（CPM）且果皮和胚乳之间变化8倍的DEG来收集数据集。果皮主要DEG的列表还与Pellny在17daa收集的从解剖纯淀粉胚乳获得的RNA Seq数据进行比较(在线发布: Arrayexpress - E-MTAB-8397)，以确定在果皮中主要表达的基因均未在胚乳中表达。在淀粉胚乳数据表中，如果测定的表达量在8000万份中超过40个reads，那么被确定为来自果皮的DEGs被认为对果皮没有特异性，因此被丢弃。果皮优势基因DEGs列表中有175个基因符合这一阈值，果皮优势基因DEGs的数量从638个减少到463个。

为了可视化基因表达的模式，使用Z分数缩放和全局聚类产生相对表达热图，以便对具有相似表达曲线的基因（图。4.,5.,6.)。要通过“z分数”进行缩放，请计算样本中某个基因的读取计数的平均值，然后从该基因的每个样本分数中减去。然后计算标准偏差，然后再将每个数据点除以该标准偏差。

K-均值聚类分析

收集CPM值从RNA测序分析DEGS的果皮和胚乳主要列表中的每个基因在本实验中进行，并且对数转换。对于每个从果皮和胚乳两者五个簇的数CPM值的中值被在每个样品中，并计算此值作为量度的基因簇。

基因本体分析

使用Knetminer对每个簇内的基因进行功能分析™ 罗瑟斯特德研究所生物信息学系开发的web工具[79.]．使用BLAST2GO™进行丰富的富集[80还对鉴定的基因簇进行。在分析中，参考基因组用于该实验的RNA-SEQ分析（TGAC_V1。）[71.使用Fischer的确切测试将与确定的簇内的基因进行比较。

统计分析

粒重和水分含量统计分析使用Genstat™第17版进行[81.].通过方差分析对数据进行分析：为了分析受控环境材料，使用队列/柜/柜内队列位置/柜内罐位置/罐号的阻塞结构。基因簇平均CPM值的比较使用Microsoft Excel中的统计分析插件完成，并选择双向方差分析来比较治疗和发育阶段之间的簇。通过获得数据之间平均值的最小显著性差异（LSD）并将其与样本平均值进行比较，确定结果之间的显著性差异。如果比较样本平均值之间的差异大于平均值的LSD值，则表示存在显著差异(P= <0.05），反之亦然，样品之间的差异意味着低于装置的LSD值。

支持本文结论的数据集可在ArrayExpress存储库中使用（www.ebi.ac.uk arrayexpress）在以下加入号：实验数据 - E-MTAB-8520，Pellny Data - E-MTAB-8397，PELCE数据 - E-MTAB-3103。此外，支持本文结论的数据集包含在文章（及其附加文件）中。

CPM：

每百万计数

Daa:

几天后开花

度:

差异表达基因

EXPS：

扩张素

罗斯福:

错误发现率

log-cpm：

百万数量

LSD：

最低差异

LTP:

脂质转运蛋白

nsltps：

非特异性脂质转移蛋白

答：

后波瑟

PAR：

光合有效辐射

主成分分析:

主要成分分析

RH：

相对湿度

ROS:

自由基氧物种

xth：

木聚糖内转葡萄糖基酶/水解酶

作者希望感谢Ihsan Ullah博士的建议，并提取RNA提取。

RACM，TKP和AG由BBSRC为设计未来小麦研究所战略计划BB / P016855 / 1提供资金。

RK由雷丁大学SAPD的PT持有的BBSRC DTP拨款(编号1515391)资助。

隶属关系

1. 农业政策与发展学院，阅读，白奈格特大学，邮政信箱237，阅读，RG6 6AR，英国

   理查德·基诺和保拉·托西

2. Rothamsted Research, West Common, Harpenden，赫特福德郡，AL5 2JQ，英国

   直到K. Pellny，Rowan A. C. Mitchell＆Asier Gonzalez-Uriarte

3. 当前的隶属度：欧洲生物信息学院，惠康基因组校园，剑桥，英国CB10 1SD

   Asier Gonzalez-Uriarte

贡献

RIK种植实验材料，提取RNA，分析和解释转录组分析结果，并撰写手稿。PT负责工作构思，为实验设计和从谷物样品中提取RNA提供建议。PT还参与组织和编辑ng提交的手稿。RM参与了论文的构思，为实验设计、RNA序列数据的分析和解释以及提交的手稿的编辑提供了建议。AG-U为转录组分析的处理提供了建议，并编写了用于原始转录组分析的R代码数据。AG-U还就DEG分析的解释提供了后续建议。TP提供了RNA提取方面的培训，并就提取RNA的质量和数据分析的潜在影响提供了建议。所有作者都已阅读并批准了提交的手稿。

通讯作者

对应于帕乌拉托西.

道德认可和参与同意

N / A.

同意出版

N / A.

竞争利益

提交人声明他们没有竞争利益。

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