内生真菌的超高活性免疫诱导物通过SA途径和RNA沉默诱导烟草对病毒的抗性

背景

植物病毒给农业生产造成严重的经济损失。从内生真菌中提取了一种极具活性的植物免疫诱导剂(ZhiNengCong, ZNC)，该诱导剂能促进植物生长，增强植物对细菌的抗性。然而，其抗病毒功能尚未得到研究。本研究旨在探讨ZNC在烟草中的抗病毒分子机制。

结果

在这里，我们使用过土豆X病毒(PVX)-键入烟草和奈格以转基因烟草为材料，研究ZNC对病毒的抗性。ZNC具有较高的抗病毒活性，最佳使用浓度为100-150 ng/mL。ZNC通过上调苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达，诱导活性氧积累，提高水杨酸(SA)含量，激活SA信号通路。我们利用RNA测序技术从znc处理的幼苗中生成了转录组谱。生物过程中的第一个GO阶段是转录后基因沉默的正调控，后续结果表明ZNC促进了RNA沉默。ZNC喷施后，野生型叶片侵染面积减少，但对PVX无保护作用奈格叶子。

结论

所有结果表明，ZnC是一种超高活性免疫诱导剂，通过通过SA途径阳性调节RNA沉默，可以以低浓度提高对PVX的烟草抗性。在本研究中首先揭示了ZnC的抗病毒机制，本研究提供了一种新的抗病毒生物制剂。

病毒是生物养殖寄生虫和植物的重要病原体，导致一系列严重的植物疾病和巨大的产量损失。迄今为止，化学试剂广泛用于预防或控制农业植物疾病[1］．然而，农药的广泛使用造成了有害的农药残留和环境污染，使作物品质下降，威胁人类健康。因此，由于世界人口不断增长，迫切需要创新和突破性的战略来控制植物病毒病原体和提高粮食产量[2那3.］．

利用内生菌进行生物防治是防治植物病害同时消除污染的一种很有前景的措施[4.那5.］．在大多数情况下，Endophytes可以产生生物活性次级代谢物，以抑制病原体，例如细菌，真菌和昆虫，或改善对病原体的抗性[3.那6.那7.]. 由于内生真菌的作用机制尚不清楚，生长条件特殊，限制了其在生物防治中的应用[8.］．内生真菌提取物智能聪(ZNC)生防剂在我国已得到广泛应用;是一种新型、高效、环保的提取物。ZNC是一种诱导子，不仅能保护作物免受假单胞菌皂苷PV。番茄（太平洋标准时间) DC3000还能促进作物生长[9.］．在本研究中，我们发现ZNC在很低的浓度下具有对病毒的抗性，并对其抗病毒机制进行了研究。

RNA沉默是一种保守的监测机制，在防御侵袭性核酸中发挥关键作用[10那11那12那13]，如病毒，通过互补mRNA转录本的序列特异性降解(转录后基因沉默，PTGS) [14那15］．双链RNA，其是由植物感染RNA病毒的病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RDRPS）产生的复制中间体，触发RNA沉默[16］．然后将该中间体通过称为Dicer样蛋白（DCl）的RNASEIII的酶切割成短21-24-核苷酸小干扰RNA（siRNA）[17那18那19那20.］．双链sirna被合并到rna诱导沉默复合体(RISC)中，该复合体包含一个argonaute (AGO)蛋白，该蛋白具有一个小的rna结合域和一个用于切割目标rna的内切酶活性，然后遵循目标rna的序列特异性切割[21］．

水杨酸(SA)是一种重要的植物激素，介导宿主对微生物病原体的反应。这种植物激素诱导植物对病原体的重要防御反应[22那23那24那25那26］．此前的研究表明，rna沉默途径与SA调控的信号转导途径可能存在重叠[27那28那29那30.];例如，SA处理后烟草植株中的NtRDRP活性增加了[29］．

在这项研究中，土豆X病毒以PVX和烟草为材料，研究了植物免疫诱导剂ZNC的抗病毒作用。我们发现ZNC诱导了植物的严重防御反应，包括H₂O.₂积累、SA积累和RNA沉默。SA的生物合成和信号转导途径是znc介导的防御反应所必需的。本研究首次揭示了ZNC的抗病毒机制。该研究结果将为植物免疫诱导剂ZNC作物生物防治提供新的抗病毒生物制剂，并有助于今后植物免疫诱导剂ZNC作物生物防治的应用。

ZNC保护植物免受病毒侵染

为了检测ZNC对植物的抗病毒活性，我们进行了侵染试验n benthamiana和具有GFP-YFP标签的PVX（图S1）.H.₂O-PVX叶片(水处理后接种PVX植株)荧光强度高(图2)。1a)和较大的PVX量(图。1b）。病毒疾病的典型症状发生5天后接种后（DPI）。相反，用100ng / ml ZnC处理的植物的症状显示出显着降低的疾病严重程度，并且来自ZnC -PVX组的PVX的相对量仅为31.77％，与H.₂O-PVX组（图。1A和B）。为了进一步证实ZnC引起的抗性抗病毒的功能，在喷涂ZnC和H之前用PVX接种叶片₂O。结果表明，ZNC对病毒感染有一定的预防作用（图S）2），ZNC处理叶中PVX的相对量低于H中的pVX₂o组（74.42％）。然而，与ZNC处理相比（31.77％）相比，差异是微不足道的（图。1）.这些结果表明，ZNC通过增强对病毒的植物抗性而是治愈植物来防止病毒。此外，ZNC还改善了植物抵抗力烟草马赛克病毒但对TMV的抗性较PVX低(图S3.）.

采用梯度浓度的ZNC水溶液在0、50、100、150和200 ng/mL下测定ZNC的最佳浓度。结果表明，随着ZNC浓度的增加，其抗病毒作用逐渐增强。当ZNC浓度为200 ng/mL时，植株出现萎蔫现象。因此，我们在接下来的实验中使用了150 ng/mL的ZNC。

ZnC促进过氧化氢积累

非生物应激通常会增强细胞ROS的产生并引起氧化损伤。为了研究ZNC是否调节ROS积累，采用DAB(3,3-二氨基联苯胺)和NBT染色评价其水平，即H₂O.₂和o.^2-结果表明:水喷组和150 ng/mL氯化锌喷组离体叶片均有显著性差异(p < 0.05)。数字2a和b，表明DAB染色随着时间的延长先增强后减弱。在喷淋ZNC 2 h后DAB染色最深，说明h₂O.₂升高了。

几种重要的活性氧清除酶编码基因的mRNA水平，即过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和活性氧生成相关基因，包括呼吸爆发氧化酶同源基因(rboha.和rbohb.)，采用qRT-PCR检测，并对治疗前后进行监测。ZNC处理后猫那草皮， 和APX型在2岁时急剧下降 h后处理（hpt）与对照组植物的比较（图。2C）。相比之下，表达水平rboha.和rbohb.显着增加（图。2d）。这种现象表明过氧化氢的积累通过还原来调节猫表达和增加rbohb.表达式。这些结果表明，锌酸锌可以改善H₂O.₂而不是清除活性氧。

ZNC促进了SA的合成，激活了SA信号通路

通过使用HPLC，用足够的强度测定SA样品萃取并得到令人满意的结果。使用标准添加方法验证，因为在几乎每个样品中检测到SA的存在（图。3.）.SA的相对浓度由Empower软件和标准SA确定。ZNC在不同时间（2,4,6,8小时）诱导的SA的量的变化烟草．Benthamiana检测到叶子，结果表明，SA浓度首先增加，然后随着时间的推移而降低，并在图2中以6小时达到其浓度最大值。3.．结果表明，锌酸锌促进了SA的积累，激活了防御反应。

植物主要通过ICS和苯丙氨酸解氨酶(PAL)途径合成SA。因此，我们检测到了ICS和朋友基因使用qRT-PCR。结果表明：朋友基因被ZNC上调，而ICS基因基本保持不变（图。4.一种）。这些结果意味着ZnC通过改进促进SA合成朋友转录水平。

致病相关蛋白在植物防御中起着重要作用。它们通过抑制病毒繁殖提高植物抗病能力，主要参与植物获得性系统抗性。它们也可以通过SA的诱导在植物中高度表达[22那31那32］．PR-1A和PR的非投资者（NPR）是SA途径的关键因素，涉及n benthamiana抵抗病毒[33]或其他病原体，如疫霉感染(34］．wrky可以结合NPR的启动子区域，在SA信号通路中发挥作用[35那36那37］．高表达WRKY40和WRKY70.烟草可以增强对病原体的抵抗力[38];过度表达WRKY70.能增强sa的表达吗PR.基因(39]; SA随时间而增加拟南芥突变体受正调控怀疑基因，包括WRKY51[40]．WRKY转录因子基因参与激素信号通路，如SA通路[41］．此外，病毒感染后烟草中几种腕基因的表达模式显着增加[42那43］．要确认结果，我们检测到相对基因PR-1A(属PR1属)NPR1.那WRKY40那WRKY51， 和WRKY70.，采用qRT-PCR。结果表明，上述基因表达水平上调(图。4.b). ZNC可促进SA合成，激活SA信号通路，增强防御反应。

基因表达的定量差异n benthamianaZNC治疗后

为了进一步揭示ZnC在诱导植物抗性方面的作用，对用ZnC处理的叶片进行非参数转录组测序分析。在150ng / ml ZNC处理2小时后收获叶子。产生了超过4700万张清洁读数（表S2）.共2801个基因上调2倍，1983个基因下调(P. < 0.05）英寸n benthamiana150℃处理的植物 与用H处理的相比，ZNC的ng/mL₂O在2hpt(图。5.A和B）。大多数ZnC调节基因在2 HPT属于非常广泛的GO类别，例如与生物过程，细胞组分和分子功能有关的那些（图。4.）.上调的Go术语（表1）生物过程包括PTGS，防御反应和对SA的响应的正调节（图。5.c） 。在KEGG分类中，植物激素信号转导基因表现出最高的表达变化，95个差异表达基因（DEG）表达上调（图。5.D和图.. s5.）.因此，我们推测通过SA途径通过RNA沉默诱导对PVX的抗性。

ZNC增强RNA沉默

转录组测序结果显示，ZNC对PTGS具有正向调控作用。三十n benthamiana用去离子水和ZNC喷雾，研究ZNC对RNA沉默的影响。2小时后，农杆菌文化(OD₆₀₀ = 1.0）将含有pBI121-GFP的基因注入叶片，在长波长紫外光照射下观察渗透和新生叶片的GFP荧光强度7小时，确定RNA沉默 天。采集新生叶片，提取总RNA，用qRT-PCR检测GFP的表达水平。如图所示。6.，GFP荧光强度在3dpi下最强，ZnC处理组的GFP荧光强度和表达水平明显低于3dpi的对照组（图。6.A和B）。此外，提取siRNA，进行Northern印迹。这GFP.ZNC处理组的siRNA积累量高于对照组(图2)。6.C）。上述结果表明ZnC促进RNA沉默。

DCL和AGO是RNA沉默途径中的关键蛋白。DCL负责切割细胞产生的dsRNA，AGO作为RNA诱导沉默复合物（RISC）的催化成分，促进扩增沉默信号。qRT-PCR检测RNA沉默途径相关基因。NbDCL1那NbDCL2那NbDCL3那NbDCL4那NbRDR6那nbago7.， 和NbAGO10上调;在这些基因中，NbDCL3和NbAGO10显著上调(图。6.d）。因此，ZNC通过调节RNA沉默的上游途径起着沉默增强的作用。

ZNC通过SA途径促进RNA沉默

此前的研究表明，SA可诱导RNA沉默相关基因和植物对RNA病原体的抗性[28］．因此，我们推测ZNC诱导通过SA途径的RNA诱导的病毒抗性。要测试这个猜测，奈格转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.用作植物材料。SA无法累积，因为SA被分解为儿茶素。在瞬态表达实验中，我们可以看到GFP的荧光强度在3 dpi出现区域最强，然后逐渐减少。然而，GFP荧光强度显示ZNC治疗叶片和水处理组之间没有显着变化，以及表达水平GFP.从两个治疗区域符合现象（图。7.A和B）。相反，与用水喷洒的非转变植物相比，用ZnC处理的非转变植物的GFP荧光强度显着降低，GFP.表达水平与荧光强度一致。

进一步确认结果，奈格转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.和野生型N塔巴库姆简历萨姆松NN.植株与汁液摩擦叶片接种PVX。7.d)野生型烟草在15 dpi时，水处理组比锌nc处理组出现更多，出现面积更大。为奈格转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.，PVX累积和新兴区域没有显着差异（图。7.C）。结果表明，ZNC不能诱导抗病毒能力奈格转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.和SA-deficient植物。以上结果表明，ZNC通过SA途径促进RNA沉默，进而诱导病毒抗性。

大多数植物都有内生菌（主要是细菌和真菌），在大多数情况下，内生菌可以促进生长和植物健康。在与植物的长期共同进化过程中，内生细菌和真菌产生了许多因子，帮助植物抵御逆境并促进其生长。例如，内生微生物通常具有以下功能：它们可以提高植物的抗逆能力，增强植物的抗病能力，抑制病原体的毒力，抑制竞争植物物种的发育，并将土壤中的养分带入植物。由于内生微生物的有效功能，内生微生物可显著减少农作物栽培中农药（化肥、杀菌剂、杀虫剂和除草剂）的使用[44那45那46］．然而，在农业中使用的生物防治剂的数量非常少。ZNC是一种商业化的产品，它是一种天然植物的粗提物P.Variotii从植物的根中分离出来的菌株[9.］．ZNC广泛用于作物，蔬菜和果树，最近评估了植物生长促进和细菌疾病保护的分子机制。为了进一步了解ZnC的抗病毒机制，我们研究了烟草中的ZnC介导的病毒抗性。在我们的研究中，我们发现ZNC不能治愈病毒感染的植物，但它具有预防功能，增强了植物中对病毒的抵抗力（图。1和s3）。ZNC可以促进h₂O.₂（图。2)、SA积累(图。3.）和激活RNA沉默（图。6.a和b).这些数据证实了ZNC在植物中作为主动防御反应的诱导子。本研究首次揭示了ZNC的抗病毒机制。

已经确定了许多能够诱导植物防御反应并保护它们免受病原体感染的诱变剂[47];它们包括鞭毛[48]，伸长因子[49，依托丁[50那51]和其他寡糖（例如，寡糖酸酐酸，OGS）[52］．它们是病原体相关分子模式(PAMPs)，并与植物受体相互作用，激活pamp触发的免疫[53那54那55］．然而，上述激发子的有效浓度在μg/mL和mg/mL数量级之间，远远高于ZNC (ng/mL)的工作浓度，如Flg22 (1 μM，约2.232 μg/mL)和OGs (50 μg/mL) [48］．此外，几种植物激素的工作浓度高于ZNC;例如，SA的抗病毒浓度为10μm，约为1.38μg/ ml [26］．ZNC是来自的发酵提取物p . variotii，主要含有核苷，糖，蛋白质和其他化合物（数据未显示）。我们不知道哪个分子是一种有效的引诱者，诱导植物抗病毒的抗性，因为我们不能获得单一化合物。因此，需要进一步的研究来分离，提取和鉴定有效化合物。

非生物胁迫通常会增加植物细胞活性氧(ROS)的产生[56］．以前的研究表明，SA和过氧化氢水平密切相关，它们在许多生物过程中相互诱导彼此的积累[57那58那59］．病毒侵袭引起植物过敏反应，产生丰富的过氧化氢，将细胞加速到编程的细胞死亡中，抑制病毒的繁殖和传播，增强植物病毒的抗性。因此，我们认为过氧化氢在调节许多生物学过程中的信号分子中起作用的重要作用，例如对植物中非生物刺激的反应[60那61］．植物具有清除活性氧的活性，以防止植物受到活性氧的毒害。SOD和Rbohs主要负责产生过氧化氢，过氧化氢能将有害的超氧自由基转化为过氧化氢，然后清除ROS的酶APX和/或CAT水解过氧化氢。在本研究中，我们发现经ZNC处理后DAB染色有显著性差异，而NBT染色无显著性差异。NbCAT与过氧化氢清除过程相关的基因显著下调，而rbohb.基因调节。ZNC可能通过促进SA的积累而促进过氧化氢的积累;这一发现需要进一步研究。

病原菌感染诱导的SA生物合成主要依赖于ICS1基因并部分取决于朋友基因。ICS1蛋白具有等氯化合酶活性，而PAL是苯丙氨酸氨裂解酶[62那63那64］．有趣的是，在我们的研究中，SA生物合成主要取决于朋友基因（图。4.一种）。原因尚不清楚，需要进一步研究。

植物激素SA在抗病性调节中起着重要作用。系统获得性抗性(SAR)依赖于植物中的SA信号，如化学苯并噻二唑通过增加内源SA水平诱导SAR [65那66］．以往的研究表明，外源性SA也会增加PR基因表达[67］．因此，SAR需要信号分子SA，并且与PR蛋白的积累相关，这应该有助于抵抗[22］．在我们的研究中，喷射ZnC后植物中的SA含量增加，以及相关标记基因PR1A那NPR1.那WRKY40那WRKY51和WRKY 70在SA途径通过QRT-PCR上调（图。4.b).这些结果证实了在znc介导的防御反应中需要依赖于PAL的SA生物合成。

转录组测序显示，许多不同的基因表达上调;这些基因参与了PTGS的正调控、SA分解代谢过程、SA应答、防御反应等多个方面(图)。5.,无花果。4.，S.5.）.上述生物过程与植物防御和抗性诱导密切相关。以前的研究表明，SA诱导RNA-沉默相关的基因[27那28］．此外，rna沉默途径调节对某些胁迫的反应，并可由SA部分调节[68]， sa相关转录因子与多种AGO和DCL共表达[69］．在我们的研究中，我们发现NbdCl1，NbdCl2，NbdCl3，NBRDR6，NBAGO7和NBAGO10在RNA沉默途径的标记基因中进行了SA积累（图。6.）.结果表明，SA通过SA抑制RNA沉默相关基因的预测抑制PVX积累。

以往的研究表明，SA诱导RNA沉默相关基因和植物对病毒的抗性[28]和SA缺陷N．Benthamiana衰减病毒诱导的基因沉默，但不会影响转基因诱导的PTGS [70］．我们的研究表明，ZNC可以促进SA的积累(图。4.)，转录组测序结果显示，ZNC上调了RNA沉默相关基因的表达(图。5.）.沉默效率分析表明，用ZnC处理的野生型植物的荧光强度明显弱于水基。但是，荧光强度没有显着差异奈格观察到转基因植物（图。7.A和B）。此外，ZnC喷涂的野生型叶片显示出降低的感染区域，而ZnC未能对PVX引起保护作用奈格叶子。这些结果表明，通过SA途径对ZNC进行RNA沉默可以获得病毒抗性。然而，RNA沉默对于sa介导的植物RNA病毒抗性是必不可少的拟南芥蒂利亚纳[71］．这些发现表明，水杨酸可能通过多种平行抗性机制提高植物对病毒的抗性，如诱导系统获得性抗性(SAS) [72]或作为烟草中RNA沉默防御的增强剂。SA和RNA沉默的防御机制也可以合作以防止病毒入侵[73那74那75］．因此，我们推测ZNC通过SA途径增强RNA沉默从而增强植物对病毒的抗性，这是一种抗病机制。ZNC是否能通过其他SA途径提高对病毒的耐药性尚不清楚。

此外，SA被发现在众多植物中（尼科尼亚塔哈瓦姆那番茄那拟南芥蒂利亚纳那橙色），并且可以诱导RNA沉默相关的基因和植物抗RNA病原体[28那75］．之前的报告显示ZNC活化了水杨酸生物合成和信号通路拟南芥蒂利亚纳[9.］．在支持信息中，我们发现ZNC也增强了N。Benthamiana抗TMV。因此，我们推测ZNC可以通过不同植物中的SA和RNA沉默途径诱导对各种病毒的抵抗力。ZnC的抗病毒现象是非特异性的。

我们首先表明，超高活性ZnC可以以低浓度诱导病毒抗性，并且初步揭示抗病毒机制。所有结果表明，通过水杨酸SA途径正调节RNA沉默，ZNC介导对病毒的抗性。本研究提供了一种新的抗病毒生物制造，即ZNC。这种生物制造将是植物抗病毒研究和应用的非常有用的生物制造。

材料及生长条件

ZNC由山东鹏博生物科技有限公司提供;它是乙醇的粗提物Paecilomyces Variotii.．pCaPVX440-GFP-YFP质粒由山东农业大学李向东教授提供[76]（图.. S1）.对于RNA沉默分析，将带GFP标签的空向量PBI121转化为根癌土壤杆菌本研究中的GV3101。野生型尼古利亚娜·宾夕法尼亚州和N塔巴库姆简历萨姆松NN.在本研究中进行繁殖和储存。奈格（编码水杨酸羟化酶将SA转化为儿茶酚）转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.(选自西班牙马德里atonoma大学Josefa M. Allimino博士)[74在16-H光/ 8-H黑色光周期下在24℃下在温室中升高。DNA聚合酶和其他基因工程酶购自Takara Inc.（大连，中国）。

所有其他化学品和试剂都是最高质量的。

ZNC的抗病毒研究

野生型的n benthamiana用五个或六个叶阶段接种马铃薯病毒X.（PVX）-GFP-YFP在喷射100ng / ml ZnC之前或之后，以确认ZnC的抗性对PVX感染。用于病毒接种，1g PVX感染N塔巴库姆将叶片接地在1ml 5mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.2。通过用新鲜制备的SAP摩擦叶片接种六叶阶段的控制植物。接种植物在24℃下在无昆虫温室中生长，并监测病毒症状。每个实验都被复制三次并包括10个独立植物。

喷洒0,50,100,150和200ng / ml的ZnC的梯度浓度水溶液n benthamiana接种PVX之前2小时进一步确定ZNC抗病毒的最佳工作浓度;所有其他条件与上述相同。通过在长波长（365nm）UV光（Spectroline Model SB-100P / A; Spectronics Corporation，Lexington，Ky，USA）下观察GFP-YFP荧光来确定PVX的感染，并用Fujifilm FinePix S8000FD数码相机拍摄（Fujifilm Holdings Corporation）[77]。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测病毒含量[78那79]. 使用EnSpire多标签阅读器在490处对平板进行比色读数 纳米波长。对照组为n benthamiana叶片未接种PVX。

活性氧的组织化学染色

这n benthamianaZNC和H的叶子₂o用于组织化学染色程序的脱离治疗组。使用3,3'-二氨基苯甲酸（DAB）和硝基唑鎓（NBT）进行染色以检测H的积累₂O.₂和o.₂⁻．h的积累₂O.₂在叶子中使用DAB作为指示剂可组织化学进行可视化。将叶子置于1mg / ml的DAB溶液中，真空渗透30分钟，用去离子水洗涤三次，并与H反应₂O.₂在28°C的光下为12小时。反应后，在叶片中清楚地看到深褐色沉积，用沸腾的乙醇洗涤过量的染料溶液，叶片成像。

对于NBT染色，n benthamiana将叶片置于1％（m / v）叠氮化物溶液中，真空渗透30分钟，转移到0.5mg / ml的NBT溶液中，然后进行另一个真空渗透30分钟。叠氮化钠可以改善细胞渗透性，以允许NBT溶液在整个幼苗中扩散。NBT与O反应^2-从而形成了一种深蓝色的不溶性复合物质。用煮沸的乙醇洗去多余的染料溶液，对叶子进行成像。采用ImageJ软件定量分析H₂O.₂和o.₂⁻强度 [80］．

SA提取和内容分析

后n benthamiana用150ng / ml ZnC喷涂，使用前述方法在不同的时间点（0,2,4,6,8小时）中萃取游离SA。简而言之，在研磨0.1g播种样品后，在研磨物中加入1ml 70％的甲醇，然后在4℃下放入过夜。将样品转移到聚丙烯离心管中。通过离心（8000×g，10分钟）获得提取物。然后将上清液置于另一个管中以蒸发（n₂, 45°C)。用500μLDDH重构干残留物₂O.将总共300μl提取物用40μl0.5mg/ ml三氟乙酸（TFA）重构，混合并摇1分钟。加入1ml乙酸乙酯和环己烷用于除去有机相，然后将水相置于另一个管中以蒸发（n₂, 45°C)。用500 μL流动相重建干渣。提取液经0.22 μm过滤后转移至EP管中(0)，[81］．通过监测306nm的吸光度，使用HPLC分析SA提取溶液（10μL）和SA标准。将所有样品分别在C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）上装载。洗脱甲醇和0.1％乙酸水（该比例为65:35）分离，然后在35℃下在30分钟内洗脱，流速为0.8ml / min。

RNA提取和定量实时PCR

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Takara，Shiga，Japan）从叶中从叶中提取总RNA，并在逆转录后在37℃下用DNase I处理30分钟。使用Fastking GDNA分布RT Supermix套件（天根，北京，中国）从1μg总RNA合成cDNA。使用人才Sybr Green Kit（天根，北京，中国）进行定量实时（QRT-PCR）。每次反应一次进行并重复三次。结果由Bio-Rad CFX Manager软件（Bio-Rad，California，USA）分析。SOD，CAT，APX的相对表达，rboha.， 和rbohb.使用QRT-PCR测量。每个测定重复三次。QRT-PCR实验的底漆序列列于表S中1．

RNA测序的数据分析

RNA样品从五个或六个叶阶段叶中取出，用0（h₂O)或150 ng/mL ZNC处理2小时。每次处理包含三个样品(植物)。根据质量选择样本(RIN评分≥7)。它们由上海OE生物技术公司进行了汇集和测序。公司简介(上海，中国)之前的文章已经详细描述了如何分析rna测序数据[82那83］．所有差异基因表达均以log2比值绝对值≥1和FDR≤0.001为标准。

RNA-silencing分析

野生型的n benthamiana那N塔巴库姆简历萨姆松NN.， 和奈格转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.叶子在五叶或六叶阶段渗透，携带GFP基因的农杆菌GV3101。每个农杆菌培养（OD₆₀₀= 1.0)孵育3h后，与其他培养物按1:1 (v/v)比例混合渗透。在长波长(365 nm)紫外光照射下，通过观察渗透叶片和新生叶片的GFP-YFP荧光来检测局部和系统RNA沉默。qTR-PCR检测沉默通路相关基因，如(AGO)蛋白、DCL蛋白、RDRP。

siRNA的Northern blot分析

如前所述从叶片中提取低分子量RNA [84］．用于siRNA检测，15 μg低分子量rna在15%聚丙烯酰胺- 7 M尿素凝胶上分离，转移到Hybond-N上⁺薄膜在0.5 X TBE在0.8 mA cm⁻²1 h。将膜紫外交联，80℃孵育2 h后，与DIG标记的探针GFP mRNA杂交。根据制造商的说明，使用DIG Northern Starter Kit(罗氏，巴塞尔，瑞士)进行化学发光检测。

在附加号PRJNA616072下将转录组序列数据沉积在NCBI序列读取存档（SRA）中。在当前研究期间分析的数据集可以从相应的作者获得合理的请求。本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发表的文章[及其补充信息文件]中。

轻拍：

3,3-二氨基苯胺

H₂O.₂：

过氧化氢

NBT：

氮蓝四唑

NPR：

不具有致病性相关的表情

朋友：

苯丙氨酸氨裂解酶

公关:

病因相关蛋白质

PVX：

马铃薯病毒X.

ROS：

反应性氧气

山:

水杨酸

TMV：

烟草马赛克病毒

ZNC:

Zhinengcong

我们感谢湘东李教授提供矢量PCAPvx440-GFP-YFP，Josefa M. Allimino博士提供奈格转基因N塔巴库姆简历萨姆松NN.，以及费燕教授提供TMV-GFP。

该研究由国家自然科学基金（授予第312721133号国国家自然科学基金（Grant 31272113）为设计和执行实验，以及山东省（ZR2019MC009）的自然科学基金，为常乡朱进行数据分析，写作和修改稿件。

作者指出

1. 彭春娥、张爱玲对这项工作做出了同样的贡献。

隶属关系

1. 山东农业大学生命科学学院作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018

   彭春娥，张爱玲，宋云志，朱长祥

2. 山东鹏波生物科技有限公司，山东泰安，271018，P.R.中国

   青班王，杨立泉镇耿

3. 国家工程实验室有效利用土壤和肥料资源;国家工程技术研究中心，山东省农业大学资源与环境学院缓慢控释肥料，山东省泰安，271018，P.R.中国

   青斌王和敏张

4. 山东农业大学植物保护学院作物生物学国家重点实验室，山东泰安，271018，P.R.中国

   新华鼎

贡献

ZCX设计了实验，ZCX，PCE和Zal构思了原始筛选和研究计划。PCE，Zal，WQB，Syz，Ly和GQZ执行了实验。PCE，zal和zcx分析了数据。PCE和ZCX写了稿件。ZCX，ZM和DXH写作审查和编辑。所有作者读并同意发布本文。

通讯作者

对应于昌乡朱．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

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