全基因组关联分析导致新的遗传见解耐黄曲霉在玉米内核

背景

FENPLE谷物中的真菌感染会影响食物储存并威胁粮食安全。这黄曲霉已知感染多种晶粒并产生霉菌毒素的黄曲霉毒素B1，其致致致畸和导致动物免疫抑制。但是，玉米抗性的分子机制答:flavus在很大程度上是未知的。

结果

在这里，我们使用玉米核来调查阻力基因答:flavus利用313个自交系的全基因组关联研究(GWAS)。对接种后籽粒的抗性水平进行了表征答:flavus．GWAS共鉴定出4个相关位点，涉及29个候选基因，这些基因与种子发育、抗性或感染有关，并参与信号通路、种子发育、萌发、休眠、表观遗传修饰和抗菌活性。此外，一些候选基因还与几种g蛋白信号转导和植物激素有关，这些基因可能参与了种子发育过程中不同抗性的协同作用。籽粒发育过程中29个基因中有16个基因的表达也与抗性水平有关。

结论

对313粒玉米接种后的抗性水平进行了测定答:flavus，发现四个相关的基因座和16个候选玉米基因。参与核结构和核心组合的表达的16个基因最有助于成熟玉米核心的抵抗力答:flavus，特别是在Pericarp的发展中。可以通过实验转化链接的候选基因以验证和操纵真菌抗性。因此，此结果为繁殖计划中的玉米内核增加了值。

玉米，也被称为玉米（玉米玉米是最重要的谷类作物之一，在世界各地都有种植，作为饲料和食物。粮食安全经常受到真菌感染产生的有毒污染的威胁[1］．真菌种类aspergillus.属，例如，土生A. Flavus，已知产生黄曲霉毒素，一种影响人和动物的致癌霉菌毒素[1］．玉米和其他谷物容易受到影响答:flavus在采前和采后感染，导致有毒黄曲霉毒素B1的积累，这种毒素非常稳定，在加工过程中难以清除[2］．防止玉米粒答:flavus感染，持续努力在过去50年内降低了感染。众所周知，一些玉米牧草，例如，墨西哥的塔克斯潘，对答:flavus和黄曲霉毒素积累;因此，通过育种结合高的遗传抗性被认为是一个很有前景的解决方案。几个自交系对答:flavus已由美国农业部农业研究署(USDA-ARS)报道，并在综述中进行了总结[3.，4，5］．因此，它具有理论和重要性，以识别玉米赋予高抗性的遗传遗传变异答:flavus感染(3.，6］．

植物病原体防御中的基因如抗性（R）基因和信号级联基因应该有助于玉米病原体抗性。但是，抗性通常受到多种基因和玉米之间的相互作用调节答:flavus这就导致了寻找关键基因的困难。利用连锁作图法，在多个染色体上发现了数量性状位点(qtl)。，1,2,3,4,5,9在源自高电阻线MP313e和易感线VA35或B73的交叉群体中的交叉群体[7，8］．另一项利用全基因组关联研究(GWAS)的研究显示，由亲本RA和M53衍生的重组自交系在8号染色体上有一个显著的QTL位点[6］．在Mp715中，6.06 centimorgan (cM)和7.03 cM的两个qtl被认为是最有希望的标记辅助导入抗性的qtl [9］．然而，报道的QTL为抗性答:flavus仍然在大型染色体地区，通常是几个厘米。染色体8个主要QTL QAA8区域答:flavus电阻证实，并通过使用228个重组自交系系（RIL）精制和关联群体包括437个玉米自交系[6］．与硬秆品系Tx714杂交的346个玉米自交系在关联群体中未发现与黄曲霉毒素积累相关的QTL [10］．相比之下，通过使用300自交线路的关联映射面板，GWAS分析鉴定了与黄曲霉毒素累积相关的107个SNP，其与易感线VA35越过[11］．微阵列表达分析显示，在高抗性品系MP313E的QTL箱中，一些基因的表达水平高于易感品系[12］．茉莉酸生物合成途径中的基因可能与抗性有关答:flavus根据GWAS的分析[13］．玉米抗性患者候选基因的调查答:flavus和/或黄曲霉毒素污染表明，过去的研究或内部研究中没有鉴定的基因没有显着[14］．

到目前为止，玉米基因组的参考序列在几个品种中都是可用的[15，16，17，18，19］．近年来，随着DNA重测序等高通量测序技术的发展，遗传变异，特别是SNPs和InDels已被公开[20.，21］．李，等。（2013）报道了368米玉米玉米加入玉米B73 Genome（版本2）的368米玉米玉米的SNP [21］．基于这些DNA变异，一些基因型-表型分析已经通过GWAS成功地发现了一些基因位点[22),如。，zmvpp1.编码可提高抗旱性的焦磷酸酶[23),而ZMFBL41通过使用自然变异群体展示玉米的带状叶片表型和鞘枯燥性[24］．

在本研究中，我们调查了在抗答:flavus在313多个面板中收获后玉米粒细胞感染。与SNP方差相结合，我们旨在识别与抵抗力相关的基因组区域答:flavus通过GWAS分析。通过对80 Kb侧位基因的进一步功能筛选，我们确定了引起抗性差异的候选基因。29个候选基因中的16个基因在种子发育过程中的表达也与抗性水平相关。我们成功地揭示了4个基因座的遗传变异，其中包括几个新的玉米抗病基因座答:flavus在收获后，再指导玉米储存遗传育种改良。

内核对病原体抗性的变化答:flavus

检查对病原体的抵抗力答:flavus感染，〜24来自每个面板的完整玉米核，包括313近交线[20.，21都接种了答:flavus在生长室七天。电阻率是通过测定感染面积的比例与总内核表面积（图分为11级。1、表S1）.因此，较低的感染率应反映较高的耐药性。我们观察到抗性的变化答:flavus，服从正态分布。60个自交系感染率最高，在4左右。17个株系的感染率较高(> 9)，20个株系的感染率较低(< 1)。1）.易感内核有可见的菌丝体的内部，而抗性近交系的内核没有（图2）.另外，在抗交线的粒子中产生较少的黄曲霉毒素B1的抗扰动线的粒子（图。S1）.

与抗性相关的遗传基因座答:flavus通过GWA.

研究相关的基因候选者赋予抵抗力答:flavus在全基因组规模上，我们进行了基于snp的GWAS。过滤次要等位基因频率(MAF) < 0.05后，共使用556,790个SNPs通过一般线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)鉴定相关位点[21，25.］．通过GLM的关联分析确定了与阈值相关的四个SNP区域p ≤ 1.8 × 10^{- 6}，分布在四个染色体上(图。3.）.GWAS分析发现，有4个、3个、1个和3个SNPs分别与第1、2、8和9号染色体上的区域相关(见表)1）.与GLM相比，MLM在2号染色体上只检测到一个SNP区。2号染色体上的两个相关SNPs在GLM鉴定的SNPs中是相同的(见表)1）.通过MLM检测较少的相关SNP而不是GLM（图。3.）.这里，GLM的结果用于随后的分析。

玉米的候选基因具有对病原菌的抗性答:flavus

GWA识别的SNP基因座提供了解理解遗传建筑的线索，该遗传架构赋予阻力变化。玉米自交系和SNP数据已被用于研究油生物合成，干旱耐受，带状叶和鞘枯燥等，峰SNP的50kb至100kb区域通常用于搜索候选基因[21，22，23，24］．解决负责的候选基因答:flavus电阻，we further extracted the genes flanking 80 kb at either side of the associated SNP locus and within the significant associated region, and then annotated their functions against databases to identify the most likely gene candidates. After comparing the annotation of genes in maize genome assembly between version V2 and V4 (TableS2)，我们将一致的基因和有额外证据的基因作为最终的基因集。9、9、9和2个候选基因分别与第1、2、8和9号染色体上的2、2、1和1个SNP区相关(见表)1）.进一步的Boxpot分析表明，所有六个SNP的多态性都适合于每个阻力等级的变化（图。4)，这表明这6个单核苷酸多态性可能与赋予抗性的基因有关A. Flavus。

基因表达和抗性的关系答:flavus在种质面板上

为了鉴定候选基因的表达，从NCBI下载了368个自交系授粉后15天玉米籽粒的原始转录组谱，并利用HISAT2工具进行分析。结果表明，除GRMZM2G024131、GRMZM2G319150和GRMZM2G474575基因在所有自交系中不表达或极低表达外，大多数抗性相关基因在自交系核发育过程中都有表达(图)。5和表S3）.从这些基因表达的转录物的丰度被用来经由GWAS [进行SNP-表达的关联分析20.］．与抗性- snp关联结果一致的是，29个基因中有16个与侧边80 kb区域相关(见表)1)，表明涉及籽粒结构和组成的16个表达基因最有可能与成熟玉米籽粒的抗病性有关答:flavus．

值得注意的是，本研究中的染色体9上的三个相邻的SNP（CHR9.S_131,725,983，CHR9.S_131,726,004和CHR9.S_131,726,006）与先前在预先收获预抵抗力的基因座重叠答:flavus在Kelley等（2012）进行的一项研究中（图。6) ［12]，表明抗性的常见基因组特征。在该区域中，基因GRMZM2G309327和GRMZM2G108655是收获预收研究中最重要的候选基因。基因GrmZM2G309327作为AT4G20780和AT5G4466的同源物中，编码已知在植物感染防御期间在信号运输中起作用的钙结合蛋白（CM142）[26.，27.］．该基因也在玉米粒的果皮/糊粉中表达[28.］．GRMZM2G108655基因编码参与花青素生物合成的cop1相互作用蛋白7 [29.]，表明基因可以影响种子着色。

此外9号染色体上的三个相邻的SNP，剩余的相关的SNPs在关联结果被新近鉴定的答:flavus阻力。据报道，许多候选基因参与了种子发育。ch2上的相关位点与此前报道的耐药QTL位点接近答:flavus［7］．在洛尼（表1)，基因GRMZM2G127591同源于拟南芥AT1G21870，编码高尔基核苷酸糖转运体5 (GOLGI NUCLEOTIDE SUGAR TRANSPORTER 5)，有报道称该蛋白是合成细胞表面必需成分所必需的[30.］．在CHR8上的基因中，基因GRMZM2G129065编码培养的双折射样蛋白，其与Arabidopsis基因同源为1G48880。该基因通过影响果胶聚合物的酯化状态参与二次壁纤维素的合成和沉积[31.，32.］．基因GrmZM2G400092编码组蛋白乙酰转移酶（帽子）B，其在胚胎萌发期间参与新合成的组蛋白H4的乙酰化。帽子B也参与玉米种子发育和萌发[33.，34.］．GRMZM2G393070和GRMZM2G393072是dirigigproteins which were reported to介导木脂素和氰基葡萄糖苷在亚麻籽中形成[35.］．

开花植物的种子涂层在种子萌发，活力和长寿潜力中起重要作用[36.］．它也是种子防御不良外部因素的第一个表面[37.］．玉米籽粒的种皮包括籽粒的两层外层，称为果皮和糊粉层。果皮约87%为粗纤维，主要由半纤维素(67%)、纤维素(23%)和木质素(0.1%)组成[38.］．Pericarp的坚韧纤维形成屏蔽以保护来自非生物和生物应激的种子内部，包括霉菌和细菌的感染[36.，39.］．一次答:flavus真菌菌丝能穿透种子的种皮或果皮，在敏感自交系的核内生长。2）.通常，渗透到玉米核中的真菌越多，在接种的7天内核中检测到较高的黄曲霉毒素B1答:flavus分生孢子(图S1）.结果表明，玉米种子的完整性应性起着至关重要的作用，答:flavus感染收获后的玉米粒。

种皮还充当信道用于发送环境线索，诸如水进入在添加晶种的内部，以作为屏蔽[37.］．玉米种子吸水后会膨胀。果皮的完整性对籽粒的抗霉性和抗霉率起着至关重要的作用答:flavus体现了种子吸收水分后的完整性。本研究中抗性水平的多样性表明，自交系在吸水后种子的完整性应有所不同。自交系中,结果17种子行更高的感染比率(> 9)而20种子行感染率较低(< 1)表明,感染率较低(< 1行)更完整的线条与更高的感染比率(> 9)在真菌感染的过程。在本研究中，有2个、2个、1个和1个SNPs分别与第1、2、8、9号染色体上的区域相关，候选基因分别为4、6、5和1个，经snp表达GWAS分析进一步验证。这6个SNPs可以解释11 ~ 14%的表型变异。大多数基因位点与抗性有关答:flavus在这项研究中凯利的研究是从QTL区域的不同，等人（2012）[12，这可能与种子发育阶段和贮藏条件不同有关。自花授粉后14日龄种子接种真菌答:flavus研究中发现的NRRL 3357菌株[12而在我们的研究中使用的是干燥成熟的种子，这应该是造成差异的原因。

玉米种子在吸收少量水分后的完整性可能受种皮完整性和胚乳吸湿能力的控制。种皮开裂或破损的种子易受霉菌感染[37.，40，41.］．成熟的种子是由双受精的受精卵发育而成，形成二倍体胚和三倍体胚乳[37.，42.］．与胚和胚乳不同，种皮在起源时完全是母性的[37.］．要了解核开发，通过RNA测序研究了158个近交系的不成熟种子[20.］．线的基因表达谱是高度变化的，建立了表达量性状基因座（EQT1）与其靶标的关系，以揭示基因监管网络[20.］．虽然玉米核中候选基因的表达水平没有答:flavus接种不应该直接参与内核开发过程中真菌阻力，至少一些表达的基因可能是导致内核的不同组成部分的候选基因。已经总结出种子尺寸由若干途径包括IKU途径中，泛素 - 蛋白酶体途径，G蛋白信号确定的，有丝分裂原活化的蛋白激酶信号转导通路，植物激素和转录调节因子[42.］．途径可以通过调节胚乳和/或母体组织生长影响种子大小的形成。在这项研究中，一些候选基因属于G-蛋白信号转导途径（GRMZM2G113569，和GRMZM2G309327），而其它基因涉及植物激素（GRMZM2G431066，GRMZM2G114153，GRMZM2G413887和GRMZM2G092759）。参与种子大小的发育的基因也是相关的基因，有助于答:flavus电阻．此外，据报道了几种相关基因参与胚胎，胚乳和种子涂层的合成。例如，GRMZM2G127591和GRMZM2G092945在种子发育过程中从事糖和氨基酸的运输[30.，43.］．GRMZM2G129065，GRMZM2G393070和GRMZM2G393072可能参与聚合物，例如，果胶的合成，木质素[31.，32.，35.］．g蛋白信号转导和植物激素相关基因与其他候选基因应该协同作用于种子的发育，从而使成熟的种子具有不同的抗不利环境条件的能力。一些自交系的种子将具有很高的抗霉菌感染的能力，包括A. Flavus。响应期间，验证和进一步表征可能基因候选人的详细角色答:flavus在未来的实验中，如基因过表达和基因敲除分析，感染可能是优先考虑的。

对313粒玉米接种后的抗性水平进行了测定答:flavus．利用GWAS对4个基因座和16个候选玉米基因进行了挖掘。籽粒结构和组成相关的16个表达基因最有可能与成熟玉米籽粒的抗病性有关答:flavus，特别是涉及调控果皮发育的基因。这些连锁候选基因可以通过实验转化来验证和操纵抗性，从而在育种计划中增加玉米籽粒的价值。

植物材料

（中国农业科学院作物科学研究所）教授，包括热带/亚热带自交系，包括热带/亚热带自交系，温带血统和混合血统和混合源性的血统近交系。在2015年11月，在三亚（海南省，18.75吨，109.17e）领域种植了所有自交系。每种近交系的成熟种子用于真菌感染分析。

玉米抗真菌感染的分析

如Brown等人所述进行甲实验室内核筛选测定（KSA）。（1999）用修饰[44.］．简单地说，用75%乙醇和1% NaClO对每个自交系的约24粒籽粒表面消毒5 min，然后浸于悬浮液中答:flavusConidia（4×10⁶ cfu/mL) for 5 min. Kernels were then placed in a 24-well plate individually, one kernel in each well, and incubated at 28 °C for 7 days. High humidity (> 95% RH) was maintained by supplying sterile water to the space between holes. Two biological replicate experiments were conducted for each inbred line. Infection was designed as visible mycelial and conidia on the surface of the kernel, and the infection was classified by the ratio of the infected area to the surface area of each kernel. Eleven classes were defined as follows: 0 = no visible mycelial and conidia, 1 = 1–10%, 2 = 21–30%, 3 = 31–40%, 4 = 41–50%, 5 = 51–60%, 6 = 61–70%, 7 = 70–80%, 8 = 80–90%, 9 = 90–100%, 10 = 100%.

提取黄曲霉毒素B1，用荧光检测器HPLC测定黄曲霉毒素B1的丰度[2］．将粒子在60℃的烘箱中干燥两天，然后研磨成粉末。在甲醇中萃取黄曲霉毒素B1：H₂O = 70:30 (v/v)，在20°C下190 rpm摇晃2小时，然后在8000 rpm离心5分钟。上清液经0.22 μm滤膜过滤，滤膜液进行高效液相色谱分析。

候选基因的全基因组关联研究和注释

558,529个snp、群体结构和亲属关系数据由王国英教授和闫建兵教授提供(http://www.maizego.org.) ［20.，21］．玉米种质池中的558,529个SNP用于使用流苏进行GWA（V5.0）[21，25.］．通用线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）用于识别与抗性相关的遗传基因座答:flavus如前所述的感染[23］．为了平衡GWAS中的假阴性和假阳性关联，我们使用了两个工作流:GLM +主成分分析(PCA)用于人口结构推断，主成分1和2作为协变量，以及使用Tassel 5工作流的传销+主成分和亲属关系。此外，我们还利用之前生成的种群结构信息和亲属关系数据进行GWAS [20.，21］．两个输入数据集都产生了相同的结果。曼哈顿和Q-Q图是通过R中的“QQman”包生成的。如果是P-value was lower than Bonferroni-adjusted significance threshold (1.8 × 10^{- 6})， SNP被认为是显著的位点[21］．通过对NCBI Nr、InterProScan (swiss-prot)和Pfam的blastp进一步注释了重要SNP位点上游或下游80kb侧边区域内的所有基因[45.，46.］．

候选基因表达水平分析

从NCBI中获得授粉后15 d玉米籽粒的原始转录组图谱(BioProject: PRJNA208608)。SRA格式数据在sratoolkit (version 2.9.2)中通过NCBI fastq-dump转换为fastq格式。使用Trimmomatic (v0.33)工具修剪原始读取以删除低质量的基调用和适配器序列[47.］．清洁读取被映射到基因组z梅斯b73（v2）通过Hisat2（v2.1.0）[48.］．stringtie被应用于组装并集成每个样本中的转录物[48.］．通过BALLGOWN计算每个基因的表达水平[48.］．使用每个候选基因的表达再次进行GWA，以通过流苏（v5.0）来搜索SNP表达关联[25.］．

SNP数据可在http://www.maizego.org/resources.html.．SNP数据的文件名为'snps_368lines_maf0.05_0.56 m.hmp.gz'https://pan.baidu.com/s/1t_s_kof4s8g1b_j4_c4bq#list/path=%2fmaizego%20resources%2fgenotype.［20.，21］．本研究中使用的所有其他数据和材料可在合理的请求时从相应的作者获得。

GWAS:

基因组协会研究

QTL:

数量性状位点

MAF：

轻微的等位基因频率

阿巴：

脱盐酸

帽子：

组蛋白乙酰化酶

ksa：

内核的筛选试验

glm：

一般线性模型

传销:

混合线性模型

玉米自交系由王国英教授提供。感谢阎建兵教授和实验室成员的技术支持。我们非常感谢两位匿名审稿人对本文的改进提出的宝贵意见。

本工作得到了中国国家重点研究和发展方案（2017YFD0301306），中国安徽省教育委员会（项目编号KJ2016A841）。作者声明，没有一个融资机构在研究设计中具有任何作用，数据收集和分析以及手稿准备。

隶属关系

1. 安徽农业大学生命科学学院，合肥，230036

   韩国民，李翠萍，项芳志，赵倩倩，赵阳，蔡荣浩，程北九，陶方

2. 安徽农业大学作物胁迫抗性育种国家工程实验室，合肥，230036

   吉甘韩，杨钊和北京程

3. 佐治亚大学遗传学系，雅典30602，美国

   Xuewen王

贡献

F.T.，B. C.和X.W.构思了这项研究。F.T.和X.W.设计了这项研究。F.T.，C.L，F.X.和Q. Z.进行实验。Y.，Z.，R. C.和B.C.收集和繁殖的植物材料。Y. Z.，R. C.和B. C.修订了这篇文章。G. H.和X.W.分析并解释了数据。X.W. and G.H. wrote the manuscript. All authors reviewed and approved the final manuscript.

相应的作者

对应于Xuewen王要么方涛．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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