玉米种子萌发过程中对耐寒性的基因表达和遗传控制

背景

通过生理品质评估以及与此性状相关的遗传控制，研究玉米种子和幼苗的耐寒性，可以对基因型进行早期表征。本文研究了玉米种子萌发过程中耐冷性的遗传控制及受该胁迫影响的基因。

结果

使用六条玉米线，三条分类为耐受，三种易受低发芽温度的影响。开发了一种领域以在包括往复交叉的部分拨号方案中产生混合种子。对于表达分析，使用来自两个对比度线的种子，以及它们的杂化组合及其倒数交叉，在10℃下在10℃下干燥和润湿的种子4和7天。其评价过氧化氢酶（CAT）和酯酶（EST）的酶，耐热蛋白质和基因推定的硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD），抗坏血酸过氧化物酶（APX），超氧化物歧化酶（SOD）和丝裂原活化蛋白激酶（ZmMPK5）．进行估计的杂种优势，一般和特异性组合能力和互惠母体和非母体效果，并显示出在低温下发芽的杂种优势，也是非添加剂基因更重要，并且存在互易效应．

结论

有所述CAT的更大表达和EST中潮湿的种子7天时酶和有耐热蛋白的表达更低，7天时润湿的SAD基因。另外，还有一些在APX，SOD的表达的变化和ZMMPK5基因干燥和湿润种子，以及其中所研究的基因型。

玉米耐寒品种的选育是保证低温下种子萌发、育苗和籽粒产量的基础。在适当的温度条件下，玉米种子一般在三到四天内发芽。当温度降低到15°C时，萌发期可达14天，并且随着温度的降低，萌发过程所需的时间增加[1］．除了缺乏均匀性和在萌发过程中的延迟，与低温发生有关的另一个问题是种子在土壤中待得更久，暴露在恶化和虫害的侵害下。

增加植物对环境压力的耐受性是育种计划的最相关目标之一，以及各种基因型的选择应考虑种子萌发和幼苗出苗阶段。在一些研究中，已经观察到杂种优势对耐寒性特征的影响。

杂交系比亲本表现更好的研究结果证实了抗寒性调节涉及加性和显性效应[2，3.］．因此，在选择最佳杂交组合的过程中，评价种子对冷胁迫的耐受性是很重要的。

适应非生物胁迫需要增加数量遗传和高度受环境影响的性状。这些性状大多由数百个基因控制，它们之间的相互作用往往难以衡量[4］．许多基因据报道，在萌发过程中增加耐寒性的潜在重要性，然而，只有有限量的QTL对该特性产生了实际影响[5，6，7，8］．

在发芽过程中获得耐冷致氧化玉米基因型的最佳方法是了解与该特征有关的基因，并检查杂种优势和互核效果是否存在效果。众所周知，在玉米育种计划中，线的最终使用是用于杂化生产，因此识别最佳基因型和最佳组合是重要的。通过评估种子的生理素质的评估以及与这种特性相关的遗传特征的研究，允许研究对这种不利温度的耐受性的早期表征玉米种子和幼苗的研究。

鉴于上述情况，本研究的目的是研究萌发的耐寒性遗传控制，并评估玉米种子中具有这种特征的基因的表达。

试验时种子的平均含水量为12.8，最大变异量为1%。

关于生理质量，当在25℃下进行萌发时，评估材料之间没有显着差异（表1)．Thus, it can be affirmed that all analyzed materials, parent lines and hybrids, presented similar results when evaluated at 25 °C, which is the favorable temperature for maize seed germination. All the materials had germination rates greater than 90%, evidencing a high germinative potential (Table2)．发芽率为90 ~ 100%，杂种优势为- 8.5 ~ 3。

当种子在10℃下萌发时，各评价材料的发芽率与根突出率的结果有统计学差异(表1)3.)．这一结果是有趣的，因为它揭示了在有利条件下，种子在发芽试验中评价的生理品质是相似的。但随着温度的降低，评价材料的萌发效果显著降低。

值得一提的是，在本研究中，只有那些至少有一厘米的空中生长和至少两个不定根的一厘米的生长种子被认为是完全发芽的，而具有至少0.5cm的胚根的种子被认为突出。

对于突起结果（表4)，第91行突出率最高，其次是第44行、第57行和第64行。品系54籽粒突出率最低。突出的杂种优势范围为−21.25 ~ 10.75。

对于63/54十字架及其倒数54/63，这些十字架的杂种优势之间存在32点的变化。当线54用作女性父母时，突出结果高于当线63用作雌性父母时观察到的突出结果。尽管在耐低温基团的耐受剂中引入了线63，但是可以观察到它显示出与线64和91相关的突起和发芽的差异，这可以通过这种特征的复杂性来解释．

在品系44和54的种子中，虽然观察到很高比例的突起，但在21天湿润后未观察到具有标准标准的幼苗。在以44系为母本的杂种中，尽管突出率很高，但在发芽率方面没有观察到同样的行为。

除63/54杂种萌发试验结果无统计学差异外，所有杂交组合均存在萌发杂种优势效应。杂种优势范围为- 1.25 ~ 81.25，表明在种子萌发过程中可以而且应该利用杂种优势生产耐低温杂交种。

在突出率结果上，54/63组合的杂种优势效应最高，为10.75。然而，在反向63/54杂交中，没有观察到杂种优势效应(−21.25)。这些结果进一步说明，在亲本63和亲本54的杂交组合中，应以品系54作为母本₁可以获得具有更好的耐冷耐寒性的种子。在一般评估中，当交叉涉及线条54和91时，观察到更高的异细胞分裂值，无论它们是否被用作雄性或女性父母。

结合能力分析

为一般（GCA）和比（SCA）组合的能力和它的倒数效果（RE）的均方示于表5．方差分析结果显示，在1%的概率水平下，10℃下种子的根突出率和萌发率有显著影响。

GCA是指亲本在杂交组合中的平均表现，其方差分析的显著性是指与加性基因相关的GCA (Gi)效应之间存在变异性。SCA的重要性(Sjj)指的是非加性效应，因为SCA是对与基于GCA预期的行为偏差的估计。

互易效应（RE）的平均平方的意义表明杂交物与各自往复运动之间的显着差异存在。通过检查GCA和SCA效应的萌发试验的平均正方形，发现SCA的效果高于GCA，表明非添加性效应控制该特征的重要性。

在本研究中，对于突出百分比，GCA的效果与SCA有更大的程度，证明了在特征表达中的添加剂效应的主要效应。还可以观察到，往复效应对于10°C的萌发百分比和根突起是显着的（表4)．

一般（GCA）和比（SCA）组合的能力和效果倒数（RE）的估计

GCA (Gi)对根系突出率和萌发率的影响各不相同，这揭示了杂交组合在耐冷胁迫方面的不同表现(表1)6)．在根突出方面，品系44、64和91的GCA值最高，表明这些亲本在杂交组合中表现较好。

在第54行和第63行观察到更多的负值。因此，这些亲本在低温条件下表现较差，导致杂交组合在低温条件下表现较差。然而,对于线57,尽管GCA的积极估计,估计价值很低与其他线,这表明平均根突出的杂交种子线57作为父母,并不不同于一般的双重的。

在一般情况下，线路91是一个最有助于提高在杂交根突起的百分比，而线54，增加耐受低温的有效途径没有贡献。的是要注意重要的是，当线54被用作与线63组合的父本观察到最低的杂种优势值（表4)．

关于萌发百分比试验中的GCA，观察到最高的阳性GCA估计对于第44和91线，第91条具有最高的正估计。线91还显示出突出百分比试验的正高GCA。因此，当通过在10℃的萌发和根突起的百分比评估时，可以确认91是具有更好的抗耐耐寒性组合的性能的线。因此，推断出该线含有较高浓度的良好等位基因，用于萌发过程中的低温耐受性，并且它可以在养老液中被利用。在54,57,63和64线中，观察到GCA的负估计，最低的是线54，这有助于其参与的杂种的性能较低。

SCA（SIJ）效应是某些杂种组合的偏差，其比其母体线的GCA相对较高或低于预期，并且与基因的优势效应相关，并且包括涉及占优势的外观。值越高，组合的分歧越多，虽然它们也受到依甲赛的平均基因频率的影响[9］．对于突出百分比试验，对于所有测试的杂交组合，没有观察到SCA的表达结果。值得注意的是，对于突起百分比，除了第54行之外，该线呈现出高值，这使得杂种优势不如此表达。

线路44×63之间的交叉导致SCA的最佳结果与其他交叉口突出。对于发芽试验，混合动力57×91是具有最高SIJ估计的人。该杂种含有78.25％的杂种优势，表明优势基因在控制这种特性的贡献。

基因表达

图年代1shows the expression of the antioxidant enzymes catalase (CAT) in lines 54, 64 and in the hybrid 64 × 54 and its reciprocal 54 × 64. It is worth mentioning that for these crosses there was a RE and when it was unfolded, a maternal effect was evidenced for the crosses made with the parental 54 and 64, considering seed germination at 10 °C. In the present work, the 54 × 64 hybrid produced seeds with higher low temperature tolerance than the reciprocal cross. Despite the fact that line 64 was considered tolerant to low temperatures during the germination process, it did not behave as a good female parent when crossed with line 54. Dried seeds of Line 54 showed less catalase activity than dried seeds of Line 64 (Fig. S1)．

从64×54交叉的那些中，猫在杂交种子中的表达更大，可能是由于线64种子中的较大表达。然而，当将种子置于10℃时，在10℃下发芽时，表达中的反转观察到评估材料的种子中的猫酶的水平，即第64线显示比线54和杂种的酶活性较少。杂交种子中的表达类似。值得注意的是，独立于基因型，在将10℃的种子中观察到酶的最高表达，七天的时间。这可能是对压力条件的反应，因为众所周知，含水量较高的种子中的冷应激较高。

在低温萌发7天的种子和干燥的种子中观察到高水平的酯酶(EST)活性。1)．在seeds of line 64 was observed greater expression than in seeds of line 54 and consequently, in hybrid seeds of the 64 × 54 combination, there was also a greater expression of the EST in relation to the 54 × 64 hybrid, as shown in the upper band in Fig.1．在10℃下萌发7 d时，64系种子中该酶的表达量明显高于杂种种子(64/54和54/64)。这可能与杂交种子的低过氧化有关，因为EST与膜酯的氧化有关。

在无花果。2，示出了耐热蛋白的表达分析。在亲本系和杂种的干燥种子中观察到类似的图案。然而，在应力条件下，线64的种子表达较低，与其他材料有关。在杂交种的种子及其往复交叉中，观察到类似的表达水平，与观察到猫和Est酶的表达不同。对于耐热蛋白质，杂种种子中的表达不同于女性父母的种子。在所研究的条件下，杂交种子中的耐热蛋白的表达类似于在亲本54的种子中观察到的表达。只有线64显示在接近17kDa的条带中所示的较低表达。值得注意的是，在10°C润湿的七天内，有带消失（分子量20和17kDa）。众所周知，随着润湿过程的进展，存在耐受性的耐受性。此外，这也可能与对冷应力的耐受性丧失相关。

通常，调用硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD）的表达，其作用于建立脂肪酸，在10℃下润湿的种子中较低七天的种子，表明在冷应激哀伤活动中减少了对于所有评估的基因型（图。3.)．在干燥种子和10℃处理4天的种子中，SAD的表达没有显著差异。然而，在第7天，这种差异是非常显著的。

在干性种子中，亲本的APX活性高于杂种(图。4)．经过7天的润湿，第54系种子中APX的表达量在其他基因型中最高。可以推断,这种材料是生产大量的过氧化要求更多APX型的生产。湿润的第四天晚上10°C,有APX型基因的表达减少的种子行54岁,64年和64年混合×54。在54/64杂交种的种子中，该基因在干种子和10℃湿润4 d的种子中表达无显著差异。在第7天，该基因在品系54和杂交种64 × 54种子中的表达量相对于第4天的表达量有所增加。

SOD的表达水平显示，在四种基因型的干种子（图几乎没有变化。5)．然而，在低温胁迫下4天，在54×64杂交种的种子中观察到更高水平的SOD表达，并且在7天后，这种表达水平甚至更多地增加并且大于所有其他基因型。在我们的分析中，与分析的其他基因型相比，在54×64杂交交叉中观察到最好的发芽率。在干燥的种子中，线54的SOD表达较少。在10℃下润湿的第四天，研究的所有基因型的种子中的SOD表达显着降低。在4七天冷处理，在54×64杂交种的种子中观察到更高水平的表达。

在无花果。6，表达了ZMMPK5（发丝糖型活化蛋白激酶）基因显示。ABA和过氧化氢的积累有助于该基因的更高表达[10.］．ZMMPK5expression was higher in seeds moistened at 10 °C for 4 and 7 days than in dry seeds for lines 54 and 64. For the 54 × 64 hybrid, a higher expression was observed only at four days. Higher expression of this gene was verified in seeds moistened for 7 days at 10 °C in seeds of line 54. This line exhibited a lower percentage of root protrusion in relation to the other lines. Also, seedlings with the minimum standard established in this research were not observed for line 54. This intolerance to low temperature may be due to the accumulation of ROS and also to the higher content of abscisic acid, since these two factors may have contributed to a greater expression ofZMMPK5．

本研究的发芽结果与Farooq等人得到的结果一致[11.[凡核实低温对玉米杂交幼苗的发芽和生长性状有显着影响。在Farooq等人进行的研究中。［11.，低温增加了幼苗的时间出现，增加了超氧化物歧化酶的表达，降低了出苗百分比，应急均匀系数和根长。

在三种温度条件和30种不同杂交品种的实验中也发现了类似的结果，其中验证了基因型在不同温度条件下的显著作用，发现在低温条件下，由于冷胁迫，植株根系和地上部分发育较差，细胞分裂和伸长显著减少[12.］．

根据研究结果在混合动力和反交杂种优势，我们可以得出这样的结论是耐寒性在发芽过程杂种优势，并相互影响。这些结果进一步加强了分析最佳杂种组合的重要性，不仅旨在提高最终生产率，而且是种子的高生理质量，因为种子是建立该领域作物的第一个输入。

在63/54交叉中获得的结果及其往复式54/63交叉，与Kocová等人发现的那些不相关。［13.］．作者指出，为了获得更好的杂交耐寒性，更宽容的材料应始终被用作母本。在杂交和57/63 57/64，负杂种优势效应，观察到，这表明第57行是不是一个很好的母本低温条件下突起。

对于品种具有良好的冷应激耐受性，这是非常重要的种子具有快速萌发，并且即使在低温条件下正常发起苗。在这个意义上，凸出百分比的评价是很重要的，以验证该种子有，即使在低温条件下启动的发芽过程，它是至关重要的是，苗迅速而均匀地发展。在表中可以观察到的是什么4在许多根突出百分比值高的材料中，发芽没有观察到显著值。

突出的种子在土壤中的持久性有利于病虫害的侵袭。此外，幼苗长出来的时间越长，它与杂草的竞争就越弱。低活力种子的使用与杂草生物量增加169-210%和作物生产力下降16-21%有关[14.］．因此，幼苗必须具有耐低温的遗传潜力。

在萌发试验中，虽然许多株系有很高比例的突出种子，但这些株系通常不被认为是完全萌发的(表4)．为了耐受低温条件，有必要建立快速且均匀的植物支架，因此不仅要评估种子开始发芽过程的能力，还必须评估种子产生正常的能力幼苗即使在寒冷条件下。通常，杂种萌发的结果高于线的种子中观察到的结果（表4)．这些结果与在萌发和种子活力中观察到杂种优势的若干研究一致[15.，16.，17.，18.，19.］．

这些结果证实了Meyer等人。［20.，说明在胚发育的早期阶段，杂交组合的种子中基因表达量和代谢活性都高于亲本，这就提供了更高的代谢效率，因此杂交组合的表现也更好。

Kollipara等人[21.]在萌发过程中与对照杂交，观察到杂种的杂种优势值较高。作者还观察到,通过冷测试,混合动力车,之间的相互作用和混合发芽值最高的最高质量的血统在该测试中,显示出重要性正确选择女性的母亲或父亲获得种子的耐低温萌发阶段。然而，在本研究中，对冷胁迫更强的耐受性和使用更耐受性强的品系作为母本之间的直接关系尚未确定。

Cabral等人还报道了非添加性对种子生理素质的主要重要性。［22.在一个完整的倒数双列杂交评估10爆米花品系的种子时]。类似的结果戈麦斯等人的报道。［15.]对于热带玉米种子的生理品质，其中作者得出结论，GCA和SCA对GCA和SCA有显着影响，并且非添加剂效应对于苗木出现，发芽速度指数，空中部位长度和根部的效果更为显着幼苗，出现速度等。

在玉米品种萌发过程中的耐寒性中，重新证明是显着的，并且易受易受X耐受性横向的耐受性X的优越性显着。这种相互效应的重要贡献是由于母体效应。值得注意的是，耐寒性的母体效果与父母系列的身份有关，表明母体效果越大，母体效果越大[23.］．

根据Cockerham和Weir [24.，则可在母性和非母性影响中展开。这种展开可以推断RE的遗传原因。母质效应是由细胞质基因或细胞质与核DNA之间的相互作用引起的，因此该性状是可遗传的，可以在育种程序中加以利用，而非母质效应则直接与环境效应有关。在选择杂交组合时，一旦证明母本对种子质量有影响，就应考虑母本效应的发生。RE的发现对于了解萌发过程中耐冷性的遗传控制具有重要意义，有助于育种家对该性状做出更果断的决定。

耐寒性是一个复杂的性状，与生理品质、生化特性和抗氧化酶表达等多种因素有关。这些酶对活性氧(ROS)的去除很重要。在高等植物中，ROS是在正常的有氧代谢过程中产生的，如光合作用和呼吸作用。然而，在应激条件下，如低温，会产生更高水平的ROS，这会导致DNA、蛋白质和脂质受损。在生物和非生物胁迫下，抗氧化酶在清除这种ROS中发挥重要作用[25.］．

CAT是一种抗氧化酶，能催化过氧化氢转化为水，保护细胞免受自由基氧化。种子的新陈代谢越快，活性氧的产生就越多，而且这种产生在逆境条件下更加突出。CAT在杂交种中的表达相似，说明低温湿润玉米籽粒时，该酶的表达存在杂种优势效应。EST参与酯水解反应，作用于种子的膜磷脂，引起脂质过氧化。值得一提的是，膜的稳定性是种子耐低萌发温度的基本因素之一。

根据Menezes等人[26.]，耐热蛋白在不同品质的玉米种子中具有多态性和稳定性，是优良的品种鉴定标记。Fu等人[27.， 12 ~ 40 KDa的耐热蛋白在萌发过程中起保护作用。作者还认为这些蛋白与种子萌发过程中杂种优势的出现有关。以品系54为母本时，品系54耐热蛋白的表达量高于品系64，这可能是品系54作为母本时杂交种性能较好的原因。

参与抗寒性的机制也已通过转录物表达在一系列物种的研究，包括拟南芥［28.)、小麦(29.]和大麦[30.］．Real-time PCR能够对目的基因表达进行定量分析，从而更深入地分析基因对感兴趣特征的影响。基因表达分析结果显示，在干燥的种子中，在10℃湿润4天和7天后，基因表达均有变化。

SAN将饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸，并且该转化率是低温条件下植物耐受性的重要机制。在拟南芥，低温强烈诱导去饱和酶(FAD8)的表达[31］．刘等。［32]研究了去饱和酶的表达（lefad7.(4°C)冷胁迫诱导，高温(45°C)抑制。在水稻,OsFAD2建议基因赋予在温度下产生的植物对植物的应力阻力不理想[33］．

植物酶抗氧化防御系统主要由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)组成。APX是一种利用抗坏血酸来中和过氧化物的蛋白质，这些蛋白质是植物细胞中主要抗氧化剂的一部分。当超氧化物作为光合作用或NADPH氧化的副产物产生时，SOD迅速将超氧化物转化为相对稳定和中性的过氧化氢(H₂O₂）分子。APXS清洁过氧化氢并中和它们通过抗坏血酸 - 谷胱甘肽周期[34］．

脱落酸(ABA)是一种已知的植物激素，它调节植物对逆境的发育和生长反应，调节种子休眠的启动和维持[35］．ABA稳定种子的休眠状态，以确保萌发仅在足够的环境条件下发生[36］．

遗传控制分析结果显示，玉米种子在萌发过程中存在杂种优势和RE，且与蛋白质和基因表达结果相关的非母性效应影响较大，这些都增强了玉米种子耐冷性的复杂性。非加性效应的重要影响，杂种优势和RE的存在，加强了杂交组合检验的重要性，以及选择哪一个亲本作为母本和哪一个亲本作为父本的重要性。

可以认为，研究的重点放在与生物化学和分子分析杂交组合的研究可以用来更好地了解参与耐受非生物胁迫，并有助于选择和材料的开发耐受这些应力的机制。

本研究结果表明，玉米种子萌发过程中的耐冷性具有杂种优势，其中非加性基因效应的贡献更大。在萌发过程中，过氧化氢酶的表达量增加，在湿、冷处理7 d后，过氧化氢酶的表达量增加;而耐热蛋白则表现出相反的效果。APX、SOD和ZMMPK5基因型中的基因和在潮湿条件下响应低温。最重要的是，结果揭示了评估杂种组合及其互殖交交叉的必要性，以确定最佳的混合组合，以改善苗木建立下一代的耐寒性。

种子生产

这项研究是在拉夫拉斯联邦大学（UFLA）进行，在拉夫拉斯，MG，巴西。With a latitude of 21°14′ S, 40°17′ W longitude and altitude of 918.80 m. This region presents a Cwb climate in the Koppen classification. The average annual temperature is 19.4 °C and rainfall is mainly distributed from October to April, with annual values of 1529.7 mm.

选用6个玉米品系，其中耐低温品系3个(91、64和63)，不耐低温品系3个(44、54和57)。材料的选择是根据Silva-Neta等人的研究结果进行的。[1］．植物材料是由拉夫拉斯联邦大学的玉米育种计划提供的。一种用于六行的乘法和生产杂种字段被安装在包括正反交的局部双列杂交方案。因此，制作的24个玉米基因型的种子。

土壤是根据化学分析进行常规准备和施肥的。行距0.8 m，每线米7株。根据玉米栽培推荐施肥和其他栽培处理进行了覆盖施肥。在35°C人工干燥，直到种子含水量达到13%左右。为了评价玉米种子的生理和生理品质，测定了水分含量，并在10℃和25℃条件下进行了发芽试验。

The water content was determined by the greenhouse method at 105 °C for 24 h, using two subsamples of each material, according to the Brazilian Rules for Seed Analysis - RAS [37］．结果以平均湿度百分比表示，并确保每种材料的水分含量接近13%。在每个温度下，用浸水2.5倍于干纸重量的蒸馏水浸湿最生型纸，共4个重复，共50粒种子进行发芽试验。卷装在塑料袋中，并保存在b.o.d型室中，温度调节在10和25°C(+或- 3°C)。

在10℃条件下，某些材料的根突出现象需要21天，因此在播种后4、7、14和21天进行评估。结果以4个重复中正常发芽苗的平均百分比表示。具有至少1cm主根、两个至少1cm不定根和1cm地上部(枝条)的幼苗被认为已充分发芽。还计算了所有胚根生长在0.5 cm以上的幼苗的突起率。

对于10℃和25℃的萌发试验，进行以评估种子的生理质量，使用具有四种复制的完全随机化设计，并且每次复制在不同的生长室中为每个温度完成。通过分析斯科特肾旋转试验比较5％水平的方差和手段，统计解释数据。分析在统计计划R.中进行。

一般和特殊结合能力的估计以及产妇和非产妇的相互影响

在方差分析的基础上，将各处理的平方和分解为一般配合力(GCA)、特定配合力(SCA)和交互效应，后者表现为母源效应和非母源效应。采用Griffing模型[38，来描述实验观察结果，我们有以下描述:

在哪里：

I = 1, 2，…p,p= 3，对应第1组种子生理品质较低的品系;

J = 1, 2，…p,p = 3, which corresponds to group 2, lines with high physiological quality of seeds;

Yij：第1组第1族生物的杂合组合的平均值，第2组的第j族药物;

μ：总体均值;

Gi:组1第i亲本一般配合力的影响;

Gj:第2组第j亲本一般配合力的影响;

Sij:分别为组1和组2中雌雄i和j间的特定配合力的影响;

Rij:交叉的交互效应:Rij = Rji, E (Rij) = Rij;和。

平均实验误差。

假设所有效果都在该分析中固定，以估计父母的影响，因此，施加了一些限制，以估计GCA，SCA和互惠性，母体和非母体效应。如：ΣGi= 0;ΣSij= 0，每个j为sij = sji;RJI = RIJ;Σmi= 0;Σnmi。nmij = -nmji =Σnm.j= 0。

蛋白质分析

耐冷性差异最大的品系54和64的种子[1)，以及它们之间杂交组合的种子和它们的反义词。分析用干燥的种子和在10°C下湿润4天和7天的种子进行。

为了萃取耐热蛋白质，将种子在液氮中研磨。然后加入缓冲液（50mM Tris-HCl-7.5,500mM NaCl，5mM MgCl 2,1mM PMSF）（材料重量：提取缓冲液的体积），转移到上清液Microtubes容量为1500μL。将样品以14,000rpm和4℃离心30分钟。在85℃下使用15分钟的水浴孵育上清液，并以相同的方式再次离心样品。后者将上清液倒入微管中，颗粒丢弃。在施加到凝胶之前，含有70μl萃取+40μL样品缓冲液（2.5mL甘油，0.46g SDS，20mg溴苯酚蓝色和完成至20mL Tris提取缓冲液，pH7.5）的样品管均置于a中沸水水浴5分钟[39］．每孔加入50 μL的蛋白+样品缓冲液，用12.5%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶(分离凝胶)和6%的浓缩凝胶(浓缩凝胶)进行分离。电泳在120 V下进行，考马斯蓝在0.05%(水稀释)下染色12小时，在10%醋酸溶液中染色[40］．

对过氧化氢酶(CAT)和酯酶(EST)的提取，种子在液氮中粉碎，然后用0.2 M Tris HCl缓冲液(pH 8.0，含0.1%巯基乙醇，100 mg组织/ 250 μL缓冲液)进行提取。旋流后放入冰箱保存12小时，4℃14000 rpm离心30分钟。蛋白(60 μL上清)用4.5%(浓缩凝胶)和7.5%聚丙烯酰胺凝胶(溶解凝胶)分离。电泳在120 V下进行5 h。按照Alfenas的方法对凝胶进行染色[40，以显示酶的活性。

qRT-PCR表达分析

表达分析使用品系54和64的种子，以及这两个品系的杂交组合及其互交的种子。在干燥的种子和在10°C下湿润4天和7天的种子上进行分析。

在RNA提取，将种子在液氮中研磨，然后加入纯链接RNAPlant®试剂（Invitrogen），按照生产商的手册的规格。核酸提取后，将样品用DNase - 自由处理以消除任何DNA污染。为此，DNA酶的TurboFree®试剂盒（Ambion）中使用。为了验证DNA去除的有效性，进行常规PCR反应。作为阳性对照，使用玉米基因组DNA的样品。

经提取纯化后，以mrna为模板进行cDNA合成。cDNA Reverse Transcription cDNA®kit (Applied Biosystems)根据制造商推荐的协议使用。用标准PCR验证了cDNA的合成效率。在本分析中，以玉米基因组DNA样本，使用构成基因泛素对应的引物作为阳性对照。制备1.5%琼脂糖凝胶，用溴化乙啶染色。

通过在Genbank中搜索玉米序列的基因组数据库来发现所选靶基因的序列（www.maizegdb.org)．基于这些序列，利用Primer Express 3.0软件(Applied Biosystems)设计引物。所用引物序列如表所示7．作为参考基因，使用泛素基因。

选用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR仪(Applied Biosystems)和SYBR Green对所选基因进行表达分析。从干燥和湿润的种子中获得的cDNA样本在10°C下浸泡4天和7天，用于生物3个重复。用绝对定量稀释曲线确定引物的效率。引物效率在97.45 ~ 102.71之间。

在表达分析中，每个反应使用1 μL的cDNA(稀释1:5)、0.4 μL的引物正向/反向(10 μM)和5 μL的Master MixSYBR green (Applied Biosystems)，最终体积为10 μL。样品被移液成技术3个重复，每对引物都包含一个无cDNA对照(NTC)。结果用内参基因泛素表达得到的阈值循环(CTs)进行归一化。CT由反应中产生的荧光穿过阈值周期(CT)的周期数决定。用Pfaffl法分析相对表达[41］．反应的热条件为:起始温度为50℃时2 min, 95℃时10 min, 95℃时15 s, 60℃时1 min，循环40次，95℃时15 min。在循环结束时，利用60-95℃的变性曲线评价PCR反应的特异性。

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

QTL：

定量特质基因座

GCA：

一般结合能力

SCA:

具体的结合能力

CT：

阈值周期

再保险:

相互影响

ROS:

活性氧

猫:

过氧化氢酶

美东时间：

酯酶

SS：

干种子

悲伤:

假定的stearoyl-ACP desaturase

草皮：

超氧化物歧化酶

APX型:

抗坏血酸过氧化物酶

ZMMPK5：

丝裂原活化蛋白激酶

ABA：

脱盐酸

不适用。

这项工作得到了巴西国家科学和技术发展委员会(CNPq)和巴西联邦研究生教育支持和评估机构(Capes - Finance Code 001)的财政支持。资金被用于研究的设计、分析和数据解释以及手稿的写作。

从属关系

1. Helix Sementes，帕托斯德米纳斯，巴西米纳斯吉拉斯州

   Izabel Costa Silva Neta & Milena Christy Santos

2. 巴西米纳斯吉拉斯州拉夫拉斯联邦大学农业部

   Édila Vilela de Resende Von Pinho, Danielle Rezende Vilela, Heloisa Oliveira dos Santos, Renzo Garcia Von Pinho & Renato Coelho de Castro Vasconcellos

3. 拜耳作物科学，São保罗，São保罗，巴西

   薇薇安·玛丽亚·德·阿布鲁

4. 先正达(Syngenta)， Uberlândia，巴西米纳斯吉拉斯州

   里卡多·奥古斯托·迪尼兹卡布拉尔费雷拉

贡献

ICSN、EVRVP、HOS和RGVP设计了实验。ICSN、VMA、DRV和MCS进行实验。ICSN, RADCF, RCCV对数据进行分析并撰写论文。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应于雷纳托·科埃略·德·卡斯特罗·瓦斯康塞洛斯．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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