水通道蛋白的全基因组鉴定和表征gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba以及它们与其他茄科植物的关系gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

细胞膜是动态结构，不断调整其组成，使植物能够响应发育信号、胁迫和变化的环境。为了促进底物的跨膜运输，植物膜上同时嵌入了主动和被动转运蛋白。水通道蛋白(AQPs)是一个主要的膜跨越通道蛋白家族，它选择性地促进底物在生物膜上的被动双向通过，其速度达到惊人的10倍gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba分子每秒。AQPs在植物界最为多样化，包括5个主要亚家族，它们在时间和空间基因表达、亚细胞蛋白定位、底物特异性和翻译后调控机制方面存在差异;共同提供一个跨越整个工厂的动态运输网络。植物AQPs可以运输一系列溶质，这些溶质对许多植物过程至关重要，包括水分关系、生长发育、胁迫响应、根系养分吸收和光合作用。操纵aqp以提高植物生产力的能力依赖于我们对aqp多样性和功能作用的深入了解。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们描述了AQP家族的特征gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba(NtAQPs;烟草)是一种流行的模型系统，能够从实验室扩展到现场。烟草与主要经济作物(如番茄、马铃薯、茄子和辣椒)密切相关，本身具有新的商业用途。烟草含有76个AQP，使其成为第二大AQP家族。它们分为五个不同的亚家族，我们描述了它们的系统发育关系、基因结构、蛋白质序列、选择性过滤器组成、亚细胞定位和组织特异性表达。我们还从烟草亲本基因组中鉴定出AQPs (gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba)，使我们能够描绘NtAQP家族的进化历史。对番茄和马铃薯AQPs进行同源性鉴定，可以跨物种比较它们在蛋白质结构、基因表达和潜在生理作用方面的保守性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究提供了烟草AQP家族的全面特征，并加强了AQP生物学的现有知识。精细化的基因/蛋白质模型、组织特异性表达分析和跨物种比较，为NtAQPs及其茄科同源植物的进化历史和可能的生理作用提供了有价值的见解。总的来说，这些结果将支持未来的功能研究，并有助于将基础研究转移到应用农业。gydF4y2Ba

细胞膜是动态结构，不断调整其组成，使植物能够对发育信号、胁迫和不断变化的环境作出反应[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。细胞膜的生物学功能是由其蛋白质组成赋予的，脂质双分子层提供了基本结构和通透性屏障，而完整的跨膜蛋白质促进了选定底物的扩散[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。细胞膜扩散是植物生物学的一个基本过程，也是植物生理学研究最早的课题之一[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。细胞水平上的扩散事件最终发生在整个植物中基质的协调运输中，以支持发育和生长。gydF4y2Ba

植物膜包含三种主要的转运蛋白，即atp驱动泵蛋白、转运蛋白和通道蛋白[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。泵是一种主动的转运体，它利用ATP水解的能量，在浓度梯度或电位的作用下将底物穿过膜。转运蛋白沿梯度或逆梯度以10的速率在膜上移动各种分子gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba分子每秒。与前两类不同，通道蛋白是双向的，可以增加膜对特定分子的通透性。通道蛋白可渗透到广泛的底物，并可通过高达10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba分子每秒。在植物中，水通道蛋白(AQPs)是这类通道蛋白的一个主要家族，在许多生物过程中促进底物的选择性运输，包括水关系、植物发育、胁迫响应和光合作用[qh]gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AQP单体形成一个典型的沙漏状跨膜孔，在细胞膜中组装成四聚体复合物。四个单体的结合，在四聚体的中心产生第五个孔，它可以提供一个额外的扩散路径[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。给定AQP的底物特异性是由孔壁残基的补体赋予的，这些残基通过尺寸排除和与底物的生化相互作用的结合来实现特异性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。鉴定出的关键特异性残基包括双Asn-Pro-Ala (NPA)基序、芳香/精氨酸过滤器(ar/R过滤器)和Froger位置(P1-P5) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。然而，已知AQP单体的其他孔壁残基和各种跨膜结构域和环结构域的长度也会通过孔径和可及性的构象变化影响底物特异性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。很可能其他决定特异性和转运效率的残基仍有待阐明。gydF4y2Ba

水通道蛋白是主要内在蛋白(MIP)超家族的成员，在所有分类学领域都有发现[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。哺乳动物通常只有15个同工异构体，而植物有更大的AQP家族，通常有30至121个成员[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。这种令人印象深刻的多样化是由基因复制事件的倾向促进的，特别是在被子植物中普遍存在，并且可能是由aqp提供的适应潜力。基于序列同源性和亚细胞定位，目前在植物界已识别出多达13个AQP亚家族[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。这些AQP亚家族中有8个存在于更古老的植物谱系中，包括苔藓中的glfp样内在蛋白(GIPs)和杂交内在蛋白(HIPs)，绿藻中的MIPs A到E，以及硅藻中的大内在蛋白(lip)。其余五个亚科在高等植物中普遍存在，并广泛分化为亚群，包括质膜内在蛋白(PIPs;PIP1和PIP2亚群)，tonoplasast Intrinsic Proteins (TIPs;TIP1至TIP5亚群)，小基本内在蛋白(SIPs;SIP1和SIP2亚群)，结节蛋白26样内在蛋白(NIPs;亚群NIP1至NIP5)和X内在蛋白(XIPs;子组XIP1 ~ XIP3)。在许多菊科植物中都有，但在芸苔科和单子科植物中不存在。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AQP亚家族在底物特异性上存在一定程度的差异，并整合到不同的细胞膜上，为植物提供了亚细胞区隔化和细胞间运输的通用系统。在植物中，aqp的种类是迄今为止最广泛的，能够运输各种各样的底物，包括水、氨、尿素、二氧化碳、过氧化氢、硼、硅和其他类金属[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。最近，乳酸、氧和阳离子被确定为渗透底物[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，而RNA分子也可能是一种被运输的底物[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。进一步的多功能性是通过严格调节不同的时空组织特异性表达来实现的gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba基因，以及控制膜运输和通道活性的AQP蛋白的翻译后修饰(如磷酸化)[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

考虑到AQPs具有不同的转运底物补体，并且越来越多地参与许多发育和应激反应生理作用，AQPs是设计更具弹性和生产力的植物的目标[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。例如，一氧化碳gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-渗透性AQP是提高光合效率和提高产量的目标[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，而对干旱胁迫作出反应的aqp则被用于提高对缺水条件的耐受性[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，并且正在研究对透硼AQPs的操纵，以提高作物对含硼有毒或硼含量欠佳的土壤的耐受性[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。植物生物学的基因组时代为探究许多物种同种异构体之间的序列保守性和多样性提供了前所未有的机会。这反映在近年来越来越多的植物AQP家族研究报道中。这些研究几乎完全集中在感兴趣的物种上，没有直接评价其他植物物种的aqp。然而，将AQP家族特征扩展到密切相关的物种(例如在同一分类科内)可以提供特别丰富的信息，通过比较接近的同源AQP有助于更好地阐明不同AQP的进化史和生理作用。密切相关物种之间的比较也可以提高基础AQP研究向应用农业的转化，特别是当分析涉及作物物种时。gydF4y2Ba

为了提高我们目前对AQP生物学的了解，并帮助它们在提高植物抗灾能力和生产力方面的潜在应用，我们从gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba(NtAQPs;烟草)。烟草是探索AQP生物学未知的合适候选物种，因为它是研究基本生理过程的流行模型系统，能够从实验室扩展到现场。烟草是茄科植物的一种，茄科植物包括具有重要经济价值的品种，如西红柿、土豆、茄子和辣椒[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]，并在生物燃料和植物制药领域重新获得商业应用[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。我们发现烟草含有76个aqp，使其成为迄今为止鉴定的第二大家族。烟草是最近的异源四倍体，这说明其AQP家族规模很大。系统发育关系、基因结构、蛋白质序列、选择性过滤器组成、亚细胞定位和组织特异性表达谱被用于表征NtAQP家族成员。我们还鉴定了烟草亲本基因组的AQPs (gydF4y2Ba烟草的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ba烟草tomentosiformisgydF4y2Ba)，使我们能够描述NtAQP家族的近期进化史。此外，利用已定义的番茄AQP家族(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba)及马铃薯(gydF4y2Ba茄属植物tuberosumgydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，我们进行了基因结构、蛋白质序列和表达谱的跨物种比较，为未来的研究和工程工作提供蛋白质功能的保护和多样化以及生理作用的见解。gydF4y2Ba

NtAQP基因的鉴定与分类gydF4y2Ba

利用番茄和马铃薯AQP蛋白序列进行同源性检索，鉴定出TN90烟草品种基因组中85个推测编码AQP样基因的位点[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。其中9个基因编码严重截断的蛋白质，并被归类为假基因gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表1)。其余76个基因与番茄和马铃薯AQPs具有一定程度的同源性，被认为是“真正的”烟草AQPs (NtAQPs;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这76个烟草AQP基因中的73个也在最近测序的K326品种(Nitab4.5v)的基因组中被鉴定出来[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。为了确定烟草AQPs的精确蛋白质序列和基因结构，在所有前向翻译框架中检查鉴定编码序列周围的基因组区域。可能的蛋白质产物和相关的内含子/外显子结构通过与各自的茄科同源物比对而得到。然后，我们的基因模型通过与烟草全转录组mRNA-seq数据(来自Edwards等人，2017年)的比对独立验证和支持，这也有助于定义5 '和3 ' utr。人工构建的AQP蛋白和基因模型与TN90和K326品种计算预测的比较[j]。gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]结果显示，15%的TN90和50%的K326计算的AQP模型标注错误(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在所有NtAQP亚家族中，计算的基因模型都存在错误，包括缺失或截断的5 '和3 ' utr，缺失的外显子，截断的外显子(范围从4到87个氨基酸)，以及由于包含邻近的内含子序列而导致的外显子插入(16-57个氨基酸)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。我们对TN90和K326品种的NtAQP基因模型、标识符和基因组位置的总结见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S2。编码DNA序列(CDS)、蛋白质和基因组序列的FASTA测序文件可在附加文件中找到gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。这些高置信度的NtAQP蛋白和基因模型的序列已提交给NCBI(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

通过整理烟草AQP基因和蛋白序列的过程，我们对之前标注错误的番茄和马铃薯AQP基因进行了修正，即:gydF4y2BaStXIP3; 1, StXIP4; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSlXIP1; 6gydF4y2Ba，gydF4y2BaSlPIP2; 1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSlTIP2; 2gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;表S3)。我们还通过烟草基因组序列分析发现，在报道的经常被研究的烟草AQP1基因(NtAQP1;为NtPIP1;本研究中为5 s)。该突变导致在该基因的最初克隆和随后的使用中错误地报告了第207个氨基酸位置的组氨酸(H)到酪氨酸(Y)的替换([gydF4y2Ba44gydF4y2Ba];NCBI AF024511和AJ001416)。这种替换是值得注意的，因为His207对应于菠菜PIP2晶体结构的His193位置;[1]gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，在所有被子植物PIP AQP中高度保守，是AQP通道门控和运输能力的关键调节因子[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。在功能表征研究中无意中使用了H207Y NtAQP1突变体，可能会影响对这种经常被研究的植物AQP得出的结论。为了支持His207是NtAQP1中正确的残基，我们发现独立生成的gDNA-seq片段以及来自TN90和K326品种的RNA-seq映射reads都含有His207残基(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。此外，在茄科的几个物种中发现了几个密切相关的NtAQP1同源物，包括3个额外的gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba种，均有His207残留(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2Ba

烟草AQPs基因结构与系统发育分析gydF4y2Ba

为了将76个整理好的NtAQP蛋白序列放入各自的亚家族中，我们使用了系统发育分析，结合了来自多种被子植物的特征AQP亚型:拟南芥(gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba、十字花科)、番茄(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicum,gydF4y2Ba橡胶树(gydF4y2Ba的橡胶树割面干涸病gydF4y2Ba麻瓜)、大米(gydF4y2Ba栽培稻,gydF4y2Ba和大豆(gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba， Fabales)(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3)。NtAQPs分为五个不同的亚科，这些亚科通常出现在高等植物中，即NIPs [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]， sip [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]， XIPs [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]， pip [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]及TIPs [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3)。在越来越多的跨物种描述植物AQP家族的研究中，一个新出现的问题是命名法上的混淆，或者错过或错误地分配AQP基因之间的同源性。在番茄和马铃薯aqp的命名中可以看到这种混淆。至少在这种情况下，命名不一致主要是由于两个家族特征同时由不同的小组发表[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。为了促进物种间AQP的命名结构更加一致，特别是在单一被子植物家族中，我们将NtAQP的命名惯例与番茄AQP的命名惯例对齐，因为它们的命名更一致，可能与拟南芥AQP同源。额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S2列出了烟草aqp及其对应的番茄和马铃薯同源基因。gydF4y2Ba

76个NtAQP基因中有65个在番茄中有明确的同源物，这指导了它们的命名(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表2)。11 .烟草gydF4y2BaaqpgydF4y2Ba没有明显的番茄或马铃薯同源物被分配给烟草特有的名称(在附加文件中用黑色星星表示)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4)。NtAQPs的基因长度从1091 bp到6627 bp不等，单个极端情况为17278 bp (gydF4y2BaNtPIP2; 11gydF4y2Ba)，这是由于内含子插入量大(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。NtAQP基因的外显子-内含子模式与番茄和马铃薯同源基因高度保守(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S2) [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。PIP、TIP、NIP和SIP亚科的AQPs在三个茄科物种中都有很好的保守性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4)。XIP是一个例外，因为它们在系统发育上主要聚集在每个单独的物种中，这表明在茄科植物中存在高度的种内XIP多样化gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2Ba

系统发育的一个显著特征是，大多数ntaqp以成对的形式存在，这得到了高自举值的支持(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这些系统发育对成员之间蛋白质序列的高度同源性也延伸到高度相似的核苷酸序列和基因结构(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

烟草AQP蛋白序列比较gydF4y2Ba

NtAQP蛋白的一般结构特征gydF4y2Ba

使用TOPCON进行拓扑分析(见材料和方法)，预测所有NtAQP蛋白均由6个跨膜螺旋结构域、5个介入环区和细胞质局部N-末端和C-末端尾部组成，这与aqp的典型结构一致(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。跨膜螺旋结构域的大小似乎是AQP结构的一个不可分割的属性，因为它们在亚家族中的长度非常保守(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)。相反，环区长度在亚族之间表现出很大的差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)。最明显的是环a，与tip、sip和XIPs的平均长度(14aa)相比，其在PIP2s (18aa)中明显更长，并在胞外暴露，而在NIPs (8aa)中更短。细胞质环B在XIPs中较短(20aa比24aa)。与其他亚家族(20aa)相比，XIPs中的C环长度(38aa)几乎是其两倍。环D在PIPs中略长(12aa)，在SIPs中较短(7aa)，而环E在XIPs中较长(32aa)，在NIPs中较短(20aa)(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).细胞质上定位的N端和c端尾部是AQP结构域中大小变化最大的(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa). nip的n端尾部长度从59aa到7aa不等，nip的c端尾部长度从30aa到14aa不等。gydF4y2Ba

通过对亚家族中不同蛋白结构域序列保守性的检测，发现跨膜螺旋通常是AQP的高度保守特征(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).环b和环E相对于其他结构域也高度保守，这可能是由于它们在形成跨膜孔中的直接作用。相反，环路A和C以及两个末端尾巴被发现是每个NtAQP亚家族中最不保守的结构域(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

为了进一步了解不同NtAQPs的推测功能特征，我们使用多个蛋白质序列比对来报告已知调节AQP功能的蛋白质关键位置的残基组成(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。包括双Asn-Pro-Ala (NPA)基序，五个Froger 's位置残基(P1-P5)和芳香/精氨酸过滤器(ar/R过滤器)的残基，它们都是特定的孔衬残基，有助于确定哪些底物通过AQP孔渗透。我们还报道了其他几个已知的翻译后修饰位点，它们影响通道活性和膜定位(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

NtPIP亚科gydF4y2Ba

NtPIPs代表了最大的NtAQP亚家族，有29个成员，在系统发育上分为PIP1和PIP2亚群。尽管是最大的亚家族，但NtPIPs在蛋白质序列上是最保守的(> 50%;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).外胞体暴露的环A和环C是例外，只有~ 20%的序列同一性，并且在PIP1和PIP2蛋白之间大小不同(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。这种序列多样化可能具有重要的功能，因为环A主要通过保守的半胱氨酸残基参与PIP-PIP二聚化，这种残基存在于所有NtPIPs中。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。大多数PIP蛋白结构域的高序列相似性也反映在具有相同NPA和ar/R基序残基构型的PIP1s和PIP2s中;主要是亲水性残基(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。只有Froger的位置2显示出不同性质的氨基酸(G, M或Q)占据该位置的变化(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。ntpip1与ntpip2的主要区别在于具有较长的n端和较短的c端尾部序列。n端尾部通过两个酸性残基(Asp28和Glu31)的相互作用参与孔的钙依赖性门控gydF4y2Ba2gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。pH也会触发孔门控，涉及环D组氨酸的质子化(His-193，表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和Loop B丝氨酸的磷酸化(Ser115，表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。在每个NtPIPs中鉴定出这四个残基，表明整个亚家族保留了这些调节模式(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。环B丝氨酸(Ser115)，或可磷酸化苏氨酸，也在XIPs、TIPs和SIPs(但不包括NIPs)成员中保守，这表明不同NtAQPs之间存在共同的门控调节机制(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在NtPIP2s较长的c端尾部发现了两个常被磷酸化的丝氨酸位点(Ser274和Ser277;表2，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图5)。已知这些丝氨酸残基的磷酸化状态可促进蛋白质-蛋白质相互作用，影响进出质膜的运输，并改变孔的运输能力[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。NtPIP1蛋白具有这些丝氨酸残基中的第二个(Ser277)，但预计不会被磷酸化(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图5)。除具有组氨酸的NtPIP1;5和PIP2;11外，在所有的NtPIPs中，在第二个磷酸化丝氨酸之前都发现了一个高度保守的带正电的赖氨酸或精氨酸，并且在其他植物物种的PIPs中也发现了更广泛的存在(数据未显示)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图5)。组氨酸可以通过质子化获得正电荷，这表明在这些NtPIPs中c端尾部可能存在pH调节的功能状态。gydF4y2Ba

NtNIP亚科gydF4y2Ba

发现NIPs具有最低的总体序列同源位点(~ 10%)，表明在序列水平上存在高度分化的亚家族(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).序列变异均匀分布在所有AQP结构域，只有环b和环E保持适度的保守性，每个位点的相同残基大于30%。这种相对较高的守恒可能反映了这两个环直接参与形成主孔结构和控制底物选择性。回路B和E各包含一个NPA基序，回路E还包含ar/R和Froger残基(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在不同的NtNIPs中，构成双NPA基序(NP)的残基有很大的差异gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba/gydF4y2BaVgydF4y2Ba)和所有5个蛙人的位置(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。除了LE2之外，所有的ar/R残基都是可变的，尽管存在的残基倾向于更疏水(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。同样值得注意的是，与其他亚家族相比，NtNIPs的N和C末端明显更长(~ 57-30aa)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).延长的c端尾部含有大量丝氨酸残基，其中许多被预测会被磷酸化(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图5)。包括GmNOD26(大豆NIP)中Ser262和PIPs中Ser277磷酸化位点同源位置的丝氨酸残基(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在PIPs中控制孔门控的Ser115磷酸化位点是保守的，并且预计仅在NtNIP4;3 s中被磷酸化，所有其他NtNIPs在该位置具有结构刚性的脯氨酸残基(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

NtTIP亚科gydF4y2Ba

NtTIPs之间的保守性为~ 22%的序列一致性(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).与nip相似，环路b和E的序列保守性最高(> 40%)。双NPA基序ar/R H2和Froger 's P3至P5在TIP亚群中具有较好的保守性。除了第一个NPA基序具有NPD结构的NtTIP2;1蛋白和在ar/R H2上具有H > N取代的NtTIP2;1蛋白(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。其他的ar/R和Froger位点在nttip中变化很大，尤其是ar/R LE2，它在性质完全不同的氨基酸(V, R或Y;表格gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。一种与苯丙氨酸相对的组氨酸，位于NtTIP2s、TIP4s和TIP5s的ar/R LC(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，表明输送氨的能力增强[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。在22个NtTIPs中的5个中发现了控制pip孔门控的Ser115磷酸化位点，其余的NtTIPs具有苏氨酸，这也是一种潜在的可磷酸化残基。NtTIP2和NtTIP5蛋白在C环中有一个保守的组氨酸(His131)，参与类似于PIPs和NIPs环D中的His193的pH调节孔门控[qh]gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。NtTIPs的c端尾部平均含有少于2个丝氨酸残基，其中没有一个被预测为磷酸化目标(数据未显示)。gydF4y2Ba

NtSIP亚科gydF4y2Ba

虽然NtSIP亚家族仅由5个基因组成，但其序列保守性较低，环路A的保守性最低(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).第一个NPA基序随NP的变化而变化gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba/gydF4y2BaTgydF4y2Ba/gydF4y2BalgydF4y2Ba组合(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。NtSIP1和NtSIP2蛋白之间在ar/R和Froger 's P1-P2中残基结构完全不同的其他关键残基上也发现了实质性的差异(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。NtSIPs的N端尾部明显短于其他亚家族(~7aa)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

NtXIP亚科gydF4y2Ba

xip是一个小的亚家族，具有很高的序列同一性(约75%)。在所有四个NtXIP蛋白中，第一个NPA基序都被一个NPV基序所取代gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在Froger和双NPA基序中的残基有很强的一致性，唯一的变化是在ar/R H2处的I/ a(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。与其他对XIPs的研究一致，NtXIP的环C比其他亚家族长得多(~38aa) [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。NtXIPs具有保守的磷酸化Ser115，尽管它不是预测的磷酸化靶点(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。NtXIPs的c端尾部含有单个丝氨酸残基，预计不会被磷酸化(数据未显示)。gydF4y2Ba

烟草AQPs的亚细胞定位gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba

AQPs可以促进一系列底物在各种植物膜上的扩散，不同亚科之间的特定膜定位可能不同，最终影响亚细胞流动和溶质的区隔化。计算预测程序可用作亚细胞定位的初步推断，以进一步帮助阐明候选蛋白质的假定生物活性和生理功能[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。我们使用Plant-mPLoc、Wolf Psort和YLoc三种常用软件程序进行亚细胞预测分析(见材料和方法)。在三个程序中发现35个(46%)ntaqp的预测一致性(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。预测定位的一致性主要观察到PIP2s和NIPs，它们通常被预测为质膜(PM)定位。TIP和SIPs在亚细胞定位结果中似乎具有最不同的预测，TIP定位范围在细胞质、PM、过氧化物酶体、细胞质和细胞外定位之间;SIPs在3种预测工具中具有PM、叶绿体、内质网和额外的细胞定位(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

为了补充预测，对较大的PIP、TIP和NIP亚家族的代表性烟草aqp进行了可视化gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba使用GFP:NtAQP融合。NtSIPs不包括在这个分析中，因为它们是一个较小的AQP亚家族，而NtSIPs已经被确定为定位于PM [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。植物AQPs在组织之间保持忠实的亚细胞定位能力，即使在植物物种之间易位，这一点从大量研究亚细胞定位或使用宿主物种外来的转基因AQPs进行生理操作中得到了证明。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。因此，我们将烟草GFP:AQP转基因引入拟南芥，以便能够利用已建立的描述特定亚细胞区室的GFP标记系[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。考虑到aqp占据的某些亚细胞结构非常接近，这些标记线对于指导正确解释亚细胞位置至关重要。例如，PM和ER都是可能的位置，但是ER网络的一部分紧挨着PM，这使得很难区分ER、PM或共定位。大多数植物细胞的大液泡占据了大部分内部体积，将细胞质及其内容物推向外围，这进一步加剧了解释。这可以给PM定位的错觉，即使是细胞质蛋白，如“自由”的绿色荧光蛋白，特别是如果只在整个细胞水平上作为二维光学切片进行检查(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba人工智能)。gydF4y2Ba

我们使用共聚焦显微镜使用二维切片和三维光学堆栈来可视化GFP:NtAQP和GFP标记线的亚细胞定位。叶绿素自身荧光的激发和发射波长接近绿色荧光蛋白，为了避免信号污染，我们检测了根细胞。定位于细胞质、质膜(PM)、内质网(ER)和细胞质(tono)的GFP标记系被使用，因为这些是pip、TIPs或NIPs的预期可能位置(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。四个亚细胞特征之间的关键差异在细胞核附近，信号的地形和细胞的连续z堆栈图像的3D渲染中清晰可见(图11)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab-g)。当靠近细胞核时，PM:GFP标记仅定位于细胞外周(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Babii)， ER:GFP包裹在细胞核周围(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba图2:GFP定位于细胞核内部，在靠近PM的一侧留下信号空洞(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba造成)。PM:GFP与细胞边缘形成了清晰的整合(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Babiii)，在3D渲染中作为外壳(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba出)。ER:GFP外周信号在外观上呈斑驳状(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Badi)，由局部亮斑和不同的无信号区域组成(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Badiii)，在3D渲染中显示为“网络”(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Badiv)。图1:绿色荧光蛋白表现为与跨液泡链(液泡体划界的细胞质通道)和液泡膜(液泡体)折叠相关的大波浪形“片”信号(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bafi-iv)，具有明显的“波浪形”地形(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bafiii)。gydF4y2Ba

在确定了标记线的定义特征之后，我们开始检查具有代表性的ntaqp。截然不同的gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba观察到PIP、TIP和NIP NtAQPs的亚细胞定位模式，与这些不同AQP亚家族已知的膜靶向特性一致(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac, e, g)。代表性PIP (NtPIP2; 5t)的GFP信号在细胞周围清晰均匀，在3D渲染中信号向细胞核外延伸，形成光滑的外壳，内部结构无明显信号(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).这一模式与PM:GFP标记一致(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)，表明NtPIP2; 5t与PM有很强的整合。gydF4y2Ba

具有代表性的NtNIP (NtNIP2;1 s)具有表明其共定位于PM和ER的特征。外周局部NtNIP GFP信号呈斑驳状，有明显的亮斑，类似于ER标记。然而，与内质网标记物不同的是，这些斑点沿着一致的基底信号连续分布在细胞周围，表明PM定位(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baei-iii)。3D渲染进一步展示了共享的贝壳状PM信号与斑驳的网状ER模式信号重叠(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baeiv)。gydF4y2Ba

代表性的NtTIP (NtTIP1;1 s)的定位与整合到tonoplaste一致。NtTIP GFP信号在细胞内显示均匀而弥漫性的定位，与细胞质标记一致。NtTIP GFP信号在细胞质侧包围细胞核，而不在质膜侧(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bagi-ii)，标记的膜具有波浪形地形，并出现类似跨液泡链的内膜(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bagiii-iv)。gydF4y2Ba

的PM集成gydF4y2BaNtPIP2; 5gydF4y2Ba均被3个软件程序预测，而gydF4y2BaNtTIP1; 1gydF4y2Ba仅由Plant-mPLoc预测。最后，PM本地化gydF4y2BaNtNIP2; 5 sgydF4y2Ba，但没有一个预测到它与ER的共定位(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

烟草AQPs亲本关系及近期进化史gydF4y2Ba

在我们最初的系统发育特征中，大多数NtAQPs的独特系统发育配对可能是烟草最近进化起源的特征，这是由烟草和烟草之间的异源四倍体杂交事件引起的gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba大约20万年前[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。为了探索烟草AQP家族的进化，我们利用NtAQP核苷酸编码序列作为BLAST搜索的查询，在两个亲本系中鉴定了AQP基因家族。最初，在两者中分别鉴定出40和41个aqpgydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2BaAQP基因数量与番茄和马铃薯相关二倍体种AQP基因数量相当(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。如本研究所示，烟草有76个aqp，几乎全部来自每个亲本物种(40个aqp)gydF4y2BaN.sylvestrisgydF4y2Ba和42gydF4y2BaN.tomentosiformisgydF4y2Ba)，与最近的异源四倍体杂交事件一致。父母的介绍gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba将大多数不同的NtAQP系统发育对转化为四个基因的小分支，其中每个配对的NtAQP现在都清楚地与来自两个亲本之一的AQP相关(例如NtPIP1;1亚分支，图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。这种系统发育关系证实了NtAQPs的独特系统发育配对对应于杂交产生的同源“姐妹”基因，亲本两个基因组都为每个烟草姐妹对贡献了一个AQP基因(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。最初鉴定了30对姐妹基因对，它们与双方的同源基因明显匹配gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。祖先的起源gydF4y2BaNtAQPgydF4y2Ba在命名法中，基因是通过添加后缀“s”或“t”来表示的。gydF4y2BaNtPIP1; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNtPIP1; 1 tgydF4y2Ba)，表示gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba或gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba分别血统。gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaNtAQPgydF4y2Ba吉恩没有确定的匹配gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba或gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba亲代AQP，并被赋予后缀“x”(gydF4y2BaNtPIP2; 1 xgydF4y2Ba)。缺乏明确的亲代匹配gydF4y2BaNtPIP2; 1 xgydF4y2Ba可能意味着在烟草出现后，亲本基因组中同源基因丢失，或者由于测序数据的不完全覆盖而未鉴定出同源亲本AQP。无论哪种方式，这种基因在烟草基因组中的存在使我们能够推断出它在杂交时在亲本基因组中的存在。我们预测gydF4y2BaNtPIP2; 1 xgydF4y2Ba继承自gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba，因为它发生在具有烟草姐妹基因(gydF4y2BaNtPIP2; 1gydF4y2Ba)和一个同源的gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2BaAQP (gydF4y2BaN.sylPIP2; 1gydF4y2Ba)，但缺乏gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba祖直方图(图中橙色框)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。因此，分配gydF4y2BaNtPIP2; 1 xgydF4y2Ba作为一个gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba这使得亲本基因组中aqp的总数达到了40个gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba42英寸gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba， PIP、NIP和TIP亚家族的基因总数与番茄和马铃薯非常相似(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

系统发育分析还揭示了烟草最近的进化事件gydF4y2BaN.西尔维斯特里斯gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2BaAQP家庭。这些事件是通过与传统的由烟草姐妹基因和它们各自亲本同源基因组成的四基因小亚枝分组的偏差来识别的。七个gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba基因丢失事件在gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba，其中6例发生在上述烟草杂交事件之前gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba两次都缺席gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和烟草(蓝色星星，图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在一些情况下，侵蚀的残余物gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba假基因在烟草基因组中也可遗传和识别。gydF4y2BaSIP1; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP2; 7gydF4y2Ba;无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。两个基因丢失事件在gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba，没有代表gydF4y2BaNIP1; 1gydF4y2Ba或gydF4y2BaNIP2; 1gydF4y2Ba在两者中确定的直同源物gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba或烟草(红星，图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。5个亲本AQP基因在烟草中丢失，其中3个来自gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba两个来自gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba起源(图中绿色星星)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在烟草杂交事件之前，两个亲本物种的基因增益实例也很明显(紫色和橙色星形，图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。这些获得的基因在系统发育上是不同的，因为它们并不唯一地匹配特定的茄科基因同源物，而是作为现有基因的复制副本出现gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba烟草亲本种内的基因(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;图S4)。AQP基因获得事件发生在gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba，其中两个(gydF4y2BaN.sylNIP3; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaN.sylPIP1; 2gydF4y2Ba)，在烟草杂交之前就开始了冗余基因侵蚀(紫色星形，图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。第三,gydF4y2Ba11 b N.sylPIP2;gydF4y2Ba，作为一个功能单元保留在gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba但在烟草行业受到侵蚀;因此，指定“b”而不是唯一的数字标识符。第四个基因，gydF4y2BaN.sylPIP1; 8gydF4y2Ba，在这两个国家都得到了保留gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和烟草作为一个功能基因(紫色星，图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。一个单基因复制事件在gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba引起，引起gydF4y2BaPIP2; 2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP2; 3gydF4y2Ba在烟草中遗传并随后作为功能基因保留的同源基因(橙色星形，图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

烟草AQP基因表达gydF4y2Ba

NtAQP转录组数据集gydF4y2Ba

为了深入了解各种NtAQP亚型可能的生理作用，公开的全转录组RNA-seq数据集[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]进行处理和分析，比较76个烟草AQPs的器官特异性表达模式。虽然所有数据集都有很大的读取深度(每个组织1 - 2亿对读取)，但我们选择了Sierro等人(2014)的TN90品种转录组进行分析，因为它提供了最广泛的不同组织在不同发育阶段的样本(幼叶、成熟叶、衰老叶、茎、根、幼花、成熟花、衰老花和干蒴果)。gydF4y2Ba

虽然gydF4y2BaNtAQPgydF4y2Ba姐妹基因在核苷酸编码序列上高度同源(~ 96.5%)，存在的snp出现的频率和分布使得独特的reads定位能够区分姐妹基因。在TN90数据集中，我们检测到76个ntaqp中的75个表达，只有gydF4y2BaNtXIP1; 4 tgydF4y2Ba没有映射的mRNA读取。然而,gydF4y2BaNtXIP1; 4 tgydF4y2Ba是一个表达的基因，尽管表达水平很低，正如在K326品种中检测到的低转录丰度所表明的那样(数据未显示)。验证的准确性gydF4y2BaNtAQPgydF4y2Ba表达谱，我们将其与RNA-seq数据进行比较gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba;假设大多数AQP同源基因在这些密切相关的物种之间将保留相似的表达谱。亲本数据集独立于烟草数据集，以及在大量读取深度(每个组织约2.65亿对读取)下采样的根、叶和花组织数据集[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。相对转录物丰度的相关性在二维上进行比较;(i)给定组织内的AQP之间和(ii)跨组织的给定AQP(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S6)。在等效组织内，相对转录物丰度gydF4y2BaN.sylAQPgydF4y2Bavs。gydF4y2BaNtAQPsgydF4y2Ba和gydF4y2BaN.tomAQPgydF4y2Bavs。gydF4y2BaNtAQPtgydF4y2Ba基因，相关良好(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba根、叶、花:分别为0.91、0.74、0.98和0.65、0.74、0.80)。在整个组织中，大多数(> 80%)的NtAQPs和NtAQPt基因表现出与其亲本同源基因相匹配的表达谱gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S6)。与预期的一样，两者之间的相对转录丰度gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba烟草中的姐妹基因(即gydF4y2BaNtAQPsgydF4y2Bavs。gydF4y2BaNtAQPtgydF4y2Ba)，比亲本系之间的直系同源物(即。gydF4y2BaN.sylAQPgydF4y2Bavs。gydF4y2BaN.tomAQPgydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S6)。总的来说，大部分保守模式表明烟草转录组数据提供了NtAQP转录组的适当准确的表示。gydF4y2Ba

分析NtAQP转录组gydF4y2Ba

在NtAQP亚家族中，PIPs和TIPs的基因表达量普遍高于SIPs、XIPs和NIPs(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).在表达程度最高的gydF4y2BaNtAQPsgydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP1; 5 sgydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP1;5 t, PIP1;3 sgydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP1; 3 tgydF4y2Ba突出表现为在所有主要植物器官中组成性表达，而gydF4y2Ba中,1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba一定要;1 tgydF4y2Ba，在除干囊外的所有组织中均存在(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).一些高表达基因也表现出一定的组织特异性，其中gydF4y2BaNIP4; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNIP4; 1 tgydF4y2Ba只在花中表达，和gydF4y2BaTIP3;1 s, TIP3;1 tgydF4y2Ba和gydF4y2Ba一句话;2 tgydF4y2Ba主要在花蒴果中(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

为了研究植物器官间的表达差异，给定的表达水平gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba相对于其最高表达组织进行标准化(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba在整个植物中具有广泛表达分布的S可以很容易地识别(例如;gydF4y2BaSIP1; 2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP1; 5gydF4y2Ba姐妹对，图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).其他AQPs有组织特异性表达:幼花(gydF4y2BaPIP2; 11gydF4y2Ba&gydF4y2Ba11 t PIP2;gydF4y2Ba;gydF4y2BaNIP2; 1gydF4y2Ba)，树叶(gydF4y2BaPIP2; 5 sgydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP2;gydF4y2Ba5 t;XIP1gydF4y2Ba, 6 sgydF4y2Ba;gydF4y2BaPIP2; 1 xgydF4y2Ba)或根(gydF4y2Ba一定要;gydF4y2Ba2，gydF4y2Ba一定要;3gydF4y2Ba，gydF4y2BaTIP2; 2gydF4y2Ba,gydF4y2BaTIP2; 3gydF4y2Ba基因)。在次家庭尺度上，gydF4y2BaNtNIPsgydF4y2Ba和gydF4y2BaNtTIPsgydF4y2Ba在根、茎和花中优先表达，在叶中表达的倾向较低(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。gydF4y2BaNtPIPsgydF4y2Ba和gydF4y2BaNtSIPsgydF4y2Ba更广义的表达，而没有表达gydF4y2BaNtXIPsgydF4y2Ba在茎或干蒴果中(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).在亚家族中，我们看到具有专门或优先组织表达的基因成员。例如，一些优先在根(gydF4y2BaPIP1;1 s & PIP1;1 tgydF4y2Ba;gydF4y2BaPIP2; 4 sgydF4y2Ba&gydF4y2BaPIP2; 4 tgydF4y2Ba)，另一些则优先在叶片中表达(如:gydF4y2BaPIP2; 5 tgydF4y2Ba&gydF4y2BaPIP2; 1 xgydF4y2Ba),而gydF4y2BaPIP2; 11gydF4y2Ba&gydF4y2Ba11 t PIP2;gydF4y2Ba已经成为专门的幼花(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).在其他科的成员中也观察到离散的组织特异性特化，例如，gydF4y2Ba一句话,1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba一句话;2gydF4y2Ba基因仅在干蒴果(种子)中表达gydF4y2BaNIP4; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNIP4; 2gydF4y2Ba仅在花中检测到(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

接下来，我们比较了姐妹基因之间的表达差异，以探索可能的功能差异。一般来说，姐妹基因对表现出组织特异性表达的匹配模式(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab)。然而，在31对姐妹基因中，18对在至少一个组织中表现出显著的差异表达水平(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).在大多数情况下，一对姐妹基因中的一个在几个植物器官中表达得更高。例子包括,gydF4y2Ba1 t, SIP1;2 t, PIP2;6 t, PIP2;4 s, PIP1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP1; 1gydF4y2Ba。也有一些对比表达的例子，姐妹基因在植物器官之间表现出优先表达的区别。例如,gydF4y2Ba一句话,1gydF4y2Ba在胶囊中的表达量是其姊妹对的4倍gydF4y2Ba一句话;1 tgydF4y2Ba，其在根中的表达要高出10倍以上(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).对比表达的其他例子包括:gydF4y2BaNtPIP2; 5 tgydF4y2Ba(叶)gydF4y2BaNtPIP2; 5 sgydF4y2Ba(根)和gydF4y2BaNtNIP6; 1gydF4y2Ba(叶和干蒴果)对gydF4y2BaNtNIP6; 1 tgydF4y2Ba(根)(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

与其他茄科植物的保护gydF4y2Ba

为了探究不同物种间AQP同源基因在生物活性和生理功能上的保守性，我们比较了近缘种番茄和马铃薯中NtAQPs与其同源基因的组织特异性表达水平。这是通过比较根、叶和花组织的相对基因表达来完成的gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba我们已经确定了茄科物种(例如:茄科植物)之间的同源基因。gydF4y2BaNtPIP1; 1gydF4y2Ba&gydF4y2BaNtPIP1; 1 tgydF4y2Ba在烟草,gydF4y2BaSlPIP1; 1gydF4y2Ba西红柿和gydF4y2BaStPIP1; 2gydF4y2Ba在马铃薯;附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表2)。我们能够对pip、TIPs、NIPs和sip进行分析，但不能对XIPs进行分析，因为前面提到了在物种之间分配同源性的困难。即使将NtXIPs与番茄和马铃薯的表达模式进行随机两两比较，也无法找到一致的模式，这进一步暗示了茄科植物中独特的种内多样性gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S7)。gydF4y2Ba

在大多数情况下(36个茄科AQP同源集中的25个)，烟草姐妹基因在三个器官之间的相对表达水平模式与番茄和马铃薯的同源基因相似，这意味着茄科同源基因在整个茄科中具有保守的生理作用。gydF4y2BaNIP1; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNIP3; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNIP4;gydF4y2Ba2，gydF4y2BaPIP2; 6gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 9gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 11gydF4y2Ba，gydF4y2BaTIP5; 1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSIP1; 1gydF4y2Ba;无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。在同源物之间观察到组织特异性表达模式的一些差异，表明可能存在物种特异性功能多样化。观察到的主要偏差是烟草、番茄或马铃薯AQP在组织特异性表达模式上与其他茄科同源植物不同。例子包括;烟草gydF4y2BaNtNIP5; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtPIP1; 2、一定要;1gydF4y2Ba;番茄gydF4y2BaSlPIP2; 8gydF4y2Ba，gydF4y2BaSlTIP2;gydF4y2Ba1，gydF4y2BaSlTIP3; 1,gydF4y2Ba和gydF4y2BaSlTIP3; 2gydF4y2Ba基因;还有土豆gydF4y2BaStPIP1; 2gydF4y2Ba（gydF4y2BaNtPIP1; 1gydF4y2Ba直接同源),gydF4y2BaStTIP1; 2、StTIP1; 1gydF4y2Ba（gydF4y2BaNtTIP1; 3gydF4y2Ba直接同源),gydF4y2BaStTIP2; 4gydF4y2Ba（gydF4y2BaNtTIP2; 3gydF4y2Ba同源)基因(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）gydF4y2Ba。gydF4y2Ba此外，我们观察到一个NtAQP姐妹基因(gydF4y2BaNtPIP2; 5 sgydF4y2Ba)，与番茄、马铃薯及其NtAQP“t”姊妹基因表达不同;提示烟草中基因功能的潜在多样化。更复杂的差异也被观察到，涉及到烟草姐妹基因，它们之间的表达差异很大，这与番茄和马铃薯同源基因之间的表达差异相似。gydF4y2BaNtPIP2; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNtNIP6; 1gydF4y2Ba妹妹的基因;无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对aqp的研究越来越多，极大地促进了我们对其多样性和功能作用的理解，朝着操纵它们以潜在地提高植物性能和对环境胁迫的适应能力[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]。烟草AQP基因家族的建立使我们能够通过比较近缘种内和物种间的同源区域，分析孔隙衬里残基，确定关键结构特征，并为未来的功能筛选提供必要的信息和候选物，有效地贡献当前AQP生物学知识。此外，阐明已经表征的番茄之间的同源性[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]和土豆[gydF4y2Ba41gydF4y2BaAQPs，可以比较这些茄科物种的同种异构体，这将有助于将烟草的知识转化为与其密切相关且具有园艺重要性的作物物种。gydF4y2Ba

NtAQP蛋白序列分析及其与AQP功能的关联gydF4y2Ba

我们发现烟草AQP家族包括76个成员，使其成为迄今为止表征的最大AQP家族之一;仅次于多倍体油菜(gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba)，共有121名委员[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。76个ntapq包括被子植物常见的5个主要AQP亚家族(NIPs、PIP、TIPs、SIPs和XIPs)中的每个成员。正确定义和分析NtAQP蛋白结构、序列同源性和功能相关残基的比较，有助于预测潜在的渗透底物、翻译后调控和亚细胞定位。AQP单体具有高度保守的结构，跨膜(TM)片段提供了结构支架并定义了通道环境，连接环在通道功能中也起着重要作用[qh]gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。我们发现NtAQP TM结构域在长度和序列一致性上具有高度保守性;它们的可变性可能受到限制，以保持AQP单体的结构完整性[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。此外，TM结构域中关键残基的保护对于四聚体的形成至关重要，修饰会导致AQP的异常寡聚化[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。不同亚家族的NtAQP环和末端长度差异显著，序列保守性较低;这种变异对AQP单体相互作用、孔可达性和细胞膜目的地都有影响[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AQP溶质选择性是通过AQP单体孔的特定结构特征以及底物与孔壁残留物的相互作用来确定的。我们调查了NtAQPs中已知的特异性决定残基，包括芳香精氨酸(ar/R)过滤器、NPA结构域和Froger位置[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。我们观察到，在含有这些特异性决定残基的环中，特别是在形成跨膜孔中起直接作用的环B和E中，亚家族保护增加。每个亚家族在这些位置都有其独特的氨基酸特征组合，与已知亚家族底物特异性一致。例如，ntpip在ar/R过滤器中有更多的极性残基，这与pip通常具有渗透水的倾向一致，而ntnip在ar/R过滤器中有更多的疏水氨基酸，这与它们较差的透水性和对氨、尿素和类金属等底物的偏好一致[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

除了决定特异性的孔壁残基外，特定残基的翻译后修饰(例如通过质子化或磷酸化)也直接或间接地决定AQP单体的转运机制[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。植物依靠这些次级机制来确保AQPs的严格调控，特别是在对胁迫的反应中。响应外部刺激的单体孔门控是AQP功能的关键控制。在目前表征的门控残基中(见表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，我们在NtAQPs中发现了亚家族特异性的保护。例如，所有的ntpip都含有环D组氨酸(His193)，它在所有的植物PIP中都是高度保守的，并且可以响应胞质pH的变化而被质子化(例如，洪水诱导缺氧)，并导致PIP毛孔的关闭[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。pH调节的反应对AQP和PIP蛋白的c端尾都很重要[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。这些事实引起了我们的注意，在c端尾部发现赖氨酸/精氨酸>组氨酸取代gydF4y2BaNtPIP1; 5gydF4y2Ba和gydF4y2BaNtPIP2; 11gydF4y2Ba(添加文件2:图S5)。通常带正电的赖氨酸/精氨酸残基存在于所有其他ntpip中，并且在植物pip中高度保守，直接位于功能重要的磷酸化丝氨酸之前。总之，这表明在PIP调节中，这个位置的带正电残基可能具有功能相关性。在NtPIP1;5和NtPIP2;11中存在于等效位置的组氨酸在质子化后仍然可以获得保守的正电荷，这意味着可能有一种新的pH控制通常由PIP c端尾部施加的调节影响。gydF4y2Ba

从我们的分析中可以推断出不同亚家族的NtAQPs之间存在一些共同的门控机制。例如，环B丝氨酸(Ser155)在pip中参与磷酸化依赖的n端尾部门控破坏[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，在其他NtAQP亚家族的一些成员中是保守的。考虑到丝氨酸残基的丰度，NtPIPs和NtNIPs似乎都受其c端尾部磷酸化的调节。已知c末端尾部的磷酸化状态可调节通道活性并控制向质膜的运输[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]。有趣的是，NtTIPs在c端尾部缺乏丝氨酸残基，这表明缺乏c端磷酸化依赖的调节机制。这可能是由于整合到液泡膜中的功能需求与整合到PIPs和NIPs的质膜中的功能需求不同。根据不同的调控要求，我们发现NtTIP2和NtTIP5蛋白在C环中具有一个保守的组氨酸(His131)，该组氨酸参与了类似于PIPs和NIPs环D中的His193的pH调节孔门控[qh]gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba[在leit et al.， 2012中被错误地报道为位于VvTnTIP2的D回路;1]。然而，与细胞质PIP/NIP Loop D His193不同，TIP Loop C His131可能定向到液泡中，从而对液泡内容物和环境做出反应。gydF4y2Ba

NtAQP值得注意的其他结构特征包括:与其他亚族相比，pip的环D较长，这有助于其限制孔隙入口的能力[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba];与其他NtAQPs相比，PIPs的环A要长得多，已知通过介导PIP1和PIP2异构体之间的二硫键在四聚体形成中发挥作用[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba];NtNIPs的N端和c端长尾，对蛋白质调节、运输和蛋白质-蛋白质相互作用很重要[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba];SIPs的明显短的n端与其进入内质网的胞内目的地相关[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba];NtXIPs的长环C，其特点是富含柔性甘氨酸残基，使其能够塞进通道开口，并与选择性过滤器残基和渗透溶质相互作用[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

NtAQP亚细胞定位gydF4y2Ba

确定AQP的亚细胞定位有助于阐明其在植物中的生理作用。例如，整合到质膜上表明溶质在细胞内外运输;定位于液泡体意味着在液泡储存中起作用;或保留在内质网膜中，以协调植物膜间底物和营养物质的穿梭[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。我们利用亚细胞定位预测软件，通常用于快速预测AQP异构体膜整合。这些软件结合已知的分类信号、氨基酸组成和功能域来生成结果[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。使用三种软件预测工具(Plant-mPLoc, WolfPsort和YLoc)一般得出结论，PIP, NIPs和XIPs主要定位于PM;所有Plant-mPloc和部分WolfPsort输出预测了TIPs的叶绿体定位;SIP的定位也各不相同。虽然这些预测是一个有用的开始，但应该注意的是，我们在三个软件工具之间的预测AQP亚细胞定位中只发现了46%的共识。这些差异突出了AQP膜整合过程的复杂性以及我们目前对AQP转运基元的有限理解[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

GFP:NtAQP融合，以及一组已建立的亚细胞GFP标记线，使我们能够直接可视化并自信地确定gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba代表性NtAQPs的亚细胞定位。代表PIP (gydF4y2BaNtPIP2; 5 tgydF4y2Ba)， nip (gydF4y2BaNtNIP2gydF4y2Ba;1 s)及TIP (gydF4y2BaNtTIP1; 1gydF4y2Ba) NtAQPs具有不同的亚细胞定位，这与其他植物中这些AQP亚家族的已知情况一致[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。与其他物种中这些亚科的研究一致[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]，我们发现NtPIP和NtTIP分别定位于质膜和tono质体。NtNIP2;1共定位于PM和ER，预测软件没有捕捉到这一点，而预测软件只报告PM集成。这种次优的PM靶向可能限制NtNIP2;1的功能能力及其随后的生理作用(见讨论)。gydF4y2Ba

烟草AQP基因进化gydF4y2Ba

烟草最近起源于一个异源四倍体杂交事件gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba，它们是烟叶属的远亲[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]。基因组缩小是对多倍体化的一种广泛的生物学反应，最终导致二倍体化[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]。然而，由于烟草自诞生以来的进化时间较短(20万年)，烟草经历了有限的基因组缩小。因此，NtAQP家族的特征是由姐妹基因对组成，我们可以将其分配给给定的父母起源。烟草只丢失了大约10%的复制基因，没有观察到亲本中任何一方的优先基因丢失[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。与这一估计一致的是，在烟草中发现了7个基因丢失事件(约占遗传亲本AQPs总数的8.6%)，其中3个和4个是来自烟草的冗余同源损失gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba分别的基因组。根据我们的表达分析，NtAQP基因拷贝遗传自双方gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba(分别为“s”和“t”基因)，总体上表达相同，这与更广泛的烟草基因组研究一致[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。同源物的冗余可能允许一个姊妹基因积累突变，而不会对适应度产生直接影响，最经常导致非功能化(基因丢失)，或者在某些情况下导致亚功能化甚至新功能化。为此，我们观察到姐妹对中的一个AQP基因在几个植物器官中一致优先表达的情况(例如:gydF4y2BaPIP1;1 s, PIP1;3 t, SIP2;1 t, NIP5gydF4y2Ba);这表明多余的低表达姐妹基因可能随着时间的推移而失去功能。另外，一些姐妹基因表现出明显的组织特异性多样化，例如gydF4y2BaNtPIP2; 5gydF4y2Ba基因对，其中s-和t-基因分别在根和叶中表达得更高，并且可能是亚功能化甚至新功能化的候选人。gydF4y2Ba

我们能够在父母亲之间确定几个AQP基因的获得和丢失事件，因为他们在烟草属中分化，大约15 Ma以前[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。这两个gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2BaN.tomentosiformisgydF4y2Ba具有丰富的重复扩增(转座因子的积累)基因组，使其大小几乎是番茄和马铃薯的3倍(2.6 Gb vs. 0.9 Gb) [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。尽管基因组大小存在差异，但在这些二倍体茄科物种中AQP同源物数量具有密切的保守性;pip和TIPs始终是较大的亚家族。我们发现在茄属植物(番茄和马铃薯)和烟叶属植物中存在显著的iip多样性。这种多样性表现为物种间同种异构体数目的差异和较低的序列同一性;在系统发育中被描述为将番茄、马铃薯和烟草同种异构体分离成不同的类群。xip是最近发现的AQP亚家族，在单子叶和芸苔科中缺乏同种异构体，与其他AQP亚家族相比，其整体序列一致性较低[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。番茄和马铃薯的XIP主要聚集在一条染色体上，这表明番茄和马铃薯中最近的片段基因重复可能解释了与烟草XIP缺乏直接的基因同源性。gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

发现NtAQP转录组与其亲本物种的转录组在很大程度上保守，这与它最近的进化出现一致。我们还注意到，在gydF4y2BaAQPgydF4y2Ba亲本间AQP表达模式的相关性优于亲本间AQP表达模式的相关性。这种表达模式的同质性改善是杂交事件的常见结果，因为两个基因组(例如' s '和' t ' AQPs基因)现在受到相同的调控网络[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在烟草中，我们的NtAQP基因表达分析揭示了跨组织类型的广泛模式，与已知的AQP功能多样性一致[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。它揭示了一些AQPs在整个植物的许多组织中具有高水平(例如。gydF4y2BaPIP1; 3 tgydF4y2Ba和gydF4y2BaPIP1; 5,一定要;1gydF4y2Ba姐妹对)，这意味着参与了广泛的跨越过程(例如，从根到芽到花的基质运输)，而其他基因则具有高度的器官特异性表达(例如:gydF4y2Ba一定要;gydF4y2Ba3.gydF4y2BaNIP4; 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一句话,1gydF4y2Ba姐妹基因，分别存在于根、花和种皮中)。总的来说，尽管有可能它们的表达可能会因特定刺激而改变，或者它们以相似的水平表达，但在非常特定的细胞类型中构成RNA-seq取样的总组织的一小部分，但XIPs和大多数NIPs的总体表达水平较低。gydF4y2Ba

组织特异性表达模式有助于确定NtAQPs的生理作用。我们观察到了AQP亚家族之间的一般趋势。在整个植物中观察到NtXIPs的表达量很低，但普遍存在，以前报道过它们可以渗透尿素和硼酸等大块溶质，但不包括水。目前对XIP的生理作用知之甚少，但其独特的运输能力和快速的进化多样化，甚至只是在茄科植物中，暗示了其在环境适应反应中的作用。gydF4y2Ba

与其他亚家族相比，烟草PIPs似乎具有更多的叶片特异性表达亚型。这些可能涉及跨植物物种的pip通常报道的作用，包括;叶片细胞膨胀，叶片运动，调节水分离开木质部，控制气孔开口和气体输送(如CO)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)进行光合作用[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]。几种pip在花中靶向表达(gydF4y2BaPIP1; 7 tgydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP1; 8秒gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 2 tgydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 3 tgydF4y2Ba,gydF4y2BaPIP2; 8gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 9gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2 PIP2; 11日,13岁gydF4y2Ba姐妹对)，其中一些可能参与柱头、花药和花瓣发育过程中的供水调节[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与pip非常相似，NIPs内的几个同工异构体(gydF4y2BaNIP4; 3 sgydF4y2Ba和gydF4y2BaNIP4; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNIP4; 2gydF4y2Ba姊妹基因)和TIPs (gydF4y2BaTIP5; 1gydF4y2Ba姐妹基因)有针对性地表达到花上。这些的组织特异性gydF4y2BaNtNIPgydF4y2Ba年代和gydF4y2BaNtTIPgydF4y2Bas与拟南芥的花组织定位一致gydF4y2BaNIP4; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNIP4; 2gydF4y2Ba和gydF4y2BaTIP5; 1gydF4y2Ba，它们在花粉发育和花粉萌发中起着已知的作用[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]。此外，我们还发现gydF4y2BaNtTIP3; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNtTIP3; 2gydF4y2Ba只在种皮中表达。这与它们的同源物在其他物种中的种子特异性表达是一致的[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba，gydF4y2Ba94gydF4y2Ba]在那里它们在成熟的胚胎中积累，然后在种子吸胀和萌发过程中起吸水作用[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba，gydF4y2Ba96gydF4y2Ba]。物种间一致的表达模式意味着功能守恒，即gydF4y2BaNtNIP4; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtNIP4; 2gydF4y2Ba和gydF4y2BaNtTIP5; 1gydF4y2Ba可能在烟草花粉生物学的不同方面发挥作用gydF4y2BaNtTIP3; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNtTIP3; 2gydF4y2Ba有望帮助烟草种子发芽。gydF4y2Ba

发现一些PIP和TIP亚型在根中独占或优先表达。gydF4y2BaPIP1; 1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 4gydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 5 sgydF4y2Ba，gydF4y2BaPIP2; 6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一定要;gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一定要;3gydF4y2Ba，gydF4y2BaTIP2; 5gydF4y2Ba和TIP2;2 s)，它们可能在侧根萌发中起作用[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba，gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]，细胞水分摄取和体内平衡的调节[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]或通过在液泡中装载铵来吸收营养[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba，gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba]。铵负载的后一种可能作用与所列出的两种NtTIP2蛋白特别相关，它们在氨运输TIPs的ar/R LC位置具有组氨酸残基[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

上述各种NtAQPs的推测作用同样适用于许多番茄和马铃薯AQPs，反之亦然，因为这三种茄科植物在组织特异性表达模式上普遍保持一致。茄科AQP同源基因表达模式的高度保守性支持了NtAQP同源基因的准确性;根据蛋白质序列同源性分配。在蛋白质和转录水平上的相似性强烈暗示了这些茄科物种中许多AQP同源物的功能守恒。这种保护程度的知识是有价值的，因为它可以帮助促进跨茄科物种的发现转化为具有农艺重要性的性状，并有助于指导工程工作。偏差也很有趣(我们观察到了几个)，因为它们暗示了潜在的新的物种特异性功能，或者有助于解释物种之间的生理差异。例如，NIP2;1是一种独特的NIP，具有独特的GSGR ar/R过滤基序和NPA基序之间精确的环C间距，使其能够渗透并帮助硅在许多高硅积累物种中从根到茎的运输[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102gydF4y2Ba]。但是，茄科植物被认为是硅积累能力差的[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102gydF4y2Ba]，这与…的明显恶化相吻合gydF4y2BaNIP2; 1gydF4y2Ba在我们的跨物种比较中看到的茄科谱系;gydF4y2BaNIP2; 1gydF4y2Ba迷失在gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba在烟草杂交之前;缺席:随后的缺席gydF4y2BaNtNIP2; 1 tgydF4y2Ba基因;N.sylNIP2;1和NtNIP2;1都具有不利于硅输运的C环长度，SlNIP2;土豆不具有gydF4y2BaNIP2; 1gydF4y2Ba;的不同表达模式gydF4y2BaNtNIP2; 1gydF4y2Ba和gydF4y2BaSlNIP2; 1gydF4y2Ba暗示不同的角色;NtNIP2;1:GFP在PM的定位不佳，可能会限制功能能力;并且没有其他NtNIP具有GSGR ar/R冗余过滤器配置。gydF4y2Ba

我们确定烟草AQP家族由76个成员组成，分为5个亚家族，每个亚家族在蛋白质结构、孔衬残基和翻译后调控机制方面都有细微的特征变化。关键残基和区域的特征通过指导未来的功能研究来帮助鉴定底物特异性残基组合，拓宽了我们对AQP生物学的认识。推测的翻译后调控位点的注释支持了目前对AQP调控的认识，不仅在更广泛研究的PIP亚家族中，而且在TIP、NIP、SIP和XIP亚群中。不同的NtAQP亚家族成员被发现定位于特定的亚细胞膜，这些亚细胞膜共同促进了一个动态和广泛的运输系统。这些亚细胞谱有助于阐明生理作用，例如，pm定位的NtAQPs可能促进溶质在细胞内外的扩散，而tonopast定位的异构体有助于溶质在细胞内的分布。烟草是近代异源四倍体，其AQP家族规模大，亲本遗传并保留了姐妹基因的系统发育配对特征;gydF4y2Ba烟草的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ba烟草tomentosiformis。gydF4y2Ba通过建立NtAQP姐妹基因的遗传，我们能够重建NtAQP家族的近代史，这有助于建立候选基因的潜在功能同源性。NtAQPs的表达分析显示出不同的组织特异性，这与AQP广泛的生理功能相一致。一些NtAQPs广泛表达，而另一些则在单个组织中表现出特化或强烈的优先表达。我们发现，许多NtAQPs的表达特异性与其他物种中具有既定生理作用的同源AQPs相似，这使我们能够在烟草中指定假定的同源功能。AQP蛋白结构和基因表达模式与其他茄科植物高度保守，这将有助于将烟草的知识转化为密切相关的重要园艺作物。gydF4y2Ba

烟草鉴定;gydF4y2BaN.sylvestrisgydF4y2Ba和gydF4y2BaN.tomentosiformisgydF4y2BaaqpgydF4y2Ba

烟草基因组与TN90蛋白序列[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]和K326-Nitab4.5v [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]栽培品种来自茄科基因组学网络[gydF4y2Ba103gydF4y2Ba]并导入genous (V9.1.5)软件[gydF4y2Ba104gydF4y2Ba]。为了全面鉴定烟草中可能存在的水通道蛋白基因，对烟草预测的TN90蛋白质组进行了多次BLASTP搜索，使用马铃薯(gydF4y2Ba茄属植物tuberosumgydF4y2Ba)及番茄(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba)水通道蛋白序列作为查询。从每个个体的同源性检索中，编译出前3-5个匹配的推定NtAQPs;在搜索例程结束时合并列表。一个类似的过程被用来识别aqpgydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba(烟草亲本基因组)，但烟草水通道蛋白编码序列用于BLASTN查询。使用MUSCLE [gydF4y2Ba105gydF4y2Ba]。全家族和亚家族序列比对用于标记异常AQP蛋白序列，以便进行更仔细的检查。gydF4y2Ba

烟草的系统发育分析与分类;gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2BaaqpgydF4y2Ba

使用MUSCLE对齐的核苷酸或蛋白质序列构建系统发育树，采用邻居连接(NJ)方法(成对删除;bootstrap = 1000)在MEGA7软件中[gydF4y2Ba106gydF4y2Ba]。烟草AQP命名惯例是基于与番茄AQP的同源性。gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2BaN.tomentosiformisgydF4y2Ba根据AQP与烟草AQP的同源性，确定了AQP基因名称。gydF4y2Ba

烟草AQPs的结构特征gydF4y2Ba

通过比对CDS和基因组序列，鉴定了烟草水通道蛋白的内含子/外显子结构。基因序列(计算和我们的策展)和RNA-seq数据的比较通过JBrowse可视化。使用TOPCONS定义精心策划的ntaqp的拓扑[gydF4y2Ba107gydF4y2Ba]。已知功能相关残基的补体从MUSCLE对齐的NtAQP蛋白序列中收集。比对统计(例如，使用BLSM62矩阵的序列同一性和相似性百分比)从单个亚家族的MUSCLE比对序列中收集。使用NetPhos 3.1预测评分≥0.8进行磷酸化位点预测[gydF4y2Ba108gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

亚细胞定位预测使用;YLoc [gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]， Wolf PSort [gydF4y2Ba109gydF4y2Ba]及Plant-mPloc [gydF4y2Ba110gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

亚细胞定位gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba(拟南芥)gydF4y2Ba

通过Gateway克隆烟草AQP - GFP基因(gydF4y2BaNtTIP1, 1gydF4y2Ba)、PIP (gydF4y2BaNtPIP2; 5 tgydF4y2Ba)及NIP (gydF4y2BaNtNIP5; 1 tgydF4y2Ba)从pZeo入口向量到pMDC43目的向量的编码序列[gydF4y2Ba111gydF4y2Ba];产生由组成型2x35S CaMV启动子驱动的n端GFP:NtAQP融合蛋白。通过农杆菌(GV3101)浸花植株转化法(Clough and Bent 1998)获得拟南芥转基因品系。作为细胞质定位标记的GFP标记系(MG0100.15)是在我们的实验室通过Gateway克隆pMDC32目标载体中包含的pZeo入口克隆的GFP mGFP6变体生成的[gydF4y2Ba111gydF4y2Ba];通过2x35S CaMV启动子驱动mGFP6转基因的组成性表达。我们的实验室也生成了PM:GFP系，构建在pMDC83 Gateway目的载体上，由拟南芥PIP2;1(已经建立的PM标记物)组成[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba])与mGFP6 c端融合，全部由2x35S CaMV启动子驱动。gydF4y2Ba

用次氯酸盐对拟南芥种子进行液体灭菌，清洗数次，然后播种在含有0.8%琼脂和抗生素潮霉素的Gamorg’s B5培养基上进行转化体筛选。生长8天后，将拟南芥幼苗从琼脂中轻轻取出，置于磷酸盐缓冲液(100 mM NaPO)中gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba缓冲区,gydF4y2BapH值gydF4y2Ba7.2)在标准载玻片上，盖上盖片，用40倍水浸物镜(1.2 NA)用蔡司LSM 780共聚焦显微镜观察。采用差分干涉对比技术(DIC)观察根伸长区皮质细胞的显微光学照片，在488nm激发下捕获GFP荧光，在490 - 526nm范围内进行发射检测。在570-674 nm范围内检测到自身荧光，排除在GFP检测通道之外。使用Fiji (ImageJ)程序对图像进行处理[gydF4y2Ba112gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AQP基因表达分析gydF4y2Ba

鉴定出的水通道蛋白的转录物表达是通过两种途径从公开发布的数据集中提取出来的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba];经过处理的转录表达矩阵的挖掘和[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba上传到GenBank Sequence Read Archive (SRA)的原始RNA-Seq reads分析。处理后的转录表达gydF4y2Ban .烟草gydF4y2BaK326 [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]提取自The Sol Genomics Network [gydF4y2Ba103gydF4y2Ba]。数据以每百万副本(TPM)的形式提取，因此无需进一步处理即可进行挖掘。该数据集包含叶和根的组织特异性表达。原始RNA-Seq从两者中读取gydF4y2Ban .烟草gydF4y2BaK326及TN90 [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]从GenBank SRA下载(TN90: SRP029183;K326: SRP029184)通过命令行转换成对结束的fastq文件。Read文库具有叶、根、幼叶、幼花、成熟叶、成熟花、衰老叶、衰老花或干蒴果的组织特异性。平均每个组织由约1.1亿对reads的RNA-seq文库代表。使用Trimmomatic [gydF4y2Ba113gydF4y2Ba来删除适配器序列。已处理的读取与gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba基因组，要么是K326 [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]或TN90 [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，在Salmon中使用准对齐模式[gydF4y2Ba114gydF4y2Ba调用k-mer长度为31，相对丰度报告为每百万转录本(TPM)。K326和TN90转录组的定位率分别为73 ~ 78%和89 ~ 94%。原始RNA-seq读取亲本基因组gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba都是从[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。RNA-seq文库是从根、叶和花组织中提取的文库，每种组织类型平均有2.65亿对reads。读取操作如上所述进行处理并映射到gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba从[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

番茄和马铃薯的根、叶和花的表达数据通过EMBL-EBI表达图谱检索，最初由[gydF4y2Ba115gydF4y2Ba]及[gydF4y2Ba116gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

我们声明，支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。我们所有的水通道蛋白CDS核苷酸和蛋白质序列数据报道gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba，gydF4y2Ban的抗旱性gydF4y2Ba和gydF4y2Ban tomentosiformisgydF4y2Ba可在DDBJ/ENA/GenBank数据库的第三方注释部分获得，登录号为TPA: BK011376-BK011532;BankIt2254789。gydF4y2Ba

AQP:gydF4y2Ba

水通道蛋白gydF4y2Ba

基于“增大化现实”技术/ R:gydF4y2Ba

芳香族/精氨酸gydF4y2Ba

cd:gydF4y2Ba

编码DNA序列gydF4y2Ba

呃:gydF4y2Ba

内质网gydF4y2Ba

MIP:gydF4y2Ba

主要内在蛋白gydF4y2Ba

夹:gydF4y2Ba

结节蛋白样内在蛋白gydF4y2Ba

NPA:gydF4y2Ba

Asparagine-proline-alaninegydF4y2Ba

n西尔维:gydF4y2Ba

烟草的抗旱性gydF4y2Ba

n .汤姆:gydF4y2Ba

烟草tomentosiformisgydF4y2Ba

Nt:gydF4y2Ba

烟草gydF4y2Ba

皮普:gydF4y2Ba

质膜固有蛋白gydF4y2Ba

下午:gydF4y2Ba

等离子体膜gydF4y2Ba

Sl:gydF4y2Ba

茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba

圣:gydF4y2Ba

茄属植物tuberosumgydF4y2Ba

提示:gydF4y2Ba

张力质体固有蛋白gydF4y2Ba

TM:gydF4y2Ba

跨膜域gydF4y2Ba

Tono:gydF4y2Ba

液泡膜gydF4y2Ba

XIP:gydF4y2Ba

X内在蛋白gydF4y2Ba

我们感谢CSIRO的Rosemary White提供Tonoplast:GFP和ER:GFP标记系的种子[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。作者感谢澳大利亚国立大学先进成像区澳大利亚显微镜协会的设施和科学技术援助(Darryl Webb);这是一个由澳大利亚国立大学、澳大利亚州政府和联邦政府资助的设施。我们承认澳大利亚政府的国家合作研究基础设施战略(NCRIS)，为澳大利亚国立大学提供了作为澳大利亚植物表型学设施一部分的生长设施。gydF4y2Ba

ADR, AWL, JRE和MG，由澳大利亚研究理事会转化光合作用卓越中心(CE140100015)支持。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释或撰写手稿方面没有任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 澳大利亚国立大学生物研究学院，ARC转化光合作用卓越中心，澳大利亚堪培拉2601gydF4y2Ba

   安娜玛丽亚·德·罗莎，约翰·r·埃文斯和迈克尔·格罗斯曼gydF4y2Ba

2. 西悉尼大学霍克斯伯里环境研究所，ARC转化光合作用卓越中心，新南威尔士州悉尼，2751，澳大利亚gydF4y2Ba

   亚历山大Watson-LazowskigydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

MG和JRE构思了最初的研究计划;对ADR和MG进行了研究;AWL、MG和ADR处理烟草RNA-seq数据进行基因表达分析;ADR、MG撰稿;JRE严格审查手稿的知识内容;MG监督项目。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba迈克尔GroszmanngydF4y2Ba。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba。创作共用公共领域免责声明(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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