低氧胁迫下两种不同基因型水稻根系脯氨酸合成及抗氧化能力的研究gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

脱落酸（ABA）和脯氨酸在水稻适应中发挥重要作用，对不同的应力条件。To study whether cross-talk exists between ABA and proline, their roles in rice acclimation to hypoxia, rice growth, root oxidative damage and endogenous ABA and proline accumulation were investigated in two different rice genotypes (‘Nipponbare’ (Nip) and ‘Upland 502’ (U502)).

结果gydF4y2Ba

与U502幼苗相比，Nip幼苗对缺氧胁迫具有较高的耐受性，植株生物量和叶片光合作用增加，根系氧化损伤减少。缺氧显著刺激了两个品种根系中脯氨酸和ABA的积累，Nip的ABA水平高于U502，而脯氨酸水平在两个品种间无显著差异。结果表明，在缺氧胁迫1 d内，Nip根系ABA和脯氨酸含量分别增加了1.5倍和1.2倍，U502根系ABA和脯氨酸含量分别增加了2.2倍和0.7倍，但在脯氨酸积累5 d之前，两个品种均出现了ABA产量高峰(1 d)。ABA合成抑制剂norflurazon抑制了两个品种的根中脯氨酸的合成，同时加剧了缺氧诱导的氧化损伤，但外源ABA的施用逆转了这一效应。缺氧加Norf处理也引起谷氨酸(脯氨酸的主要前体)的增加。这说明在缺氧胁迫下，脯氨酸的积累受aba依赖信号的调控。此外，脯氨酸代谢相关基因在两种基因型之间存在差异表达，缺氧胁迫下ABA介导表达。在Nip中，低氧诱导的根系脯氨酸积累归因于Os的上调gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba和OS下调gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba，而OsgydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba结合OS的下调gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba提高了U502的脯氨酸水平。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果表明，Nip品种的高耐性与根中较高的ABA水平和ABA介导的抗氧化能力有关。ABA通过调控脯氨酸生物合成关键酶基因的表达，起到脯氨酸积累的上游作用，也在一定程度上提高了水稻对缺氧胁迫的适应能力。然而，其他增强Nip耐缺氧能力的信号通路还有待进一步研究。gydF4y2Ba

作为需氧生物，高等植物需要氧气(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)以支持呼吸、新陈代谢和生长。然而，由于氧含量低，植物往往会经历缺氧胁迫gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度，由长期洪水，涝渍或土壤压实引起的[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．耗尽O.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，导致ATP合成显著减少，并导致活性氧(ROS)的过度积累[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．ROS是细胞毒性，通过氧化脂质和蛋白质破坏正常细胞代谢，从而引起颜料分解，细胞内容物泄漏，最终细胞死亡[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．低啊gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba也影响植物营养代谢和生长，如根形态、营养吸收和与这些过程相关的基因表达的显著改变所示[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了应对缺氧胁迫，植物发展了几种机制来减少缺氧的负面影响[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．形态适应，包括不定根和通气组织的形成，以及叶片厚度的改变，是植物利用的逃逸策略[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．细胞壁木质素化和根皮层和中柱木质素化也可以防止OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在缺氧期间从根部丢失[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．与缺氧敏感植物相比，耐缺氧植物的不定根数量更多，径向氧损失更大，以避免OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba不足(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．在细胞和生理水平上，耐缺氧植物通常会进化出一些清除ROS的抗氧化酶(如过氧化氢酶、CAT;抗坏血酸盐过氧化物酶(APX型;过氧化物酶,豆荚;以及超氧化物歧化酶(SOD)等多种复杂的代谢适应[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．已经提出了保护脯氨酸的机制，一种相容的渗透电解质，并与适应缺氧的适应性相关[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba],渗透[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],盐度[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，重金属[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，和冰冻[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]应力。已经提出了许多可能的功能，包括使渗透调节，稳定蛋白质和细胞膜结构，并作为自由基清除剂作用[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．脯氨酸的其他功能包括调节胞质酸度、能量转移和还原剂活性、作为碳和氮储备和信号分子[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物激素，尤其是脱落酸（ABA），也起到重要作用，在引发植物反应中涉及到广泛的非生物胁迫中所涉及的代谢的化学反应[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在缺氧条件下，有报道称不同物种的根中ABA含量都有所增加，外源ABA的施用显著提高了拟南芥的耐缺氧能力[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．这些对非生物胁迫的适应性反应诱导了不同的生理生化变化，如气孔关闭的激活、抗氧化酶、不定根的形成和代谢产物的碳水化合物[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．一些学者进一步证明，脯氨酸的功能和对脯氨酸代谢的调节依赖于ABA的积累[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]，而其他反应独立于ABA发生，而ABA单独不能重复干旱诱导的脯氨酸积累[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．ABA积累对非生物胁迫的响应随植物种类、品种和器官的不同而显著不同[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba］．因此，了解这些保护机制将有助于植物的基因改造，提高其对恶劣环境条件的适应能力。gydF4y2Ba

旱稻和低地稻都是我国北方重要的水稻品种。这两种水稻基因型的根表现出不同的形态、激素相关和基因表达特征，这些差异在解毒、抵御氧化应激、维持细胞充血和完整以及蛋白质合成等方面发挥重要作用[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．本研究以水培方式研究了水稻适应缺氧胁迫过程中内源ABA和脯氨酸积累、根系氧化损伤及其保护机制的差异。选择了两个不同的水稻品种，即旱稻品种‘Nipponbare’(Nip)和旱稻品种‘旱稻502’(U502)，并在低氧和常氧条件下栽培。研究结果表明，aba介导的脯氨酸积累和根系抗氧化能力可能在增强根系对缺氧胁迫的适应中发挥重要作用，特别是在低地品种中。然而，aba介导的其他参与水稻耐缺氧的信号调控机制仍需进一步研究。gydF4y2Ba

水稻生长和生理特性gydF4y2Ba

两种基因型的生长和生理相关参数，如生物量、光合速率和根系活力，在应对缺氧胁迫时受到不同程度的影响(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa e)。与常氧处理相比，低氧处理显著降低了U502品种的生物量(根、茎、全株生物量)和叶片SPAD值，而Nip品种的这些参数变化不显著。在低氧条件下，叶片光合作用和根系活力均受到显著抑制，Nip品种叶片光合作用和根系活力分别下降17.9和23.3%，U502品种叶片光合作用和根系活力分别下降34.8和51.6%，且Nip品种叶片光合作用和根系活力均显著高于U502品种(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad，e）。gydF4y2Ba

为测定低氧胁迫下根系的氧化损伤程度，进一步研究了低氧胁迫下根系脂质过氧化(MDA)和蛋白质氧化(羰基)的水平以及抗氧化酶的活性。与对生长的影响相反，缺氧对U502根系的氧化损伤增强，表现为U502的MDA和羰基含量显著高于Nip品种(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.缺氧对Nip品种根系氧化损伤无显著影响。相对于常氧处理，U502处理的根系SOD、POD、CAT和APX活性显著升高，而Nip处理仅POD和APX活性升高。因此，Nip品种对缺氧胁迫的耐受性似乎比U502品种更强。gydF4y2Ba

水稻内源脯氨酸和ABA积累gydF4y2Ba

通过对两个品种根系内源ABA和脯氨酸积累量的监测，探讨其耐缺氧机制。缺氧诱导两个品种根系中ABA和脯氨酸的显著积累(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, d).缺氧胁迫14 d后，Nip根系ABA含量比U502增加了2.25倍，但脯氨酸含量无显著差异。然而，在试验2中，在胁迫的第3天和第7天，Nip品种的脯氨酸合成水平仍然高于U502品种，如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab.低氧显著抑制了两个品种叶片中脯氨酸的积累，但刺激了U502叶片中ABA的积累(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa，c）。基因表达分析表明，缺氧上调了基因的表达gydF4y2BaOsNCED3gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNCED4gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsNCED5gydF4y2Ba在尼斯和尼斯gydF4y2BaOsNCED4gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsNCED5gydF4y2Ba在U502(图。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.这些结果也与根系中ABA产量的变化相一致。gydF4y2Ba

外源ABA及ABA抑制剂对根脯氨酸产量的影响gydF4y2Ba

为探讨内源ABA和脯氨酸积累在水稻缺氧胁迫响应中的作用，测定了两个品种ABA和脯氨酸积累的时间进程。缺氧胁迫同时诱导ABA和脯氨酸积累，但二者的时间进程变化趋势差异很大(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.根系ABA含量迅速增加，在缺氧胁迫1 d后达到峰值，随后6 d逐渐下降，在胁迫1 d和7 d后Nip的ABA含量分别是U502的1.29-和2.40倍(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa）。根脯氨酸含量在缺氧应激下也大大增加，并且在5d的压力下达到峰值，但除了0.5d和1d的应激之外，它们的内容物之间的内容几乎不同（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).在常氧条件下，根系ABA含量在前24 h内略有下降，但随后保持不变，而根系脯氨酸含量变化不大。gydF4y2Ba

随着时间的推移，根系中ABA和脯氨酸积累的变化提出了一个问题，即在缺氧胁迫下，ABA积累的增加是否作为增加脯氨酸产量的信号。因此，在试验2中以时间过程的方式定量分析外源ABA或ABA抑制剂(Norf)施用对总氨基酸、谷氨酸、脯氨酸和ABA水平的影响。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在低氧胁迫下，两个品种的总氨基酸和脯氨酸含量均显著增加，其中Nip的含量均高于U502(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.在常氧条件下，尽管总氨基酸略有增加，但脯氨酸和谷氨酸产量随时间变化不大。缺氧+ Norf处理显著抑制了两个品种根系中脯氨酸的积累，而脯氨酸的主要前体谷氨酸含量显著增加。而在低氧条件下，外源ABA处理诱导的内源脯氨酸和ABA含量较常氧处理显著增加，Nip的内源脯氨酸和ABA含量分别是U502的1.21倍和2.16倍(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba碳氢键)。综上所述，这些结果表明，ABA可能在缺氧胁迫下作用于脯氨酸的上游。gydF4y2Ba

外源ABA和ABA抑制剂对脯氨酸生物合成和氧化损伤中酶组合酶表达的影响gydF4y2Ba

与常规治疗相比，缺氧治疗诱导P5CS活性显着增加，并在两种品种根部中的产品中的降低（图。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)，导致脯氨酸含量增加。进一步的结果表明，缺氧胁迫下调了gydF4y2BaOsP5CS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsProDHgydF4y2Ba但上调了gydF4y2BaOsP5CS2gydF4y2Ba夹(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA，B，D）。缺氧加NORF治疗显着下调了表达gydF4y2BaOsP5CS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsP5CS2gydF4y2Ba但上调了gydF4y2BaOsProDHgydF4y2Ba外源ABA则显著上调了脯氨酸的表达量gydF4y2BaOsP5CS1gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsP5CS2gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsProDHgydF4y2Ba．在U502品种中，缺氧显著上调表达gydF4y2BaOsP5CS1gydF4y2Ba但下调gydF4y2BaOsProDHgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA, d)与常氧治疗相比。缺氧加Norf处理降低了表达gydF4y2BaOsP5CS1gydF4y2Ba但上调了gydF4y2BaOsProDHgydF4y2Ba，但随着ABA加缺氧治疗的外源性，这些效果逆转。所有结果表明，与脯氨酸代谢相关的基因表达的显着差异由ABA信号传导介导。在Nip中，低氧诱导的根系脯氨酸积累归因于Os的上调gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba和OS下调gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba，而OsgydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba结合OS的下调gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba提高了U502的脯氨酸水平。gydF4y2Ba

为了进一步研究外源ABA和ABA抑制剂对水稻耐缺氧能力的影响，我们测定了不同处理对脂质过氧化和蛋白质氧化的响应。低氧胁迫0.5 ~ 3 d后，根系MDA和羰基组含量的变化与试验1的变化趋势一致(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba模拟)。与低氧处理相比，缺氧加Norf处理显著加重了两个品种的氧化损伤。而外源ABA显著减轻了根系的氧化损伤，这与所观察到的ABA和脯氨酸积累的变化相一致。这进一步证实了ABA参与并在降低缺氧胁迫下的氧化损伤中发挥了关键作用。gydF4y2Ba

Nip品种似乎比U502品种更耐缺氧，根系中ABA积累量更高，氧化损伤更小gydF4y2Ba

在缺氧压力下，植物中萎缩，被捕的营养吸收和降低生长的症状由于o由于o而受到各种真核细胞的有氧呼吸和有丝分裂。gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba不足(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．低氧胁迫也显著降低了两个品种的叶片光合作用和根系活力，这与之前在淹水条件下的研究结果一致[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．然而，水稻生长对缺氧应激的响应显示出显着的基因型差异，并且肌瘤品种看似耐受性比U502品种更耐受缺氧应激。NIP品种的相对较高的水稻生物质伴有适应性特征，如不定根发展[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba和增强光合作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．高光合速率增强了初级光合同化物从韧皮部向根的长距离转运[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］．相比之下，U502叶片中较高的ABA含量导致气孔关闭，抑制光合能力和碳水化合物的产生[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．这种阻滞也可能是由于U502品种相对较高的细胞氧化损伤造成的，MDA和羰基分别反映了脂质过氧化和蛋白质氧化gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.然而，U502品种比Nip品种具有更高的氧化损伤，同时SOD和CAT酶的活性也更高，这两种酶是显著的抗氧化酶，这与之前的研究结果相反[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．结果表明，这些抗氧化酶的积累仍然不足以清除缺氧下积累的ROS，这相应地刺激其增加的积累。gydF4y2Ba

在非生物胁迫下，ABA和脯氨酸含量的暂时增加也在增强植物对耐缺氧的适应中起着重要作用[gydF4y2Ba40.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，两种品种显示出显着增强的脯氨酸和ABA在根中，表明缺氧对其积累的刺激作用。表达gydF4y2Banced.gydF4y2Ba(例如,gydF4y2BaOsNCED3gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsNCED4gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsNCED5gydF4y2Ba）控制ABA生物合成途径的第一步的基因也支持ABA合成在缺氧应激下活化的结论。无论存在缺氧应激的情况如何，ABA内容物都显示出显着的基因型差异，并且辊隙根的值显着大于U502根部的值。该结果与先前的结果一致[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]，它将高层水稻的低水平的根源ABA归因于高水平的根流渗出，从而改善了ABA依赖性的干旱适应。ABA和脯氨酸在根中对缺氧胁迫的反应表明，水稻生长受到内部信号紧密调节，ABA可能在水稻适应中发挥基本作用与缺氧应激。然而，脯氨酸和ABA的作用及其在水稻适应中与缺氧应力的关系仍不清楚。gydF4y2Ba

在低氧胁迫下，根系ABA作用于脯氨酸的上游gydF4y2Ba

利用经典毒理学研究进一步证实，在缺氧胁迫下，根ABA可能作用于脯氨酸代谢的上游。首先，在低氧胁迫下，内源脯氨酸和ABA含量呈时间过程同步增加;缺氧胁迫24 h内，根系ABA和脯氨酸含量显著增加。其他报道也描述了在缺氧胁迫条件下植物ABA含量和耐缺氧能力的类似增加[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．然而，他们发现外源施用环己亚胺抑制了ABA诱导的厌氧耐受性，这进一步说明ABA可能是感知缺氧胁迫并诱导生理适应的早期信号物质。在我们的研究中，ABA的峰值出现在两个品种积累脯氨酸之前(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.该发现表明，ABA和脯氨酸信号传导途径之间的交叉谈话可能参与水稻生长期间的缺氧诱导的适应性。虽然在NIP中7 d缺氧应激后的ABA积累显着高于U502，但它们响应外源NORF或ABA治疗的变化呈现了类似的趋势。与缺氧治疗相比，在外源ABA治疗下，脯氨酸的积累显着增加，但在NORF处理下显着降低。鉴于脯氨酸作为渗透性的作用及其在不同应力条件下平衡细胞内氧化还原性稳态的能力[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba研究结果表明，ABA可以启动一个参与脯氨酸代谢的信号通路网络，从而调节水稻对缺氧胁迫的适应。ABA和脯氨酸之间的类似关系以及它们在非生物调节中的参与也在其他作物中观察到[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

缺氧根也经过几种与N吸收和同化相关的生化修饰，相应地参与植物适应缺氧应力[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．在我们的研究中，缺氧诱导根系总氨基酸含量显著增加。这种应激诱导的氨基酸积累可能是一种机制，为细胞提供几种已知参与非生物应激反应的化合物的前体[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，如多胺或次级代谢产物。缺氧胁迫3 d后，Nip中脯氨酸的主要前体谷氨酸含量比常氧条件下增加了70.0%，U502中增加了167.2%，促进了氮的循环[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］．缺氧+ Norf处理诱导谷氨酸随时间的增加而显著增加，但相反地抑制了脯氨酸的合成。外源ABA处理显著抑制了缺氧诱导的谷氨酸在根中的积累，尤其是在胁迫1和3 d时。结果表明，norf诱导的谷氨酸积累似乎依赖于抑制ABA的生物合成，这也间接证实了上述结论，即脯氨酸可能作用于ABA的下游。此外，Nip品种中ABA介导的氨基酸积累量远高于U502品种，也在缓解缺氧胁迫下的氧化损伤中发挥着重要作用[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ABA可以减轻缺氧诱导的氧化损伤，并介导脯氨酸代谢相关基因的表达gydF4y2Ba

一般来说，脯氨酸积累的原因是参与脯氨酸生物合成的限速酶P5CS活性增强或ProDH活性降低[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．我们的研究表明，缺氧胁迫下P5CS的升高和ProDH的抑制共同诱导了两个品种根系中脯氨酸的积累。利用转基因技术，Aleksza等人[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba报道，脯氨酸含量减少了gydF4y2BaP5CS1-1gydF4y2Ba突变体和增强gydF4y2BaPDH2-2gydF4y2Ba突变体，表明这两个基因决定了非生物胁迫下脯氨酸的合成。确定ABA是否确实与协同抑制相关gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba和归纳gydF4y2BaP5CS.gydF4y2Ba基因表达，还研究了调节该过程的信号线。表达gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba在Nip品种和gydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba在U502中，在缺氧应激下，品种显着上调，通过应用外源ABA进一步加强，但通过阻断缺氧加入NORF治疗中的ABA生物合成而逆转。但是，gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba表达在上述不同的情景中呈现出相反的趋势。先前的研究的gydF4y2BaP5CS.gydF4y2Ba基因揭示了他们转录的时间和空间调节的显着差异[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba，我们的研究发现gydF4y2BaP5CS1gydF4y2BaP5CS2基因表现出显著的基因型差异。Székely等人在拟南芥根尖、叶和花器官中贡献了不同的细胞类型特异性和亚细胞定位模式的差异[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．此外，P5CS基因的转录受到干旱、盐度和ABA的不同调控，表明这些基因在脯氨酸生物合成的控制中发挥着特定的作用[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．虽然基因表达差异的内在机制还有待阐明，但我们的研究结果表明，脯氨酸的积累和脯氨酸生物合成途径的基因编码酶的表达，特别是OsgydF4y2BaP5CS1gydF4y2Ba，OS.gydF4y2BaP5CS2.gydF4y2Ba和操作系统gydF4y2BaProDHgydF4y2Ba，在缺氧胁迫下诱导需要ABA，这与其他作者最近获得的结果一致[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在不同的非生物胁迫条件下，植物中脯氨酸代谢、抗氧化酶活性和基因表达水平的升高响应非生物胁迫已被广泛报道[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．我们的结果进一步证明，通过降低根部的氧化损伤，缺氧诱导的缺氧诱导的ABA积累能够通过降低氧化损伤，特别是在凝固型中，以增强缺氧。在缺氧条件下，在U502品种中，根氧化损伤显着增强，但与常氧条件相比，没有在尼皮栽培品种中。然而，缺氧加NORF治疗通过提高两种品种中MDA和羰基的含量显着加剧了根氧化损伤。这些发现表明，ABA可能在减轻缺氧诱导的根中氧化损伤的重要作用，这是通过随后的实验进一步证实，其中外源ABA的应用显着缓解缺氧诱导的氧化损伤。gydF4y2Ba

Nip和U502品种对缺氧胁迫的潜在适应机制gydF4y2Ba

Nip品种比U502更耐缺氧，表现为干物质含量高，根系氧化损伤小。专注于根响应ABA和脯氨酸,我们的研究结果表明,无论在水稻生物量和脯氨酸水平的差异,根源ABA可以上游调节脯氨酸积累的脯氨酸代谢相关基因的表达和显著减轻低氧诱导氧化损伤在这两个品种。Nip根系ABA水平显著高于U502，这与水稻生物量的变化一致。然而，生长与ABA含量之间的联系在地上部分并不像在根中那样明显。低氧处理显著提高了U502品种叶片中ABA含量，但对Nip品种无显著影响。达斯和卡尔[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba揭示了ABA通过影响NADPH氧化酶生成的胞外ROS，介导了水分胁迫下Wilczek幼苗根和芽的不同生长反应。U502光合作用下降可能与ABA含量升高导致气孔关闭有关[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，进一步减少了水稻叶片中初级光合产物的产生和转运。因此，我们认为，耐缺氧的Nip品种在保持内源ABA介导的较高光合和抗氧化能力方面，利用了比U502更好的保护机制。gydF4y2Ba

虽然许多生理学研究表明，脯氨酸涉及多种应激机制，但这些价值观在我们研究中两种品种之间没有显着差异。在先前的报道中，发现脯氨酸的较高积累与改善的应力耐受性相关[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]，而在其他地区，这种相关性并不明显[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba］．这些有趣的研究结果表明，脯氨酸积累可能不是适应环境压力的唯一因素。在缺氧条件下，也许根部的其他信号传导途径也被激活以减少缺氧的负面影响。由乙烯，IAA和一氧化氮（NO）控制的不同保护机制已广泛证明植物适应性对非生物应激[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba］．有研究表明NO或乙烯可能作为ABA的下游信号分子参与信号转导过程，从而提高植物的抗氧化能力[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba］．因此，缺氧或ABA是否进一步刺激NO /乙烯生产，并且它们在增强缺氧的细胞耐受性方面的作用仍然需要阐明。gydF4y2Ba

总之,我们的植物生长数据清楚地表明,夹生物量和叶片光合作用和较高的品种变得更好更适应低氧压力比U502品种,这是有关ABA含量越高和增强ABA-mediated前品种根系的抗氧化能力。根系ABA通过调控脯氨酸代谢相关基因的表达，起到脯氨酸积累的上游作用，可能在一定程度上提高了水稻对缺氧胁迫的适应能力，尤其是Nip品种。但Nip的脯氨酸水平与U502无显著差异，说明脯氨酸积累可能不是适应缺氧胁迫的唯一因素。因此，其他增强Nip耐缺氧能力的信号通路仍需进一步研究。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

在本研究中使用了传统的低地粳稻品种Nipponbare（Nip）和Upland japonica水稻品种Upland 502（U502）。从中国国家水稻改善中心获得尼波和U502品种的种子（gydF4y2Bahttp://www.chinariceinfo.com/en/AboutUs/Organization/8036.htmlgydF4y2Ba）.用1% (v/v)次氯酸钠水溶液对水稻种子进行表面消毒。将发芽的种子转移到0.5 mM CaCl溶液中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(pH 5.5)有利于水稻根系生长。3 d后，秧苗移栽到1-L黑色塑料罐中，罐中含有NH溶液gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(0.5毫米),不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba·2H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (0.18 mM)， KCl (0.18 mM)， CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba（0.36毫米），mgsogydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (0.6 mM)， MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Bah·4gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (9 μM)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaMoOgydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·4gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (0.1 μm)， hgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba（10μm），znsogydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (0.7 μM)， CuSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba（0.3μm）和fesogydF4y2Ba_4gydF4y2Bah·7gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba邻乙二胺四乙酸(EDTA) (20 μM) [gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba］．每盆育苗5株，在光周期14-h/10-h，光周期400 μmol m .，光周期10-h，暗周期10-h的条件下，在生长室内培养gydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}光强度，28°C白天和23°C夜间温度，60％相对湿度（RH）。将溶液pH调节至5.5，用5mm 2-（N-炔胺）乙磺酸（MES）。gydF4y2Ba

实验1:gydF4y2Ba在培养1周后，选择六个具有类似尺寸的幼苗的盆栽，用于实验1，每种基因型的六种复制同等分为两组：常氧和缺氧治疗。对于常氧治疗，将含有每个基因型的三个罐用空气泵充气，并且每4小时溶液曝光以保持溶解的ogydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容在1.5-2.0 mg l的范围内gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}．对于缺氧治疗，ngydF4y2Ba_2gydF4y2Ba每4小时泵入3个罐中，溶解的OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba含量维持在0.1 ~ 0.5 mg LgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}．溶液每3 d更换一次gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用便携式溶解氧仪(HI9143;汉纳仪器公司，帕多瓦，意大利)。gydF4y2Ba

在常氧和缺氧条件下培养14 d后，用Li-6400XT便携式光合系统(Li-Cor Co. Ltd.)测定了完全展开的幼嫩叶片的叶气交换。“无人飞行系统”)。测定时间为09:00 ~ 12:00，光合光子通量密度为1500 mmol mgydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}，比皿温度28°C，参考COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度为390 mmol molgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}，相对湿度为60-70%。用叶绿素仪(SPAD502 Plus;Spectrum Technologies Inc.， Aurora, IL, USA)。测定叶片光合作用和SPAD后，分别采收水稻幼苗(叶片和叶鞘)和根系，立即在液氮中冷冻，在−70℃下保存至使用。gydF4y2Ba

实验2：gydF4y2Ba为了测定根系中ABA和脯氨酸的产生时间过程，在培养1周后，将每个基因型的预处理水稻幼苗分别在低氧和常氧条件下生长，如试验1所示。分别在0、0.5、1、3、5和7 d取样，测定根系中ABA和脯氨酸的含量。gydF4y2Ba

为了探讨ABA与脯氨酸之间的串扰，在水稻适应缺氧应激后，在1周的预防后，每个基因型的类似预处理水稻幼苗也受到以下五种治疗方法：常摩氧化，缺氧，缺氧+ NORF（100μmnorf，作为ABA合成抑制剂），诺莫莫昔西亚+ ABA（50μmABA，作为ABA供体），缺氧+ ABA（50μmABA，作为ABA供体）[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba］．由于ABA的产生在缺氧胁迫后24 h达到峰值(见结果部分)，因此5个处理分别在培养0.5、1和3 d后取样。然后测定总氨基酸、脯氨酸、谷氨酸、ABA、脯氨酸相关代谢酶、基因表达和根氧化损伤(丙二醛(MDA)和羰基)水平。gydF4y2Ba

根系活性，氧化损伤和抗氧化酶活性gydF4y2Ba

根活力的测定采用三苯基四唑氯铵(TTC)法，如Wang等人所述[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba］．简单地说，将0.5 g新鲜根样品浸泡在10 mL 0.4% TTC和磷酸盐缓冲液等混合溶液中，37℃黑暗保存2 h。以2ml的1mol L停止反应gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba．根用滤纸干燥，乙酸乙酯萃取。记录提取物在485 nm处的吸光度。以TTC还原强度计算根系活力，其结果表示为每根干重TTC还原量(μg)和时间(h)。gydF4y2Ba

根据Velikova等人的方法[gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba]，通过测定硫代巴比妥酸(TBA)反应产生的丙二醛(MDA)含量来测定脂质过氧化。正如Zhang等人所描述的，蛋白质的氧化损伤是根据羰基的含量来估计的。[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba］．根据Bradford的方法测定蛋白质含量[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba]，用牛血清白蛋白用作标准。gydF4y2Ba

新鲜根样品(0.5 g)用含有4% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮和1 mM EDTA的5 mL 10 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)均质。匀浆在4°C下以12,000 rpm离心15分钟，然后在−70°C保存，用于测定抗氧化酶的活性。Jiang和Zhang用光比色法测定了SOD、CAT、APX和POD的活性[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba］．所有这些测量都是在三个独立的生物学重复中进行的。gydF4y2Ba

氨基酸和ABA分析gydF4y2Ba

根系中脯氨酸、谷氨酸和总游离氨基酸的含量测定如下:鲜根约1.0 ggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，用3％硫磺酸（W / V）在4℃下均化。将匀浆在4℃下以10,000rpm离心10分钟，然后通过0.22-μm水膜过滤器。根据Ma等人所述的方法，使用Hitachi L-8900自动氨基酸分析仪（L-8900;日本日本的日本日本）测定氨基酸含量。[gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

采用高效液相色谱-串联质谱系统(HPLC-MS)测定根和叶中ABA含量。ABA的提取、纯化和测定方法参照Cao等[gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba］．每种治疗都有三种复制。gydF4y2Ba

P5CS, OAT和ProDH活性gydF4y2Ba

用5 mL由50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、7 mM MgCl组成的提取缓冲液提取大约0.5 g新鲜根样品，三次重复gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，0.6M KCl，3mM EDTA，1mM二硫代噻吩和5％（w / v），可溶的聚乙烯吡咯烷酮。将匀浆物以39,000rpm离心5分钟，然后通过在4℃下以39,000rpm离心20分钟进一步澄清上清液。测量上清液中1-吡咯啉-5-羧酸合酶（P5CS，EC2.7.2.11），鸟氨酸氨基转移酶（OAT，EC2.6.1.68）和脯氨酸脱氢酶（PRODH，EC1.5.9.8）的活性按照先前报告的方法[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

根据Cao等人进行总RNA提取，逆转录和PCR。[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］．设计引物用于使用Primer5软件扩增150-至250-BP片段[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba］．测定中使用的引物列于补充表中gydF4y2BaS1gydF4y2Ba．使用引物UBQfw (5 ' -GCTCCGTGGCGGTATCAT-3 ')和UBQrv (5 ' -CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3 ')将表达水平归一化至内参基因UBQ的表达水平[gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba］．2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}方法采用三次重复实验的平均值测定相对基因转录水平。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析，并用SPSS v. 13.0 (IBM Corp.， Armonk, NY, USA)软件进行最小显著差异(least significant difference, LSD)检验。数字上不同的字母表示平均值在统计上有差异gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05的水平。图是用Origin v. 8.0 (Origin Lab Corporation, Northampton, MA, USA)绘制的。gydF4y2Ba

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从相应的作者获得合理的请求。gydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

U502:gydF4y2Ba

高于502.gydF4y2Ba

扼杀：gydF4y2Ba

nipponbare.gydF4y2Ba

Norf:gydF4y2Ba

NorflurazongydF4y2Ba

OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

氧气gydF4y2Ba

ROS：gydF4y2Ba

反应性氧气gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

氢过氧化物酶gydF4y2Ba

APX型:gydF4y2Ba

抗坏血酸过氧化物酶gydF4y2Ba

豆荚：gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

草皮：gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

MDA：gydF4y2Ba

脂质过氧化作用gydF4y2Ba

P5CS：gydF4y2Ba

1-吡咯啉-5-羧酸合酶gydF4y2Ba

燕麦:gydF4y2Ba

鸟氨酸氨基转移酶gydF4y2Ba

ProDH:gydF4y2Ba

脯氨酸脱氢酶gydF4y2Ba

EDTA:gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸gydF4y2Ba

市场经济地位:gydF4y2Ba

2-（N-吗啉代）乙二磺酸gydF4y2Ba

RH：gydF4y2Ba

相对湿度gydF4y2Ba

MDA：gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

TTC):gydF4y2Ba

氯化三苯基四唑gydF4y2Ba

稍后通知:gydF4y2Ba

硫代巴比土酸gydF4y2Ba

高效液相色谱法:gydF4y2Ba

高效液相色谱gydF4y2Ba

DW:gydF4y2Ba

干重gydF4y2Ba

我们要感谢《美国期刊专家》对英语语言的编辑。gydF4y2Ba

这项工作得到了中国天然科学基金（31771733）的自然科学基金（Ly18C130005），以及中国的国家重点研发计划（2017年，2017年，2016年，2016年，2016YFD0101801）。资金机构在研究中没有作用，在收集，分析和解释中没有作用或写作稿件。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 曹晓昌和吴龙龙同等为这项工作。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 浙江省杭州市体育场路359号中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室，浙江杭州310006gydF4y2Ba

   曹晓闯，吴龙龙，朱春泉，金乾宇，张俊华gydF4y2Ba

2. 2 .长江大学粮食产业湖北省协同创新中心/湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州434025gydF4y2Ba

   梅亚吴gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

曹兴昌、金启元构思并设计了实验。Cao XC, Wu LL, Zhu CQ进行了实验。曹兴昌、吴明明、张建华对数据进行了分析。论文由曹兴昌、吴立林撰写。所有作者阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2BaXiaochuang曹gydF4y2Ba或gydF4y2Ba张俊华张gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称不存在相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba