子推子发育过程中碳水化合物代谢和内源激素调节的变化GydF4y2BaLycoris Radiata.GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

Lycoris.GydF4y2Ba种具有很大的观赏和药用价值;但再生效率低，严重制约了其工业化生产。了解该属植物的鳞茎繁殖机制，可为提高该属植物的繁殖效率提供理论依据。因此，我们研究了微球的形成和发育过程GydF4y2BaLycoris Radiata.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们发现，在鳞片和基板的最内层和基板的结块上形成了推子，并且最初作为腋芽呈现并逐渐地发展成器。我们还确定在推子启动和发育过程中碳水化合物和内源激素含量的变化，以及参与碳水化合物代谢和激素生物合成的基因的表达模式和通过转录组分析的信号传导。通过内尺度的淀粉合成来运输从外鳞片中衍生自淀粉降解的可溶性糖通过内尺度的淀粉合成来运输到并促进子弹开始和发育。该方法由涉及碳水化合物代谢的几种基因介导，特别是编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶的基因，这是一个关键的淀粉合成酶。至于激素，内源性IAA，GA和ABA含量分别在推子启动和开发中分别增加和减少，其与参与IAA，GA和ABA合成和信号转导的基因的表达模式一致。此外，Zr含量的降低分别可以分别通过CK生物合成和降解相关基因来下降和上调，随着增长率含量的增加。此外，增加了与Br，Ja和Sa生物合成相关的基因的表达水平，而乙烯生物合成基因的基因的表达水平降低，这也与其信号转导基因的表达模式一致。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究为碳水化合物代谢和内源激素调节在控制糖尿病中的作用提供了理论依据GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba推子启动和开发。根据结果​​，提出了几个改进建议GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba生产中的传播效率，这将为未来的研究提供指示。GydF4y2Ba

属GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba包含大约20种物种，其分布在东亚的温水和亚热带地区[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba主要分布在中国西南部和日本。GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba品种具有很高的观赏价值，并能显示极为丰富的花色[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．它们也有很高的药用价值，从它们的球茎中分离出来的生物碱可以抑制病毒、炎症、肿瘤和癌症[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．因此，该属具有巨大的商业开发潜力。但再生效率低。近年来，狂野GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba中国的资源已经过分推翻，以满足日益增长的需求GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba灯泡[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．因此，提高了生殖效率GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba种属是非常重要的，种属主要由种球繁殖效率决定。在GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba种，鳞片由鳞茎的腋部形成，然后逐渐发展成鳞茎[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．不同物种产生子弹的能力是不同的;它是最强的GydF4y2BaLycoris Radiata.GydF4y2Ba， 其次是GydF4y2BaLycoris Sprengeri.GydF4y2Ba和GydF4y2BaLycoris AureaGydF4y2Ba．在其他开花鳞茎的研究中，鳞茎分化受多种因素的调节，包括碳水化合物代谢和内源激素调节[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba，该地区仍未得到充分开发GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba迄今为止。GydF4y2Ba

碳水化合物代谢对于推子形成和发育至关重要。在开花灯泡中，灯泡充满了几种化合物，其中一个主要的化合物是淀粉，用作碳汇。淀粉降解成可溶性糖，可提供碳和能量的植物形态发生，例如叶芽的出现和发育[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．在GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba物种，母灯泡部分中可用于降解的淀粉颗粒作为推子启动和发育的能源[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．在水垢切割繁殖过程中GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba，母鳞片中的淀粉含量下降，而在推子中，它同时增加[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．在推子发育过程中碳水化合物化合物的变化研究GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba在此过程中揭示了对蔗糖和淀粉代谢的强烈调节[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．然而，我们对碳水化合物代谢作用的认识GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba在子弹的形成和发展过程中是非常有限的。GydF4y2Ba

球茎再生过程在GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba物种与水稻，拟南芥，诱饵和豌豆等种类的腋芽起始过程非常相似[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．在这些物种中，芽的生长受到环境和内源性信号(如植物激素)相互作用的调节[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]．生长素和独脚金内酯(SLs)抑制芽的生长，而细胞分裂素(CK)促进芽的生长[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．芽外产生的激素信号传导主要是由Teosinte分支的转录因子（TB1）/分支1（BRC1）：SLS促进，而CK抑制其表达[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]．此外，脱离酸（ABA）的作用最近待焦点，因为它证明BRC1通过Homeobox蛋白（HB）21，HB40，HB53和9-CIS-环氧丙酸二氧化基因（nced）的转录激活促进ABA积累3，从而抑制芽的发展[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．此外，凝胶酸（Ga）和芸苔类固醇（Brs）可分别抑制和促进芽外生长[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]．然而，报告的激素调节期间GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba鳞茎再生相当有限。最近的研究在GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba鳞茎生长表明，增加生长素而降低细胞分裂素含量可能有助于促进鳞茎生长和发育，而单独增加细胞分裂素可促进鳞茎起始[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．此外，最近的研究表明，GA促进射击生长和繁殖，而ABA，氨基氧化氨酰和氯化物氯化物显着改善的推子质量参数，如平均尺寸[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．此外，在GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba，外源性施用的Ga生物合成抑制剂患者，具有抑制作用，其与电器的天线和根部部位的浓度相称，具有低浓度促进和抑制子推子发育的高浓度[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．然而，这些研究评估了外源激素对胚珠发育的影响;内源激素在胚珠形成过程中的调节变化GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba有待分析。GydF4y2Ba

在本工作中，我们研究了在GydF4y2BaLycoris Radiata.GydF4y2Ba结果表明，在此过程中，小麦碳水化合物含量、淀粉合成、代谢酶活性、内源激素含量以及碳水化合物代谢、激素合成和信号转导相关基因的表达模式均发生了变化。我们希望我们的研究结果能够更好地理解胚珠形成和发育过程中碳水化合物和激素的调控GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba，这将有助于今后提高生殖效率的研究GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba物种。GydF4y2Ba

苗期鳞茎形成和发育的形态学描述GydF4y2BaLycoris Radiata.GydF4y2Ba

通过两个月的观察，在制备的切片GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba球茎形成过程可分为球茎起始(处理后0 ~ 7 d)和球茎发育(处理后7 ~ 60 d)两个阶段。小芽由腋芽形成，腋芽在鳞片最内层与基板交界处形成。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.新形成的腋芽从7dat开始伸长并逐渐发育成鳞茎(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

转录组测序，GydF4y2Ba新创GydF4y2Ba装配和unigenes的功能注释GydF4y2Ba

用于rna测序(RNA-seq)分析GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba分别在0、1、3、7、14、30 DAT(分别命名为B0、B1、B3、B7、B14、B30)上对鳞茎起始发育、腋芽形成区和新形成鳞茎区进行采样，包括3个生物重复。RNA-seq产生了7000 - 7700万原始读取，每个库有超过6.7 Gb的数据(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。剔除低质量reads和适配器序列后，每个文库获得6600 - 7100万个干净reads并用于GydF4y2Ba新创GydF4y2Ba， Q20和Q30的百分比分别高于97和89%(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。将所有Contig组装成114,638个非冗余unigenes，平均长度为1406 bp（n50 = 1946 bp）（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：表S2）。GydF4y2Ba

所有unigenes都是基于Blastx的七个公共数据库的und，包括NR，NT，Swissprot，Kegg，Kog，PFAM以及Go。总共，在至少一个数据库中，94,264 unigenes（总基因的82.23％）在至少一个数据库中注释，每个数据库中的注释的未成年人数在表中显示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．其中，所有数据库中注释的unigenes达12,732个，占基因总数的11.11%。GydF4y2Ba

分析差异表达基因（DEGS）GydF4y2Ba

我们鉴定了胚珠起始(B0, B1, B3, B7)和发育(B14, B30)阶段的DEGs。比较B0与B1、B0与B3、B0与B7亚样本组起始阶段的差异。B0与B1、B0与B3、B0与B7的差异表达基因分别为34131、33214和43892个(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba此外，B0对B1、B0对B3、B0对B7的特异性deg分别为7254、3558和14067个，三种比较均鉴定出18,606个deg(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种）。在亚样品组中，也比较了发育阶段的DEGS，即B7对B14和B14对B30，更恰当地反映了该阶段的基因表达的变化。共有11,824和17,241℃分别鉴定为B7与B14和B14与B30，其显着小于在子引发阶段期间鉴定的含量的数量（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac, d)。GydF4y2Ba

推子启动和开发中的推子和母鳞淀粉和可溶性糖含量的变化GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba

在鳞茎的起始和发育过程中，淀粉含量先下降，在14d时达到最低点，然后上升。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa).可溶性糖含量在前3天呈先下降后上升趋势，在45天达到峰值(图3)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

先前的研究表明，母灯泡部分可以作为推子启动和发展的能源[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]，我们之前报道，母尺度可以分为三层，每个层可能不同地贡献推子启动和开发[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．因此，我们还测定了鳞茎起始和发育过程中母鳞片外层、中层和内层碳水化合物含量的变化。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac, d)。我们发现，中层淀粉含量，特别是外层鳞片的淀粉含量持续显著下降(图3)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac)，而内层鳞片的淀粉含量下降速度低于其他层(图3)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac).可溶性糖含量在鳞片中部和鳞片内部的变化相似，先轻微下降后上升(图3)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad);而外层鳞片的糖含量不断下降，这与淀粉含量的变化相似(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad)。GydF4y2Ba

与碳水化合物代谢相关的degGydF4y2Ba

我们鉴定了与碳水化合物代谢相关的38个基因，这些基因在至少一个比较中差异表达（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S3），其表达式图案显示在图2中的热线图中。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba湾在这些DEG中，七种编码蔗糖合成酶的基因（GydF4y2Ba苏GydF4y2Ba)和3个编码udp -葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)的基因在胚珠形成过程中显著上调，而在胚珠发育过程中则显著下调，且这一趋势尤其明显GydF4y2BaSUS2GydF4y2Ba（UNI_7393）和UGPA（UNI_28319）（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab).另外，除了GydF4y2BaSS3.GydF4y2Ba(CL7807_C1和C2)和GydF4y2BaAGPL2.GydF4y2Ba(CL7619_C2)，编码淀粉合成酶的几个基因，包括GydF4y2BaSS2GydF4y2Ba（cl1875_c2和c6），GydF4y2BaGBSS1.GydF4y2Ba(CL6155_C2和C4),GydF4y2BaAGPS2GydF4y2Ba(CL5192_C2),GydF4y2BaAGPL2.GydF4y2Ba(CL7890_C3)、编码淀粉合成酶(SS)、颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)和ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大小亚基的表达模式均与上述3个亚基的表达模式相反GydF4y2Ba苏GydF4y2Ba基因;这些基因主要是下调，或者它们的表达在子引发期间没有显着变化，而它们在推子发育期间上调。GydF4y2Ba

蔗糖还可以通过转化酶(INV)、果糖激酶(FRK)和磷酸葡萄糖合成酶(PGM)介导的另一途径代谢(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba然而，在胚珠形成过程中，编码这些酶的基因，包括GydF4y2BaFRK1-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaPGMP.GydF4y2Ba，显著下调(图。GydF4y2Ba4B.GydF4y2Ba)，提示SUS和UGPase途径可能是小麦胚芽形成过程中蔗糖的主要代谢途径GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

淀粉可以通过α -淀粉酶(AMY)、β -淀粉酶(BMY)和异淀粉酶(ISA)降解为葡萄糖和麦芽糖(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA)，导致淀粉含量的减少。在我们的研究中，几乎所有的基因编码淀粉代谢酶，特别是GydF4y2BaBAMY1GydF4y2Ba(CL10992_C2)和GydF4y2Baisa3.GydF4y2Ba(CL10455_C2)，在球芽形成过程中显著下调(图1)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

胚珠形成过程中淀粉合成酶的活性与基因表达GydF4y2Ba

在推子开始和发育期间，我们测量了三种淀粉合成酶（AgPase，SS和GBSS）的活性的变化。AgPase活性显示出在整个发育过程中三种酶中最显着的增加（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa). SS和GBSS活性在鳞茎形成过程中没有显著变化，但在鳞茎发育过程中有所增加(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。GydF4y2Ba

我们选择了六种候选基因通过定量逆转录（QRT）-PCR来验证RNA-SEQ数据，结果与RNA-SEQ结果吻合良好（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab)。GydF4y2BaSUS2GydF4y2Ba和GydF4y2Baugpa.GydF4y2Ba在胚珠形成过程中表达量显著增加，随后在胚珠发育过程中表达量下降。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab).有趣的是GydF4y2BaSS2GydF4y2Ba和GydF4y2BaGBSS1.GydF4y2Ba与那些相反GydF4y2BaSUS2GydF4y2Ba和GydF4y2Baugpa.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab).与其他4个基因不同，表达水平GydF4y2BaAGPL2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAGPS2GydF4y2Ba编码AgP酶的基因，其较大和小亚基，在整个子弹开始和发育阶段增加（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab），其与AgPase活性的变化一致。GydF4y2Ba

胚珠形成过程中四种内源激素含量的变化GydF4y2Ba

测定了4种主要内源激素(吲哚-3-乙酸(IAA;最常见的生长素)，玉米苷核苷(ZR;一种细胞分裂素)，GAGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba和ABA，在鳞茎起始和发育过程中。IAA和GAGydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba在0 ~ 30 DAT时，GA含量呈先增加后降低的趋势GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba内容在前3个DAT上以比IAA更低的速率增加（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa, b).有趣的是，ZR和ABA含量的变化非常相似;从0到14 DAT，这些激素先是快速下降，然后略有上升(图1)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa、b)。GydF4y2Ba

与激素生物合成和信号转导的次数GydF4y2Ba

我们鉴定了大量与胚珠形成和发育过程中IAA、CK、GA、ABA、BR、茉莉酸(JA)和乙烯等激素的合成和信号转导相关的基因。值得注意的是，这些deg大多数与IAA有关(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba额外的文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S4）。GydF4y2Ba

IAA.GydF4y2Ba

我们鉴定了60只参与生长素生物合成和信号转导。至于植物合成途径，两个GydF4y2Bayucca.GydF4y2Ba基因调节。具体地说,GydF4y2BaYUC10GydF4y2Ba（UNI_30382）在1 DAT上下调，但此后显着上调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2BaGH3GydF4y2Ba基因（特别是，GydF4y2BaGH3.1GydF4y2Ba（UNI_24954）），编码IAA-AMIDO合成酶，其将IAA与氨基酸缀合，从而降低IAA浓度[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba，在子弹形成过程中被下调。GydF4y2Ba

植物素信号传导涉及通过一类养肝剂受体激活或抑制基因表达，包括F箱蛋白转运抑制剂响应1（TiR1）和生长素响应因子（ARF）[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．ARF的活性部分是通过与生长素/吲哚乙酸(Aux/IAA)阻遏物的相互作用来调节的[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]，这是一种毒素诱导和功能，作为疾病响应的关键调节剂[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]．在我们的研究中，有两个GydF4y2BaTIR1GydF4y2Ba基因（CL673_C10和C11），GydF4y2BaIAA6GydF4y2Ba（UNI_2289，UNI_8701），以及，特别是，GydF4y2BaIAA30GydF4y2Ba（CL11240_C2）在子引发期间上调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.在推子发育期间也上调IAA30（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.然而,除了GydF4y2BaARF2AGydF4y2Ba（cl12069_c1），GydF4y2BaARF12GydF4y2Ba（cl1132_c3），和GydF4y2BaARF19GydF4y2Ba（cl5386_c7），GydF4y2BaARF.GydF4y2Ba在球囊形成中下调或未显着改变基因。在其他几种物种中，ARF表达由毒素升级或下调[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba，可能是通过反馈循环[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

Saur.GydF4y2Ba（小型胃辘RNA）基因先前据报道，响应于外源性疾病表现出表达的快速且比，这能够调节毒素合成和运输并影响细胞扩张[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．在我们的研究中，几个GydF4y2BaSaur.GydF4y2Ba基因，特别是，GydF4y2BaSaur50.GydF4y2Ba(Uni_1130),GydF4y2BaSaur61.GydF4y2Ba（cl2078_c2），和GydF4y2BaSaur61.GydF4y2Ba（Uni_7999）上调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)，这可能与球茎形成过程中IAA含量的增加有关。GydF4y2Ba

参与控制植物素分布的基因也被毒素处理诱导。这GydF4y2Ba引脚形成GydF4y2Ba（GydF4y2Ba别针GydF4y2Ba)生长素流出载体基因家族和生长素流入载体生长素1 (LAX)家族控制生长素的分布，建立和维持植物组织中生长素的浓度梯度[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．我们的结果表明GydF4y2Ba别针GydF4y2Ba基因，包括GydF4y2BaPIN1AGydF4y2Ba（cl11901_c2），GydF4y2BaPIN1CGydF4y2Ba（cl11901_c4），和GydF4y2BaPIN7C.GydF4y2Ba(L2026_C2),GydF4y2BalGydF4y2Ba基因，除了GydF4y2BaLAX2GydF4y2Ba，在子引发期间显着上调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

ZRGydF4y2Ba

在顶端优势中的芽活性控制中，Cytokinins拮抗植物蛋白，因此代表了用于助长信号的可能的第二个信使[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．在此保持一致，Zr内容物与子弹启动和发育期间的IAA含量相比显示相反的趋势（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).然而，与CK生物合成相关的基因包括GydF4y2BaIPT5.GydF4y2Ba(编码磷酸腺苷-异戊烯基转移酶，CK生物合成的关键酶)，GydF4y2Balog1.GydF4y2Ba和GydF4y2Balog5.GydF4y2Ba（编码细胞分裂素核苷5'-一磷酸磷酸磷酸酶，一种催化生物活性CK合成的最终步骤的CK活化酶），和GydF4y2BaCYP735A1GydF4y2Ba（编码催化反式扎带的生物合成的细胞因子水解酶）（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba），大多是在推子形成的早期上调的。这可能意味着在此期间提高CK合成。然而，Zr内容物降低（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab），这可能是由于CK降解的增加。编码细胞分裂素脱氢酶（CKX）的基因，包括GydF4y2BaCKX3.GydF4y2Ba(CL4293_C3和C4)和GydF4y2BaCKX11GydF4y2Ba(Uni_25098)，在球芽形成过程中显著上调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.组氨酸激酶(AHK)编码基因，与CK信号转导有关，包括GydF4y2BaAHK3GydF4y2Ba到GydF4y2BaAHK5GydF4y2Ba，表达下调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)，表明在胚珠形成过程中CK活性降低。GydF4y2Ba

遗传算法GydF4y2Ba

至于GA代谢，有四种GydF4y2BaGA2OXGydF4y2Ba编码Ga2-氧化酶的基因，催化生物活性Ga或其前体的失活[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba，均显著下调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)，这可能有助于增加内源GA含量。至于GA信号转导，三GydF4y2BaGID1CGydF4y2Ba基因编码一个和两个GA受体GydF4y2BaSLR1.GydF4y2Ba编码DELLA蛋白的基因表现出相反的表达模式;它们分别上调和下调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

植物特异性GA刺激的拟南芥（GydF4y2Ba气体”GydF4y2Ba）基因家族在激素反应，防御和发展中发挥作用[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]．我们确定了无数GydF4y2Ba气体”GydF4y2Ba这些基因在胚珠起始和发育过程中有差异表达，其中大多数基因表达上调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.这意味着GydF4y2Ba气体”GydF4y2Ba基因可能在胚珠的形成中起重要作用。GydF4y2Ba

阿巴GydF4y2Ba

NCED，由GydF4y2Banced.GydF4y2Ba基因家族是植物中ABA生物合成的速率限制酶。在我们的研究中，显着下调Ncce基因，特别是Nced3（Cl7385_C1和C2）（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.在ABA信号转导途径，ABA受体GydF4y2BaPYL8GydF4y2Ba基因被下调，而GydF4y2BaPYL4GydF4y2Ba基因调节。此外，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(GydF4y2BaSAPKGydF4y2BaABA信号转导相关基因的表达大多下调(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba），暗示ABA信令被抑制。GydF4y2Ba

其他激素GydF4y2Ba

我们没有评估内源性BR，乙烯，JA和SA内容物的变化，但我们预测其在通过分析与这些激素相关的基因表达水平的变化来控制子制片的功能。GydF4y2Ba

至于BR,GydF4y2BaCYP.GydF4y2Ba基因，编码细胞色素P450酶，参与BR生物合成，显著上调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.这表明BR可能正调控小球的形成。与此一致的是，参与BR信号传导的基因，包括GydF4y2BaBak1.GydF4y2Ba（芸苔类固醇不敏感的1相关激酶1），GydF4y2BaBSK3GydF4y2Ba（BR信号传导激酶3），和GydF4y2BaBZR1GydF4y2Ba（铜唑氏抗性1），全部上调。GydF4y2BaCYCD3-2GydF4y2Ba（UNI_2492）也上游，其在BR信令下游的函数，是上游的（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

乙烯生物合成和信号转导相关基因的表达与br相关基因的表达趋势相反。在乙烯生物合成途径中，GydF4y2Ba地空导弹/ METKGydF4y2Ba(编码s -腺苷蛋氨酸合成酶)GydF4y2BaACS1.GydF4y2Ba（编码1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶）显着下调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.乙烯信号基因，包括GydF4y2BaETR2GydF4y2Ba(编码乙烯受体2)，GydF4y2BaEIN3.GydF4y2Ba(编码乙烯不敏感3)，和GydF4y2Ba小块土地GydF4y2Ba（编码乙烯响应转录因子2），显着下调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.此外,GydF4y2BaCTR1GydF4y2Ba（编码组成型三响应1，上调乙烯信号传导的负调节剂）。这些结果表明，乙烯可能会产生负面调节后的形成。GydF4y2Ba

JMT.GydF4y2Ba(编码与JA生物合成相关的JA o -甲基转移酶)GydF4y2Bajar1.GydF4y2Ba(编码JA-amido合成酶，这与JA信号有关)都上调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.然而,GydF4y2BatGydF4y2Ba基因家族，包括GydF4y2Bajaz.GydF4y2Ba基因(编码JA ZIM结构域蛋白)，其产物在JA信号转导中起抑制因子的作用[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba)，大部分为下调(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2BaICS1GydF4y2Ba(编码异染色质合酶1)和GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba(编码苯丙氨酸a8解氨酶)，与SA生物合成有关GydF4y2Ba美国国家公共电台GydF4y2Ba参与sa信号转导的基因均显著上调(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.这些结果暗示JA和SA是推子形成的正稳压器GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

我们选择了涉及激素生物合成和信号转导的几个基因，其在RNA-SEQ分析中显示出明显且显着的变化，用于通过RT-PCR验证（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.总的来说，结果与RNA-seq得到的数据一致，说明RNA-seq数据是可靠的。GydF4y2Ba

L. Radiata.GydF4y2Ba是研究鳞茎形成和发育机制的理想种;不同于其他GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba物种或其他开花灯泡（例如，GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba和GydF4y2BaHippeastrumGydF4y2Ba），其中推子随机出现，其中推动机GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba优先产生于鳞片最内层与基板交界处，最初表现为腋芽，逐渐发展为弹丸，易于追踪(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.由于广泛的初步观察，我们可以在腋芽实际出现之前准确地采集到组织样本。在本研究中，我们根据当前腋芽或胚芽的状态，将胚芽按照起始和发育阶段进行划分(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba），我们在这些阶段评估了碳水化合物代谢和激素调节的变化。GydF4y2Ba

淀粉的积累是胚芽发育的关键GydF4y2BaLycoris。GydF4y2Ba当新形成的推子逐渐发展时，推子中的淀粉内容增加（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。砂砂中的可溶性糖含量增加，但在比淀粉的早期时间点处增加（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)。在以前的研究中GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba百合属植物GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaHippeastrumGydF4y2Ba，发现子弹中的可溶性糖来自母鳞片中的淀粉降解[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．与此一致的是，我们观察到母鳞片中的淀粉含量迅速下降，但三层鳞片之间存在差异(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC）。外鳞片显示出淀粉和可溶性糖含量的最快减少，然后是中间鳞片（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC, d)，这意味着淀粉主要在外部鳞片中降解，从那里糖被运输到子弹将开始和生长的地方。GydF4y2Ba

在百合和其他球茎状观赏植物中，蔗糖是球茎中可溶性糖的主要形式[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，占溶于糖分数的70％以上。还原糖大部分地转化为在子鳞片中的蔗糖，并且蔗糖用作淀粉合成的直接基材[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．蔗糖新陈代谢由一系列酶控制，如图2所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa. SUS通常被认为参与蔗糖水解[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba苏GydF4y2Ba在本研究中，在胚珠启动过程中表达水平显著上调(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab,GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB)，表明从母鳞片运输的蔗糖被用来合成淀粉，这将有利于鳞茎的形成和膨大。在匍匐茎发育成新的鳞茎时GydF4y2Ba郁金香属可食的GydF4y2Ba，淀粉是新灯泡中的主要储存物质，并由三个主要淀粉合成相关酶，即AgPase，SS和GBS合成淀粉，来自SUS催化的蔗糖裂解产物[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．在此保持一致，我们发现AGPase，SS和GBSS活动在整个推销开发中增加GydF4y2Ba在L. RadiataGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).然而，在胚珠形成过程中，只有AGPase的活性显著增加(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).这三种酶的基因表达模式与它们的活性变化一致(Figs。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab,GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab），暗示AGPase和编码其亚基的基因是促进子推子形成和发育的主要因素。AGPase是一个主要的淀粉合成酶，已经证明在调节灯泡扩大中发挥主要作用GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．为了支持我们的发现，在GydF4y2Ba唐菖蒲杂交用GydF4y2Ba， AGPase的大亚基，由GydF4y2BaGhAGPL1GydF4y2Ba，有助于剑兰球茎和球茎的质量和数量，如沉默GydF4y2BaGhAGPL1GydF4y2Ba导致较小的羊毛肉豆和更少的鸬鹚[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在模式植物中，小苞的形成与腋芽的生长十分相似，主要受多种激素(尤其是生长素和细胞分裂素)的控制。生长素运输渠化假说认为，茎中生长素的极性运输对芽的生长是必需的[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]．在我们的研究中，内源生长素含量和与生长素合成、信号转导和运输相关的基因表达在鳞茎起始和发育过程中显著增加。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一个,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2BaA)，这与生长素在模式植物中控制芽生长的作用一致。根据基于渠化的生长素运输模型，在茎中建立生长素运输通道是芽生长所必需的，最先发育的芽可以抑制生长素从后生芽运输，从而抑制其生长[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba，这种现象被称为“顶端优势”。同样，在一定范围内发育的鳞茎可能形成了生长素运输的主导通道，从而抑制了其他范围内鳞茎的出现。GydF4y2Ba

CK已被证明促进Bud Forgrowth [GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]．与此相反，在我们的研究中，ZR含量在球胚形成过程中降低(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).在芽的生长调节中，生长素已经被证明下调主茎节点的细胞分裂素合成[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]．虽然CK触发芽激活，但一旦芽生长出来，从新生长的APEX运输的植物蛋白将抑制CK合成[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．在我们的研究中，与CK生物合成相关的基因表达先增加后显著降低(fig。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2BaB)，这可能与生长中的鳞茎中生长素含量的增加有关。同时，CK降解基因在小鳞茎形成过程中上调(fig。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Bab)，这可能是内源CK降低的原因。GydF4y2Ba

在推子启动和开发期间GA含量增加（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab），其与参与Ga合成和信号转导的基因的表达模式一致（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Bab)。类似于植物蛋白，GA抑制芽越来越多。在水稻中，Ga Biosynthesis突变体GydF4y2Basd1GydF4y2Ba展示侏儒症，而GA信号的激活会导致更高的身材[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]和外源GA申请在我们以前的研究中显着抑制了米饭分蘖芽过度[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]．然而，据报道GA可以促进玫瑰腋芽的发育[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba] 和GydF4y2Ba麻风树图GydF4y2Ba[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．此外，根尖维管系统中的GA通过其对生长素运输的影响对植物正常发育是必要的[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba， GA调控PIN-FORMED丰度，是生长素运输依赖的生长和发育所必需的GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]．基于这些结果，我们建议GA的增加促进了推子过度，这也有助于血管系统中的吞噬侵入式毒素传输官能化。GydF4y2Ba

据报道，阿巴抑制了芽越来越[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba，并受到正向调节GydF4y2BaBRC1GydF4y2Ba在此处 [GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaBRC1GydF4y2Ba在腋芽中特异表达，并编码TCP转录因子，抑制芽的生长和分枝[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．与此一致的是，在胚珠形成过程中，ABA含量和ABA合成及信号转导相关基因表达量均降低GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Bab），这意味着ABA对推子过多的抑制作用。GydF4y2Ba

对于其他激素，包括BR、乙烯、JA和SA，我们通过分析它们的合成和信号转导相关基因的表达，间接地研究了它们参与胚珠形成的过程(Figs。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba8.GydF4y2Bac).基于我们的研究结果，我们提出了BR、JA和SA促进胚珠形成，而乙烯抑制胚珠形成的假设。BR正调控水稻芽的生长，因为BR生物合成突变体显示出分蘖数减少[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba[Br生物合成基因的过表达导致更多的分支[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]．虽然少数研究报告了JA，SA和乙烯对模型植物的芽外生病的作用，但一些研究报告了JA的积极作用，特别是SA对根茎或灯泡发展[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba，这支持了我们上述的假设。GydF4y2Ba

基于我们的主要发现，我们提出了一个模型来解释胚珠形成和发育过程中碳水化合物代谢和内源激素的调节GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.在该模型中，可溶性糖，主要来自外鳞片中的淀粉降解，促进子推子引发，用于合成推子中的淀粉以进一步发展。后一种方法是在涉及碳水化合物代谢的几种基因的控制，特别是编码AgPase的基因，这是一个关键的淀粉合成酶。根据我们的结果，我们建议提高糖含量可以通过在组织培养生产中的泡叶片生长培养基中应用糖（例如蔗糖）来实现的推子的增殖效率GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba并在体外的百合子的推子再生中验证了[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．此外，我们提出通过转基因和其他分子生物学方法编码AGPase亚基的基因过表达可能导致AGPase活动的显着促进GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba灯泡可能导致推子的增殖效率更高，并且该建议在唐菖蒲中初步验证[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

此外，我们还提出了一个模型来解释胚珠起始和发育过程中内源激素的变化与激素生物合成和信号转导相关基因的表达之间的关系和相互作用(图)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.球茎生长过程需要内源性IAA和GA的持续支持，其含量不断增加，这可能是受IAA合成基因上调的调控GydF4y2BaYUC10GydF4y2Ba和IAA和GA降解基因的下调和下调GydF4y2BaGH3.1GydF4y2Ba那GydF4y2Bagh3.5，GydF4y2Ba和GydF4y2BaGa2ox1-2，GydF4y2Ba分别。IAA和GA促进小鳞茎发育(如细胞伸长和扩张)的作用可能受以下因素的控制GydF4y2BaSaur.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba气体”GydF4y2Ba基因，受其信号转导基因的下游调控，包括GydF4y2BaTIR1GydF4y2Ba那GydF4y2BaIAA.GydF4y2Ba基因和GydF4y2BaGID1GydF4y2Ba那GydF4y2BaSLR1.GydF4y2Ba德拉(蛋白质)。此外，生长素运输有利于其后续生长，这可能受到生长素运输基因上调的调控GydF4y2Balax3,4.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPIN1 7GydF4y2Ba．内源性Zr和ABA含量显示在子生长期间类似的降低，这可能通过它们的合成基因的下调来调节GydF4y2BaIPT5.GydF4y2Ba那GydF4y2BaLOG3 5 7GydF4y2Ba和GydF4y2Banced.GydF4y2Ba那GydF4y2BaNCED3,GydF4y2Ba分别导致CK和ABA信号转导基因下调。然而，表达水平GydF4y2BaIPT9.GydF4y2Ba那GydF4y2Balog1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYP735A1GydF4y2Ba在胚珠形成过程中表现出增加，说明CK生物合成加速;因此，我们认为ZR含量的下降主要是由于CK降解基因的上调引起的GydF4y2BaCKX3.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCKX11GydF4y2Ba．CK合成和降解基因的表达水平的降低和增加可分别由增加的养肝含量进行调节，这将来应该调查。就Br，乙烯，ja和sa而言，我们没有直接确定其内容的变化，但我们发现Br，Ja，Sa和乙烯生物合成基因的表达水平分别表现出增加和减少，暗示在推子发育期间BR，JA和SA含量增加，而乙烯含量下降。另外，在信号转导中呈正或负面调节的基因的表达模式与它们的合成基因的表达模式一致，支持我们关于BR，JA，SA和乙烯含量的变化的假设。基于这些结果，我们初步评估了内源激素对子推子启动和发展的影响GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba，这可以为应用外源激素提供理论依据，从而提高生产中推子的增殖效率。GydF4y2Ba

本研究分析了金银花胚芽形成和发育过程中碳水化合物和内源激素含量的变化及其基因表达模式GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba．基于这些结果，我们提出了从母鳞鳞片衍生的可溶性糖被运到于引发子推子的区域，支持随后的推子的发育。当推子逐渐发展时，淀粉含量增加，主要由编码AgPase的基因调节，该基因是与淀粉合成相关的关键酶。此外，我们发现内源性IAA和GA含量显示增加，而ZR和ABA含量在推子启动和开发期间降低，这与参与IAA，GA所涉及的基因的表达模式一致GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， ABA的合成和信号转导，提示IAA和GA增加GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba内容对推子过度有益，而ABA则没有。我们还假设可以通过抑制CK合成基因来调节Zr含量的降低，通过养蛋白的增加和CK降解的促进，需要在未来的研究中进行核实。此外，增加了Br，Ja和Sa生物合成基因和正常调节的信号转导基因的表达水平，尽管这种趋势在乙烯的情况下相反，表明Br，Ja和Sa具有促进，而乙烯已经抑制分别对推子形成的影响。GydF4y2Ba

植物材料和治疗GydF4y2Ba

L. Radiata.GydF4y2Ba本研究中使用的材料最初是从中获得的GydF4y2BaLycoris.GydF4y2Ba南京植物园MEM的种质储存库。Sun Yat-Sen（NBG）于2016年5月20日在法律许可下的YCZ和QZL，本材料的凭证标本（样品编号为NAS00571237）已经沉积在NBG的植物标目中。这些灯泡被移植到上海农业科学院（中国上​​海市上海市上海市青浦区）的实验基地2年以上。什么时候GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba7月底植株处于休眠状态，无叶，采球茎，直径2.7±0.2 cm。在去除根茎、干燥鳞片和表面消毒后，鳞茎被切成平均四段，放在搪瓷托盘上，如前所述[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．这些部位用纱布覆盖，每天喷两次蒸馏水以保持湿润。经过这些预处理后，切片置于植物生长室中形成鳞茎，光照时间为14 h /10 h (6000 lx)，温度为25/20°C(昼/夜)，相对湿度为80%。实验于2018年7月31日开始，持续2个月。本试验共制备鳞茎切片200份，共3个重复，每个重复66份或67份。GydF4y2Ba

采样GydF4y2Ba

我们以前观察到推子出现并在最内层的鳞片和基底板的结时出现和发展，其中逐渐发展的腋芽。收集灯泡部分，收集在第0,1,3,7 DAT中，并收集围绕腋芽出苗区的组织样品。在腋芽成长后，在为期两月的实验期间每周收集新形成的片段。我们以前的研究表明，尺度GydF4y2BaL. Radiata.GydF4y2Ba灯泡可以基于形态指数分成三层，每层可能在调节灯泡发育方面具有不同的作用[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．因此，每一段的三层也分别取样。所有材料在液氮中冷冻30分钟，保存在−70℃。GydF4y2Ba

淀粉和可溶性糖含量测定GydF4y2Ba

通过传统的蒽比色度测量淀粉和总可溶性糖的含量[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．样品在液氮中研磨，约0.5 g粉末与4 ml 80%乙醇在80℃下孵育30分钟。提取液8000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba20分钟。在用活性炭脱色后，测量上清液中的可溶性糖。沉淀物连续悬浮在9.2米和4.6米HCLO中GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba除去乙醇 - 可溶性糖残基后提取淀粉。然后使用蒽反应测定总可溶性糖和淀粉浓度。GydF4y2Ba

淀粉合成酶活性测量GydF4y2Ba

酶的提取和淀粉合成酶(AGPase, SS，和GBSS)的活性测定如前所述进行了[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba]．为每个样品制备彻底混合的冷冻灯泡组织（0.5g）。所有程序在0℃至4°C的温度下进行。如上所述地研磨样品。GydF4y2Ba

用缓冲液提取[5ml gGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}含有100mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烯磺酸（HEPES）-NAOH冷冻萃取缓冲液（pH7.5），8mM MgClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，2mM乙二胺四乙酸（EDTA），50mM 2-巯基乙醇，12.5％甘油，1％（0.01g / ml）不溶性。GydF4y2Ba

聚乙烯吡咯烷酮-40）。然后以30000×离心匀浆GydF4y2BaGGydF4y2Ba上清用于AGPase和SSS的测定，沉淀物用于GBSS的测定。AGPase、SSS和GBSS的活性按照前面描述的方法测定[GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba]．基于可溶性蛋白质含量进行比较酶，其通过修饰的Bradford方法测定[GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba]．所有处理试验包括三个独立的重复。GydF4y2Ba

内源性植物激素测量GydF4y2Ba

IAA，ZR，GA的水平GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba， ABA由青岛科技创新质量检测有限公司(中国青岛)测定。样品的提取和纯化如前所述[GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba]，修改。在液氮中首先研磨约0.2g样品。在4℃下加入1ml冷50％乙腈（v / v）后，将样品在50Hz的振动磨机中进一步研磨2分钟，然后超声提取3分钟。在4℃温育4小时后，将样品以12,000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba4°C, 10分钟。上清液用Oasis HLB纯化柱(Waters)纯化，并收集在塑料微管中。样品在NGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，溶于200μl30％乙腈（V / V），并使用0.22-μm膜过滤器过滤。GydF4y2Ba

将纯化产物经受高效液相色谱 - 串联质谱（TSQ量子超，热）分析，使用C18（Agilent Technologies）柱（2.1mm×100mm，1.8μm），流速为0.3mL minGydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}，以溶剂A(0.1%甲醇)和B(乙腈)的梯度按以下配置:1 min, 95% A + 5% B;15分钟，20% A + 80% B;16分钟,100% b;19 min, 95% A + 5% b，柱温40℃，进样量5 μl。MS条件为:喷雾电压分别为3500v (ESI -)和4000v (ESI +)，喷雾温度为330℃。GydF4y2Ba

外部标准方法用于确定激素含量。IAA，ZR，GA的校准曲线GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba和ABA标准是通过7或8个浓度(0、1、5、10、50、100、500和1000 ng/ml)获得的(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：图。S1）。标准的TIC色谱图显示在附加文件中GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba：图。S2。GydF4y2Ba

RNA提取GydF4y2Ba

如前所述进行总RNA提取和cDNA合成[GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]．按照制造商的说明，使用RNAprep Pure Plant Kit(天根生物技术，北京，中国)提取总RNA。在使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, USA)测量RNA的数量和质量后，我们用aGydF4y2Ba_{260/280GydF4y2Ba} = 1.8–2.2 for library preparation. Three biological replicates were used for RNA-Seq.

cDNA文库构建与测序GydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用mRNA- seq样品制备试剂盒(MGIEasy™mRNA library Prep Kit, MGI, Shenzhen, China)构建cDNA文库;如前所述[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba]．聚（a）通过低聚磁吸附来富含poly（a）mRNA。将富集的mRNA分离并用N6随机底漆分段并反转成双链CDNA。测序适配器与纯化的cDNA连接，通过PCR扩增产生了15个双链文库。在北京基因组学研究所的BGiseq-500平台上测序图书馆（GydF4y2Bawww.genomics.org.cnGydF4y2Ba、深圳、中国)。GydF4y2Ba

de-novo.GydF4y2Ba转录组组件GydF4y2Ba

低质量序列，包括碱基不明确的序列、低质量读和带有适配器的读，被从对端原始读中删除。在随后的分析中只使用干净的读取。使用Trinity结合默认参数组装高质量的reads，构建唯一的一致序列[GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

差异基因表达分析GydF4y2Ba

根据FPKM值计算Unigene表达水平。然后，使用NOISeq包识别样本组中的deg [GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba]．基于假发现率<0.05和日志来识别DEGGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba折叠|≥1。GydF4y2Ba

unigenes的功能注释GydF4y2Ba

Unigenes由Blassx注释，针对七个公共数据库，包括NR，NT，Swissprot，Kog，PFAM，Go和Kegg。使用BLAST2GO软件执行GO注释，如前所述[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

QRT-PCR测定GydF4y2Ba

根据制造商的说明书，使用PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa，中国大连)，使用大约500 ng总RNA制备第一链cDNA。该cDNA用于qRT-PCR，在ABI 7500 Fast测序仪上使用SYBR Premix Ex Taq™(Takara, Kyoto, Japan)进行，如前所述[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．GydF4y2Baactin7.GydF4y2Ba（UNI_17610）用作参考基因。每次治疗包含三种生物重复。使用的引物在附加文件中列出GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba：表S5。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

所有统计分析均采用spss16.0进行。采用标准方差分析比较各值的均数，然后进行最不显著差异检验，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的。GydF4y2Ba

所有相关的补充数据均作为附加文件1、2、3、4、5、6、7在本手稿中提供。本研究产生的所有clean read数据均保存在NCBI Sequence read Archive (GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/GydF4y2Ba， SRR10198454、SRR10198463、SRR10198464 (B0)、SRR10198451-SRR10198453 (B1)、SRR10198448-SRR10198450 (B3)、SRR10198447、SRR10198461、SRR10198462 (B7)、SRR10198458 - SRR10198460 (B14)、srr10198457 - srr10198457 (B30)。GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

ACN：GydF4y2Ba

乙腈GydF4y2Ba

ACS1：GydF4y2Ba

1-aminocyclopropane-1-carboxylic酸合酶GydF4y2Ba

AGP：GydF4y2Ba

葡萄糖-1-磷酸亚苯甲酰转移酶GydF4y2Ba

艾米：GydF4y2Ba

阿尔法GydF4y2Ba

东盟地区论坛:GydF4y2Ba

助线响应因子GydF4y2Ba

辅助/ IAA:GydF4y2Ba

生长素/吲哚乙酸GydF4y2Ba

BAK1:GydF4y2Ba

芸苔类固醇不敏感的1-相关激酶1GydF4y2Ba

我:GydF4y2Ba

β淀粉酶GydF4y2Ba

BR：GydF4y2Ba

BrassinosteroidGydF4y2Ba

BRC1:GydF4y2Ba

分支1GydF4y2Ba

BSK3：GydF4y2Ba

BR信号激酶3GydF4y2Ba

BZR1：GydF4y2Ba

BRASSINAZOLE耐1GydF4y2Ba

CK:GydF4y2Ba

cytokinin.GydF4y2Ba

ckx：GydF4y2Ba

细胞分裂素脱氢酶GydF4y2Ba

CTR1:GydF4y2Ba

本构三重反应GydF4y2Ba

DAT：GydF4y2Ba

治疗后的日子GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

ETR2:GydF4y2Ba

乙烯受体2GydF4y2Ba

EIN3:GydF4y2Ba

乙烯不敏感3GydF4y2Ba

ERF：GydF4y2Ba

乙烯响应转录因子2GydF4y2Ba

FPKM：GydF4y2Ba

每百万碱基对测序每百万碱基对的每千碱基片段GydF4y2Ba

FRK:GydF4y2Ba

果糖激酶GydF4y2Ba

遗传算法:GydF4y2Ba

吉布林素GydF4y2Ba

GASA:GydF4y2Ba

GA刺激的拟南芥GydF4y2Ba

GBSS：GydF4y2Ba

Granule-bound淀粉合酶GydF4y2Ba

走:GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

HPLC-MS /女士:GydF4y2Ba

高效液相色谱-串联质谱GydF4y2Ba

IAA：GydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸GydF4y2Ba

ICS1:GydF4y2Ba

Isochorismate合酶1GydF4y2Ba

inv：GydF4y2Ba

逆变酶GydF4y2Ba

ISA:GydF4y2Ba

异淀粉酶GydF4y2Ba

JA：GydF4y2Ba

茉莉酸GydF4y2Ba

JAR1:GydF4y2Ba

JA-Amido合成酶GydF4y2Ba

JAZ:GydF4y2Ba

JA ZIM结构域蛋白GydF4y2Ba

JMT：GydF4y2Ba

JA O-甲基转移酶GydF4y2Ba

Keeg：GydF4y2Ba

Kyoto基因和基因组的百科全书GydF4y2Ba

KOG:GydF4y2Ba

同源组的蛋白质簇GydF4y2Ba

宽松的:GydF4y2Ba

像Auxin1GydF4y2Ba

NCBI:GydF4y2Ba

国家生物技术信息中心GydF4y2Ba

nced：GydF4y2Ba

9-CIS-环氧丙酮蛋白二氧化酶GydF4y2Ba

NR：GydF4y2Ba

NCBI冗余GydF4y2Ba

NT：GydF4y2Ba

核苷酸GydF4y2Ba

朋友:GydF4y2Ba

苯丙氨酸ammonia-lyaseGydF4y2Ba

PGM：GydF4y2Ba

磷素酶GydF4y2Ba

别针：GydF4y2Ba

引脚形成GydF4y2Ba

RNA-Seq:GydF4y2Ba

RNA测序GydF4y2Ba

RT-PCR：GydF4y2Ba

逆转录定量PCRGydF4y2Ba

SA：GydF4y2Ba

水杨酸GydF4y2Ba

萨姆斯：GydF4y2Ba

S-腺苷甲硫氨酸合成酶GydF4y2Ba

SAPK:GydF4y2Ba

丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶GydF4y2Ba

阿富汗二月:GydF4y2Ba

小auxin-up rnaGydF4y2Ba

sbe：GydF4y2Ba

淀粉分支酶GydF4y2Ba

瑞士:GydF4y2Ba

可溶性淀粉合成酶GydF4y2Ba

SUS:GydF4y2Ba

蔗糖合酶GydF4y2Ba

TB1:GydF4y2Ba

墨西哥类蜀黍BRANCHED1GydF4y2Ba

Tic：GydF4y2Ba

总离子色谱图GydF4y2Ba

TIR1:GydF4y2Ba

运输抑制剂RESPONSE1GydF4y2Ba

UGP：GydF4y2Ba

UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferaseGydF4y2Ba

ZR型:GydF4y2Ba

玉米素核苷GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意发布GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

这项工作得到了上海农业应用技术发展计划的补助金（Grantno.g20160106）和上海市农业系统青年人才发展计划（授予20180110）。资金机构没有参与数据的设计和收集，分析和对数据的解释以及写作稿件。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 2 .上海市农业科学院林业与果树研究所，上海201403GydF4y2Ba

   徐俊旭，李庆柱，杨柳艳，李鑫，王真，张永春GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JXX和YCZ负责设计工作。JXX和QZL进行了实验。稿件由JXX撰写。LYY参与了生理指标的测量。XL和ZW对数据分析和手稿修改有贡献。所有作者均已阅读并批准本稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba永春张GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

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