植物中的精确基因组编辑:基于CRISPR/ cas9的基因组工程的最新进展

传统上，培育具有改良或理想特性的新植物依赖于费力而耗时的育种技术。基因组编辑技术引领了基因组工程的新时代，使植物基因组的有效、精确、快速工程成为可能。聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)是一种新的基因组编辑工具，广泛应用于包括植物在内的各种生物。使用CRISPR/Cas9可以在短时间内产生无转基因的基因组编辑植物(“零分离”)。在这篇综述中，我们对CRISPR/Cas9衍生技术在基因组靶位点诱导突变和控制靶基因表达方面的最新进展进行了综述。我们强调了CRISPR/Cas9应用于植物工程的重大突破，以及零分离生产的挑战。我们还提供了工程Cas9蛋白，新发现的Cas9变体以及用于植物的新型CRISPR/Cas系统的最新进展。CRISPR/Cas9及其相关技术在植物工程中的应用，不仅有利于作物的分子育种，也将加快基础研究的进展。

性状改良植物的生产推动了当前农业和各行业对植物资源的依赖。传统上，植物育种是通过杂交和选择来完成的。然而，传统的育种方法是劳动和时间密集型的。基因组编辑允许靶向和修改特定的DNA序列[1，2，3.，4]。一般来说，使用基因组编辑技术在目标DNA序列中引入突变涉及三个常见步骤。首先，由识别模块和核酸酶结构域组成的外源性工程核酸酶识别目标DNA序列。然后，工程核酸酶与目标DNA序列结合，并在目标位点或附近诱导双链断裂(DSBs)。内源性非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)途径随后修复DSB。虽然NHEJ是一个容易出错的修复过程，并且经常导致引入突变，例如小的插入和删除(Indel)，但HDR导致dsb的精确修复[1，2]。这些技术已成功地应用于各种生物，包括植物[1，2，3.]。

有三种技术已经发展成为主要的基因组编辑技术[1，2，3.]。锌指核酸酶(ZFN)是一种工程核酸酶。其次，转录激活物样效应核酸酶(TALEN)作为一种更灵活的工程核酸酶出现。最后，集群规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9核酸酶(Cas9)作为一种更简单、更灵活的工程核酸酶被开发出来。ZFNs和TALENs由序列特异性DNA结合模块和FokI核酸酶结构域组成。FokI核酸酶结构域需要二聚化才能成为活性核酸酶。因此，需要设计两个模块来靶向紧密间隔的DNA序列，允许FokI在目标DNA序列上二聚化。这种二聚化的要求使zfn和TALENs具有特异性。但事实上，设计活性核酸酶既昂贵又困难[1，3.]。相比之下，CRISPR/Cas9系统价格低廉，且实验设计简单[1，2，3.]。CRISPR/Cas9系统于2012年作为基因组编辑工具出现[4，5，6]。CRISPR/Cas9系统的简单、易用和高效使其发展成为应用最广泛的基因组编辑工具。

CRISPR/Cas9系统有两个主要组成部分:Cas9蛋白和引导RNA (gRNA)。Cas9蛋白是一种依赖rna的DNA内切酶，与gRNA形成复合物。gRNA是一种小RNA，含有与靶序列互补的20 nt核苷酸，是将Cas9蛋白募集到靶位点所必需的。这是CRISPR/Cas9与其他基因组编辑技术的主要区别，即它依靠DNA- rna相互作用，而不是DNA-蛋白质相互作用来识别目标DNA序列。对于通过dna -蛋白相互作用靶向特定序列的ZFNs和TALENs，每个靶点需要设计和表达两个不同的dna结合结构域(TALEN为500-700个氨基酸)。这个过程相当费力。另一方面，使用DNA-RNA相互作用的CRISPR/Cas9，只需要设计一个18 - 20bp的寡核苷酸就可以了。这使得使CRISPR/Cas9系统适应基因组编辑应用变得非常容易。为了发挥基因组编辑工具的作用，Cas9和gRNA必须结合特定的原间隔器邻近基序(protospacer邻基序，PAM)序列，这是一个位于目标序列3 '端的短核苷酸序列。在…的情况下酿脓链球菌Cas9 (SpCas9)是最常用于基因组编辑的Cas9，其序列5 ' -NGG-3 '被认为是PAM。除非另有说明，本综述中的基因组编辑实验都是使用SpCas9完成的。

Cas9的募集通常会导致基因组中靶位点的dsb，但有时也会诱导意想不到的变化(脱靶效应)。CRISPR/Cas9系统是为精确的基因组编辑而开发的，通过增强特异性或避免DSB，对基因组的影响最小[2，3.]。此外，当所需的突变株被培育出来时，外源转基因的去除已经被仔细评估[3.]。

本文综述了近年来利用CRISPR/Cas9靶向操纵植物基因组的方法，重点介绍了在没有转基因的情况下也能导致遗传基因组修饰的方法和生产无转基因植物(零分离)的方法，讨论了它们的优点和缺点，以及进一步发展的领域。我们还介绍了新开发和发现的CRISPR/Cas系统在不久的将来作为植物基因组工程的有前途的工具。

CRISPR/Cas9系统已成功应用于多种植物。这些不仅包括模式植物，如拟南芥，也有农作物，如水稻、烟草、高粱、小麦、玉米、大豆、西红柿、土豆、杨树、苹果和香蕉[1，3.]。愈伤组织、叶盘、原生质体和花已被用作植物材料。应用的目的包括增强非生物或生物抗逆性，工程代谢途径和提高粮食产量。引入的突变被下一代植物遗传，这表明植物基因组编辑可以用于植物研究和有用植物的生产。

使用CRISPR/Cas9系统的一个重要优势是可以同时编辑多个靶基因[7，8，9]。例如Zsögön等，[7在两步实验方法中瞄准了6个基因，并诱导了4个基因的突变。通过应用第二轮基因组编辑实验，实现了6个基因的同时基因组编辑。这项研究的重要意义还在于，他们通过定位6个关键驯化性状的重要位点，实现了野生番茄的从头驯化。这些结果表明，利用CRISPR/Cas9进行多重基因组编辑可以在短时间内模拟进化过程中的驯化过程，这意味着可以快速方便地产生具有理想性状的新植物。同时靶向多个位点也可以诱导靶位点之间具有确定大小的缺失[8，9]，这将有助于破坏调控序列和产生敲除突变体，这些突变体的基因功能不是因框外突变而中断，而是因某一区域的缺失而中断。

利用CRISPR/Cas9进行基因靶向(GT)是另一种精确设计植物基因组的方法。植物细胞可以通过HDR途径进行GT，但HDR效率远低于NHEJ。为了提高植物的GT效率，已经开发了几种方法，例如抑制NHEJ途径[10，11]，利用病毒复制子扩增供体dna [12]，并使用鸡蛋特异性启动子驱动Cas9表达[13]。最近，Miki等人。[13的顺序转换拟南芥以提高GT效率。作者首先生成了表达Cas9基因受卵细胞和早期胚胎特异性控制DD45启动子的拟南芥。然后，他们通过花浸法将供体DNA片段和gRNA表达载体引入到表现出高基因组编辑活性的亲本植物中。通过这种方式，作者以5-10%的效率实现了遗传基因靶向(根据T₂拟南芥人口调查)。然而，需要进一步提高GT效率，以提高可预测和精确的基因组编辑的效率。

尽管使用CRISPR/Cas9有各种各样的好处，但一个重要的相关问题是脱靶效应，即基因组编辑在意外位点诱导的意外突变。在体外和体内已经发展了几种检测脱靶突变的方法。这些包括SITE-seq [14]，双基因组测序[15]， CIRCLE-seq [16]， GUIDE-seq [17]和DISCOVER-seq [18]。与此同时，Cas9蛋白的工程化也被用于增强特异性。细节将在以后讨论。另一方面，迄今为止尚未解决的新型突变最近被报道出来。Kosicki等。[19观察到由于基于cas9的基因组编辑在哺乳动物细胞中引发了意想不到的大缺失(高达9.5 kb)。虽然这种意想不到的大缺失尚未在植物中报道，但应该考虑到它们发生的可能性。

dsb是基因组编辑中的关键事件，但它们具有基因组不稳定和DNA修复结果不可预测的风险。因此，已经探索了在不诱导dsb的情况下改变目标DNA或基因表达的方法。这些方法中的关键蛋白是一种催化死亡的Cas9变体(dCas9)，它可以结合到目标序列上，但不会切割双链DNA。dCas9蛋白与另一种效应蛋白融合，这种效应蛋白在不切割双链DNA的情况下修饰基因组或表观基因组[2，20.，21]。最近，在酵母和哺乳动物细胞中报道了另一种称为“初始编辑”的新方法[22]。引体编辑也可以在没有DSB诱导的情况下改变DNA信息。我们将在下一节中简要介绍这项技术。

使用dCas9融合DNA脱氨酶进行碱基编辑

与DNA脱氨酶融合的dCas9蛋白已被开发为碱基编辑器，可以在不诱导dsb的情况下改变目标DNA序列[23，24，25，26]。结合胞苷脱氨酶的DNA碱基编辑器;Target-AID和BE)已开发用于从C到T的核苷酸转化，基于腺嘌呤脱氨酶的DNA编辑器(ABE)已开发用于A到G的转化。这两种类型的碱基编辑器都已成功地用于植物基因组的碱基编辑[3.，27，28]。

Target-AID利用PmCDA(一种来自激活诱导胞苷脱氨酶(AID)家族的蛋白质)与dCas9或Cas9n (D10A)缺失酶融合进行碱基编辑[24]。相比之下，BE1、BE2、BE3和BE4系列利用大鼠胞苷脱氨酶rAPOBEC与dCas9或Cas9n (D10A)融合[23，26]。CBE催化胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶。然后，尿嘧啶通过DNA复制或修复过程转化为胸腺嘧啶，导致从C到t的靶向转化。CBEs在植物基因组工程中的应用已报道拟南芥大米、小麦、玉米和番茄[26]。另一方面，ABE利用由tRNA腺嘌呤脱氨酶定向进化产生的腺嘌呤DNA脱氨酶大肠杆菌恩(25]。ABE催化腺苷的脱胺。在新合成的DNA链中加入G后，产生的肌苷可以与胞苷形成碱基对。ABE在植物基因组工程中的应用已被报道拟南芥，芸苔属植物显著，大米和小麦[26]。

作为碱基编辑技术在植物中的应用实例，Zhang等，[27]已经开发了一种共同编辑策略，可以在没有外源选择标记的情况下生产碱基编辑的植物(图2)。1a).他们发现，在基因组编辑的小麦中，小麦乙酰乳酸合成酶(ALS) Pro-174密码子的突变赋予了抗尼科磺隆除草剂的能力，尽管基因组编辑的小麦在抗尼科磺隆方面表现出差异。这种可变性是由于产生的基因型的多样性，这是由于在典型的碱基编辑窗口内(在原间隔区第3位和第9位之间)存在几个碱基可编辑序列和碱基编辑窗口外的意外突变所导致的[27]。此外，肌萎缩性侧索硬化症gRNA可以靶向小麦所有三个亚基因组的基因内等位基因，扩大了基因型变异的可能性[27]。它们瞬间共表达gRNA靶向塔阿尔基因和gRNA靶向小麦中感兴趣的基因，并通过耐硝磺隆选择基因组编辑植株。在协同编辑乙酰辅酶A羧化酶的情况下(ACCase)基因中，22-78%的抗硝磺隆植物携带突变ACCase基因，导致基因组编辑的植物与没有nico磺隆选择相比富集9-31倍。此外，33-78%的抗硝磺隆植物在T₀一代(27]。这些结果表明，尽管在抗尼科磺隆方面存在差异，但这种共同编辑策略可能对生产无转基因碱基编辑植物有用。然而，需要进一步的实验例子来证明共同编辑策略的效用。

另一方面，近年来人们对碱基编辑的脱靶效应提出了一个重要的问题。事实上，在某些情况下，与使用特定的BE和ABE编辑器有关的多种脱靶突变已在植物中得到证实[28]和哺乳动物模型[29，30.，31]。已经尝试在人类细胞中减少脱靶效应[29]，通过使用抑制rna编辑活性和增加DNA靶上活性的工程碱基编辑器。CBE和ABE碱基编辑系统在植物中的改进需要进一步的验证。

利用dCas9进行靶向表观遗传修饰

表观遗传修饰如DNA甲基化和组蛋白修饰影响基因表达。植物表观遗传状态跨代遗传的几个例子已被报道[32]。因此，有针对性的表观遗传修饰可以作为一种策略，即使没有转基因，也可以引起可维持的遗传变化。

与表观遗传修饰子融合的dCas9蛋白已被开发为引入靶向表观遗传修饰的工具，以改变亲本和子代植物中的基因表达[20.]。作为一个例子，gallego - bartolom等人。[33]利用dCas9在植物中引入可遗传的靶向DNA去甲基化/甲基化(图2)。1b).作者使用SunTag系统，DNA去甲基化酶TET1cd和CRISPR/dCas9 (dCas9-SunTag- tet1)的组合来上调开花瓦赫宁根（澳洲公平工作委员会)基因，该基因的激活导致晚花表型拟南芥。dCas9- suntag - tet1系统由融合GCN肽重复序列的dCas9和融合识别GCN肽单链抗体的TET1cd组成。单链抗体与GCN肽结合导致TET1cd的局部积累，导致靶向DNA去甲基化。它们实现了去甲基化澳洲公平工作委员会基因启动子区与激活澳洲公平工作委员会基因的表达。表观遗传编辑后的植株表现出晚开花表型。即使没有转基因，修饰后的表观遗传状态和晚花表型也能稳定地遗传给下一代。

靶向表观遗传修饰可以在不改变DNA序列的情况下改变基因的表达。然而，在不进行转基因的情况下，能否在下一代中保持表观遗传状态尚不清楚。实际上gallego - bartolomorel等人[33也针对另一种基因，CACTA1基因，但甲基化状态恢复转基因分离后，在下一代。虽然推测不完全去甲基化吸引了rna导向的DNA甲基化机制，但为了进一步在植物中的应用，需要明确可遗传表观遗传修饰的必要条件。

'编辑

最近，Anzalone等人[22已经在酵母和哺乳动物细胞中开发了一种新的基因组编辑技术“引体编辑”。他们在不诱导dsb或不需要供体DNA模板的情况下实现了精确的基因组编辑，这是通过HDR进行基因组编辑所必需的。引物编辑使用Cas9缺口酶融合到逆转录酶和工程gRNA(一种引物编辑指导RNA, pegRNA)，其由引物结合位点(PBS)、所需编辑序列和识别目标DNA的序列组成。Cas9刻痕酶被pegRNA招募到目标DNA序列，然后刻痕含有pam的DNA链。缺口DNA链的3 '端与pegRNA的PBS杂交，通过与Cas9缺口酶融合的逆转录酶在pegRNA上引发所需编辑序列的逆转录。目标DNA与逆转录产物杂交产生带有编辑序列的3 '瓣或带有未编辑序列的5 '瓣。5 '瓣被内切酶优先切割，3 '瓣被连接到DNA链上。异双工DNA通过内源性DNA修复过程修复，从而将编辑的序列稳定地整合到基因组中。引体编辑已经高效、精确地实现了靶向插入(最多44 bp)、缺失(最多80 bp)和所有类型的点突变。基因组编辑需要额外的两步杂交(目标DNA-pegRNA PBS和目标dna -反向转录产物)，导致脱靶编辑比Cas9低得多，Cas9只需要目标dna - grna杂交。 No requirement for DSBs prevented the production of unintended mutations compared to Cas9-initiated HDR. In addition, prime editing has demonstrated more advantages than base editing in cases where multiple cytosines or adenines were present in a base editing window, and bystander edits were unacceptable, because prime editing enabled precise single-nucleotide replacement. The target scope is also expanded in prime editing because, unlike base editing, it is not limited by the need for a PAM sequence at a suitable distance from the target nucleotides. Although prime editing offers advantages compared to other genome editing technologies, it has not yet been applied to plant cells. Prime editing would be a promising technology for plant genome engineering, especially because prime editing can achieve efficient knock-in of DNA fragments in plant cells. Generally, HDR efficiency is low in plant cells, so knock-ins of DNA fragments to target sites is difficult. However, prime editing offers a new strategy for knock-in of DNA fragments via an HDR-independent pathway. It will be interesting to determine if prime editing functions in plant cells as well as in mammalian cells.

随着CRISPR/ cas9介导的植物基因组编辑取得革命性进展，研究人员一直致力于开发有效的方法来建立无转基因的基因组编辑植物。消除转基因有助于实现精确的基因组编辑，在这种编辑中，基因组中不存在不必要的变化。消除Cas9来自基因组编辑植物的基因也可以防止在非靶向位点诱导突变。正如后面提到的，迄今为止已经开发了几种工具和方法来减少脱靶效应，尽管脱靶位点的意外突变也可以通过在植物的连续几代杂交来消除。消除转基因还将减轻人们对基因组编辑植物的担忧。实现这一目的的方法之一是使突变植株在没有选择压力的情况下再生。然而，这种方法是非常费力和耗时的，因为获得无转基因突变植物的效率非常低[34]。因此，已经开发了几种替代方法。表中总结了产生零分离的代表性方法1和无花果。2模拟。这些技术包括孟德尔分离、转基因植物的程序化自我消除、CRISPR/Cas9的瞬时表达和核糖核蛋白(RNP)介导的基因组编辑。下面将详细描述它们。

孟德尔分离

获得无转基因植株最常用的方法是通过孟德尔分离分离零分离(图2)。2a).这种方法通常涉及将CRISPR/Cas9磁带作为DNA引入，并根据抗生素抗性选择转基因植物。在基因组编辑的植物被鉴定后，植物生长，直到获得基因组编辑的植物的后代。在后代中，当再生植株不具有嵌合性时，转基因根据孟德尔分离定律进行分离。因此，有可能获得转基因分离的基因组编辑植物。虽然基因组编辑植物的筛选通常是通过PCR进行的，但已经开发了新的方法来促进零分离的分离[34，35]。例如，Gao等人。[34]通过表达mCherry从CRISPR/Cas9载体中提取基因。在荧光显微镜下对不发出mCherry信号的种子进行视觉筛选，可以快速分离出mCherryCas9无拟南芥T间突变体₂种子。这种方法是有效的，但仍然费力且耗时。

转基因植物的程序化自我消除

为了减少选择零分离子代的时间和成本，采用了程序自消法。他等人。36]利用了两个自杀基因(BARNASE和CMS)用于水稻中零分离的富集和分离(图2)。2b). BARNASE是一种毒性核酸酶，而CMS是水稻雄性配子体特异性致死蛋白。作者将BARNASE受早期胚胎特异性启动子(REG2发起人)及CMS在基因的控制下35个年代发起人Cas9表达载体，预期转基因植物携带Cas9基因和两个自杀基因将在一代之内被消灭。通过应用这一策略，作者成功地富集和分离了T1代的零分离。然而，这种策略只能用于能够通过组织培养转化再生，并通过种子繁殖的植物。换句话说，它不能应用于无性繁殖的植物。

从DNA或mRNA中瞬时表达CRISPR/Cas9

另一种获得零分离的方法是在转化过程中避免转基因插入。这可以通过瞬时表达CRISPR/Cas9 DNA或mRNA来实现。2c). Anderson等人。[37]从马铃薯中分离和转化原生质体，Lin等。[38]从九种植物中分离和转化原生质体(Bambusa oldhamii，Setaria italica，栽培稻，玉米，拟南芥，芸苔属植物oleracea，芸苔属植物显著，烟草,茄属植物lycopersicum）.在这两项研究中，通过PEG处理将原生质体转化为CRISPR/Cas9载体，成功实现了诱变。在10%的分析马铃薯品系中检测到载体序列[37和17.2%的基因组编辑n .烟草行(38]。然而，使用原生质体的缺点是，已经建立了植物再生方案的植物物种数量有限。作为一种选择，农杆菌属的瞬时表达Cas9基因已应用于烟草叶盘[39]。随后的分析显示，17.2%的基因组编辑植物是零分离。总之，这些研究表明，瞬时表达系统可以用于零分离的产生和分离，尽管它仍然存在转基因整合到宿主基因组中的风险。因此，仍然需要一种有效、简便的筛选系统来分离零分离。

Zhang等。[40比较了两种策略，瞬态表达的Cas9的体外转录本(IVT)的瞬时表达Cas9-编码序列在小麦愈伤组织细胞中的表达。作者使用六倍体面包小麦(小麦)和四倍体硬粒小麦(t . turgiduml . var。硬质)愈伤组织为植物材料，采用粒子轰击法转化。他们成功地在第0代六倍体面包小麦中引入了所有六个等位基因的突变。在43.8 ~ 86.6%的T0突变体中没有检测到转基因。相比之下，通过IVT方法获得的T0突变体中未检测到转基因。综上所述，瞬时CRISPR/Cas9表达式是在T0代中建立零隔离的一种很有前途的策略。

rnp介导的基因组编辑

无dna基因组编辑是无需转基因整合的植物基因组工程的另一种有前途的方法(图2)。2d).在没有供体DNA模板的情况下，可以使用由Cas9蛋白和gRNA组成的核糖核蛋白(RNP)进行靶向诱变。RNP可以在离体中形成并转移到植物原生质体中。由于RNP不包含任何DNA，因此可以避免转基因整合。Woo等。[41]是第一个证明预组装的Cas9-gRNA RNP复合物可以直接传递到植物原生质体的拟南芥烟草、生菜和大米。作者成功获得了基因组编辑植物，效率为8.4 - 44%，并且突变稳定地保持并遗传给后代。事实上，在一些研究中，原生质体已被用作引入RNP复合物的植物材料[42，43，44，45]。rnp介导的基因组编辑在葡萄和苹果原生质体中的成功应用已有报道[42]，小麦[44]，以及卷心菜和大白菜[45]。作为一种替代方法，利用生物学方法转化未成熟胚胎已用于玉米[46]和小麦[44]。在玉米中，Svitashev等人。[46]报道，当使用选择标记时，基因组编辑的效率为47%，而未使用选择标记时为2.4-9.7%。在小麦中，Liang等。[44]产生突变体的效率为4.4%。重要的是，与CRISPR/Cas9 DNA基因组编辑相比，这两项研究都证明了脱靶突变的显著减少。另一个例子是，最近，Toda等人[47]报道了一种基因组编辑系统的开发，该系统将Cas9-gRNA RNP直接传递到水稻体外受精受精卵中。在不选择的情况下，基因组编辑效率达到4-64%。此外，Kim等人[48]证明纯化的Cas12a和gRNA也可以用于诱导大豆和野生烟草的突变。

总的来说，这些观察结果表明，使用RNP复合体可能成为植物基因组编辑的一种重要策略，不需要转基因整合，也减少了脱靶效应。研究结果还表明，Cas9同源物和变体(见下文)可以作为RNP用于植物基因组编辑，扩大了植物基因组工程的可能性。

CRISPR/Cas9系统的适用性受限于PAM序列的特异性和脱靶效应的存在。SpCas9-gRNA复合体通常识别PAM序列上游20 nt的区域(5 ' -NGG-3 ')。这意味着不含NGG的序列不能作为目标序列。因此，人们采用了几种方法来扩大PAM的相容性并提高特异性。这些包括合理的SpCas9工程、Cas9同源物的鉴定和表征以及来自其他来源的新的CRISPR/Cas系统。

SpCas9蛋白目前被广泛用于扩大PAM相容性或增强PAM特异性，同时减少脱靶效应[49)(表2）.基于Cas9的晶体结构，利用gRNA和靶DNA对SpCas9蛋白进行合理的工程修饰，产生了具有不同PAM偏好的工程Cas9蛋白。kelinstver等。[58]分别报道了用NGA-PAM、NGAG-PAM和NGCG-PAM生成SpCas9-VQR、SpCas9-EQR和SpCas9-VRER。SpCas9-VQR, SpCas9-EQR和SpCas9-VRER也在拟南芥但与野生型SpCas9相比活性不高[59，60，62]。Nishimasu等。[63]开发了SpCas9- ng，这是一种增强兼容性的SpCas9，可以识别NG-PAM。SpCas9-NG已经应用于植物基因组编辑，用于水稻和大豆的靶向诱变拟南芥植物(64，65，66，67，68]。相反，特异性增强的SpCas9蛋白(SpCas9- hf1 [70]， eSpCas9 [72]及HypaCas9 [73])也得到了发展。SpCas9-HF1和eSpCas9已经在水稻中进行了测试[71]。SpCas9-HF和eSpCas9的脱靶编辑活性降低，表明在植物细胞中具有高特异性。最后，定向进化方法已被用于Cas9工程，从而产生了具有高特异性的工程SpCas9蛋白(xCas9 [76]， evoCas9 [74]和Sniper-Cas9 [75])。在xCas9中也检测到了扩展的PAM首选项(NG、GAA和GAT-PAM)。xCas9已经在拟南芥而大米[65，66，67，68，77，78]。xCas9和Cas9-NG都能诱导植物中一些非规范PAMs发生突变。然而，它们在植物细胞中的效率和特异性似乎有所不同。尽管Hua等人，[67报道了xCas9可以在水稻中有效地发挥作用，其他研究[65，68，78]报道xCas9在水稻愈伤组织中的活性远低于在哺乳动物细胞中的活性[78]，不能识别番茄中的NG PAM [68]。钟等，[65]也报道了xCas9在水稻NGG PAM中表现出与Cas9-WT相当的活性，并且比Cas9-WT具有更高的特异性，但xCas9在水稻NGH (A, T, C) PAM中的活性不高。另一方面，Cas9-NG在水稻中几乎所有NG PAM位点的活性都高于xCas9 [65]。Hua等。[67]也表明Cas9-NG在几个NG PAM位点(CGG、AGC、TGA、CGT)上具有强大的编辑活性。这些研究表明Cas9-NG更适合在植物的NG PAM位点进行基因组编辑。xCas9在植物细胞中作为高度特异性的SpCas9使用效果更好。Cas9变体的碱基编辑也已经完成。SpCas9-NG和SpCas9-VQR已成功应用于植物碱基编辑[53，61，64，65，67，69]。

在其他细菌中也发现了具有不同PAM偏好的Cas9同源物[78]，例如NmCas9 from脑膜炎奈瑟氏菌(50]，从金黄色葡萄球菌(54]， StCas9 from乳酸链球菌(51]， FnCas9 from弗朗西斯氏菌属novicida(56]和CjCas9 from空肠弯曲杆菌(55］。编码这些蛋白质的基因比SpCas9,这是通过病毒载体传递基因的一个优势。FnCas9、StCas9和SaCas9已经被应用于基因组编辑拟南芥烟草[52，57，79]。有趣的是，Steinert等人。[52研究表明，SaCas9和SpCas9系统不会相互干扰拟南芥。通过Cas9同源物的同时靶向，可以同时靶向具有不同PAM序列的位点，从而实现多重基因组工程，扩大CRISPR/Cas系统的适用性。这些Cas9同源基因可用于迄今为止涉及SpCas9的基因组编辑应用。例如，SaCas9与碱基编辑器融合，成功用于水稻的碱基编辑[53]。

最后，最近发现了可能应用于植物基因组编辑的新型Cas蛋白。例如，Cas13 (C2c2)蛋白属于识别RNA序列并表现出RNA基因组编辑活性的VI型CRISPR/Cas系统[80，81]。由于RNA编辑可以在不改变基因组序列的情况下修饰RNA序列，因此RNA编辑是一种有前途的植物性状修饰策略。CRISPR/Cas13系统已成功应用于水稻和水稻中内源基因的靶向敲除烟草benthamiana(80，82]。Aman等。[82使用CRISPR/Cas13系统设计干扰RNA病毒拟南芥这表明该系统可用于设计RNA引导的植物对RNA病毒的免疫。另一个例子，Yan等人，[83]表明V型CRISPR/Cas系统(Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i)的功能多样性。它们的功能范围从dsDNA的剪切和裂解活性到ssRNA和ssDNA的侧切活性，这表明未被发现的具有多种功能的Cas蛋白在自然界中仍然存在。此外，新型的CRISPR/Cas系统也从未培养的微生物中分离出来[84]。例如，CRISPR/Cas14系统被归类为V型CRISPR/Cas系统，它可以靶向和切割不含PAM序列的ssDNA [85]。CasX和CasY(分别被分类为Cas12e和Cas12d)具有独特的结构，不同于已知的Cas蛋白，CasX在基因组编辑中的活性已被证实大肠杆菌而人类细胞[86]。基于其体积小、结构独特和DNA切割机制独特，CasX有望提供相对于其他基因组编辑技术的优势。最后是Cas3，一种来自Thermobifida fusca(87),大肠杆菌(88I-E型CRISPR/Cas系统，在人类细胞的靶位点上游诱导了高达100 kb的大缺失。这种独特的特征将有助于通过引起基因缺失来实现基因敲除。总的来说，这些Cas蛋白的应用将在未来扩展植物基因组编辑工具的库。

基因组编辑技术的出现使植物基因组工程发生了革命性的变化。特别是，CRISPR/Cas9系统通过提供简单、高效、精确的基因组编辑方法，加快了研究项目的速度。Zsögön等，[7已经成功地通过基因组编辑模仿了番茄的驯化，展示了基因组编辑技术的力量。此外，CRISPR/Cas9不再仅仅是切割基因组DNA的剪刀。它可以将一个核苷酸转变为另一个核苷酸，并改变目标位点的表观遗传环境。工具箱不断更新新开发的CRISPR/Cas系统、Cas蛋白和效应模块等。这些工具的首选使用因研究目的而异，因为它们具有不同的优点和缺点，如本文所述。

引体编辑最近在酵母和哺乳动物细胞中发展起来，是一种很有前途的技术，可以更精确地编辑植物基因组。有趣的是，Anzalone等人，[22在没有供体DNA的情况下，成功地在靶位点敲入了DNA片段，因此不是通过HDR途径。这可以应用于植物基因组编辑，因为DNA片段的敲入在植物细胞中是困难的。引体编辑将为植物基因组编辑开辟新的方向。

另一方面，控制诱导大缺失也代表了基因敲除、基因簇缺失和诱导染色体缺失的新策略。I型CRISPR系统最近已被用于人类细胞的基因组工程[87，88但还不能用于植物基因组工程。研究I型CRISPR系统在植物细胞中会表现出什么特征也是很有趣的。

最近，一些研究也为解决植物转化系统长期存在的问题提供了线索。植物转化一般需要组织培养，这种方法劳动强度大，耗时长，适用于的植物种类有限。它也有在再生过程中诱发意想不到的体细胞突变的风险。为了克服这些问题，在足底最近已经报道了可以避免组织培养过程的转化系统[89，90]。这将有助于增加可进行基因组编辑的植物物种的数量，并加快植物基因组编辑研究的速度。精确的基因组编辑也在朝着从基因组编辑的植物中去除不必要的DNA序列和转基因的方向发展。的Cas9基因在基因组编辑的植物中是不需要的，因为它可能在脱靶位点诱导突变，也可能导致植物嵌合。将选择标记基因整合到基因组中意想不到的位置也是不希望的。此外，一些国家需要去除不必要的转基因，以减轻监管方面的担忧。基于这些因素，许多研究者正在尝试建立有效构建零隔离的方法。目前，使用RNPs的靶向诱变是实现这一目的的最著名的策略。然而，进一步的改进将是必要的，因为这种策略可以应用的植物物种的数量是有限的。此外，启动编辑有可能用于实现精确的无DNA基因组编辑，因为它可以在没有供体DNA模板的情况下精确编辑DNA序列。原编辑技术在植物工程中的应用已被广泛期待。

新发现的CRISPR/Cas系统和新技术的发展不断被报道，这表明在不久的将来，用于植物工程的CRISPR工具箱将进一步扩大。这套工具将提供新的方法来实现精确的基因组编辑，而不会在基因组编辑的植物中留下任何转基因的痕迹。

不适用。

ZFN:

锌指核酸酶

取得:

转录激活因子样效应核酸酶

CRISPR / Cas9:

聚集规则间隔的短回文重复序列/Cas9

Cas9:

crispr相关蛋白9核酸酶

双边带:

双链断裂

NHEJ:

Nonhomologous end-joining

HDR:

Homology-directed修复

indel:

插入和删除

gRNA:

指导RNA

帕姆:

原间隔邻近图案

SpCas9:

酿脓链球菌Cas9

GT:

基因打靶

dCas9:

死Cas9

是:

基本编辑器

CBE:

基于胞苷脱氨酶的DNA碱基编辑器

援助:

激活诱导胞苷脱氨酶

安倍:

基于腺嘌呤脱氨酶的DNA编辑器

肌萎缩性侧索硬化症:

Acetolactate合酶

ACCase:

乙酰辅酶A羧化酶

诊断:

体外转录

RNP:

核糖核蛋白

我们感谢K. Yamada博士和T. Miyaji博士对本文的批判性讨论。

KO由JSPS KAKENHI资助号JP19H02932资助，YO由企业，科研院所和学术界开放创新平台计划(OPERA)成立。资助者在实验设计、数据收集和分析或手稿准备中没有任何作用。

从属关系

1. 德岛大学技术、工业和社会科学研究生院，日本德岛

   和田直树、上田丽莎、大阪部百合子、大阪部庆世

贡献

NW, RU, YO, KO写了评论。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Keishi Osakabe。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

YO是本刊的客座编辑。作者宣称他们没有竞争利益。

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