优化水杨酸和壳聚糖治疗苦区和磷酸锡糖苷的芽培养Shertia paniculata.采用响应面法和人工神经网络

背景

在这项研究中,响应面方法(RSM)和人工神经网络(ANN)是用于构造预测模型的线性,二次和互动两个独立变量的影响viz.水杨酸(SA)和壳聚糖(CS)的生产amarogentin(我),swertiamarin苷(2)和(3)拍摄的文化Shertia paniculata.墙．这些化合物是主要的治疗代谢物獐牙菜属植物，在制药行业具有重要作用和需求。

结果

目前的研究强调，不同浓度的SA和Cs Elictoration大致影响在改性½MS培养基上建立的芽培养中（I），（II）和（III）化合物的百分比（补充含有2.22mm，2.54 mm naa）。在RSM中，使用具有五因素三级完整因子CCD计算具有线性，二次和2路交互模型的不同响应变量。在ANN建模中，将13个CCD矩阵分为3个亚群，近似8：1：1的比率，训练，验证和测试。（I）（0.435％），（II）（4.987％）和（III）（4.357％）生产的最佳增强是在14天的芽培养的14天治疗中实现的S. Paniculata.引出9毫米和12毫克l^{- 1}浓度(SA)和(CS)。

结论

在优化研究中，（i）显示0.170-0.435％;（ii）显示1.020-4.987％和（iii）高达2.550-4.357％的差距，随着SA（1-20毫米）和Cs（1-20 mg L.^{- 1}）.总体而言，优化Elictors促进Secoiridoid和Xanthone糖苷的生产与ANN建模（r²= 100%)与RSM (r² = 99.8%).

图形抽象

獐牙菜属（家庭：GentiaCeae）是在亚洲，美洲，欧洲和非洲的北部温带地区全球分布的多样化属[1]．在印度传统(阿育吠陀，乌纳尼和悉达)和英国药典中，这个属被引用为一种有效的草药。生物活性化合物，即amarogentin(苦味指数为58,000,000的最苦的化合物)、獐牙菜amarin和芒果苷的存在被发现是广泛的治疗潜力的原因[2]．S. Chirata.（roxb。ex fleming）H.喀斯特。用作几种商业草药/聚比式制剂中的主要成分。S. Paniculata.墙。通常用作替代品S. Chirata.在许多草药制剂中[3.]．据报道，很长时间S. Paniculata.含药用重要生物活性化合物[3.那4.那5.那6.]，最近的研究得到了支持[7.那8.]．提取物S. Paniculata.在印度医学体系中被用作苦补和治疗一些精神疾病[4.]．negi等人。[5.的抗糖尿病活性S. Paniculata.发现阿仑胍诱导大鼠血糖水平降低51.0％。生物学活动S. Paniculata.是由于X吨酮糖苷的存在和苦塞 -3.那4.那5.那6.那7.那8.]．不断增长的工业需求、过度采收、种子发芽率低(2-3%)和其他人为干扰对野生种群产生了不利影响獐牙菜属物种。一些獐牙菜属物种被列为严重濒危，从而占商业需求与供应之间的差距獐牙菜属草本不断增长。一旦特定工厂被商业化，随后由于广泛的过度投资而很快地危及。像世界卫生组织（WHO）和欧洲药物局（EMA）这样的政府机构制定了一些原则，以适度适度的药用植物的威胁状态。植物生物技术的进步对保护和生产的植物生物技术的巨大保障和生产具有良好的药用稀有和濒危植物群以及大规模生产的植物衍生的二次代谢物。在各种药用植物中，组织培养技术已被成功被证明是潜在的替代策略，用于生产具有临床意义的有价值的生物活性化合物[9.]．在獐牙菜属SPP。，很少有报告可用于增强使用毛茸茸/不定根培养，根瘤菌等的生长和次级代谢产物产生的体外策略。[10.那11.那12.]．迄今为止，水杨酸(SA)和壳聚糖(CS)对环烯醚萜和口山酮苷生产的影响尚未见报道S. Paniculata.拍摄文化。

Elicerors可以在进一步增强特异性酶促反应的植物中诱导生物或非生物胁迫，并诱导与所需次生代谢物的信号传导途径相关的基因子集[13.]．在非生物和生物诱导子中，水杨酸(SA)和邻羟基苯甲酸(o-hydroxybenzoic acid)是植物产生系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)和诱导系统抗性(induced system resistance, ISR)的重要内源信号分子[14.]．SA信号通路促进了保护植物免受病原菌侵害的SAR，从而产生病原菌相关蛋白(PRPs)。作为植物防御系统的一部分，SA也可以诱导活性氧(ROS)的产生。大量研究表明，SA对激发不同种类酚类化合物的外源性作用[15.那16.那17.那18.]．值得注意的是，壳聚糖（CS）是无毒，成本效益的，并且是第二种最丰富的聚阳离子生物聚合物，其在体外产生的高值次级代谢产物如芳族氨基酸，苯基丙醇，朱锐，单宁，三萜类，x原蝶酮，secoiridoids等[19.那20.那21.那22.]．

众所周知，只有Elicitor和前体浓度的最佳水平增加了所需次级代谢物的体外产生。在优化代谢物生产培养基中，中央复合设计（CCD）和Box-Behnken设计（BBD）是最常用的设计，从响应表面方法（RSM）的统计数学建模中获得最佳响应[23.那24.]．统计上，RSM使用对称的实验设计，探讨单个或多个响应变量的影响，并优化这些变量以获得最佳响应[25.]．另一方面，人工神经网络（ANN）是基于非线性加权和统计数据建模工具的信息处理模型。Ann是通过发现响应和预测变量之间复杂连接的生物神经元网络的启发。与RSM相比，ANN是一个更准确的插值，预测和验证方法[26.]．

Amarogentin、swertiamarin和mangiferin被认为是该属的3个主要植物化学标记獐牙菜属．因此，优化这些化合物的体外合成具有重要的意义。优化的快繁技术有潜力满足医药工业对药用植物的需求。植物生长调节剂已被报道用于生物活性化合物的高频再生和离体生产[27.]．

目前的工作已经致力于优化SA和CS对amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin的体外生产的影响S. Paniculata.．采用多元响应面分析的全因子CCD完成优化过程，并与人工神经网络模型进行比较。

有机组织

在该研究中，使用烘烤（6-苄基氨基氨基嘧啶），KN（kinetin）和NAA（1-萘酸）的组合用于有机组织。通过½MS培养基在6周后含有2.22μm的培养基，1/2 ms培养基，α和2.60μmnaa实现了高射击再生和伸长率。表格中提出了不同浓度的射击诱导介质（SIM）的平均拍摄长度1．

RSM的实验设计和统计优化

在目前的研究中，与对照组的培养物相比，具有最佳浓度的SA（低于10mm）和Cs（高于10mg / L）的芽培养物（低于10 mm）和Cs（以上，芽孢杆菌和Mangiferin（未治疗的芽）增加了amarogentin，swertiamarin和mangiferin的收率有elictors）。在比较比较0.25,3.0和2.2倍后，使用9mM SA和12mg / L Cs处理的培养物观察到amarogentin（0.435％），Swertiamarin（4.987％）和Mangiferin（4.357％）的最大收率。分别对受控培养物。

采用响应面法(RSM)进行统计优化，采用中心复合设计(CCD)对两个变量(α= 1.41)，所有因素在5个不同的水平进行研究(−一个−1,0，+ 1，+一个）.通过CCD，表中总结了amarogentin (I)、swertiamarin (II)和mangiferin (III)对SA和CS作用的实验值2．计算响应表面回归和差异分析（ANOVA）（I），（II）和（III）化合物的％产率％，并且总结在额外的文件中1：表S1和S2。更高费雪分布(F T.(I) (1213.5)， (II)(1818.51)和(III)(668.11)表示模型的充分性。在这个实验,p <0.001被认为是非常重要的，但是p <0.05作为显着的值。在这个模型中，缺乏适合并不重要（p >0.05）因为它代表（I）（1.51），（II）（II）（0.55）和（III）（0.82）的较小的F值。显着的回归和非显着缺乏适应性证实了与实验数据的数学建模的充分性和健康状况[25.]．R²从（I）（99.64％），（II）（99.82％）和（III）（99.51％）中获得的值还揭示了响应值与独立变量之间的良好相关性。通过该设计获得的预测值用于绘制SA的轮廓图和Cs与Amarogentin的屈服％（图。1），swertiamarin（图。2）和mangiferin（图。3.)化合物。

根据二次方程计算线性、二次和双向交互模型的不同响应变量(1)，上面提到的所有变量都是显著的(附加文件1：表S1和S2）。基于二阶动力学的多元回归方程用于预测响应值（％）的amarogentin（y₁), swertiamarin (Y₂）和mangiferin（y_3.）.

其中A和B代表使用用作显着反应变量的水杨酸和壳聚糖，以获得培养的植物中的（I），（II）和（III）的最大收率S. paniculata。在本实验中，Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin分别显示出0.170-0.435％，1.020-4.987％和2.550-4.357％的差异。独立变量（A和B）的线性回归系数对（i），（ii）和（iii）的产量显示了积极影响（附加文件1：表S1）。线性系数值表明，SA效应Swertiamarin产率（1.01422）最大，其次是Mangiferin产率（0.22064），但对Amarogentin含量的影响表现出较小的影响（0.05000）。另一方面，Cs也影响了Swertiamarin产量（0.68208）最大，然后是Mangiferin产量（0.51145），对Amarogentin含量的影响较小（0.04096）。出于两个独立变量（A和B），SA对Swertiamarin和Amarogentin产量的影响更多，但CS对Mangiferin产量的影响相对高。如附加文件所示1表S1和S2, A和B变量的线性和二次效应非常显著(p <0.001）对于（i），（ii）和（iii），而变量（a和b）的相互作用仅显示出显着影响（p<0.05）。

如轮廓图所示（图。1那2那3.,4.），为SA和CS获得的最佳值为9 mm，12 mg l^{- 1}分别产生最大数量的Amarogentin（0.435％），Swertiamarin（4.987％）和Mangiferin（4.357％）。实验值非常接近预测值（表2因此，该数学模型适当开发用于统计优化SA和Cs对SecoIridoid（Amarogentin和Swertiamarin）和X吨酮（Mangiferin）糖苷的产率的统计优化。

ANN建模

在本研究中，ANN采用了训练阶段的反向传播算法，并开发成3层：输入层（A和B），隐藏层和输出层（Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin的％收率）。在ANN建模中，将13个CCD矩阵分为3个子集，近似训练，验证和测试的近似8：1：1。数字5.描绘了在整个训练数据上获得的性能数据，并以最佳的时期安装了验证数据。类似地，在图4的帮助下解释了整个ANN培训中实现的梯度损失和训练状态。5.．amarogentin (I)、swertiamarin (II)和mangiferin (III)的优化验证性能分别在epoch 0、75和40时达到最佳。

此外，将RSM模型与ANN模型进行比较，该模型表示ANN模型，作为更准确的插值，预测和验证方法。与RSM相比，ANN模型在预测和实验值之间显示出较少的偏差。桌子2响应于所有三种研究的生物活性化合物获得的实验值，描绘了预测值。此外，在两个模型之间基于三个显着的统计参数，VIZ之间绘制了比较。根均线误差（RMSE），绝对平均偏差（AAD）和回归系数（r²）.

根据EQS计算RMSE和AAD。4.和5.．

表中显示了RSM和ANN模型的分析参数的比较概述3.．在目前的研究中，ANN证明了最佳验证统计参数，因此可以用作优化方法中的准确方法。

HPTLC定量Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin的定量

现在，高性能薄层色谱（HPTLC）现已成为一种高效，简单，特异性，精确，准确的以及强大的分析技术，通过该方法可以一次分析巨大的样品。在过去几年中，HPTLC技术已被证明是在几种药用植物中进行化疗的强大技术[28.那29.]．在目前的研究中，流动阶段（S1）在具有R的TLC板上给出了明确的密集点_f獐牙菜苦苷(II)为0.62,amarogentin (I)为0.8(图。6A）.流动相(S2)在薄层色谱(TLC)板上显示清晰的单点_fmangiferin（III）的0.48（图。6B.）.所有标准的峰值一致为定义的R_f在所有测试样品的3-D密度图模式中叠加，以及参考化合物（I），（II）和（III）。将（I），（II）和（III）化合物的吸收光谱与测试样品进行比较以检查峰纯度（图。6.）.在效果指纹;图中轨迹6和9。6A（Secoiridoids），而图2中的轨道4和8。6B.（mangiferin），用最佳水平的SA和Cs浓度进行显示的显示样品（描绘了更高浓度的Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin化合物）。通过峰面积参数来定量所有研究的代谢物。根据ICH指南验证了HPTLC方法的精度，准确性和可重复性[30.]．

PGR对器官发生的影响

在本研究中，在诱导芽的MS培养基中添加具有一定浓度的细胞因子(BAP或KN)的生长素(NAA)可促进健康的芽形成。

在獐牙菜属， BAP与NAA和KN联合使用是最常用的最佳器官发生[31.那32.那33.]．在许多其他药用植物中，细胞分裂素与毒素的组合显示出抗血液增殖的优异结果[8.那9.]．细胞因子和生长诱导剂的种类和浓度对平均芽数和平均芽长有影响。在獐牙菜属和其他植物;用于茎伸长和增殖的最常见的植物生长调节剂是BAP与NAA和激动素的各种成分结合[8.那9.那31.那34.]．

在目前的研究工作中，射击培养物用于检查SA和Cs对次生代谢物的产生的影响。在细胞分化过程之后，次级代谢物通常是生物合成的。结果，器官培养对植物中活性原理表达了良好的前瞻性。同样，在其他Gennaceae家族，Krstic等人。[35.]描述了器官培养中的x原酮和secoidoids的较高生产。Boroduske等人。[36.]倡导的射击培养更适合Secoiridoid生产。

诱导子处理

低浓度SA的外源性处理通过上调防御相关基因表达，引发各种重要的次级代谢物[15.那18.那37.]．在本研究中，较低浓度的SA (>5 mM)和CS (>10 mg L^{- 1})导致化合物含量低(表2， 图。6.）.在本研究中开发的实验设计清楚地表明（9毫米）SA和（12毫克L.^{- 1}）Cs产生的氨基蛋白酶（0.435％），Swertiamarin（4.987％）和Mangiferin（4.357％）的最大含量S. Paniculata.．然而，浓度较高的菌株（A和B）处理降低了SecoIridoid和X吨酮含量（表2）.在我们之前的报告中，同样在野生样本中发现了结果S. Paniculata.从Himachal Pradesh和Uttarakhand的更高海拔地区收集[8.]．

已经注意到，与根系相比，在空中零件上上调unigenes獐牙菜属用于amarogentin, swertiamarin和mangiferin的活性代谢合成[38.]．Secoiridoids遵循MVA/MEP信号通路，而口山酮苷遵循苯基丙烷信号通路[38.那39.那40]．具有最大次级代谢物含量的组织具有高水平的基因表达，可由最佳水平的前体或激发子触发[41.]．转录组研究显示，升高的基因表达参与代谢途径的赛烯醚萜和口山酮化合物。研究表明，壳聚糖可显著提高獐牙菜苦苷的含量矢车菊射变[36.]，Amarogentin化合物Swertia chirata.[12.和芒果苷化合物金刚素孔化物质培养植物[42.]．含壳聚糖众所周知，释放各种防御基因，也诱导次级代谢物的生产以抑制微生物的生长[21.那43.]．Krstić-milošević等。[44.]研究了水杨酸和壳聚糖elictors对毛发根克隆X原酮的影响Gentiana Dinarica贝克。并报告称，最高浓度的菌株增加了X吨酮：糖苷酮无糖素含量，但同时减少其糖苷的生产：Norswertianin-1-O-Primeveroside。在另一个研究中，Toci等人。[45.[评价壳聚糖诱导对疾病和细胞悬浮培养的X原酮生物合成的影响H.穿孔亚普。angustifolium.并且在引发的细胞培养物中表现出X原酮生产（Paxanthone，1,3,5,6-四羟基吡喃酮，1,3,6,7-四羟基吡喃蒽酮和镉素G）。

这是关于优化水杨酸（SA）和壳聚糖（CS）的第一次研究，用于生产Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin的芽培养S. Paniculata.．采用中心复合设计(CCD)响应面法(RSM)优化SA和CS的线性效应、二次效应和互作效应，以最大限度地生产紫茉莉酸酯(amarogentin和swertiamarin)和口山酮(mangiferin)苷。将RSM模型与人工神经网络模型进行了比较，结果表明，与RSM相比，人工神经网络的插值和验证方法更为准确。为了使误差最小化，加快收敛速度，ANN在训练阶段采用反向传播算法进行模型的训练和收敛，没有任何延迟和损失。SA和CS处理的最佳水平可提高植株的培养效率。这些结果表明，组织培养技术的进步可能有助于重要的次生代谢物的产生和增强。组织培养体系的优化是进一步提高多种细胞/组织培养类型生物合成潜力的前提。体外繁殖也为商业植物细胞系和其他生物技术策略提供了下一个平台。未来，化学工程和分子技术的改进将为组织培养提供新的方向，以提高次生代谢产物的生产和生物反应器的使用，优化微繁殖技术。

化学品和标准化合物

目前实验中使用的所有化学品和溶剂都是从E. Merck（孟买，印度）购买的HPLC等级。所有amarogentin（1）标准（目录号CFN 90519; 98％纯度）和swertiamarin（2）（目录号CFN 99818; 98％纯度）是从Chromadex，India和Mangiferin（3）（目录号）（目录号M3547-100mg;> 98％纯度）购自Sigma Aldrich。修改Murashige和Skoog（MS）[46.]补充有CaCl的培养基₂(332.2 mg / L)_那HIMEDIA TM（印度）获得维生素（NITSCH维生素混合物），蔗糖和琼脂，植物激素，灭菌剂，水杨酸和壳聚糖（低分子量壳聚糖衍生的≥75％脱乙酰化程度）。

植物材料和快繁

成熟的植物S. Paniculata.在2017年11月，位于Chakrata-Deoban地区的高海拔药用和芳香植物苗圃中的水果阶段，位于Chakrata-Deoban地区，在2017年11月，植物以3,2600米，高度2600米）。该工厂是根据R.C Gupta教授的形态特征，分类学家专家。制备凭证标本（第11112017号），并在植物学，可爱的专业大学，Phagwara，旁遮普邦，印度博士省。将胶囊与植物分离，分离种子，用蒸馏水洗涤，除去从场上携带的所有污染物。将种子在4℃下储存在气密容器中。在接种前一天，种子浸泡在100ppm ga_3.（凝胶酸）在4℃下过夜。对于灭菌，将种子浸入5％Bavistin溶液中20分钟;用70％乙醇灭菌30秒并用0.1％HGCL处理₂溶液持续摇晃5分钟，然后用蒸馏水清洗5次，以去除消毒器的痕迹。MS培养基在15 psi和121°C温度下适当灭菌15分钟。

对于幼苗的萌发，种子被½ms培养基接种，其具有3％（w / v）蔗糖，维生素，CaCl₂和0.7％的琼脂。6周后，用不同组合的BAP和KN（每次4.44mm）和NAA（2.60和5.20mm），将小植物转移到芽诱导培养基（SIM）中（SIM）（2.22和4.44mm）（表1）.在4和6周后估计，用不同组合的植物和细胞素组合开发的平均射击长度。在培养期的6周内开发了健康的射击（5-6厘米长）。6周后，无菌地取出繁殖的射击。用不同浓度的水杨酸（1,5,10和20mM）和壳聚糖（1,5,10和20mg L处理孤立的芽。^{- 1})混合到½MS培养基中2周。所有实验都在同一时间进行，以消除培养条件和环境的变化。保留两组对照实验(不进行诱导子处理)。所有实验均为三次重复。14天后，用蒸馏水彻底冲洗处理和未处理的苗。

所有培养物的pH使用1M NaOH和1 N HCl保持在5.8。所有培养物和治疗方法在50-80％相对湿度下，25±2℃温度和16小时光周期（冷，白色荧光灯）完成。

基于响应面法的统计优化与试验设计

rsm被应用于检查自变量的效果及其对amarogentin，swertiamarin和mangiferin％含量的互动。在实验中使用的两个独立变量是水杨酸（SA）（1-20mm）和壳聚糖（CS）（1-20 mg L.^{- 1}）.在初步研究的基础上选择SA和Cs浓度。在RSM中，中央复合设计（CCD）应用于五种不同（ -一个−1,0，+ 1，+一个）获得Elicitor治疗的个体和成对效果。一个通过等式计算值：2^{（k-p）/ 4.};k =否。因素和p表示复制否。在中心点。进行了总数的13个实验，以测试全因素CCD的五个水平和CS。通过使用编码单元，在表格中提出了在表中产生Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin的实验和预测值，以及SA和CS的不同变量2．

二阶模型（二次）方程用于计算SecoIridoid和X吨酮含量的实验响应，如下所述：

式中Y为预测响应;A和B表示变量级别;β_0.缩放常量;β₁和β₂线性系数;β_11.和β_22.是二次系数，β_12.描述相互作用系数。响应面回归系数和方差分析(ANOVA)预测了自变量对紫花楸苷、獐牙菜苷、芒果苷体外产率的影响S. Paniculata.．

人工神经网络（ANN）建模

ANN的功能是将给定为模型的给定的输入向量转换为特定规则的特征映射或输出。在所提出的方法中，采用单层，由隐性神经元组成，用于产生近似多层模型。预测的输出计算是在EQ的帮助下表达的。（7.） 作为：

这里，Y表示从输出层获得的输出，f（一种_z）表示与与神经元Z相关的模型的非线性性质负责的激活函数。w_ZP.表示神经元Z和P之间的重量连接。θ_z为输入偏差和x_p说明了给予神经元的输入p．

为了使误差最小化，加快收敛速度，ANN在训练阶段采用反向传播算法进行模型的训练和收敛，没有任何延迟和损失。由于考虑了适当的神经元大小，得到的结果是可靠和准确的，没有任何妥协。

多层感知器模型包括两个输入(水杨酸和壳聚糖)，一个隐藏的输出层用于预测(图。7.）.输出层对于三个特异性输出为Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin，输出层将不同，如表所示2．为了训练和验证分析，Log SigMoid函数用作非线性输出预测的激活单元。对于突触权重调整和分析培训数据，在阵列算法的帮助下接受培训，并在5倍交叉验证策略的帮助下支持和执行验证。

样品制备

体外种植材料S. Paniculata.用自来水彻底洗涤以除去生长激素痕迹，然后在室温下完全干燥。在体外样品中干燥干燥，在混合器研磨机中分开粉碎（Champ Essentials，Morphy Richards，India）。使用微波辅助萃取（MAE）分别用50％乙醇水溶液（2×20mL）分别提取一克粉末样品[4.]．通过Whatman NO：1滤纸分别过滤所有提取物，以6000rpm（在4℃下5分钟，然后用旋转蒸发器蒸发至干。将干燥的提取物溶解在甲醇溶剂中以使最终体积（mg ml^{- 1})，然后将含有提取物的试管保存在4°C冰箱中进行进一步的植物化学分析。

标准溶液的制备：Amarogentin的储备溶液，将Swertiamarin化合物（10mg各自）溶于10mL甲醇（Mg ml^{- 1}）和将5mg mangiferin标准标准溶于50ml甲醇（0.1mg ml^{- 1}）.

HPTLC的定量测定标记化合物

HPTLC系统为CAMAG (Muttenz, Switzerland)，配备Linomat-5自动加样器和CAMAG TLC扫描仪-3，配备cat软件(版本:1.4.4.6337)，配备100 μL汉密尔顿注射器(固定100 nl/s送样速率)。采用20 cm × 10 cm预涂硅胶60 F组成的固定相色谱_254.HPTLC板(0.25 mm厚)。用汉密尔顿注射器将样品作为5毫米宽的条带注入板中。将3 μL植物样品载于色谱板上。

采用60 F硅胶预涂铝板进行薄层色谱分离_254，用乙酸乙酯：甲醇：水（77：15：8V / v）流动相（S1）用于定量Amarogentin [I]和Swertiamarin [II]化合物[47.]虽然乙酸乙酯：冰醋酸：甲酸：水（100：11.0：11.0：26V / v）流动相（S2）用于定量Mangiferin [III]化合物[48.]．在开发高达75毫米的双槽玻璃罐（CAMAG）之后，用热空气干燥器干燥板，在λ=下在UV（带有双波长UV灯的UV机壳）下可视化透明带（没有任何后色谱衍生化） 254 nm. Immediately plates were scanned at 254 nm reflectance wavelength with CAMAG TLC Scanner. Densitometric scanning conditions were set at 4.00 × 0.30 mm slit dimension with 20 mm/s scanning speed and 100 μm/step data resolution. The R_f（i），（ii）和（iii）在移动系统中具有参考标准的价值和獐牙菜属在254nm处分离并分离粗样品并分离。所有HPTLC实验在25（±2°C）温度下，40％相对湿度进行。

施加在HPTLC板上的2,4,6,8,10,12μL量范围的施加校准每种标记化合物（Amarogentin，Swertiamarin和Mangiferin）的储备溶液的线性范围。用峰面积与相关浓度产生校准曲线。回归方程和相应的峰面积用于计算所有测试植物样品中所有三种参考化合物的产量。

统计分析

MINITAB 18.0软件程序(MINITAB Inc.， State College, PA, USA);统计优化与分析使用MATLAB软件和Microsoft Excel 2010 (Ver. 14.0.7228.5000)。

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。

HPTLC：

高性能薄层色谱;

山:

水杨酸

CS:

壳聚糖

安：

人工神经网络

RSM:

响应面方法

CCD：

中心复合设计

BAP：

6-Benzylaminopurine

KN：

Kinetin

naa：

1-萘酰基乙酸

作者非常感谢生物工程和生物科学系，可爱的专业大学，为植物组织文化实验室设施提供，并感谢IPLS-DBT项目（BT / PR-4548 / INF / 146/146 / 2012）批准Punjabi大学，Patiala通过HPTLC方法进行植物样品的分析。

可爱的专业大学提供了财政支持，但在研究设计，性能，数据收集和分析中没有作用，决定发布，或准备/写作稿件。

从属关系

1. 生物技术系，可爱的技术与科学学院，可爱的专业大学，Phagwara，Punjab，144411，印度

   Prabhjot Kaur＆Devendra Kumar Pandey

2. 潘塔尼大学植物学系，Patiala，Punjab，147002，印度

   R. C. Gupta.

3. 印度加尔各答总统大学生命科学系

   abhijit dey

4. 埃塞俄比亚渡墩大学医学与健康科学学院生物化学系

   Tabarak Malik.

贡献

PK做了实验，TM帮助写论文，AD有助于收集植物样本，RCG有助于HPTLC分析，同时DKP构思了这个想法，进行了文学调查和监督工作。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应到abhijit dey要么Tabarak Malik.要么Devendra Kumar Pandey.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。然而，Abhiit Dey博士是本杂志的助理编辑。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

开放访问本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。

重印和权限