利用CRISPR-Cas9多路复用方法在拟南芥中阐明三种β-葡萄糖醛酸转移酶(GLCATs)作用于阿拉伯半乳糖蛋白的作用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

阿拉伯半乳糖蛋白(arabin半乳糖蛋白)是植物王国中最复杂的蛋白质家族之一，存在于所有陆生植物的细胞壁中。agp涉及多种生物过程，如植物生长、发育、繁殖和应激反应。通过将II型阿拉伯半乳聚糖(AG)多糖添加到其蛋白核心的羟脯氨酸残基上，agp被广泛糖基化。葡萄糖醛酸(GlcA)是添加到agp中唯一带负电荷的糖，GlcA残基在agp上的功能尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

利用CRISPR/Cas9基因编辑方法在拟南芥中对CAZy GT14家族中的三个成员(GLCAT14A-At5g39990、GLCAT14B-At5g15050和GLCAT14C-At2g37585)进行了功能鉴定，这三个成员负责将葡萄糖醛酸(GlcA)转移到agp。RNA序列和qRT-PCR数据均显示了这三种情况gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba基因在不同植物组织中广泛表达gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba在珠孔胚乳中表现出特别高的表达。不同敲除突变体agp的生化分析gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba单突变体、双突变体和三突变体显示，双突变体和三突变体通常Ara和Gal含量小幅增加，GlcA含量同时降低，特别是在gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba突变体。此外，从所有的agp分离gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba与WT相比，突变体的钙结合显著减少。进一步的表型分析发现gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba突变体表现出种子萌发显著延迟，根毛长度减少，毛状体分支减少，和缺陷花粉粒的积累。此外,这两个gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba表现出显著的短角果和减少结实率。最后，所有高阶突变体的种皮黏液均显著减少。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究提供了GLCAT14A-C在GlcA向agp的转移中发挥作用的遗传学证据，agp在多种生化和生理表型中发挥作用，包括agp的钙结合、种子萌发、根毛生长、毛状体分枝、花粉发育、角果发育、种子结块和粘附种皮粘液的积累。gydF4y2Ba

阿拉伯半乳糖蛋白(arabin半乳糖蛋白，AGPs)是植物中最复杂的蛋白质家族之一，其核心蛋白的多样性和连接这些蛋白核心的糖链的异质性。agp通过GPI锚点存在于植物细胞表面，包括质膜、细胞壁和植物的细胞间隙。agp涉及一系列植物生长和发育过程，包括细胞扩张、体细胞胚胎发生、根和茎的生长、耐盐性、激素信号、细胞程序性死亡、雄性和雌性配子体发育以及伤害/防御[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．虽然agp的多样性表现为蛋白质核心中存在不同的蛋白质结构域，装饰每个蛋白质核心的多个聚糖(AG链)以及糖基化的异质性，但它们由共同的结构统一起来。具体来说，agp是gydF4y2BaOgydF4y2Ba-连接糖蛋白，特征是存在II型(β-1,3和β-1,6) AGs附着在蛋白核心的羟脯氨酸(Hyp)残基上。更简单地说，AGP核心蛋白中的Hyp残基通过添加β-1,3-半乳糖主链进行修饰，再通过添加多个分支β-1,6半乳糖侧链进行修饰，再通过添加阿拉伯糖(Ara)残基进行修饰，其他糖如鼠李糖(Rha)、焦糖(Fuc)、木糖(Xyl)和葡萄糖醛酸(GlcA)等不太广泛地修饰[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

几种糖基转移酶(GTs)主要分布在高尔基体中，其中每一种都负责转移单个单糖以合成AGP聚糖。使用生物化学和生物信息学方法对它们进行分离和鉴定。在此之前，我们实验室发现了5种β-1,3-半乳糖基转移酶(GALT2, GALT3, GALT4, GALT5和GALT6) [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．随后又发现了另外三种galt，即HPGT1、HPGT2和HPGT3 [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．这8种酶都来自碳水化合物活性酶(CAZy) GT31家族，在拟南芥AGP核心蛋白中的羟基脯氨酸残基上催化第一个糖半乳糖的添加gydF4y2Ba．gydF4y2Ba与野生型(对照)植物相比，GALT家族单基因突变株表现出微小或无表型变化。然而,gydF4y2BahpgtgydF4y2Ba三突变体表现出更长的根毛，更小的叶子，以及植株高度和结实率的降低[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．相比之下，gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba双突变体在盐胁迫条件下表现出根长变短、根肿胀等表型，种皮粘液减少[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．另一种名为KNS4/GALT14的β-1,3-半乳糖转移酶，也在CAZy GT31家族中发现，最近在拟南芥中被鉴定[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．突变体分析发现gydF4y2Baksn4gydF4y2Ba花粉表型不规则且塌陷，这是由于发育中的小孢子外壁层形成异常所致[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．来自CAZy GT29和GT31家族的AtGALT29A和AtGALT31A分别代表了两种在拟南芥中发现的β-1,6-半乳糖基转移酶[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．此外，β-arabinofuranosyltransferase, RAY1也在拟南芥中被鉴定出来。的gydF4y2Baray1gydF4y2Ba突变体arabinofuranose (AragydF4y2BafgydF4y2Ba)在其agp内[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．虽然RAY1在烟草微粒体中的异源表达表现为β-AragydF4y2BafgydF4y2Baβ-1,3-linked Ara活性gydF4y2BafgydF4y2Ba尚未在植物中发现。此外，两种α-1,2 -焦点转移酶AtFUT4和AtFUT6也在烟草BY2细胞中异源表达[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．AtFUT4和AtFUT6能够在体外催化焦点向AGPs的转移[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．进一步的研究发现双突变体gydF4y2Bafut4 fut6gydF4y2Ba在盐胁迫条件下，与野生型(WT)相比，没有焦点，根长减少[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．最后，CAZy GT14家族中的三种β-葡萄糖醛酸转移酶(GLCATs)，gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba,gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba在拟南芥中通过与AGPs共表达分析确定，并通过异源表达和体外酶实验验证[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．到目前为止，只有GLCAT14A在某种程度上通过突变体的使用来进行功能表征[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba];然而，GLCAT14B和GLCAT14C没有这样的工作。gydF4y2Ba

由于GT家族之间的基因冗余，要全面了解装饰AGP蛋白核心的不同糖的功能，需要生成高阶突变体，以大幅减少或消除特定糖残基的添加，并观察其功能后果。传统的(基于T-DNA的)产生多个基因敲除突变体的方法既劳动密集型又耗时。此外，在GTs和细胞壁家族中常见的遗传连锁，也使传统的杂交方法产生高阶突变体更具挑战性。gydF4y2Ba

因此，我们选择利用CRISPR-Cas9基因编辑技术来解决GT家族中的基因冗余问题。CRISPR-Cas9允许通过设计针对多个GT基因的多个引导rna (gRNAs)在单个转化事件中产生多个基因突变。在这里，我们报道了CRISPR-Cas9基因编辑技术成功应用于三个目标gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba基因，已知参与GlcA残基转移到agp作为一个测试案例。所得到的突变体不仅证明了该方法的可行性，而且为agp中GlcA残基在植物生长发育中的作用提供了新的证据。gydF4y2Ba

GLCAT14A、GLCAT14B、GLCAT14C属于CAZy GT14家族gydF4y2Ba

本研究重点研究了拟南芥CAZy GT14家族中发现的GLCAT14A (At5g39990)、GLCAT14B (At5g15050)和GLCAT14C (At2g37585)的功能特征。GT14家族由一个分支域(Pfam 02485)识别，该分支域被命名为GLCAT域[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．这11个拟南芥GT14成员的异源表达gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba在使用UDP-时，只有3个成员(GLCAT14A、GLCAT14B和GLCAT14C)表现出GlcA转移酶活性gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba[C]-GlcA作为糖供体和AGP底物受体[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．虽然这三种酶都表现出GlcA转移酶与β-1,3半乳聚糖和β-1,6半乳聚糖AGP底物受体的活性，但GLCAT14A和GLCAT14B偏好前者受体，而GLCAT14C偏好后者受体[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．GeneCAT共表达分析发现GLCAT14A与AtGALT31A共表达[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在这三个人当中gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba氨基酸相似度为73.3%，与氨基酸相似度仅为43.4和48.3%gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba，分别(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba都位于第5号染色体上，然而gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba在2号染色体上发现。gydF4y2Ba

表达谱gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba,gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba

我们的qRT-PCR和公开的RNA-seq数据来自Klepikova Atlas [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]用于检测三种GLCATs的表达水平(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2)。qRT-PCR和RNA-seq数据均显示gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba表达水平高于gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba在大多数组织中。此外，qRT-PCR结果显示，3种GLCATs在吸水36 h的种子和角果中表达量均高于其他组织。gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba在茎中也表现出高表达。公开的RNA-seq数据也显示了这一点gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba在幼苗根、叶柄和角果中表达量较高，gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2BaGLCAT14C主要在成熟叶、节间和叶柄中表达，在花、种子和角果中表达量较高。基于RNA-seq数据，GLCAT14A和GLCAT14C在角果中的高表达值以及GLCAT14B在节间中的高表达值与我们的qRT-PCR结果一致。此外，eFP浏览器中显示的发育种子的转录组数据[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba发现gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba在种子发育的前球状和球状阶段珠孔胚乳中高度表达，而GLCAT14C在这个位置不表达(补充文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。这两个gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba在种皮中也有中度表达gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba只在珠孔胚乳中发现。鉴于在珠孔胚乳中的高表达水平gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba，并在水分吸收的种子gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2BaqRT-PCR检测结果显示，3gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba推测其在种子发育和萌发中起作用。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba高阶突变体使用CRISPR-Cas9多路复用方法gydF4y2Ba

到目前为止，只有gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba对拟南芥GT14家族中的基因进行了突变分析和部分鉴定。两个等位基因T-DNA插入突变体gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba,名叫gydF4y2Baglcat14a-1gydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14a-2gydF4y2Ba结果表明，幼苗AGPs中β-GLCAT活性降低，Gal升高12%，Ara降低12%。生理上，两种等位突变体在黑暗中生长时根长增加30%，下胚轴长增加30% [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．然而,随着gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba可能是冗余的，单一的基因突变等gydF4y2Baglcat14agydF4y2Ba通常不足以完全揭示GlcA残基的生物学功能。此外，使用传统的杂交方法来为两个遗传相连的基因创造双突变体，如gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba．因此，本研究利用多路复用CRISPR-Cas9基因编辑策略来创建和检测这三种基因的高阶敲除突变体gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba同时进行。gydF4y2Ba

6种grna (A1, A2, B1, C1, C2和C3)被设计为靶向gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba，gydF4y2Ba和GLCAT14CgydF4y2Ba在不同位点(图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaA)，它们被组装成两个CRISPR/Cas9多路复用结构使用pHEE401E二进制向量，其中也包含AgydF4y2Ba玉米gydF4y2Bacodon-optimizedgydF4y2BazCas9gydF4y2Ba该基因由拟南芥卵细胞特异性启动子(E.C1.1)与卵细胞特异性增强子(E.C1.2)融合控制[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．之前的研究使用pHEE401E在拟南芥中成功地在单代中创建了高阶纯合CRISPR突变体[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．用我们的两个CRISPR结构，一个是单的，一个是双的gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba创建突变体，我们为每个产生的突变体选择一条不含cas9的细胞系:gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba,gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba用于功能描述。另外，gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba三倍gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba鉴定了CRISPR突变系，并用于进一步鉴定。gydF4y2Ba

三个gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba即纯合突变体gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba,gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba在T1代中使用如图所示的结构生成。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB (1)gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba突变体在B1位点有1 bp的插入gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba突变体(17-5系)在A1和B1都有1个bp的插入(图17-5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这些突变发生在gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba导致两个基因的终止密码子提前成熟。这两个突变系在T2代均获得无cas9突变体。此外,gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba使用图中所示的基因结构生成突变体。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB(2).两个突变系在C2和C3之间均有188 bp的缺失gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba双突变系(14-4号系)另外在B1处有一个1 bp的插入位点(图14-4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．纯合子Cas9-freegydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba在T2代获得突变体。此外,一个gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba使用图中的结构在T2代中鉴定出三突变体(系# 52-4)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB(1).该突变体A1位点缺失12bp, B2位点插入1bp, C1位点缺失12bp(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在这个三突变体中，gRNA A1和B2的基因编辑事件导致过早成熟的终止密码子，而C1的突变导致其蛋白质序列中四个氨基酸的损失(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

定量β-D-Gal-Yariv沉淀agp在各种gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

β-D-Gal-Yariv是一种合成染料，常用于AGPs的纯化，因为它可以结合到AGPs上的β-1,3-半乳糖主链;因此，它是一种便于agp聚糖结构表征的理想试剂[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．在这里，β-D-Gal-Yariv用于从各种莲座叶、茎和硅果组织中沉淀AGPsgydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．单个突变体和gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba双突变体AGP含量除gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba仅在角果中AGP含量增加了约25%，而在其他器官中则没有增加。的gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba双突变体gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba然而，三突变体在莲座叶、茎和角果三个器官中AGP含量均有增加gydF4y2Ba．gydF4y2Ba具体地说,gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2BaAGP含量在莲座、茎和角果中分别增加60%、50%和25%;而gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba三个器官中AGP含量均增加约50%。gydF4y2Ba

单糖组成分析gydF4y2Ba

既往单糖组成分析gydF4y2Baglcat14agydF4y2Ba从14日龄幼苗中提取的agp中3-，6-和3,6-键的Gal含量略有增加gydF4y2Baglcat14agydF4y2Ba与WT相比，GlcA的含量gydF4y2Baglcat14agydF4y2Ba与WT相似[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．在这里，用HPAEC-PAD对40天龄的AGPs进行单糖组成分析gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体和WT。见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、单gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba与WT相比，突变体在包括GlcA在内的大多数糖的含量上没有显着差异gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba， Gal含量升高，GlcA含量降低。相反，高阶gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体,即gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba,gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba， GlcA含量分别降低了27%、12%和40%。有趣的是，与WT相比，这些高阶突变体也表现出更多的Ara和GalgydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba突变体比双突变体GlcA降低更明显;然而，三突变体中GlcA的含量并没有完全消除。gydF4y2Ba

先前的研究发现钙与某些AGPs有关，包括阿拉伯胶和从拟南芥、西兰花、胡萝卜、烟草和番茄的细胞培养中分离出来的AGPs [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．Lamport假设agp上带负电荷的GlcA残基可能是这种钙结合的位点[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．研究agp与钙的结合在我们体内是否发生改变gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体，我们从拟南芥植物的气生部分提取agp，并使用比色法测量相关钙的量[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba， WT拟南芥含钙1.5%gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}每μg AGPgydF4y2BaglcatgydF4y2BaCa含量为0.5%的突变体gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}每微克AGP。有趣的是，gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba与高阶突变体相比，突变体的钙结合减少。这些结果表明，agp上的GlcA是钙结合的主要原因，三种glcat中的任何一种的缺失都会导致agp钙结合的主要损失。gydF4y2Ba

glcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba表现为延迟发芽gydF4y2Ba

在收获后(> 3个月)和刚收获的种子中，都观察到种子萌发的显著延迟gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba种子。只有~ 40%gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba大约30%gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba种子在播种后第2天萌发，而其他基因型的种子萌发率为75%(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa).到第3天，大部分WT，gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14c,gydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba种子发芽率为~ 60% ~ 55%gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba种子分别发芽。总体而言，NgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba(50%发芽率)为大多数gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体和WT为~ 1.5 d，而对照为2.5 ~ 3 dgydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba分别突变体。这种延迟发芽的表型gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba然而，突变体并没有影响它们最终发芽的能力，因为大多数种子最终都发芽了。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

考虑到gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba都在珠孔胚乳中高度表达，胚乳细胞壁的削弱受到植物激素如ABA的负调控(即延迟)，我们发芽了吗gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba在0.5 μM、1 μM和2 μM ABA的存在下，突变种子。WT种子的萌发趋势与大多数种子相似gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体;它们发芽的速度都比gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba在0.5 μM ABA存在的情况下(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Bab).当1 μM ABA存在时，gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba发芽比WT晚，并且观察到更严重的发芽延迟gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac).当2 μM ABA存在时，所有的gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba与WT相比，突变体表现出延迟发芽(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

glcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba是否对分层条件高度敏感gydF4y2Ba

低温分层是拟南芥种子释放休眠的常用策略。分层处理尤其能加快刚采种子的萌发过程，其ABA含量高于采后(> 3个月)种子。研究是否观察到延迟萌发表型gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba是否与分层条件有关，刚收获的种子来自何处gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba在播种前对突变体和WT分别进行正常分层(4℃，吸胀72 h)、室温分层(22℃，吸胀72 h)和不分层(不吸胀)处理。播种48 h后测定发芽率。与正常分层相比，室温分层和不分层降低了所有种子的发芽率gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba种子对这两种处理特别敏感，并表现出明显的发芽延迟(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．这些实验表明gydF4y2BaGLCATs,gydF4y2Ba特别是gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba它们共同作用于休眠种子向非休眠种子的转变，并受到冷分层作用的促进。gydF4y2Ba

高阶gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体的毛状体分支减少，根毛长度减少，株高降低gydF4y2Ba

两者都有的变种人gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba敲除还显示毛状体分支缺陷和根毛生长减少。这两个gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba与WT相比，毛状体更小，毛状体分支减少，而单gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体,gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba毛状体发育中WT的表型复制(图;gydF4y2Ba11gydF4y2Baa).此外，根毛长度在gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba,gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba与WT相比(图;gydF4y2Ba11gydF4y2Bab和d)gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba双突变体和三突变体的株高降低(图2)。gydF4y2Ba11gydF4y2Bac).上述突变表型表明，GlcA残留在agp上可能有助于细胞分化和尖聚焦生长。gydF4y2Ba

glcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba含有缺陷花粉gydF4y2Ba

采用离体花粉萌发试验研究了不同品种的花粉表型gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体。只有gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba花粉发芽率均低于WT，而花粉管长度均低于WTgydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体与WT无显著差异(图;gydF4y2Ba12gydF4y2Baa和b)。此外，gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba突变体表现出显著数量的缺陷花粉(图。gydF4y2Ba12gydF4y2Bac).与正常花粉相比，缺陷花粉的大小要小得多，不能发芽(图。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

中断gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba导致角锥长度缩短，结实率降低gydF4y2Ba

只有gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba与WT相比，突变体表现出更短的角锥长度和结实率(图2)。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)．gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba以硅藻土表现为最高gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba根据我们的RT-qPCR数据，显示更温和的表达(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

高阶gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体的种皮黏液较少gydF4y2Ba

另一个值得注意的表型gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体是粘附种皮黏液的显著减少。的种子gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba,gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba通过钌红染色测定，与WT相比，粘附种子粘液显著减少，其与果胶等酸性生物聚合物结合(图2)。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

CRISPR-Cas9方法生成高阶gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

基因冗余是常见的基因编码酶功能在细胞壁生物合成，包括糖转移酶(GTs)。为了更好地理解冗余基因家族的功能，需要生成和研究高阶敲除突变体，即家族中多个基因失活的突变体。然而，传统的获取高阶突变体的遗传杂交育种方法既耗时又复杂。与传统育种相比，CRISPR-Cas9基因编辑最近被用于研究水稻、小麦、卷心菜、番茄和拟南芥等几种植物物种的冗余基因家族[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．然而，这里报道的研究代表了CRISPR/Cas9首次应用于了解拟南芥中的GTs家族。在这里，我们展示了CRISPR/Cas9基因编辑成功用于创建单gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba变种人和更高阶的人gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体。如果没有这种方法，它将非常难以生成gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba和高阶突变体，因为这两个基因在第5号染色体上大约相差12厘米。如下所述，单gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体(gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2Baglcat14c)gydF4y2Ba大部分是表型复制的WT，在其AGP上没有显示出单糖组成的变化，而破坏两个或多个GLCATs对AGP的糖组成以及拟南芥的几个重要发育/生理表型都有影响。gydF4y2Ba

两种多路复用CRISPR结构(图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)是针对三个已知的gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba基因家族成员，即gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba,gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba．在使用这些结构进行转换之后，会出现一些单、双和三重结构gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体产生了。中创建的Indel突变gydF4y2Baglcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba,gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba都导致过早成熟的停止密码子(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba三突变体，突变在gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba导致终止密码子过早成熟，而突变gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba导致GLCAT Pfam结构域(Pf02485)中四个氨基酸的丢失(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了评估CRISPR-Cas9引起的潜在脱靶突变，CRISPR-P 2.0软件[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba用来识别偏离目标的候选人。4个位点位于编码区，脱靶分数在0.1到0.2之间(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。这些位点在突变体中被扩增并测序。在我们的研究中没有发现脱靶突变gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体。gydF4y2Ba

CRISPR-inducedgydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba突变改变了AGP的糖组成和钙结合gydF4y2Ba

成熟植物AGP单糖组成分析表明gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba,gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba分别表现出约27%，12%和40%的GlcA降低(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外,gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba，gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba,gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba与WT相比，前者表现出更多的Gal(~ 5-12%)和Ara (~ 15%)gydF4y2Baglcat14agydF4y2BaT-DNA插入突变体，该突变体在幼苗分离出的agp中Gal含量增加12%，Ara含量减少12%，尽管本研究通过单糖成分分析未检测到GlcA水平的差异[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．我们的发现也与agp上的GlcA残留可能有助于终止添加到agp上的β-1,3-和β-1,6-半乳糖的进一步延伸一致[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，这样GlcA水平的降低会导致Gal和Ara残基的额外延伸和掺入(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

把任何gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba与WT相比，基因也导致AGPs与钙的结合显著减少(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，表明GlcA作为agp上唯一带负电荷的糖，在agp结合钙的过程中起关键作用。这提供了第一个直接的实验证据，具体地将agp上的GlcA残基与钙结合联系起来，证实了Lamport关于agp与钙结合的观察[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了检测糖基化AGPs的数量是否在不同器官中发生改变gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba在突变体中，我们使用β-Gal Yariv试剂从莲座叶、茎和角果中定量糖基化AGPs(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这两个gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba双突变体gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba与野生型相比，三突变体在莲座、茎和角果中的AGPs含量增加了约30-60%gydF4y2Baglcat14cgydF4y2Ba单突变体在角果中AGPs含量增加25%左右。这种AGP含量的增加与GlcA残基的缺失导致AGP中β-1,3-半乳糖主链的伸长和β-1,6-半乳糖侧链的添加的观点是一致的，β-Gal Yariv试剂揭示了这一点，单糖分析也证实了这一点(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这些结果表明gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba在三种器官中GlcA向agp转移的过程中起着重复的催化作用。gydF4y2Ba

GLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba对种子萌发有冗余调节作用gydF4y2Ba

在gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体,只有gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba与WT相比，种子萌发延迟1-1.5天(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在没有正常(冷)分层的种子中，这种发芽延迟加剧。这表明gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba调节种子萌发的功能冗余，这种调节很可能涉及加强珠孔胚乳中细胞壁的降解，这两个基因都在胚乳中高度表达。因此，低温吸胀可能会使珠孔胚乳细胞壁松动，从而促进萌发。许多其他细胞壁酶被证明参与了种子萌发，如膨胀素、β- 1,3 -葡聚糖酶、内-β-1,4甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、内转糖基酶/水解酶(XTH)、α-木糖苷酶和木糖基转移酶，所有这些酶也都是高表达的，其中许多酶在珠孔胚乳中特异性表达[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．表达分析和基因突变分析表明，这些酶可能在种子萌发中起关键作用。例如，编码内do-β-1,4甘露聚糖酶的基因敲除突变体包括gydF4y2Baman5gydF4y2Ba，gydF4y2Baman6gydF4y2Ba,gydF4y2Baman7gydF4y2Ba在拟南芥中均表现为延迟萌发表型。此外,gydF4y2Baman7gydF4y2Ba同源物也在珠孔胚乳中积累gydF4y2BaLepidium一gydF4y2Ba，是拟南芥的近亲[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

除了正常情况下的发芽延迟外，所有的gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体在1-2 μM ABA的存在下也表现出更大的延迟。ABA仅抑制萌发的第二阶段，即胚根突起。观察到的发芽延迟在这里表现为gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba表明agp上的GlcA残基可能在ABA介导的萌发过程中发挥信号分子的作用。gydF4y2Ba

GLCATsgydF4y2Ba参与拟南芥以营养尖为中心的生长gydF4y2Ba

在gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体,gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba显示根毛长度、毛状体大小和毛状体分支减少(图。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．利用β-Gal-Yariv试剂在植物培养中观察到AGPs在细胞生长和扩张中的作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．β- gal - yariv可特异性结合AGPs上的β， 1,3-半乳糖主链，在体外抑制根细胞的扩张和增殖[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．的gydF4y2Bagalt2 galt5gydF4y2Ba敲除突变体，影响了参与将第一个半乳糖残基添加到agp上的羟脯氨酸残基的两个galt，也显示出根毛长度的减少[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．根毛和毛状体的形成是由尖端产生的细胞质钙梯度驱动的以尖端为中心的生长的两个例子[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．最近的研究发现，agp可以以ph依赖的方式结合和释放钙，可能是通过其带负电荷的GlcA残基[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．因此，我们认为agp作为细胞外钙电容，参与钙介导的信号传导，从而降低肌动蛋白介导的HgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba- atp酶使钙从细胞外AGPs中分离并释放到细胞质中，产生细胞质钙内流[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．因此，这一过程可能对各种发育过程很重要，包括根毛和毛状体的生长。钙结合试验在这里进行gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba确实发现与WT相比，钙与AGPs的结合显著减少(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．因此，短根毛长度和畸形的毛状体生长在我们的观察gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变可能是由于这些组织中GlcA水平的降低以及这些组织中细胞外agp中的钙水平的降低而导致的钙流入减少。gydF4y2Ba

还有其他潜在的agp作用机制，可以解释在研究中观察到的受损根尖生长gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体，以及本研究中报道的其他突变表型。例如，agp可以通过与其他细胞壁成分相互作用来控制生长。agp通常与果胶相关，在某些情况下与它们共价相互作用[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．对嵌合AGP SOS5/FLA4的研究发现gydF4y2Basos5gydF4y2Ba籽粒黏液含量显著降低，表明SOS5与籽粒黏液中果胶网络的组装相互作用并介导[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．在另一项研究中，agp不仅与果胶发生共价相互作用，而且与阿拉伯木聚糖(半纤维素)也发生共价相互作用[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．更准确地说，该研究表明agp中的GlcA残基与果胶中的Rha残基共价连接[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．因此，这种结构的相互作用可能参与控制细胞壁的刚性和延展性。最近另一项关于GT31家族中agp特异性糖基转移酶UPEX1的研究也表明，在花粉发育过程中，agp和木聚糖在外细胞壁沉积过程中相互作用[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．类似于未甲基酯化的果胶可以通过Ca形成“蛋盒”结构的想法gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}已知的控制细胞壁完整性的结合，最近提出的AGP- CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}模型使带负电荷的GlcA残基变为潜在的CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}细胞表面调控细胞壁完整性的结合位点。gydF4y2Ba

agp也可以作为传感器和/或信号分子。由于存在于许多agp上的GPI锚定结构域，agp在质膜/细胞壁界面上的存在将它们定位于一个理想的位置，用于感知细胞壁扰动并将信息传递给相关的信号分子，如受体样激酶。agp和受体样激酶(rlk)之间的物理相互作用是可能的;这主要是基于基因数据。具体地说,gydF4y2Basos5 / fla4gydF4y2Ba两个富含亮氨酸的重复RLKs突变体，gydF4y2Bafei1gydF4y2Ba而且gydF4y2Bafei2,gydF4y2Ba表现出相似的根肿胀表型gydF4y2BaSos5 fei1 fei2gydF4y2Ba三重突变体，表明非加性遗传相互作用[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．因此，我们提出SOS5与FEI1和FEI2处于同一遗传途径，SOS5是FEI1和FEI2的配体。gydF4y2Ba

GLCATsgydF4y2Ba有助于拟南芥的生殖生长gydF4y2Ba

表型分析gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体也表明了GLCATs在植物繁殖中的作用。这两个gydF4y2Baglcat14a glcat14bgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba显示显著比例的缺陷花粉，比正常花粉小得多，不能发芽和gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba花粉发芽率也明显降低(图;gydF4y2Ba12gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．此外,gydF4y2Baglcat14b glcat14cgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba显示出硅果长度和结实率的减少(图;gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)．这些观察结果与以前对agp的研究有关。其中一个发现gydF4y2Baagp6gydF4y2Ba单突变体gydF4y2Ba, agp11gydF4y2Ba单一突变体，以及gydF4y2Baagp6 agp11gydF4y2Ba双突变体显示花粉萌发减少，花粉管伸长和花粉释放[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．另一项研究表明，仅在花序中表达的AGP4在拟南芥中起着阻止多个花粉管进入一个胚囊的作用，如gydF4y2Baagp4gydF4y2Ba功能缺失突变体未能阻止多个花粉管进入胚囊[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．最近的研究gydF4y2BaTorenia fournierigydF4y2Ba发现了一种双糖，β-甲基-葡萄糖醛酸半乳糖(4-Me-GlcA-β-1,6- gal)存在于卵巢分泌的AGPs上，使花粉管能够靶向/引导胚珠[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．因此，agp上的GlcA残基可能在拟南芥的胚珠引导和/或多管中发挥作用，但需要进一步的研究来支持这些潜在的作用。GlcA作为agp上唯一带负电荷的糖，可能负责agp与钙的结合。在拟南芥双受精过程的每一步都检测到细胞内钙信号[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．因此，agp上的GlcA残基可能通过钙信号在受精过程中发挥作用。gydF4y2Ba

GLCATsgydF4y2Ba在种皮粘液挤出中起重要作用gydF4y2Ba

种皮黏液为研究参与细胞壁生物合成的基因提供了一个有用的模型。多达90%的黏液由果胶多糖组成，不到10%的黏液由其他细胞壁成分组成，如纤维素、半乳糖葡甘露聚糖、木葡聚糖、木聚糖和agp [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．参与细胞壁生物合成的基因的破坏常导致种子黏液的减少或丧失[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．敲除两个agp特异性的galt，gydF4y2Bagalt2 galt5,gydF4y2Ba也导致了种子黏液的减少[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．其他细胞壁蛋白的突变，如gydF4y2Bacsla2gydF4y2Ba，gydF4y2Bamum2gydF4y2Ba,gydF4y2Bafly1gydF4y2Ba也会减少种皮粘液的形成[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．这项研究发现gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba双突变体和三突变体通过钌红染色检测到粘附种子粘液显著减少(图2)。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．关于GlcA在种皮粘液组成中的作用，目前还没有足够的资料。在拟南芥中，粘液分析要么没有检测到GlcA，要么只检测到小于0.5 mol%的GlcA [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．本研究首次表明，agp上的GlcA残基在拟南芥种皮粘液形成中起着重要作用，因为两个或多个GLCATs的破坏会导致粘附种子粘液的大量损失。这些GlcA残基虽然是黏液的小成分，但对于与黏液中的其他细胞壁成分(如果胶，特别是RG-1)的共价交联可能很重要，最近对细胞外agp -果胶-阿拉伯木聚糖聚合物的生化分析表明，或者通过钙桥与其他带负电荷的聚合物(例如其他agp或果胶)的离子相互作用[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．GlcA在agp上的减少可能会干扰原代细胞壁的正常结构，从而损害富含果胶的种皮粘液的释放或保留。gydF4y2Ba

本研究中使用的开创性CRISPR-Cas9方法已被证明是一种高效和有效的方法来表征这三个成员的高阶敲除突变体gydF4y2BaGLCATgydF4y2Ba基因家族。我们的生化和表型分析表明gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba在拟南芥agp中添加GlcA时起着特别多余的作用。尽管如此，突变体分析表明，事实上这三种基因都存在gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba共享某种程度的冗余，如双突变体，特别是三突变体gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba导致比单一突变体更严重的表型缺陷。所有的gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba，通过添加GlcA残基的能力，赋予agp结合钙的能力。细胞内钙来源于植物细胞壁/细胞外基质钙离子的流入，这一概念往往被忽视，而倾向于细胞内储存库(ER，液泡)的释放[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．据推测，agp可以作为ph调节的钙电容器和许多植物生长发育过程所需的细胞内钙信号的来源[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．需要进一步的研究来检查潜在的钙相关信号通路gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体。观察到，在agp上GlcA含量仅降低了~ 50%gydF4y2BaGlcat14a glcat14b glcat14cgydF4y2Ba三突变表明额外的GLCATs可能参与了催化GlcA向agp的转移。因此，在这一领域进行研究的两个重要途径是:1。发现CAZy GT14家族中的其他成员可能负责将GlcA残基添加到agp和2。了解GlcA残基和AGP控制特定发育/生理表型的确切模式或作用机制，无论是钙介导的信号传导，改变的细胞壁结构相互作用，和/或其他AGP传感/信号传导场景。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba(Columbia生态型)作为WT，最初来源于美国俄亥俄州哥伦布市拟南芥生物研究中心(ABRC)。在这项研究中，我们用它生成了所有的CRISPR突变体gydF4y2BaCol-0gydF4y2Ba背景。gydF4y2Ba

在GLCAT14A, GLCAT14B, GLCAT14C的硅分析gydF4y2Ba

基因组DNA，蛋白质序列和基因位置gydF4y2BaGLCAT14AgydF4y2Ba，gydF4y2BaGLCAT14BgydF4y2Ba,gydF4y2BaGLCAT14CgydF4y2Ba已从TAIR网站(gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba)．在Pfam中进行蛋白质结构域搜索(gydF4y2Bahttps://pfam.xfam.org/gydF4y2Ba)．表达谱gydF4y2BaGLCATsgydF4y2Ba基于从TRAVA数据库中获得的RNA-seq数据[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．种子发育的转录组数据来自eFP浏览器(gydF4y2Bahttps://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgigydF4y2Ba) [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

引导RNA设计和载体构建gydF4y2Ba

使用在线软件CRISPR-P 2.0选择所有grna (gydF4y2Bahttp://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/gydF4y2Ba)．关于选择gRNA的顺序和结构要求的若干规则如下所述[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．首先，基于CRISPR-P 2.0算法，gRNA应具有较高的on-target和较低的off-target评分。同时，gRNA的GC含量不低于40%，与模板DNA结合较强，在PAM序列前20位有一个G或C。向量构建策略采用了一种已发表的方法[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．三个模板质粒(pCBC-DT1, pCBC-DT2DT3和pCBC-DT3DT4)和一个二元载体(pHEE401E)是陈启军博士实验室赠送的礼物(Addgene质粒#50590;# 50591;# 50592;# 71287)。每个CRISPR/Cas9多路复用结构，由一个单独的gRNA盒组成，其中包括一个gRNA序列、一个gRNA支架、一个AtU6启动子和一个AtU6终止子，首先从特定的模板质粒中扩增;参见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba表S1-S3为具体的gRNA和引物序列。引物设计的详细程序和PCR反应步骤已在前面描述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．对于含有三种gRNAs (A1、B1和C1)的CRISPR/Cas9构建物，使用引物DT1-A1_F、DT1-A1_F0和DT0-R2扩增gRNA A1盒;B1和C1盒分别使用引物DT2-B1_F、DT2-B1_F0、DT3-C1_R0和DT3_C1_R进行扩增。将每个gRNA片段扩增后，采用金门克隆法克隆到pHEE401E二元载体的BsaI位点[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．对于包含A2、B1、C2和C3四种gRNA的CRISPR/Cas9构建物，使用引物DT1-C3_F、DT1-C3_F0和DT0_R2扩增gRNA C3盒;采用引物DT2-A2_F2、DT2-A2_F0和DT0-BsR3扩增gRNA A2盒;使用引物DT3-B1-BsF3、DT3-B1-F0、DT4-C2-R0和DT4-C2-BsR扩增gRNA B1和C2盒。利用金门克隆法将4个gRNAs片段克隆到pHEE401E二元载体的BsaI位点上。pHEE401E二元载体包含一个优化的玉米密码子gydF4y2BaCas9gydF4y2Ba由卵细胞特异性启动子驱动的基因(E.C 1.1和E.C 1.2) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．最终的结构被转化成gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba菌株GV3101，用于拟南芥的转化gydF4y2BaCol-0gydF4y2Ba通过花浸法对植物进行生态分型[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．基于pcr的方法用于初步检测indel突变，随后由Sanger测序证实[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

定量rt - pcrgydF4y2Ba

从各种组织(吸收的种子，发芽的种子，根，莲座，茎，开放的花，角果)中提取总RNAgydF4y2BaCol-0gydF4y2Ba拟南芥使用Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)。RNA (1 μg)与低聚物(dT20)引物和SuperScript III逆转录酶(Thermo Scientific)一起用于第一链cDNA合成。qPCR使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix (Quanta Biosciences)进行。以PerfeCTa SYBR Green SuperMix 10 μl、10x稀释cDNA 4 μl、正向/反向引物0.6 μl (10 μM)为原料配制20 μl反应液。qPCR在AriaMx实时PCR仪上进行(俄亥俄大学基因组学设备:gydF4y2Bahttp://www.dna.ohio.edu/gydF4y2Ba)．PCR条件按照PerfeCTa SYBR Green SuperMix协议进行。计算相对于拟南芥的表达水平gydF4y2BaACTIN2gydF4y2Ba基因。qPCR引物在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S5。gydF4y2Ba

β-D-gal-Yariv法定量AGPsgydF4y2Ba

agp提取于40日龄gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体和WT采用Lamport描述的β-D-Gal-Yariv沉淀法[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．简单地说，从40天大的莲座叶、茎和角果中采集组织gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba和WT植物，并在液氮上使用研钵和杵将其粉碎。将约0.3 g粉末状组织与1ml 2%的氯化钙混合gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以150转/分的转速摇晃2小时。然后通过13000离心将地面组织与上清液分离gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。将500 μL左右的上清液转移到新的1.5 mL离心管中，与200 μL溶于2%氯化钙的β-D-Gal-Yariv混合gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(1毫克/毫升)。同时，500 μL 2%氯化钙gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以200 μL β-D-Gal-Yariv为对照。β-D-Gal-Yariv沉淀2 h后，13000离心得到颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟后溶解于20mm NaOH中。通过测定OD下的吸光度来定量溶解的AGPsgydF4y2Ba_420gydF4y2Ba．不同浓度的阿拉伯胶(G9752, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶解在1%的氯化钙中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用来制作标准曲线。每种基因型的测量都是在三次重复中完成的。gydF4y2Ba

高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测单糖组成分析(HPAEC-PAD)gydF4y2Ba

从40日龄幼虫的地上部分提取agpgydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体和WT使用Lamport开发的协议[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．将粉状植物组织与2% NaCl以1:4 (w/v)的比例混合，以200 rpm的速度振荡3小时，然后在13000的温度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟。然后将2 mL 1 mg/mL β-D-Gal-Yariv试剂与上清液混合，使其沉淀过夜。次日，2000离心收集沉淀的agpgydF4y2BaggydF4y2Ba用2% NaCl洗一次，然后在2ml H中重悬10分钟gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.将β-D-Gal-Yariv试剂与AGPs分离，每2 mL AGPs样品中加入约25 mg二亚硫酸钠，在50°C下孵育15 min，直到溶液变黄。采用PD-10柱(GE Healthcare)脱盐，洗脱液冷冻干燥。取约100 μg AGPs溶于milliq水中进行单糖组成分析。用300 μl 2 N TFA在121℃下水解AGPs 90 min，然后用N去除TFAgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba气体。样品用异丙醇洗涤3次，然后溶于500 μL milliq水中。使用不同浓度(5 nM、2.5 nM和1.25 nM)的标准糖混合物(焦糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸)制作标准曲线。单糖组成以摩尔百分比(mol %)计算。所有样品和标准品均采用脉冲安培检测(HPAE-PAD)在Dionex PA-20(美国加州森尼维尔市赛默飞世尔科学公司)上进行高性能阴离子交换色谱分析，主要描述如下[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

钙结合试验gydF4y2Ba

从40日龄幼虫的地上部分提取agpgydF4y2BaglcatgydF4y2Ba突变体和WT植物，如上文所述，并溶于水。在超纯水中溶解约1 ~ 2 mg/mL AGPs, OD下用β-D-Gal-Yariv沉淀法测定其浓度gydF4y2Ba_420gydF4y2Ba．使用商业钙显色测定试剂盒(MAK022, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)按照制造商的方案进行钙测量。在本实验中，AGP提取物中的钙离子与检测试剂盒中的邻甲酚酞形成络合物，并导致颜色从透明变为粉红色。用紫外光谱仪在OD下测定钙的含量gydF4y2Ba_575gydF4y2Ba以及用不同浓度的氯化钙制成的标准曲线gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

发芽试验gydF4y2Ba

新鲜收获和两个月后收获的种子gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba采用野生型植物进行萌发实验。无菌种子经三种方式处理:未分层、4℃分层3 d、22℃暗处分层3 d。种子播种在½MS和1%蔗糖琼脂板上。播种后1 ~ 5 d统计发芽率。每种基因型大约播种50粒种子，重复3次。对于ABA处理下的萌发，收获后2个月的种子在4℃下灭菌分层3 d，播种于含有0-2 μM ABA的½MS和1%蔗糖琼脂板上。播种后4 ~ 10 d统计发芽率。每种基因型大约播种50粒种子，重复3次。gydF4y2Ba

根毛和毛状体形态gydF4y2Ba

的种子gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba将突变体和WT消毒，4℃暗处保存3 d分层，然后播种于1 / 2 MS和1%蔗糖琼脂平板上。将4天大的幼苗转移到1 / 2 MS琼脂板上，在22°C、16 h光/ 20°C、8 h暗光周期的生长室中保存。转移4天后，测量距离根尖5毫米处的根毛。每种基因型分别测量约300根根毛，共3个重复。毛状体形态为40天大的莲座的毛状体gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba用尼康SMZ1500立体显微镜在20倍放大倍率下对突变体和WT进行成像。gydF4y2Ba

角果长度和结实率的评价gydF4y2Ba

角果采自40日龄gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba用突变体和WT测量角锥长度和结实率。用70%乙醇清除角果色过夜，测定结实率。每基因型10株，重复3次。gydF4y2Ba

离体花粉萌发试验gydF4y2Ba

35天大的花gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba采用突变体和WT进行离体花粉萌发试验。花粉萌发培养基含10%蔗糖、0.01%硼酸、1 mM氯化钙gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 mM Ca (NOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、1 mM KCl、0.03%酪蛋白酶解液、0.01%肌醇、0.1 mM亚精胺、10 mM GABA、500 μM茉莉酸甲酯和1%低熔点琼脂糖。花粉取自每个基因型的5朵花，在花粉萌发培养基上孵育。培养3 h后，用尼康phot-lab2显微镜在50倍放大下测定花粉形态、花粉发芽率和花粉管长度。在一个重复3次的单独实验中，测量了大约300个花粉和花粉管。gydF4y2Ba

钌红染色gydF4y2Ba

的种子gydF4y2BaglcatgydF4y2Ba用1ml水将突变体和WT水化，以200rpm的速度摇晃1小时，以去除不粘附的粘液。用移液管除去水，用1毫升0.01%钌红替换，然后以200转/分的速度摇晃30分钟。用移液管去除污渍后，用1毫升水冲洗种子三次，然后在尼康SMZ1500立体显微镜下以20倍放大观察。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

GLCAT:gydF4y2Ba

β-glucuronosyltransferasegydF4y2Ba

AGP:gydF4y2Ba

阿拉伯半乳聚糖蛋白gydF4y2Ba

GlcA:gydF4y2Ba

葡萄糖醛酸gydF4y2Ba

忧郁:gydF4y2Ba

羟脯氨酸gydF4y2Ba

CAZy:gydF4y2Ba

碳水化合物活性酶数据库gydF4y2Ba

GT:gydF4y2Ba

糖基转移酶gydF4y2Ba

引导RNA。gydF4y2Ba

gRNAgydF4y2Ba

我们感谢Savannah Bisson, Sean McGovern和Weiheng Yu对突变体筛选和表型分析的帮助。我们也感谢Oyeyemi Ajayi对手稿的批评意见。本研究由俄亥俄大学A&S研究生研究基金资助;俄亥俄大学原创研究基金;俄亥俄大学纳米尺度与量子现象研究所(NQPI)研究员Y.Z.gydF4y2Ba

这项工作得到了俄亥俄大学贝克基金对美国医学科学院的资助。资助者在实验设计、数据分析、出版决定或手稿准备中没有任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 俄亥俄大学分子与细胞生物学项目，雅典，OH, 45701-2979，美国gydF4y2Ba

   张元，迈克尔·a·赫尔德，艾伦·m·肖沃尔特gydF4y2Ba

2. 俄亥俄大学环境与植物生物学系，雅典，OH, 45701-2979，美国gydF4y2Ba

   张元，艾伦·m·肖沃尔特gydF4y2Ba

3. 俄亥俄大学化学与生物化学系，雅典，OH, 45701-2979，美国gydF4y2Ba

   迈克尔·a·赫尔德gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YZ负责实验。MH协助进行单糖成分分析，并对稿件进行校对。AMS和YZ构思了这项研究并撰写了手稿。所有作者均已阅读并批准稿件gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba艾伦·m·肖沃尔特gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。Allan M. Showalter是本刊编委会成员(即副主编)。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba