评估紫蓝色的颜色形成gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

蝴蝶兰属gydF4y2Ba代表全球重要的现金作物。观察到丰富的花色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花的种类有红紫、紫紫、紫紫、紫蓝。然而，紫罗兰蓝色的兰花比其他颜色的兰花培育得少。花青素、液泡pH和金属离子是影响花颜色的三个主要因素。本研究旨在找出导致紫蓝色的因素gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba鲜花和分析滴点积聚和蓝色色素沉着形成可以通过瞬态过表达来实现异源gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

基于Cyanidin的花青素高度积累gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花的颜色为红紫、紫紫、紫紫、紫到紫蓝，但未检测到真蓝和飞燕草素。同时，表示gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba（gydF4y2Ba蝴蝶兰属equestrsisgydF4y2Ba）很高，但是那gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba（gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba杂交种)低或无各种颜色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花。瞬态过度表达gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba（gydF4y2Ba飞燕草羊藿gydF4y2Ba） 和gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba在白色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba该品种的飞燕草素积累率为53.6%，形成了新的蓝色。相反，两者都是短暂的过度表达gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba和gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba没有导致Delphinidin积累。Sequence analysis showed that the substrate recognition site 6 (SRS6) of PhF3’5’H was consistently different from DgF3’5’Hs at positions 5, 8 and 10. Prediction of molecular docking of the substrates showed a contrary binding direction of aromatic rings (B-ring) with the SRS6 domain of DgF3’5’H and PhF3’5’H. In addition, the pH values of violet-blue and purple蝴蝶兰属gydF4y2Ba花的分布范围分别为5.33 ~ 5.54和4.77 ~ 5.04。此外，金属离子(包括铝)的摩尔比gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba)到紫蓝色花青素gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba是紫色的190倍、49倍和51倍吗gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

花青素基花青素呈紫罗兰蓝色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba并且伴随着较高的pH值和较高的Al摩尔比gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba到花青素含量。需要增强Delphinidin的表达，以产生真蓝色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

蝴蝶兰属gydF4y2Ba杂交兰花是花卉市场上最受欢迎的兰花之一，因为它们的花朵寿命长且壮观。一种特殊的农艺性状gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba是它们丰富的花色，包括白色、黄色和红紫色。对于红-紫系列，花色范围从红-紫、紫、紫-紫、紫-蓝(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，根据皇家园艺学会颜色表(RHSCC)。在台湾，红紫色的花是最受欢迎的，因为这种颜色让人联想到幸福。然而,紫蓝色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花市场上很少见到蓝色的花，主要是因为很难培育蓝色花，本地品种很少有蓝色花，花的寿命短，花的大小小，容易褪色(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.最早的繁殖蓝色花卉gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba由RHSCC记录的，被命名为gydF4y2BaPgydF4y2Ba．肯尼斯·舒伯特，1963年。经过多年的繁殖，gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba还缺一朵真蓝色的花，而紫蓝色是其中最蓝的颜色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花。因此，养一个gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花育种者和消费者都希望兰花具有蓝色和其他雄蕊的园艺特性。gydF4y2Ba

花的颜色对植物吸引传粉者很重要。蓝色是鲜花中美丽迷人的颜色。然而，与开红花的野生植物相比，开蓝色花的野生植物很少，这可能是因为花朵颜色的共同进化和对授粉者的视觉捕捉[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

植物色素的三大类包括甜菜碱、类胡萝卜素和花青素的独特化学结构[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．花青素是一类水溶性黄酮类化合物，在胞质中合成，定位于液泡中。众所周知，七个核心结构基因可以编码催化花青素生物合成的酶[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．在黄酮类化合物和花青素颜料的生物合成中，Chalcone合成酶是催化来自丙二酰库和ρ-香豆酰基的三个乙酸盐单元的连续凝聚的第一步。结果是Naringenin Chalcone（2'，4,4'，6'-四羟基羟妥甘油酮）和6'-脱氧乐（2'，4,4'-Trihydroxychalcone）然后通过立体间环化通过Chalcone异构酶催化，形成鼻疽蛋白（n）分别和液中。黄酮-3-羟基化酶（F3H）将黄酮酮（Naringenin和Eriodict yol）转化为二氢酚酰酚（二氢戊酰胺（二氢戊戊烯醇[DHK]）。黄酮-3'-羟化酶（F3'H）和黄酮-3'，5'-羟化酶（F3'5'H）是功能性的黄酮B形环羟基化，并且是黄酮，黄酮，黄酮和花青素的生物合成所必需的。对于花青素，Cyanidins的形成，F3'H分别形成Cyanidins和F3'5'H分别用于形成滴水蛋白，用于红色和蓝色。F3'H和F3'5'H都竞争N和DHK的常见前体。二氢烷醇-4-还原酶（DFR）将二氢烷醇（DHK，二氢喹啉素和二氢霉素）减少到白藻藻氨酸（白细胞苷，白细胞蛋白和白霉素）中。花青素合酶（ANS）涉及花青素形成的关键步骤，因为它催化了无色蓝藻蛋白氧化到花青素的前体。在花青素的C-3位置处的羟基的糖基化是稳定花青素所需的主要改性步骤，并且需要进一步修饰。 UDP-glucose: flavonoid-3-0-glucosyl transferase (3GT) glycosylates anthocyanidins and flavonols on the 3 position to produce anthocyanins [4gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

以前的研究表明，由于缺乏F3'5'H，没有蓝色色调的商业园艺植物。分子方法已被用来在玫瑰中产生蓝色花[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba],康乃馨[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]和菊花通过异位过表达F3 ' 5'H [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．菊花(gydF4y2Ba菊花莫瑞菊gydF4y2Ba没有蓝色、紫色或紫色花的品种是由于F3 ' 5'H基因的缺失，该基因编码基于飞燕草苷的花青素生物合成的关键酶[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．转基因植物的花朵颜色与异源f3'5'h过表达产生蛋白蛋白的花青素，从紫色紫色色调的红色紫色变化[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．因此，F3 ' 5'H可能会与F3 ' h竞争共同底物，从而导致蝶呤的产生。F3’5’h基因在飞燕草花色苷生物合成途径中的表达调控可能是实现飞燕草花色苷和蓝调高产的成功策略gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花。gydF4y2Ba

不同的液泡pH值会导致相同花色苷化合物的花发生颜色变化。具有相同花青素化合物的花在液泡pH值不同的情况下会发生颜色变化，例如，由于芍药苷的聚酰化，pH值从6.6增加到7.7，导致牵荣花的花冠呈蓝色[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．此外，两者都是gydF4y2BaInNHX1gydF4y2Ba和gydF4y2BaInNHX2gydF4y2Ba翻译负责转运K的蛋白质gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba进入辉煌的苍白，在开花阶段产生弱碱性液泡[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba) /小时gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba交换器（NHX）在花开口期间驱动真空pH增加，导致红色到蓝色的颜色偏移[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．在这两个v型atp酶突变体中，gydF4y2Baph值5gydF4y2Ba和gydF4y2Baph值1gydF4y2Ba，液泡酸化降低，导致紫色矮牵牛花[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．已经发现了从不同的蓝色花瓣获得的金属蒽皂苷的蓝色发育。毫克gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba是蓝色罂粟花的蓝色成分[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．Fe.gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba和艾尔gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba可能会影响蓝色矢车菊的蓝色着色gydF4y2Ba矢车菊属cyanusgydF4y2Ba［gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．空泡金属离子、黄酮和花青素的摩尔比为2:6:6，形成超分子复合物，其中金属花青素起决定性作用，导致蓝色开花[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．因此，特定金属离子的含量是影响花朵蓝色的关键因素。gydF4y2Ba

R2R3-MYB转录因子在影响许多花中花青素的时空模式中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]．在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba， PeMYB2、PeMYB11和PeMYB12三种PeMYBs分别参与了全红色色素沉着、红斑和脉序的不同色素沉着模式[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．瞬态过度表达gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba在白色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花，几乎没有表达gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba，引起红色色素沉着和花青素积累，刺激下游结构基因的表达，gydF4y2Bapef3h.gydF4y2Ba，gydF4y2BaPeDFRgydF4y2Ba,gydF4y2Ba海珠gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在这里，我们旨在研究紫色蓝色形成的机制gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花。此外，我们还测试了通过瞬时过表达将白色兰花转化为蓝色的初始假设框架gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba和不同的gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba以及内源的敲低gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba通过病毒诱导基因沉默(VIGS)研究飞燕草素是否可以积累gydF4y2Ba．gydF4y2Ba本研究将设定分子育种的基础gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba具有新型蓝色色素的栽培品种。gydF4y2Ba

以花青素为基础的花青素在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba各种颜色的sppgydF4y2Ba

研究花青素是否在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba，通过使用HPLC提取和分析花青素。使用Cyanidin和Delphinidin的纯化合物作为标准品（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.Cyanidin是检测到的主要且唯一的花青素化合物gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba不同颜色（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag),包括紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛蜂蜜'ox1372'，紫色紫罗兰gydF4y2BaPgydF4y2Ba．大辣椒，深紫色gydF4y2BaPhalgydF4y2Ba．牛火鸟'ox1506突变体'，紫色蓝色gydF4y2BaPhalgydF4y2Ba．Kenneth Schubert，紫罗兰蓝gydF4y2Bap .τgydF4y2Ba蒋介石蓝宝石、紫gydF4y2BaPgydF4y2Ba．(杰曼·文森特和萨梅拉“靛蓝”)“S304”和紫罗兰蓝gydF4y2BaP。gydF4y2Ba紫色马丁，而飞燕草素在蓝色中检测到的含量较高gydF4y2Ba飞燕草羊藿gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH）。这些结果表明所有gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba因此，我们进一步研究了影响紫蓝色的因素gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种。gydF4y2Ba

强烈表达gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba与花青素为基础的花青素表达在各种gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba

研究不同基因表达gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba和gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba，gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba与兰果苗分离[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba是由紫色放大的吗gydF4y2BaPgydF4y2Ba．紫色马丁使用5'-和3'比赛。我们进行了系统发育分析gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba和12个从其他植物中提取的黄酮羟化酶(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba聚集在细胞色素75B组和gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba细胞色素75A组的表达gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba在各种各样的萼片和花盆的花瓣gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba通过定量RT-PCR（QRT-PCR）检查栽培品种（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba水平高于gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba红色紫色和紫色品种等级以及紫罗兰和紫罗兰色的品种。相比之下，gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba在白色中，维生素d含量较低gydF4y2Bap .阿佛洛狄忒gydF4y2Ba和白色花瓣/红唇gydF4y2BaP。gydF4y2Ba牛兄兄弟缝合'OX1313'（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.该结果表明了强烈表达之间的关联gydF4y2Bapef3'h.gydF4y2Ba所有基于花青素的花青素的高积累gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种。gydF4y2Ba

飞燕花青素的积累和蓝色色素沉着的形成都是异位过表达的结果gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba和gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba

评估Delphinidin是否可以累积gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花，我们使用异位过度表达gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba．首先，我们确认了PhF3 ' 5'H是否来自gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花有任何酶活性。gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba包含gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba的白色花被渗入gydF4y2BaPgydF4y2Ba．Sogo Yukidian‘V3’(以下简称V3)(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一种）。我们以前表明瞬态过度表达gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba可以增加的下游结构基因表达gydF4y2Bapef3h.gydF4y2Ba，gydF4y2BaPeDFRgydF4y2Ba和gydF4y2Ba海珠gydF4y2Ba导致花青素积累[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．过度表达gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba在白色V3中，1.2%的飞燕草苷和98.8%的花青素积累呈红紫色(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)。过度的gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba和gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba导致1.6％的替代蛋白和98.4％的红紫色cyanidin，这表明了gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba无酶活性，无飞燕草素积累(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba相反，两者的过度表达gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba(从gydF4y2Bad .羊藿gydF4y2Ba） 和gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba导致53.6％的蛋白蛋白和46.4％的Cyanidin积累（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad）。这些结果表明，蓝花可能是由功能的gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba目前gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba和激活gydF4y2BaF3HgydF4y2Ba，gydF4y2BaDFRgydF4y2Ba,gydF4y2Ba答gydF4y2BaPeMYB2。gydF4y2Ba

PEF3'H和PHF3'5'H的基板识别部位6（SRS6）和基板对接的预测gydF4y2Ba

在F3’5’h血红素基附近有6个底物识别位点(srs);这些位点上单个氨基酸的突变可能会影响酶的功能[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

检查为什么gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba不能生产德尔菲蛋白，我们想知道其序列中氨基酸的分歧。推导的氨基酸序列gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba分析了。它们含有三个保守区域，包括agtdts细胞色素p450交往区域，exxr氧合用基序和fgagricag heme结合结构域（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种）。在PHF3'5'H和DGF3'5'H中的SRS1，SRS2，SRS4，SRS5和SRS6结构域的氨基酸序列如图2所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种。gydF4y2Ba

M [D/E] Ex [F/Y] Gx [T/S/A] xQ是SRS6的保守区，SRS6的8位是决定F3 ' h和F3 ' 5'H功能差异的关键氨基酸[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．两个pef3'hgydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba在SRS6的8位有一个苏氨酸(T)残基，分离自gydF4y2BaPgydF4y2Ba．紫色马丁和gydF4y2BaPgydF4y2Ba．混合动力车“王车”(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab）。相比之下，所有f3'5'hsgydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba在SRS6的第8位有一个缬氨酸(V)残基，分离自gydF4y2Ba拟春蚕、马氏春蚕、bellina春蚕、schilleriana春蚕、lueddemanniana春蚕、PgydF4y2Ba．紫色马丁和gydF4y2Bap . violaceagydF4y2Ba“靛蓝”(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab）gydF4y2Ba．gydF4y2Ba此外，Orchidaceae中其他属的F3'5'H也在SRS6的第8位，包括VgydF4y2Ba石斛兰gydF4y2Ba杂交种，gydF4y2Ba兰花ensifoliumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba兰氏斜体gydF4y2Ba，gydF4y2Ba胃脂榆树gydF4y2Ba和gydF4y2Ba香草普林洛杉矶gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).一个等位基因gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba从gydF4y2BaV.普林洛利亚gydF4y2Ba在SRS6的第8位的丙氨酸（A）（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).此外，在兰科植物中，F3’5’hs在SRS6的5和10位点上有两个脯氨酸(P)(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).相比之下，苯丙氨酸(F)和谷氨酰胺(Q)均位于SRS6的5和10位gydF4y2Bad .羊藿gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

利用SwissDock预测了N、DHQ和eriodictyol (E)在PhF3 ' 5'H和DgF3 ' 5'H上的底物结合位点。在底物与N、DHQ、E对接预测得到的约30种不同构象中，选择能量最低的构象作为最可能的结合模型。预测结果表明，N、DHQ和E的芳香环(b环)指向PhF3’5’h的SRS4和SRS1的N端(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad-f)。而N、DHQ和E的芳香环(b环)则指向DgF3’5’h的SRS4、SRS5和SRS6的c端(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa - c)。gydF4y2Ba

紫蓝色品种的液泡pH值高于紫色和白色品种gydF4y2Ba

要理解任何发散的HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba浓度在various-coloredgydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba，测定花提取物的pH值(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.pH值呈增加趋势gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花色变得更加紫色蓝色（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花为紫色和紫罗兰蓝色的品种的pH值高于花为红紫色、紫色和白色的品种。紫色组的品种，gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛火鸟'ox1506突变体'和gydF4y2BaPgydF4y2Ba．OX1372蜂蜜的pH值分别为4.77和4.85。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.紫-紫的pH值gydF4y2BaPgydF4y2Ba．大辣椒是5.04（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.紫罗兰群中的栽培品种，gydF4y2Bap . violacea”gydF4y2Ba靛蓝”和gydF4y2BaP。gydF4y2Ba（Kenneth Schubert X Samera）'KS1226'分别具有5.52和5.54的pH值（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.紫蓝色组的品种，gydF4y2BaP。gydF4y2Ba紫色马丁和gydF4y2BaPgydF4y2Ba．Kenneth Schubert分别具有5.33和5.50的pH值（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.白色组的品种，gydF4y2Bap .阿佛洛狄忒gydF4y2Bav3分别具有5.05和5.13的pH值（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.这些结果表明，减少酸化使蓝色调的呈现gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花。gydF4y2Ba

从中吸收花青素提取物的吸收光谱gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花gydF4y2Ba

为了确定花青素在不同的酸化程度下是否会呈现不同的颜色，我们从紫紫中提取花青素gydF4y2BaP。gydF4y2Ba大辣椒（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa)并加入调节pH值从2.9到6.8的缓冲液中(图4)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab).花青素在酸性条件下向红色方向移动，在碱性条件下向蓝色方向移动(图4)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab).在可见光吸收光谱中，基本条件下出现了波长红移(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac).此外，花青素在碱性溶液中容易降解(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bad）。这结果表明gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花青素在碱性环境中呈蓝色，在高pH值的碱性条件下不稳定(图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bad）。事实上，花色在紫罗兰色的相同开花中容易褪色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.新开的花是紫色的，随着花的褪色，它变成了浅紫色gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.通过皮尔逊相关系数(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.895)。gydF4y2Ba

金属离子浓度增加与紫蓝色形成呈正相关gydF4y2Ba

然后比较了紫色和紫蓝色中金属离子与花青素的比例gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种。五个金属离子，包括mggydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba},艾尔。gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}、铁gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba和锌gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}在紫色品种gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛蜂蜜'ox1372'，紫色蓝色品种gydF4y2BaPgydF4y2Ba．肯尼斯·舒伯特，深紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．通过使用ICP-MS（表格）牛Firebird'ox1506突变体'gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.紫色的青霉素浓度为0.68,0.26和10.74μmolgydF4y2BaPhal。gydF4y2Ba牛蜂蜜'ox1372'，紫色蓝色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．肯尼斯·舒伯特和深紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．分别为“OX1506突变体”。gydF4y2Ba

Al的摩尔比gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba紫蓝色与花青素的比值分别为190、49和51倍gydF4y2BaPgydF4y2Ba．Kenneth Schubert比黑暗紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．OX火鸟‘OX1506突变体’(见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.相比之下，Mg的摩尔比gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和锌gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}紫蓝色与花青素之间没有区别gydF4y2BaPgydF4y2Ba．肯尼斯·舒伯特和紫色gydF4y2BaP。gydF4y2Ba牛蜂蜜'ox1372'。这些结果表明AL的摩尔比差异gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba到以花青素为基础的花青素，介于紫色和紫罗兰蓝色之间gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba．用皮尔逊相关系数统计分析了金属离子与花青素的摩尔比与紫蓝色形成的关系。铝的摩尔比之间的正相关关系gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba紫蓝色的形成率高(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba = 0.94, 0.88 and 0.91, respectively), whereas that between the molar ratios of Mg^{２＋gydF4y2Ba}和锌gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}对青霉素和蓝色形成低（RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba = 0.5 and 0.15, respectively).

相同的花青素化合物，但紫色 - 蓝色和紫红色花之间的不同真空pH值gydF4y2Ba

在矮牵牛、牵牛花和绣球花中，蓝色花的液泡pH高于红色花，但蓝色花和红色花的花青素化合物相同[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]．这表明，当观察不同颜色的花积累相同花色苷化合物时，液泡pH是红到蓝花颜色的显著调节因子。在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba在兰花中，以花青素为基础的花青素在从红紫色到紫蓝色的花中大量积累。然而,紫蓝色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba不同品种的花液pH值均高于紫色品种。gydF4y2Ba

紫蓝色向紫色的转变可能是由于金属离子与花青素的摩尔比的差异引起的gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba

以前的研究表明，蓝红色双色郁金香的Fe摩尔比gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba以飞燕草苷为基础的花青素在蓝色细胞中的含量是红色细胞的39倍[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．在蓝色和红色绣球花，摩尔比为AlgydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba以飞燕草苷为基础的花青素在蓝色花中的含量是红色花的40倍[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．在蓝色和紫色矢车菊中，Fe的摩尔比gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba以花青素为基础的花青素在蓝色花中的含量是紫色花的51倍[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．Fe.gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba是否有必要形成花青素中的蓝色gydF4y2Ba-gydF4y2Ba基于花包括矢车菊和蓝罂粟[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．毫克gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}是几种植物产生金属花青素所必需的，包括gydF4y2BaCommelina普通的gydF4y2Ba，gydF4y2Ba矢车菊属cyanusgydF4y2Ba，gydF4y2Ba鼠尾草金属盘gydF4y2Ba，gydF4y2Ba美国uliginosagydF4y2Ba和gydF4y2Banemophila menziesli.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．我们的研究结果表明，Al的摩尔比gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba、钙gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Ba蓝紫色花青素中金属元素含量分别是紫色的190、49和51倍gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

SRS结构域氨基酸的取代和底物取向对蛋白质功能的干扰gydF4y2Ba

大量的氨基酸导致F3’5’h功能的丧失。SRS6的8位Ser取代Thr可降低5 ' -羟基化活性[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．类似地，相应地，序列分析显示在DGF3'5'H中的val和Ala在DGF3'5'H中，这可能表明为什么PHF3'5'H失去5'-羟基化活性。此外，大豆（GmaxF3'5'H）中SrS4结构域的氨基酸残基的替换也可以改变其破坏血红素组和基材之间接触的酶活性[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．这会影响F3'5'H中的活性位点的构象，从而改变花色形成。与GMAXF3'5'H的SRS4结构域的氨基酸残基相比，在pHF3'5'h中有更多的氨基酸残基比DGF3'5'H在[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．DgF3’5’h中SRS4结构域的氨基酸序列与GmaxF3’5’h相似，只是Ser300取代了Thr300。残基侧链距离血红素300点;因此，这个残差的代换并不消除这个函数。在PhF3 ' 5'H中甚至有更多的氨基酸残基发生改变。模型结构中，除Phe294和Asp297位于血红素附近外，这些代谢物的侧链大多位于远离血红素的位置;因此，大多数替换不会改变函数。Phe294Leu和Asp297Asn可能分别通过大尺寸和电荷排斥改变活性位点的构象来干预蛋白质功能。gydF4y2Ba

另外，基板对接的结果表明，N，DHQ和E的芳环（B-RING）朝向SRS4的N-末端和PHF3'5'H的SRS1（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba），而N，DHQ和E的芳环（B形环）朝向DGF3'5'H的SRS4，SRS5和SRS6的C末端取向。此发现类似于先前的结果预测F3'hgydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．PHF3'5'H可能由于其不寻常的基板结合方向而不能起作用。因此，同源性建模和对接可以提供良好的模型来评估实验测试的突变体，并作为个体突变体效果的进一步理由。gydF4y2Ba

真正的蓝gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba通过对花青素生物合成途径的基因工程，可以获得花gydF4y2Ba

内生gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba必须沉默高滴水蛋白积累，以导致蓝色的色调，因为这两方面都是gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba和gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba竞争N和DHK的相同底物[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．对于转基因菊花，80％和35％的Delphinidin积累gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba- 有和没有内源的植物gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba沉默的[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．以前的研究表明，80%和95%的飞燕草素积累并导致紫紫(N81B)和紫紫(88C)菊花[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]．此外，通过过表达两种异种gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba和gydF4y2BaPHDFR.gydF4y2Ba，94和100％替代蛋白积聚在康乃馨中分别导致紫色82a和紫红素75a组[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．在玫瑰中，异种的过度表达gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba和gydF4y2BaPHDFR.gydF4y2Ba导致95％的Delphinidin积累和紫罗兰色第85B组[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．在我们的研究中，两者的过度表达gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba和gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba在V3花被片中，飞燕花素积累最多(53.6%)，花色由白色(NN155C)转变为紫蓝色(91A)。虽然相对较低的飞燕草素积累被观察到过表达gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba与其他过表达的植物相比，飞燕草苷的积累量更高，紫蓝色更蓝。这是第一个报告显示在白色中创造了一种新颖的蓝色色调gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种。我们的研究结果表明，添加PeMYB2后，DgF3 ' 5'H能够与内源性的N和DHK底物竞争gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba积累Delphinidin化合物。沉默内源性gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba伴随着gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba全身的转基因gydF4y2BaPhalaenopsigydF4y2Ba是必需的，以产生高氯化汀积累和真正的蓝色形成gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在花青素生物合成途径中使用了不同的遗传调控策略[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．不齐的gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba并且gydF4y2BaPHDFR.gydF4y2Ba被引入玫瑰和康乃馨的宿主植物。gydF4y2BaPHDFR.gydF4y2Ba强烈利用二氢肌酐（DHM）但不是DHK，从而有益于Delphinidin生产[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]．相反，要生产蓝色菊花，异种gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba是引进的，还是内生的gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba沉默了。击倒gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba可以增加飞燕草素的产量[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．Ofnote, for the strategy adopted in chrysanthemum, only the suitable promoter of chrysanthemum F3H was used to drive efficient heterologous expression of F3’5’H without modifying other structure genes in the anthocyanin biosynthesis pathway and led to a high production of delphinidin and accumulation in transgenic chrysanthemum [9gydF4y2Ba]．这些案例都通过调控花青素的生物合成途径，成功地产生了至少80%的飞燕草苷，并导致了一种新的蓝色色调。gydF4y2Ba

总之，我们证明了通过过表达花青素调节，白彩兰花如何将白色兰花转化为蓝色色调的初始假设框架gydF4y2BamygydF4y2Ba转录因子,gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba,不同的gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba（gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba）敲击内源性的表达gydF4y2BaF3'HgydF4y2Ba．这可以设定分子育种的地面工作gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba有真正蓝色色素的品种。gydF4y2Ba

紫蓝色的颜色形成gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba由降低的真空酸化和增强CA之间的摩尔比引起gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}和菲gydF4y2Ba^3+gydF4y2Bacyanidin-based花青素。飞燕草素没有以任何颜色积聚gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba由于氨基酸改变和可能不利的衬底结合方向，栽培品种，gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba几乎没有Delphinidin积累的能力。在过表达的情况下gydF4y2BaDgF3的5是什么gydF4y2Ba和gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba，我们在白色中观察到一种新的紫蓝色gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种，飞燕草苷积累量为53.6%，花青素积累量为46.3%gydF4y2Ba．gydF4y2Ba本研究将有助于了解紫蓝色形成的调控机制，为紫蓝色的分子育种奠定基础gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba具有新型蓝色色素的栽培品种。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

用于颜色分析，gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba来自各种当地兰花托儿所的各种颜色，包括红紫，紫，紫紫，紫罗兰色，紫色蓝色和白色的品种（附加档案gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.比较，蓝色gydF4y2Ba飞燕草羊藿gydF4y2Ba从瑞丰园艺（昌华，台湾）收集（附加档案gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种，gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛奶接缝'ox1313'，白色萼片/花瓣和紫色唇，紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛蜂蜜'ox1372'和深紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛火鸟‘OX1506突变体’采自台湾台南牛兰科农场。紫色的gydF4y2BaP。gydF4y2BaHybrid'King Car'是从国王汽车生物科技实业有限公司（台湾伊兰）收集的。紫色紫罗兰gydF4y2BaPgydF4y2Ba．大辣椒，白色gydF4y2Bap .阿佛洛狄忒gydF4y2Ba无性系种群。gydF4y2BaFormosana.gydF4y2Ba和白色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．崇光育奇牌V3系列产品来自台湾糖业公司(Taiwan Sugar Corp.，台南)。紫罗兰色的gydF4y2Bap . violaceagydF4y2Ba“靛蓝”采自台湾台南的美达兰兰花。紫罗兰色的gydF4y2BaP。gydF4y2Ba(Germaine Vincent x Samera ' indigo ')“S304”取自台湾高雄的刘景良兰花苗圃。紫罗兰色的gydF4y2BaP。gydF4y2Ba(Kenneth Schubert x Samera)的‘KS1226’和紫蓝P. Purple Martin采自台湾台南的孔爵士兰花。紫蓝色gydF4y2Bap .τgydF4y2Ba从欣普豪华园（台湾台南）收集蒋蓝宝石。紫蓝色gydF4y2BaP。gydF4y2Ba肯尼斯舒伯特由泰达园艺有限公司（台湾常市）收集。白色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．崇武Yukidian的“V3”和紫色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛蜂蜜'ox1372'用于瞬时过表达分析，因为它们的Tepals颜色有利于Delphinidin积累和蓝色。根据机构指南收集所有植物材料，并在天然光线下的温室（NCK，台南，台湾）下，在自然光线下，23-27°C。本研究中使用的所有植物材料包括gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba品种和gydF4y2Ba飞燕草羊藿gydF4y2Ba都是商业上可以买到的，而不是从野外采集的。所有的植物材料都保存在NCKU允许的温室里。对植物的实验研究符合机构、国家或国际指导方针。这些材料的真实性已经被每个兰花苗圃的主人验证。gydF4y2Ba

花卉颜色的定义gydF4y2Ba

红-紫系列植物材料的颜色由红-紫、紫、紫-紫、紫、紫-蓝组成gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.为了定义颜色，使用了皇家园艺协会的颜色图表。嘴唇的颜色gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛兄兄弟接缝'ox1313'在红紫色71a组中分类（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛蜂蜜'ox1372'，gydF4y2BaPgydF4y2Ba．牛火鸟'ox1506突变体'和gydF4y2BaPgydF4y2Ba．混合'King Car'分别分为紫色75A，77A和N78C组（附加文件）gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2BaPgydF4y2Ba．大辣椒被分类为紫色紫罗兰N80A集团（附加档案gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Bap . violacea”gydF4y2Ba靛蓝”,gydF4y2BaP。gydF4y2Ba（Germaine Vincent X Samera'Indigo'）'S304'和gydF4y2BaP。gydF4y2Ba（Kenneth Schubert X Samera）'KS1226'分别分别分别在紫罗兰色86A，N87A和N87B组中分别分配（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Bap .τgydF4y2Ba蒋蓝宝石，gydF4y2BaP。gydF4y2Ba紫色马丁和gydF4y2BaPgydF4y2Ba．肯尼斯·舒伯特被分别归入紫罗兰蓝色的90A、90B和92A组(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Bap .阿佛洛狄忒gydF4y2Ba无性系种群。gydF4y2BaFormosana.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPgydF4y2Ba．Sogo Yukidain'V3'都在白色NN155C组中分类（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.相比之下，gydF4y2Ba飞燕草羊藿gydF4y2Ba属于蓝色的101A组(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

萃取花青素gydF4y2Ba

在V3花中瞬时过度表达后4天，如前所述和用HPLC方法描述并定量了花青素[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．简而言之，用甲醇在4℃下用1％（v / v）HCl的甲醇萃取研磨物粉末20小时。然后将样品在4℃下以10,000×g离心20分钟。使用真空浓缩器干燥上清液，将沉淀物在2N HCl中溶解，并在100℃下水解糖基1小时。通过固相DSC-18 SPE提取柱（Supelco，SL，USA）检索水解样品，然后在提供1％（v / v）HCl的甲醇中洗脱。洗脱液在-20℃下储存，用于HPLC分析。我们使用了250×4.6毫米的Hypersil BDS C18柱（Thermo FiShific，MA，USA），用于HPLC分离（Hitachi D-7000，L-7100，L7200和L7420）。溶剂A（甲酸：水= 1:99 [v / v]）和溶剂C（100％甲醇）以1.0ml / min的流速混合，用于化合物分辨率。在530nm波长处检测到花青素。Cyanidin（Sigma-Aldrich，SL，USA）作为HPLC分析中的标准招募。 Three biological repeats were performed for each overexpression experiments, and repeated transient assays twice independently.

RNA提取和逆转录cDNAgydF4y2Ba

收集1-至2.5厘米的花芽的萼片和花瓣，浸没在液氮中，然后储存在-80℃下进行RNA提取。通过使用硫氰酸胍法如前所述提取总RNA [gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．通过用无RNase的DNase I（新英格兰Biolabs，MA，USA）处理残留的DNA。使用上标III（Invitrogen，Ca，USA）进行对cDNA的逆转录。gydF4y2Ba

中存在gydF4y2Ba

对于每个基因，在基因特异性区域内设计了引物对（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.用荧光Sybr Green PCR母系（Applied Biosystems，MA，MA）染料通过扩增cDNA的Q-PCR用于测量基因表达，并通过ABI棱镜7000序列检测系统（Applied Biosystems，MA，USA）检测。反应在95℃下进行10分钟，并重复循环40个循环（95℃，15s和60℃，1分钟）。放大后，使用熔融曲线分析来验证引物二聚体形成和扩增子特异性。gydF4y2BaPeActin4gydF4y2Ba(AY134752)为管家基因，qRT-PCR结果归一化[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．在技​​术三份中分析每个样品。数据显示为三种技术复制的平均值±SD和三个独立的生物样品。gydF4y2Ba

序列对准和系统发育分析gydF4y2Ba

序列比对使用Align X (Vector NTI Suite, V.8, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。采用邻域连接法构建系统发育分析树，利用MEGA5进行bootstrap分析[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，使用1000个自举数据集来估计每个树分支的置信度。构建了两种不同的系统发育树:其中一种树的序列为7gydF4y2BaF3'hs.gydF4y2Ba7gydF4y2BaF3'5'HS.gydF4y2Ba和2gydF4y2BaFLSIIsgydF4y2Ba而另一个是用23的序列构建gydF4y2BaATPASES。gydF4y2Ba序列gydF4y2BaF3'hs.gydF4y2Ba，gydF4y2BaF3'5'HS.gydF4y2Ba，gydF4y2BaFLSIIs,gydF4y2Ba和gydF4y2Baatp酶gydF4y2Ba从其他植物获取来自Genbank（gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba），以下加入号码：gydF4y2Ba风铃草属植物中gydF4y2BaF3’5是什么(D14590),gydF4y2BaCatharanthus roseus也叫gydF4y2BaF3'5'H（AJ011862），gydF4y2BaEustoma羊藿gydF4y2BaF3’5是什么(D14589),gydF4y2Ba矮牵牛织布达gydF4y2BaF3’5是什么(Z22544),gydF4y2Ba飞燕草羊藿gydF4y2BaF3’5是什么(AY856345),gydF4y2Ba葡萄属amurensisgydF4y2BaF3’5是什么(FJ645756.1),gydF4y2Ba矮牵牛织布达gydF4y2BaF3'H (AF155332),gydF4y2Ba托雷尼亚杂交品种gydF4y2BaF3'H (AB057673),gydF4y2Ba菊花莫瑞菊gydF4y2BaF3'H (AB523844.1),gydF4y2Ba大豆gydF4y2BaF3'H (AB191404),gydF4y2Ba水仙tazettagydF4y2BaF3'H（JX292106.1），gydF4y2Baarachis hypogaea.gydF4y2BaF3'H（JN572892.1），gydF4y2Ba金鱼草majusgydF4y2BaFNSII (AB028151),gydF4y2BaCallistephus对gydF4y2BaFNSII（AF188612），gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaAtAHA2 (AEE85731.1),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaAtaha4（Q9SU58.2），gydF4y2Ba尼古利亚娜朱姆比菲洛伐比亚gydF4y2BaNPPMA1（AAA34094），gydF4y2BaPetunia X HybridagydF4y2BaPhPH5 (DQ334807),gydF4y2Ba尼古利亚娜朱姆比菲洛伐比亚gydF4y2BaNpPMA9 (AF156684),gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Baptaha10-like（xp_002326625.1），gydF4y2Bavitis ViniferagydF4y2Bavvaha10-like（CBI35782），gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2BaOsAHA9 (AJ440220),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaAtaha10（NP173169），gydF4y2Bacitrobacter sp。gydF4y2BaCsMgtA (ZP04559661),gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaEcMgtA (YP672334),gydF4y2Ba肺炎克雷伯菌gydF4y2BaKpMgtA (YP002917472),gydF4y2BaPetunia X HybridagydF4y2BaPHPH1（AHH24342.1），gydF4y2Bavitis ViniferagydF4y2BaVvPH1-like (CBI41039),gydF4y2Ba里纳斯市政府gydF4y2BaRcPH1-like (XP002533565),gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2BaPtPH1like (XP002306511),gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaAtACA2 (NP195497)和gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2BaOs03g0616400 (NP001050661)。gydF4y2Ba

分子建模和对接gydF4y2Ba

使用swiss - modelell预测涉及F3’5’h三级蛋白结构(gydF4y2Bahttps://swissmodel.expasy.org/gydF4y2Ba）.以P450 1A2 (PDB ID: 2hi4.1)的x射线晶体为模板[gydF4y2Ba40.gydF4y2Ba]．接下来，利用SwissDock (gydF4y2Bahttp://www.swissdock.ch/dockinggydF4y2Ba）.最后，使用UCSF Chimera可视化预测的结合模型[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

异种瞬时过表达gydF4y2BaF3’5是什么gydF4y2Ba沙gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba花朵gydF4y2Ba

短暂的过度表达gydF4y2BaPeMYB2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPhF3的5是什么gydF4y2Ba或gydF4y2BaDgF3‘5’gydF4y2BaHsu et al.， (2015) [gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．简单地说，这些基因被pcr扩增，用限制性内切酶消化gydF4y2BaXHO.gydF4y2BaI，然后连接到p1304NhXb。重组的建筑被轰击gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba使用electroproration EHA105。这些工程gydF4y2Ba农gydF4y2Ba在28°C中生长过夜，刷新培养到ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba = 0.8–1, and then harvested by centrifugation. Cell pellets were resuspended in Murashige and Skoog medium supplied with 100 μM acetosyringone, and incubated at room temperature for 30 min. The bacterial suspensions were infiltrated into the base of sepals and petals of V3 flowers, and incubated at 25 °C with a 10 h light/14 h dark photoperiod. Five days post bombardment, the infiltrated flowers were photographed and then stored at − 80 °C for anthocyanin extraction. The transient overexpression assay was performed in five different plants for each experiment, and repeated three times independently.

Corolla匀浆的pH值测量和可见吸收光谱gydF4y2Ba

将完整的花瓣直接磨碎，13,000 rpm离心(Heraeus Biofuge Pico，德国)15分钟，然后立即使用pH电极(Van London Co.， TX, USA)测量上清液。将花液稀释于含0.2 M磷酸二钠(NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba）和0.1米柠檬酸（CgydF4y2Ba_6gydF4y2BaHgydF4y2Ba_8gydF4y2BaOgydF4y2Ba_7gydF4y2Ba）在各种pH值下，通过OD 300-800nm的分光光度分析测量（BiochromSk50，英国）。gydF4y2Ba

彩色花瓣的金属离子测量gydF4y2Ba

通过使用冷冻干燥器（Millrock Lyobt85，USA）干燥彩色花瓣的粉末，然后通过使用均化器（Qiagen Schwingmuhle TissuiceSerser 2，Germany）。接下来，在5ml的70％HNO中消化100mg干燥的样品gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和0.5毫升30％hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用于高性能微波处理(CEM, MARS Xpress 5, Matthews, NC, USA)，功率为400瓦，15分钟内提高到180°C，并持续15分钟。样品经消化后，用2%的HNO稀释gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba使用ICP-MS分析金属离子(Agilent 7500cx，美国)。高性能微波和ICP-MS均在台湾苗栗国立卫生研究院生物医学工程研究所和纳米医学研究所进行。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

用Pearson的相关系数分析金属离子和紫色蓝色形成和pH值和pH值和紫色蓝色形成之间的相关性[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。gydF4y2Ba

ANS：gydF4y2Ba

花青素合成酶gydF4y2Ba

DFR:gydF4y2Ba

Dihydroflavonol-4-reductasegydF4y2Ba

登革出血热:gydF4y2Ba

DihydroflavonolsgydF4y2Ba

DHK:gydF4y2Ba

DihydrokaempferolgydF4y2Ba

DHQ:gydF4y2Ba

DihydroquercetingydF4y2Ba

艾凡:gydF4y2Ba

圣草酚gydF4y2Ba

F3'5'H：gydF4y2Ba

类黄酮3 ',5 ' -羟化酶gydF4y2Ba

F3'H：gydF4y2Ba

黄酮类化合物3'-羟化酶gydF4y2Ba

F3h：gydF4y2Ba

类黄酮3-hydroxylasegydF4y2Ba

HPLC：gydF4y2Ba

高效液相色谱法gydF4y2Ba

ICP-MS：gydF4y2Ba

电感耦合等离子体质谱法gydF4y2Ba

护士:gydF4y2Ba

柚苷配基gydF4y2Ba

种族：gydF4y2Ba

cDNA结束的快速扩增gydF4y2Ba

RHSCC:gydF4y2Ba

皇家园艺社会彩色图表gydF4y2Ba

SRS:gydF4y2Ba

基板识别现场gydF4y2Ba

中收取:gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默gydF4y2Ba

V3:gydF4y2Ba

蝴蝶兰属gydF4y2Ba崇光百货Yukidian V3的gydF4y2Ba

感谢国立成功大学药学院郭炳中博士对手稿的讨论和批判性阅读。我们感谢国立卫生研究院生物医学工程与纳米医学(苗栗，台湾)ICP-MS分析提供的技术服务。我们也感谢当地各种兰花苗圃提供的植物材料，包括花苗圃(天威，彰化，台湾);牛兰花农场(台南，台湾);台湾宜兰王车生物科技实业有限公司;台湾糖业公司(台南);Meidarland兰花(台南);刘景良兰花苗圃(台湾高雄);孔爵士兰花(台南);新希望花园生物科技(台南)和台达园艺公司(彰化)。gydF4y2Ba

基金资助:台湾科技部项目(no . MOST 108-2811-B-006-531 -)。资助机构没有在设计研究、测量、数据分析、起草手稿等方面发挥作用，只是提供资金支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 国立成功大学生命科学系，台南701gydF4y2Ba

   Che-Yu Liang，Krishna Preethi Rengasamy，Li-Min Huang，Chia-Chi Hsu，Wen-Huei Chen＆Hong-Hwa ChengydF4y2Ba

2. 兰花研究和开发中心，国立成功大学，台南，701，台湾gydF4y2Ba

   郑美芬，陈文辉，陈洪华gydF4y2Ba

3. 台湾南投市gydF4y2Ba

   Hong-Hwa陈gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CYL，CCH，WHC和HHC构思了该项目和设计的研究;CYL，KPR和MFJ进行了研究;CYL，LMH，MFJ和HHC分析数据并写了纸张;所有作者审查并批准了发布的稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2BaChia-Chi HsugydF4y2Ba或gydF4y2BaHong-Hwa陈gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba