蔗糖转运体MdSUT4.1参与调控苹果的果糖积累

背景

糖含量是水果甜味的重要决定因素，但有关果糖积累的复杂分子机制的细节仍然稀缺。在这里，我们举报了蔗糖运输车（SUT）家庭在调节苹果中果糖积累的作用。

结果

基因标记标记被开发，以进行候选基因基型关联研究，以及SUT4成员MdSUT4.1与果糖积累显著相关。MdSUT4.1编码液泡膜定位蛋白，其表达量与果糖含量呈负相关。过度的MdSUT4.1草莓和苹果愈伤组织对糖的积累总体上有负面影响，说明它的作用是将糖从液泡中重新动员出来。此外,MdSUT4.1位于染色体上的一个糖含量QTL区域，表明该基因是苹果果实糖积累的候选基因。

结论

MdSUT4.1参与调控苹果中果糖的积累。本研究不仅有助于了解果糖积累的复杂机制，而且为苹果品质的遗传改良提供了分子工具。

蔗糖是植物光合作用的主要产物，是碳水化合物最常见的形式，从源叶通过韧皮部运输到根部和果实等下沉器官。在过去的三十年中，人们对蔗糖在植物中的运输进行了广泛的研究，蔗糖转运体(SUTs)被认为是蔗糖从源到库的输出和有效移动的关键[1]．Suts含有主要促进剂超家族（MFS）蛋白的典型12跨膜（TM）α-螺旋[2那3.那4.]．大多数sut的特征是能量依赖的质子蔗糖/H⁺利用质子动力穿过细胞膜以反浓度梯度运输蔗糖的共体[5.那6.]．

首先SUT通过酵母功能互补从菠菜中分离基因[7.]．随后，综合全基因组序列分析表明Suts.属于一个小型基因家族，有九个和五个成员拟南芥[8.] 和栽培稻[9.),分别。系统发育分析表明，SUT家族可分为SUTI、SUTII和SUTIII三个亚科，其中SUTI亚科仅存在于双独体中[1那10那11那12]．SUTII亚科进一步分为SUTIIA和SUTIIB两个支系，后者是单子叶植物特有的[11那12]．SUTIIA是被子植物SUTII亚科的一种祖先形式，比SUTIIB具有更长的中央细胞质环[12那13]．SUTI亚家族成员仅位于质膜，负责将蔗糖装载到韧皮部或将蔗糖摄取到库组织的细胞中[14那15那16那17那18那19那20.那21]．虽然大多数SUTII成员位于质膜，作为糖传感器，但最近的研究表明MdSUT2.2位于液泡膜，其过表达导致液泡中蔗糖积累增加[22那23]．Sutiii亚家族的成员以前已经与真空膜相关联，其中它们与液泡中的蔗糖流入液体进入Cytosol [24那25那26那27那28那29]．然而，一些SUTIII成员，如拟南芥Atsut4 [30.]，大麦HVSUT2 [31]，Lotus对虾LiSUT4 [25]，烟草NTSUT4和马铃薯STSUT4 [32和apple MdSUT1 [33，位于质膜中。值得注意的是，单子叶和双子叶植物利用不同类型的SUTs将蔗糖装载到韧皮部。SUT1亚家族对底物蔗糖具有最高亲和力，这对双子叶植物中蔗糖的有效韧皮部装载至关重要，而单子叶植物则利用高亲和力SUT2转运体[14那17那34那35]．此外，Sut4对蔗糖相对于Sut1和Sut2具有较低的亲和力[30.]．

除了与蔗糖运输有关，SUT基因在植物的各种发育和生理过程中也起着重要的作用。例如,SUT1基因亚家族参与营养生长的调节[17，花粉发育[36那37]、花期[38]、果实及种子发育[39那40，花青素积累[41]和块茎产量[42]．这SUT2基因亚家族最初被描述为糖传感器[13那43]．然而，这种假定的蔗糖感知功能随后受到了质疑[2，越来越多的证据表明SUT2基因作为糖转运体，有助于提高粮食产量[44]、生殖器官发育[31]和对非生物压力的抵抗力[23]．

糖积累与果实产量和品质密切相关。由于糖转运基因在糖积累中起重要作用[45那46，越来越多的人开始关注调查SUT在过去的20年里，许多水果品种的基因家族，如葡萄藤[47那48那49，甜橙[50],桃子[29那51),梨(52]和苹果[53]．一种SUT2基因,即。MdSUT2.2在Apple中，最近被证明可以调节苹果中的水果糖积累[22那23那54]．一些SUT4基因,包括柑橘类CsSUT4[50),小道消息VvSUC11[55),苹果MdSUT1[33)和枣zjsut4.[56，被发现可能与果糖积累有关。然而，它的作用SUT4基因家族在果糖积累中的作用尚不明确。

苹果 （马吕斯x有明显是蔷薇科的一员，是世界上重要的经济水果作物。它是一个二倍体，但具有同源多倍体起源，基本染色体数目为x = 17，单倍体基因组大小约为750 Mb [57]．糖含量是水果感官质量的重要组成部分，因此在苹果育种计划中获得了高优先级。然而，糖含量被定量遗传，并且已经鉴定了几种负责水果糖积累的基因，尽管在苹果苹果上广泛地进行了用于水果糖含量的定量性状基因座（QTL）的遗传映射[58那59那60那61那62]．为了便于了解控制水果中的复杂机制的复杂机制，我们调查了该角色SUT苹果果实糖含量测定的基因家族MdSUT4发现基因参与调控果糖积累。本研究将有助于我们了解SUT4蛋白对果实糖积累的影响。这SUT4基因及其分子标记也可以作为分子工具，在苹果育种过程中对果实甜度进行遗传改良。

识别的SUT苹果基因组中的基因家族

对‘Golden Delicious’双单倍体GDDH13的苹果参考基因组序列进行筛选，共发现6个参考基因组MdSUT这些基因位于不同的染色体上。1a).推导的蛋白质MdSUTs所有α-螺旋都包含12个可能的跨膜螺旋(图S1）.系统发育分析表明，这6种植物均具有较好的发育潜力MdSUTs可以分为三个亚属，每个都包含两个成员（图。1b),MdSUT基因随后按标准基因命名法命名[1]．有趣的是，二MdSUT同一亚家族的基因具有相似的基因组结构，并位于一对同源染色体上(图。1a，c）。这MdSUT1那MdSUT2,MdSUT4基因包含4个外显子、14个外显子和5个外显子，分别位于3对同源染色体5-10、13-16和8-15上。此外，MdSUT2蛋白在TM6和TM7之间有一个大的中心环，长度超过90个氨基酸，而MdSUT1和MdSUT4的中心环长度都小于45个氨基酸(图S)1）.同样，MdSUT2的n端结构域长度是MdSUT1和MdSUT4的2.7倍。这些结果与之前的报道一致，SUT2亚家族具有扩展的n端和中心环路[13]．

之间的联系MdSUTs以及苹果果实中糖分的积累

开发了SSR标记MdSUT1.1和MdSUT2.1基于两颗电子微卫星(CAAAAA)_N(助教)_N分别（表1）.位于起始密码子(CT)上游的两个微卫星_N和(AG)_N，已成功用于开发SSR标记MdSUT1.2和MdSUT4.1,分别。而SSR标记MdSUT4.2和MdSUT2.2是基于（TA）开发的_N和（CT）_N微卫星分别位于终止密码子下游。估计协会SUT利用这些新开发的SSR标记对353份苹果材料进行基因型分析[63]．结果，两种植物均检测到4个多态条带MdSUT1.2和MdSUT2.2，分别鉴定出3、3、2和2个多态性条带MdSUT1.1那MdSUT4.1那MdSUT4.2和MdSUT2.1(图S2a, b).最后，多态位点的关联MdSUT采用候选基因关联策略对含糖基因进行分析。结果仅显示(AG)_N微卫星位于起始密码子的上游15 BPMdSUT4.1与果糖含量显著相关，其概率值(P.-value）0.0028（表1）.三个等位基因，（AG）_6.(AG)_9., (AG)₁₁，被识别出来MdSUT4.1通过直接测序PCR产物的轨迹（图。2a).基于(AG)的存在或缺席_9.在MdSUT4.1将所有材料分为3个基因型:(AG)_9/9(AG)_6/9, (AG)_6/6或11．一份或两份(署理)_9.(AG)基因的果糖含量显著低于无(AG)基因的_9.等位基因(无花果。2b）。但是，（AG）_9.等位基因对总糖和蔗糖含量均无显著影响。

进一步确认关联关系MdSUT4.1研究了苹果果实糖积累基因的表达谱MdSUT4.1的水果三在不同发展阶段的品种和一个Crabapple（图。3.）.总的来说,MdSUT4.1基因在年轻阶段表达最高，然后在果实发育过程中表达减少，成熟阶段下降约7-9倍。相比之下，糖积累显示出果实发育的积极趋势，成熟阶段的峰值（图。3.）.此外，表达水平MdSUT4.1与葡萄糖含量显着呈负相关（R.=−0.359,P.<0.05），果糖含量（R.=−0.618,P.< 0.001)、蔗糖含量(R.=−0.604,P.<0.001）和总糖含量（R.=−0.624,P.< 0.001)。综上所述，这些结果表明MdSUT4.1是参与水果糖积累的候选者，进一步进行功能分析。

烟草中MDSUT4.1的亚细胞定位

如上所述，MdSUT4.1包含12个假定的跨膜结构域。为了进一步确定MdSUT4.1的亚细胞定位，将黄色荧光蛋白YFP融合到MdSUT4.1的c端。由CaMV 35S启动子驱动的MdSUT4.1-YFP融合结构在烟草中瞬时表达(烟草benthamiana)，发现MdSUT4.1-YFP融合蛋白位于液泡膜(图。4.）.此外，我们与标准液泡膜标记Vac-rk CD3-975进行共定位，以确定MdSUT4.1的亚细胞位置(图1)。4.）.激光共聚焦荧光显微镜显示液泡膜标记vacr -rk CD3-975的mCherry荧光与MdSUT4.1-YFP的YPF荧光合并。说明MdSUT4.1是液泡膜定位蛋白。

过度的MdSUT4.1草莓和苹果愈伤组织中的基因

为了检验MdSUT4.1是否能够运输糖分，将其暂时转移到草莓未成熟的白色果实中(图1)。5.a).实时定量PCR (qRT-PCR)分析表明MdSUT4.1在转基因果实中高表达。5.b）。果实过表达的蔗糖含量明显减少了35％MdSUT4.1与空载体渗透的水果相比(图。5.c).但过表达果实的葡萄糖、果糖和总糖含量无显著差异MdSUT4.1或者引入空向量。通过qRT-PCR检测蔗糖代谢或转运相关基因的表达水平，包括Fasps.(蔗糖磷酸合成酶)Fasusy.(蔗糖合酶),FavAINV(液泡酸转化酶)和FaSUT1，在测定草莓果实蔗糖含量中起重要作用[40那64]．因此，表达水平Fasps.和Fasusy.显著降低了水果的过度表达MdSUT4.1与空白载体浸润的果实相比，表达量无显著差异FaSUT1和FavINV(无花果。6.）.这与果实过表达降低了蔗糖积累的结果一致MdSUT4.1．

进一步证实的功能MdSUT4.1在苹果愈伤组织中(Fig。7.一种）。QRT-PCR测定显示MdSUT4.1基因在转基因株系中高表达(图。7.b).愈伤组织过表达的蔗糖浓度MdSUT4.1与引入空载体愈伤组织相比，葡萄糖、果糖和总糖浓度分别显著降低了27.96、20.68和48.88 mg/g FW(图3)。7.c).利用qRT-PCR分析糖转运相关基因的表达水平(图。8.）.结果，a液泡内糖转运体MdTST1和MdSUT2.2在Calli过表达中显示出显着降低的表达水平MdSUT4.1在引入空载体的愈伤组织中，愈伤组织的变化趋势与此相反MdSUT4.2那MdSUT1.1和MdSUT1.2．相比之下，MdSUT2.1愈伤组织过表达间表达量无显著差异MdSUT4.1calli引入空向量。此外，据报道影响苹果果实糖积累的糖代谢相关基因的表达水平[65)也进行了研究(图。9.）.MdvAINV1在Calli过表达中显示出显着降低的表达水平MdSUT4.1在引入空载体的愈伤组织中，愈伤组织的变化趋势与此相反MdSPS和MDSDH2-9.(山梨糖醇脱氢酶)的基因。相比之下，mdninv1.(中性/胞质转化酶),mdsusy2.,MdCWINV2（细胞壁转化酶）显示CALLI过表达之间表达水平没有显着差异MdSUT4.1calli引入空向量。

SUT4蛋白靶向液泡膜的机制的复杂性

在果实中，可溶性糖主要储存在液泡中，液泡吸收或释放是液泡内液泡定位转运体催化的。植物中N-和/或c端结构域内的二亮氨酸基序(LXXLL)负责将糖转运到液泡膜的靶向[11那66那67]．各种含有二亮氨酸基序的Sut4亚家族成员，例如拟南芥AtSUT4(又称AtSUC4) [24]，Lotus粳稻LjSUT4 [25]，大麦HVSUT2 [24稻米[68] 和杨树PtaSUT4 [26，已经被证明存在于液泡膜中。在果树中，桃的PpSUT4，苹果的MdSUT4.1和MdSUT4.2，梨的PbSUT2都含有瞄准二亮氨酸基元LXXLL的液泡(图S3.)，因此，它们将定位于液泡膜。MdSUT4.2在以前的一份报告中也被称为MdSUT1 [33]．与MDSUT4.1一样，PPSUT4显示在烟草叶中的瞬时表达中存在于真空膜中[29]．然而，MdSUT1和PbSUT2均通过在细胞中的异位表达定位于质膜拟南芥原生质体及洋葱表皮细胞[33那52]．这种不一致性表明，除了二亮氨酸基序，其他未知因素也可能影响SUT4亚家族成员的亚细胞定位。

MdSUT4.1参与调控苹果果实糖分积累

我们的研究表明MdSUT4.1与苹果果糖积累显著相关，位于LG8上的甜度QTL区间[58]．表达水平MdSUT4.1草莓和苹果愈伤组织中过表达对糖积累总体呈负相关。这些结果表明MdSUT4.1基因是苹果中果糖积累调控的强大候选者。

如上所述，MDSUT4.1将其存在于真空膜中，并且其在草莓中的瞬态过度表达显着降低了果实中的蔗糖积累。这表明MDSUT4.1具有类似的功能拟南芥AtSUT4和玉米ZmSUT2，均为SUT4亚家族成员，具有将蔗糖从液泡中再动员出来的功能[27那28那69]．这一假设与蔗糖合成基因表达的发现相一致Fasps.与用空载体的果实渗透相比，表达过表达MDSut4.1的草莓果实显着降低。这种表达水平的变化Fasps.可以归因于由过表达引起的芳瓦的蔗糖的排出的反馈MdSUT4.1．

同样，过度表达MdSUT4.1在苹果愈伤组织中己糖的积累显著减少，这与苹果愈伤组织中己糖的表达MdSUT4.1与苹果果实中糖的积累呈负相关。MdSUT4.1可能也介导了苹果愈伤组织液泡中蔗糖的流出，这一假设与结果吻合MdvAINV1在苹果愈伤组织过表达时，液泡中负责蔗糖分裂的细胞数量显著减少MdSUT4.1．苹果愈伤组织过表达后蔗糖积累量略有增加MdSUT4.1可能是由于激活MdSUT1.1和MdSUT1.2随着SUT1已知基因作为高亲和力蔗糖转运蛋白和蔗糖摄取的功能，进入水槽储存组织[70那71]．

先前的研究表明，SUT4可以与其他糖转运体如SUT1和TST相互作用[29那43那72]．因此，它不能排除过度表达MdSUT4.1在苹果愈伤组织中可能影响其与其他糖转运体如MdTST的互作，导致糖积累的变化。此外，我们的结果表明，过度表达MdSUT4.1结果糖代谢和转运基因的级联反应影响糖积累，这与以前的报道相似[32那73]．

在苹果中，山梨醇是韧皮部中主要的糖，但在成熟的水果中它只占5%左右，因为大多数转化为果糖[74]．编码山梨糖醇转运体(SOT)的基因表达，包括mdsot1.那MDSOT4.和MdSOT5.3，减少了苹果Calli过表达MdSUT4.1(无花果。4.）.因此，是否过度表达值得进一步研究MdSUT4.1对表达有影响吗MdSOTs，导致苹果果实中的糖积聚变化。

我们的结果表明，Tonoplast局部蔗糖转运蛋白MDSut4.1参与调节苹果中的水果糖积累。我们的结果对于更好地了解Sut4蛋白对水果糖积累的影响是有用的。此外，分子标记物MdSUT4.1可作为苹果育种中果实甜度遗传改良的工具。

植物材料

本研究使用的所有苹果品种均在中国农业科学院兴城果树研究所保存。收集每个品种的幼叶，在液氮中冷冻，然后在−80℃保存至使用。测定含糖量的水果样品在2015年的成熟期随机收获，这是根据之前的成熟日期、皮肤背景颜色和腮红发育以及种子颜色变为棕色的记录估计的。此外，一只海棠果(苹果属良性)，选择‘Calville Rouge’、‘lisjin’和‘Weiqinni’3个品种进行qRT-PCR分析。果实采自开花后60、90、120 d的幼、幼、成熟阶段。3个生物重复，每次添加10个果实。水果样品在液氮中冷冻，在−80°C下保存用于qRT-PCR分析，或在−40°C下保存用于糖的测定。草莓品种‘红岩’由湖北省农业科学院经济作物研究所提供，在自然光照条件下，温度为10°C - 26°C的温室中栽培。以苹果品种‘Orin’果肉为材料诱导的苹果愈伤组织由西北农业大学关庆梅教授提供。

水果含糖量的测定

根据我们之前报道的方案，采用高效液相色谱(HPLC)测定糖含量[75]．本研究中的总糖是指主要可溶性糖的总和，包括蔗糖、果糖和葡萄糖，它们加起来占苹果果实总糖的95%以上[74]．简单地说，使用A11基本分析磨(IKA-Werke, Staufen, Germany)将水果样品在液氮中磨成粉末，大约0.5克粉末转移到一个干净的Eppendorf管中。用6 mL去离子水超声提取可溶性糖，超声处理15 min，然后在5000×g离心15 min。上清液通过0.22 μm Sep-Pak过滤器(ANPEL，中国)过滤。采用高效液相色谱系统(Agilent 1260 Infinity，德国Waldbronn, Agilent, 1260 Infinity)和折射率检测器(RID)对滤膜进行糖含量测定。进样量为20 μL，色谱柱为CarboSep CHO-620 Ca (300 × 6.5 mm, 10 μm粒径)和CarboSep CHO-620 Cartridge (Transgenomic, San Jose, Ca, USA)。流动相为去离子水，流速为0.5 mL/min，柱温保持在90℃。糖浓度是通过与标准曲线的值比较来估计的。蔗糖(CAS号57-50-1)、葡萄糖(CAS号50-99-7)、果糖(CAS号57-48-7)均购自Sigma。每次添加都有3个生物重复。

RNA分离及qRT-PCR分析

在制造商的说明之后用RNAPREP纯植物套件（天根，北京，中国）提取全RNA，使用DNase I（Takara，China）除去基因组DNA污染。使用转肌型单步GDNA去除和cDNA合成Supermix（Trans，北京，中国）进行CDNA模板的合成。QRT-PCR测定用TBGreen®Mifix进行Taq™II（TLI RNase H Plus）（TARI RNASE H Plus）（Takara，大连，中国），对应用生物系统进行扩增第一加上实时PCR系统（Life Technologies Corporation），卡尔斯巴德，加州，美国）。在40个循环结束时分析熔化曲线以确认特异性扩增产物。先前报道的actin基因[76]作为本构对照，同时对每个样品进行阴性对照。每个样本有三个生物重复。底漆序列列于表s中1．

的识别SUT苹果基因组中的基因及其分类

的识别SUT基因最初是基于苹果基因组注释数据库GDDH13 [77),和六个MdSUT基因被确定。随后，每一个的编码序列SUT将基因进一步使用在线计划BLASTN与苹果草案基因组进行比较（https://www.rosaceae.org/blast),E.值截止值为1e-10，没有额外的成员被识别。来验证MdSUT利用BLASTp技术对GenBank的非冗余蛋白(NR)和Swiss-Prot蛋白数据库进行blast分析E.值截止1e-5。染色体的位置MdSUTs是根据GDDH13的基因组草图序列提出的[77]．使用Psipred进行蛋白质跨膜结构域的预测（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)[78]．使用可视化软件IBS Version 1.0绘制基因结构[79]．

分类MdSUTs，它们的氨基酸序列与SUT基因拟南芥和使用MEGA5和默认参数的桃子。所得数据矩阵采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。从1000次重复中估计引导值。

基因标记标记的开发和基于候选基因的关联分析

每个基因组DNA序列MdSUT从GDDH13的基因组草案中取出[77]，然后使用微卫星重复探测仪(http://insilico.ehu.eus/mini_tools/microsatellites/）.使用Primer总理5.使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到SSR多态性的SSR标记的引物，与前一份报告后的银染色相结合检测到SSR多态性[80]．

多态SSRs的MdSUTs用于筛选与我们之前的研究中相同的353个Apple Reversion的收集[63]，引物序列列于表S2．协会MdSUTs采用混合线性模型，在TASSEL 3.0版上进行P.<0.01作为显着标志性状协会的标准。在我们之前的研究中相同的KILESHIP（K矩阵）和最可能的K值（Q矩阵）是相同的[63]．Bonferroni阈值设为≤1/n，其中n表示样本量。

MdSUT4.1在烟草中的亚细胞定位分析

从pEarleyGate104中扩增出YFP片段，利用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit (Yeasen, Shanghai, China)克隆到pFGC5941的BamHI-SpeI位点，构建pFGC-eYFP载体。全长编码序列的扩增MdSUT4.1使用由'Calville Rouge'的果实制备的cDNA模板进行。将纯化的PCR产物插入PFGC-EYFP载体的BamHI位点，以产生沿着制造商的说明书中的融合®HD克隆套件（Takara，大连）的PFGC-EYFP-MDSut4.1构建体。用于表达载体结构的引物序列列于表S中3.．

空泡膜标记物vacrk CD3-975 [81]， pFGC-eYFP-MdSUT4构建物分别转入根癌土壤杆菌用热休克法将菌株GV3101 (pMP90)涂于琼脂平板上，28℃孵育3天。取单个菌落，悬浮在LB培养基中，28℃摇匀培养过夜。用4000 g离心5分钟收集农杆菌细胞，用10 mM MES、10 mM MgCl的渗透缓冲液重悬₂， 450 μM乙酰丁香酮，pH 5.6)。4-5周的叶子n benthamiana共聚焦显微镜(TCS SP8, Leica, Microsystems, Wetzlar, Germany)检测荧光。所有的扫描仪都使用一个× 20物镜来获取数字图像。用512 nm激光对YFP进行激发，用552 nm激光对mCherry进行激发。荧光发射波长分别为530 ~ 550 nm (YFP)和600 ~ 650 nm (mCherry)。

的功能分析MdSUT4.1在草莓和转基因苹果愈伤组织中

整个CDSMdSUT4．1通过同源重组扩增并插入EcoRI和Xbai酶位点之间的表达载体PSAK277的位点。底漆序列列于表s中3.．将重组载体pSAK277- mdsut4.1和空载体pSAK277分别转入农菌株EHA105具有热冲击方法，然后将含有50mg / L链霉素，50mg / L庆氨酰和100mg / L旁观霉素的琼脂平板。在28℃温育3天后，挑选单枚菌落，悬浮在LB培养基中，并在28℃下振荡温育过夜。通过以4000g以4000g离心5分钟来收集农杆菌细胞，然后用于渗透草莓CV的果实。从CV肉体诱导的宏岩和苹果疾病。orin。

瞬态过度表达MdSUT4．1根据之前的一份报告[82]．简而言之，将收集的细菌粒料重悬于浸润缓冲液（50mM MES，5mg / ml D-葡萄糖，2mM NA中_3.阿宝_4.(100 μM乙酰丁香酮)，细胞密度调节至OD值_600海里0.2。将悬浮液用注射器的针头注射到未成熟的白色果实的果肉中，将渗入的植株置于自然光和温度为10°C - 26°C的温室中。浸渍后9 d采集果实样品，进行qRT-PCR分析和糖含量测定。

为了转化苹果愈伤组织，收集的细菌球被重悬在5%的蔗糖溶液(pH 5.3)中，并调整细胞密度到OD_600海里2.0。将苹果愈伤组织浸泡在悬浮液中15 min，经无菌尼龙网(200目)过滤收集，在含3%蔗糖、1 mg/L 2,4- d、1 mg/L 6-BA和400 mg/L头孢氨苄的MS培养基上，在25℃黑暗条件下培养2 d。将转基因苹果愈伤组织用含400 mg/L头孢氨苄的无菌Mili-Q水洗涤5次，过滤后干燥，然后在含3%蔗糖、1 mg/L 2,4- d、1 mg/L 6-BA、400 mg/L头孢氨苄、50 mg/L卡那霉素的MS选择培养基上培养。转基因愈伤组织连续传代3代后，采用高效液相色谱法测定其糖含量。此外，转基因愈伤组织通过PCR扩增和表达得到证实MdSUT4.1采用qRT-PCR分析。底漆序列列于表s中1．

本研究中所使用和分析的数据集可由通讯作者根据合理要求提供。

SUT:

蔗糖运输车

结核菌素:

液泡膜糖转运蛋白

说:

山梨糖醇运输车

SPS:

蔗糖磷酸合成酶

SDH：

山梨糖醇脱氢酶

vAINV:

空泡的酸性转化酶

NINV:

中性/胞质转化酶

CWINV:

细胞壁转化酶

Susy：

蔗糖合酶

DAF):

几天后开花

存在:

实时定量PCR

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

不适用。

国家重点研发计划项目(No. 2018YFD1000200);中国科学院战略性先导技术专项(No. XDA24030404-4);国家自然科学基金项目(No. 31420103914)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟

从属关系

1. 中国科学院种子设计创新研究院武汉植物园，中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室，武汉，430074

   钱鹏，山药蔡，玉柴，廖廖，北北，柯林斯奥格堡，西尔维亚Cherono＆Yuepeng Han

2. 2 .中国科学院大学，北京玉泉路19A, 100049

   彭倩，蔡亚明，赖恩慧，Collins Ogutu & Sylvia Cherono

3. 日本名古屋大学转化生物分子研究所

   中村)

4. 中国科学院核心植物园经济植物研究中心，湖北武汉430074

   廖辽，郑蓓蓓，韩月鹏

5. 中国科学院中非联合研究中心，湖北武汉430074

   Yuepeng汉

贡献

QP进行分子标记发育，基因表达和转基因分析，并制备了稿件。LL和QP进行了统计分析。YC，EL和MN参与基因功能研究。CO，SC，BZ和YH修订了手稿。耶是整体项目领导者。所有作者阅读并认可的终稿。

作者的信息

中国科学院种子设计创新研究院武汉植物园，中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室，武汉430074

钱彭_那蔡亚明，赖恩慧，廖辽，郑蓓蓓，Collins Ogutu, Sylvia Cherono，韩月鹏。

中国科学院大学，19A Yuquanlu，北京100049。

钱彭_那蔡亚明，赖恩慧，Collins Ogutu & Sylvia Cherono。

日本名古屋大学转型性生物分子研究所。

中村)。

经济植物学中心，中国科学院核心植物园，武汉430074。

廖辽，郑蓓蓓，韩月鹏。

中国科学院中非联合研究中心，湖北武汉430074

Yuepeng汉族。

相应的作者。

给韩月鹏的信。电子邮件:yphan@wbgcas.cn.．

相应的作者

对应到Yuepeng汉．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

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